DE69320389T2

DE69320389T2 - Verfahren zur Herstellung des Inhibitors für die Komplexbildung des Gewebefaktors

Info

Publication number: DE69320389T2
Application number: DE69320389T
Authority: DE
Inventors: Judith Arlene St Louis Missouri 63021 Diaz-Collier; Mark Edward St Charles Missouri 63304 Gustafson; Tze-Chein St Louis Missouri 63021 Wun
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1992-03-02
Filing date: 1993-03-01
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2013-03-02
Also published as: EP0559632A3; CA2090650A1; DE69320389D1; JPH07274968A; EP0559632A2; DK0559632T3; JP3333846B2; CA2090650C; ATE169957T1; US5212091A; EP0559632B1

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES INHIBITORS DES GEWEBEFAKTOR- REAKTIONSWEGES

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines Blutgerinnungsinhibitors, der als Inhibitor des Gewebefaktor-Reaktionsweges (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) bekannt ist und alternativ als Lipoprotein-assoziierter Gerinnungsinhibitor (lipoprotein associated coagulation inhibitor, LACI) bekannt ist.
Plasma enthält einen multivalenten Gerinnungsinhibitor vom Kunitz-Typ, der hierin als Inhibitor des Gewebefaktor-Reaktionsweges (TFPI) bezeichnet wird. Dieser Name ist von der International Society an Thrombosis and Hemostasis am 30. Juni 1991 in Amsterdam angenommen worden. TFPI wurde erstmals aus einer Human-Hepatom-Zelle, Hep G2, gereinigt, wie von Broze und Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-1890 (1987), beschrieben, und danach aus Humanplasma, wie von Novotny et al., J. Biol. Chem. 264, 18832-18837 (1989) berichtet; Chang-Leber- und SK-Hepatom-Zellen, wie von Wun et al., J. Biol. Chem. 265, 16096-16101 (1990) geoffenbart. TFPI-cDNA wurde aus Plazenta- und Endothelium-cDNA-Banken isoliert, wie von Wun et al., J. Biol. Chem. 263, 6001-6004 (1988); Girard et al. Thromb. Res. 55, 37-50 (1989) beschrieben. Die aus der cDNA-Sequenz abgeleitete primäre Aminosäuresequenz von TFPI zeigt, daß TFPI einen stark negativ geladenen Amino-Terminus, drei Tandern- Hemmdomänen vom Kunitz-Typ und einen stark positiv geladenen Carboxyl-Terminus enthält. Gemäß Girard et al., Nature 328, 518- 520 (1989) ist die erste Kunitz-Domäne des TFPI für die Hemmung des Faktor VIIa/Gewebefaktor-Komplexes notwendig und die zweite Kunitz-Domäne von TFPI für die Hemmung von Faktor Xa verantwortlich, während die Funktion der dritten Kunitz-Domäne weiterhin unbekannt ist. Vgl. auch U.S. Patent 5 106 833. Man nimmt an, daß TFPI in vivo zur Einschränkung der Initiierung der Koagulation fungiert, indem er einen inerten, quaternären Faktor Xa:TFPI:Faktor VIIa:Gewebefaktor-Komplex bildet. Weitere Hintergrundinformationen über TFPI können durch Bezugnahme auf die jüngsten Berichte von Rapaport, Blood 73, 359-365 (1989); Broze et al., Biochemistry 29, 7539-7546 (1990) erhalten werden.
Rekombinanter TFPI wurde als glykosyliertes Protein unter Verwendung von Säugerzellen-Wirten, einschließlich Mäuse-C127- Zellen, wie von Day et al., Blood 76, 1538-1545 (1990) beschrieben, Babyhamster-Nierenzellen, wie von Pederson et al., J. Biol. Chem. 265, 16786-16793 (1990) berichtet, Eierstockzellen vom chinesischen Hamster und Human-SK-Hepatom-Zellen, exprimiert. Der C127-TFPI wurde bei Tierversuchen verwendet und erwies sich gemäß Day et al., supra, bei der Hemmung von durch Gewebefaktor induzierter intravaskulärer Koagulation bei Kaninchen, und wie von Haskel et al., Circulation 84, 821-827 (1991) beschrieben, bei der Verhinderung einer arteriellen Reokklusion nach Thrombolyse bei Hunden als wirksam.
Die Klonierung der TFPI-cDNA, die für das 276-Aminosäurereste-Protein von TFPI codiert, ist weiter bei Wun et al., U.S. Patent 4 966 852, dessen Offenbarung durch Hinweis darauf hierin mit eingeschlossen ist, beschrieben.
In Biotechnology, Bd. 5, 1947, Seiten 1047-1051, ist die chemische Synthese einer Codiersequenz für den Insulin-Wachstumsfaktor II (insulin growth factor II, IGF-II) und dessen Produktion in E. coli beschrieben. Der so erzeugte IGF-II besteht aus einer einzigen Polypeptid-Kette mit 3 Disulfid- Brücken und einem Molekulargewicht von 7471 Dalton. In der EP-A-0 361 830 ist ein Verfahren zur Solubilisierung und erneuten Faltung rekombinanter Proteine mit ein oder zwei Disulfidbrücken beschrieben.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors des Gewebefaktor-Reaktionsweges (TFPI) vorgesehen. Das Verfahren umfaßt die Expression einer nicht-glykosylierten Form von TFPI in E. coli als Wirt und den Erhalt eines hoch aktiven TFPI durch erneute Faltung des Proteins in vitro. Gemäß diesem Verfahren wird der TFPI durch Züchtung von E. coli-Wirtszellen, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor transformiert worden sind, der die für diesen TFPI codierende cDNA enthält, unter Fermentationsbedingungen, die zur Herstellung dieses TFPI ausreichen, Ernten der E. coli- Zellen, Isolieren der Einschlußkörper aus den geernteten E. coli-Zellen und die Durchführung einer stufenweisen Reinigung der Einschlußkörper hergestellt, wobei die Reinigung bei einer Ausführungsform (A) der Erfindung umfaßt:
(1) Sulfitolyse der Einschlußkörper zur Bildung von TFPI-S- Sulfonat,
(2) Reinigung des TFPI-S-Sulfonats durch Anionenaustauschchromatographie,
(3) erneute Faltung des TFPI-S-Sulfonats durch Disulfid- Austauschreaktion und
(4) Reinigung von aktivem, erneut gefaltetem TFPI durch Kationenaustauschchromatographie.
Gemäß einer anderen Ausführungsform (B) der Erfindung werden die zuvorgenannten Einschlußkörper einem stufenweisen Reinigungsverfahren unterzogen, welches umfaßt:
(1) Reduktion der Einschlußkörper mit β-Mercaptoethanol in Harnstoff zur Bildung von reduziertem TFPI,
(2) Reinigung des reduzierten TFPI durch Kationenaustauschchromatographie,
(3) erneute Faltung des reduzierten TFPI durch Disulfid- Austauschreaktion in Harnstoff und
(4) Reinigung des aktiven, erneut gefalteten TFPI durch Kationenaustauschchromatographie.
Illustrative Ionenaustauschharze zur Verwendung bei den zuvor erwähnten Reinigungsverfahren sind herkömmliche, im Handel erhältliche Produkte, wie beispielsweise AG 501-X8 Mischbett- Ionenaustauscher von Bio Rad; MONO Q* HR 5/5; MONO S* HR 5/5; MONO S* HR 10/10 und HiLoad 10/16 Q Sepharose-Ionenaustauscher von Pharmacia. (* Die Ausdrücke stellen registrierte Marken dar.)
Die erneute Faltung von TFPI durch Reduktion/Re-Oxidation und durch Sulfonierung/Disulfid-Austausch der rohen, solubilisierten Einschlußkörper mittels Verfahren, wie im US-Patent 4 923 967 beschrieben, führten zu einer sehr geringen Aktivität. Unerwarteterweise führte die Reinigung von TFPI vor dem Schritt der erneuten Faltung durch Sulfonierung, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie gemäß Ausführungsform (A) des Verfahrens der Erfindung beim Test der Hemmung der Gewebefaktorinduzierten Gerinnungszeit zu einer doppelt so hohen spezifischen Aktivität, wie nachfolgend aus BEISPIEL 1 ersichtlich ist, als ein TFPI, der von einem hochreinen SK-Hepatom in ganzer Länge stammte. Dies deutet darauf hin, daß Kohlehydrate am TFPI für seine Aktivität nicht notwendig sind. Diese Vorteile des von E. coli stammenden TFPI sind überraschend, da es sich bisher gezeigt hatte, daß der von glykosyliertem SK-Hepatom stammende TFPI eine bedeutend höhere spezifische Aktivität hatte als TFPI, der von anderen Säugerzell-Quellen isoliert war, wie von Wun et al., J. Biol. Chem. 265, 16096-16101 (1990), berichtet.
Die Herstellung des TFPI in E. coli war weiter insoferne unerwartet, als der TFPI ein stark strukturiertes Protein mit einer Größe von etwa 32.000 Dalton ist, das 9 Disulfid-Brücken (18 Cys-Reste) hat. Es muß ein sehr komplexer Faltungsmechanismus durchgeführt werden. Wenn überhaupt, so gibt es in der Literatur nur wenige Beispiele für solche komplexe Proteine, die in E. coli mit endgültigen Produktionsausbeuten von mehr als 10 mg/Liter der Fermentationsnährlösungen hergestellt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Expressionsmengen von mehr als 100 mg/ml mit dem E. coli-Expressionssystem erreicht. Vergleichsweise wurde die Produktion eines anderen, stark strukturierten Proteins, Renin, von vergleichbarem Molekulargewicht in E. coli nicht erreicht.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß eine wesentlich stärkere Homogenität des TFPI-Produkts erhalten wird als mit dem von SK-Hepatom stammenden Material, welches eine beträchtliche Heterogenität aufweist. Die Protein-Heterogenität kann zu einer verstärkten Möglichkeit der Toxizität, Immunogenität und Nebenwirkungen führen. Komplexere und teurere Reinigungsverfahren sind notwendig, um eine Verringerung der Heterogenität zu versuchen. Analytische und Überwachungs- Methodiken sind weniger wirksam (z.B. Elektrospray-Massenspektralanalyse) und teurer, wenn eine Heterogenität vorliegt. Es wurde beobachtet, daß bei TFPI aus Expressionssystemen von Säugern, wie folgt, mehrere Klassen von Heterogenität auftreten, jedoch nicht bei E. coli-Expressionssystemen:

A. Phosphorylierung

Es wurde beobachtet, daß Expressionssysteme von Säugern Ser-2 von TFPI in unterschiedlichem Ausmaß phosphorylieren (ein typischer Phosphorylierungswert ist 25% des gesamten erzeugten TFPI). Die Phosphorylierung beeinträchtigt die Prothrombin- Gerinnungsaktivität nicht. Aus E. coli-Expressionssystemen erzeugter TFPI ist nicht phosphoryliert. Elektrospray-Massenspektralanalyse zeigt, daß SK Hep-TFPI eine Mischung aus phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Varianten ist.

B. Proteolytisch induzierte innere Schnittstellen

Es wurde routinemäßig beobachtet, daß aus CHO, C-127 und SK- Hep erzeugter TFPI Varianten mit inneren proteolytischen Schnittstellen an inneren Stellen, wie Arg-199 und Arg-83 enthält. Man nimmt an, daß diese Schnittstellen eine Folge der langen Zeitspannen ist, während welcher von Säugern erzeugter TFPI vor dem Ernten Medien-Proteasen ausgesetzt sein muß. Es wurde beobachtet, daß E. coli-TFPI nur eine geringere Menge innerer proteolytischer Schnittstellen enthielt. Man nimmt an, daß dies darauf zurückzuführen ist, daß TFPI innerhalb von E. coli zu unlöslichen, lichtbrechenden Körpern sequestriert wird und diese lichtbrechenden Kbrper vor der Zeit, zu welcher sie solubilisiert werden, von Zellproteasen freigewaschen werden.
C. Glykosylierung
Aus CHO, C-127 und SK-Hep hergestellter TFPI ist an vielen Stellen ausgiebig glykosyliert. Etwa 30% der Masse des von Säugern erzeugten TFPI stammen aus Kohlehydrat. Proteolytische Kartierung und Massenspektral-Daten haben gezeigt, daß an diesen Glykosylierungsstellen ein hoher Grad an Heterogenität vorliegt. Von E. coli hergestellter TFPI ist nicht glykosyliert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein N-terminaler Alanin-Rest in die TFPI-Sequenz eingebaut, um die Expression zu verbessern und eine vollständige Verarbeitung dessen in E. coli zu bewirken, was ansonsten ein N-terminaler Methionin-Rest wäre. Der Einfachheit der Nomenklatur halber wurde das Numerierungssystem der 276 Aminosäuresequenz des TFPI (LACI), wie zuvor von Wun et al., J. Biol. Chem. 263, 6001-6004 (1988); Girard et al., Thromb. Res. 55, 37-50 (1989); und im US- Patent 4 466 852 geoffenbart, hierin beibehalten, und der Nterminale Alanin-Rest wird mit -1 bezeichnet. So ist diese bevorzugte Ausführungsform des in E. coli erzeugten TFPI ein Protein mit 277 Aminosäure-Resten. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck TFPI sowohl das 276-Aminosäure-TFPI-Protein als auch das 277-Aminosäure-ala-TFPI-Protein umfassen.
Bevorzugte replizierbare Expressionsvektoren, in welche die für den TFPI codierende cDNA inseriert werden kann, sind jene, wie von beispielsweise Olins et al., Gene 73, 227-235 (1988) und Olins und Rangwala, J. Biol. Chem. 264, 16973-16976 (1989) beschriebenen, die auf pBR327 basierende Plasmide sind, die den recA-Promotor (PrecA) und die Ribosomen-Bindungsstelle enthalten, die vom Bakteriophagen T7-Phage-Gen-10-Leader (g10-L- RBS) stammen. Es ist bekannt, daß solche Vektoren für eine verbesserte Expression von Fremdgenen in E. coli geeignet sind. Illustrative Beispiele für solche Vektoren sind die in Fig. 11 bzw. Fig. 12 gezeigten Plasmide pMON5557 und pMON5766. Die cDNA für TFPI, wie beispielsweise von Wun et al. J. Biol. Chem. 263, 6001-6004 (1988); Girard et al., Thromb. Res. 55, 37-50 (1989); und Wun et al., U.S. Patent 4,966,852 beschrieben, kann in diese und andere derartige Vektoren zur Expression von Fremdgenen in E. coli mittels herkömmlicher rekombinanter DNA-Verfahren inseriert werden. Vgl, beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Das Plasmid pBR327 ist ein 3273 bp-Deletionsderivat des im Handel erhältlichen Plasmids pBR322, wie von Soberon et al., Gene 9, 287-305 (1980), beschrieben, und hat in GenBank die Nummer SYNP 327.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Obgleich die Beschreibung mit Patentansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die Erfindung bildend angesehen wird, herausstreichen und genau beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung aus der nachfolgenden, detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser verständlich ist, worin:
Fig. 1 in zwei Teilen, Fig. 1A und 1B, die Chromatographie sulfonierter Einschlußkörper auf einer Mono Q HR5/5 Anionenaustauschersäule zeigt. Die Einschlußkörper wurden solubilisiert und sulfoniert, wie nachfolgend in VERFAHREN in BEISPIEL I beschrieben ist. Zwei ml sulfonierte Probe (entsprechend 20 mg Naßgewicht der Einschlußkörper) wurden auf eine in Q-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 8,6 M Harnstoff, und 0,01% Brij 35 nichtionisches Detergens) vor-äquilibrierte Mono Q HR5/5-Säule, enthaltend 0,15 M NaCl, geladen. Die Säule wurde mit 15 ml des Aquilibrier-Puffers gewaschen und mit einem 30-ml-Gradienten (0,15-0,4 M NaCl) in Q-Puffer eluiert. Ein-Milliliter-Fraktionen wurden gesammelt. (A) Mono Q-Chromatogramm. Durchgehende Linie: Absorption bei 280 nm; strichlierte Linie: NaCl-Gradient. Die von einem dicken Balken (30-33) angezeigten Fraktionen, die den Großteil des TFPI-Proteins in ganzer Länge enthielten, wurden für die Tests der erneuten Faltung gepoolt. (B) SDS-PAGE. Zehn ul der angegebenen Fraktionen wurden zur Elektrophorese auf ein 10-20%-Gradienten-Gel geladen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Die mit MW markierte Bahn wurde mit Molekulargewicht- Standards beladen. Eine Vor-Säulen-Probe wurde auf die mit Premarkierte Bahn geladen.
Fig. 2 zeigt die Chromatographie sulfonierter Einschlußkörper auf einer Hiload Q Sepharose 16/10-Anionenaustauschersäule. Sulfonierte Einschlußkörper wurden wie nachstehend in VERFAHREN in BEISPIEL I beschrieben, hergestellt. Vierzig Milliliter sulfonierte Probe (entsprechend 0,56 g Naßgewicht der Einschlußkörper) wurden auf in Q-Puffer vor-äquilibrierte Hiload Q Sepharose 16/10, enthaltend 0,15 M NaCl, geladen. Die Säule wurde mit 240 ml des Äquilibrier-Puffers gewaschen und dann mit einem 396-ml-Gradienten (0,15-0,4 M NaCl) in Q-Puffer eluiert. Durchgehende Linie: Absorption bei 280 nm; strichlierte Linie: NaCl-Gradient. Die von einem dicken Balken (43-50) angezeigten Fraktionen wurden für eine erneute Faltung gepoolt. Nebenbild (Fig. 2A): SDS-PAGE. Zehn ul der angezeigten Fraktionen wurden auf ein 10-20%-Gradienten-Gel geladen. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit Coomassie-Blau gefärbt.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die den spezifischen Aktivitätsanstieg während Sulfitolyse/erneuter Faltung von E. coli-TFPI zeigt. Der Pool aus sulfoniertem TFPI in ganzer Länge von HiLoad Q Sepharose wurde mit 0,3 M NaCl enthaltendem Q- Puffer auf eine Absorption von A&sub2;&sub8;&sub0; nm=0,07 verdünnt. Festes L- Cystein wurde auf eine Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 h lang inkubiert, 1:1 mit Wasser verdünnt, 1 mM L-Cystein wurde zugesetzt und sie wurde bei Raumtemperatur weitere 24 h lang bei 4ºC bis zu 8 Tage lang inkubiert. Zur Messung der Aktivität wurde der Test für die Gewebefaktor-induzierte Koagulationszeit verwendet und mit jener einer Standard-Präparation von TFPI von SK-Hepatom in ganzer Länge verglichen. Die spezifische Aktivität wurde durch Vergleichen der Gerinnungszeit von Plasma, das mit einer 1:10- Verdünnung einer erneut gefalteten Mischung ergänzt war, mit einer Standard-Kurve, deren Konstruktion auf der Gerinnung von Plasma, das mit gereinigtem TFPI von SK-Hepatom ergänzt war, erhalten. Die Werte sind Durchschnittswerte von drei Präparationen, wobei die Standardabweichungen in Fehlerbreite angegeben sind.
Fig. 4 zeigt die Fraktionierung der erneut gefalteten Mischung durch Chromatographie auf Mono S HR5/5-Kationenaustauschersäule. Eine 7-tägige, erneut gefaltete Lösung wurde durch Zugabe von 10 mM Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon YM10-Membran 25-fach konzentriert. Zwei ml der konzentrierten Probe wurden auf eine mit S-Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 6,4, 6M Harnstoff) vor-äquilibrierte Mono S HR5/5-Säule geladen. Die Säule wurde mit 10 ml S-Puffer gewaschen und mit einem 70 ml- Gradienten, bestehend aus 0-0,7 M NaCl in S-Puffer, eluiert. Ein-Milliliter-Fraktionen wurden gesammelt. Durchgehende Linie: Absorption bei 280 nm; strichlierte Linie: NaCl-Gradient; gefüllter Kreis: spezifische Aktivität in bezug auf Fraktion 52. Spezifische Aktivitäten wurden unter Verwendung des Tests der Gewebefaktor-induzierten Koagulationszeit bestimmt, indem mit einer Standard-Kurve verglichen wurde, die durch Auftragen der Gerinnungszeit gegen die Konzentration der Fraktion 52 in Milli- Absorptionseinheit pro ml konstruiert wurde. Nebenbild (Fig. 4B): SDS-PAGE. Zehn ul der angegebenen Fraktionen wurden auf ein 10-20% Gradienten-Gel geladen. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit Coomassie-Blau gefärbt. MW ist die Bahn, die mit Molekulargewicht-Standards beladen ist. Die mit pre- bezeichnete Bahn ist die Vor-Säulen-Probe. Die Proben auf der linken Seite der Molekulargewichtsmarker waren nicht reduziert, und jene auf der rechten Seite waren in 3,3% 2-Mercaptoethanol enthaltendem Probenpuffer reduziert und vor der Elektrophorese 3 min lang gekocht.
Fig. 5 zeigt in drei Teilen, Fig. 5A, 5B und 5C, die Optimierung der Mono S HR5/5-Kationenaustauscher-Säulenchromatographie einer erneut gefalteten Mischung. Zwei ml einer erneut gefalteten Mischung wurden durch Zugabe von 10 mM Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und auf eine in Ausgangspuffer vor-äquilibrierte Mono S HR5/5-Säule geladen. Der Ausgangspuffer besteht für (A) und (B) aus S-Puffer, und jener für (C) besteht aus mit 0,3 M NaCl ergänztem S-Puffer. Die Säule wurde mit 10 ml Ausgangspuffer gewaschen, gefolgt von NaCl-Gradienten, wie in jeder Tafel angegeben. Durchgehende Linien: Absorption bei 280 nm; gefüllter Kreis: Leerwert. Die NaCl-Gradienten waren 20 mM/ml für (A) und 10 mM/ml für (B). Bei Tafel (C) wurde die Säule mit 10 ml 0,3 M NaCl in S-Puffern gewaschen, gefolgt von einem NaCl-Gradienten von 10 mM/ml.
Fig. 6 zeigt die Chromatographie einer erneut gefalteten Mischung auf eine Mono 5 HR10/16-Kationenaustauschersäule. Eine erneut gefaltete Mischung (1050 ml) wurde durch Zugabe von 10 mM Essigsäure auf pH 4,5 angesäuert und 75-fach durch Ultrafiltration unter Verwendung einer YM10-Membran konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine in S-Puffer, enthaltend 0,3 M NaCl, vor-äquilibrierte Mono 5 HR10/16-Säule geladen. Die Säule wurde mit 120 ml (15 Säulen-Volumina) des Aquilibrier-Puffers gewaschen und mit einem 0,3-0,5 M NaCl-Gradienten in S-Puffer eluiert. Durchgehende Linie: Absorption bei 280 nm; strichlierte Linie: Na-Cl-Gradient. Der dicke Balken zeigt die gepoolten Fraktionen (20-25) an, die den Großteil der TFPI-Aktivität enthalten. Nebenbild (Fig. 6B): SDS-PAGE. Bahn 1: Molekulargewicht-Standards; Bahn 2: Pool der Fraktionen 20-25 in nichtreduzierendem Puffer; Bahn 3: Pool der Fraktionen 20-25, in 3,3% 2-Mercaptoethanol enthaltendem Probenpuffer reduziert und vor der Elektrophorese 3 min lang gekocht.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Hemmung von bovinem Faktor Xa durch gereinigten TFPI von SK-Hepatom und erneut gefalteten TFPI von E. coli zeigt. TFPI von SK-Hepatom in ganzer Länge wurde durch Chromatographie von konditioniertem Zellmedium auf einer monoklonalen anti-TFPI-Ig-gekoppelten Sepharose 4B-Säule und einer Mono S-Säule mittels herkömmlicher Vorgangweisen isoliert. Vgl. beispielsweise Day et al., Blood 76, 1538-1545 (1990) und Wun et al., Thromb. Haemostas., In Press (1992), für herkömmliche Immunochromatographie auf monoklonalen anti-LACI-Ig-Sepharose 4B-Säulen. Die Hemmung von bovinem Faktor Xa wurde durch einen amidolytischen Test unter Verwendung von Spectrozyme Xa als Substrat gemessen. Die Konzentration des TFPI wurde durch Aminosäureanalyse und Absorptionsmessung bestimmt. Für die Berechnung der Molarität von TFPI wurden ein molarer Extinktions-Koeffizient, E&sub2;&sub8;&sub0; nm=2,90 · 10&sup4;, und Molekulargewichte von 38.000 und 32.000 für SK-TFPI bzw. E. coli-TFPI verwendet. Die vom Lieferanten (American Diagnostica) bestimmte Konzentration des bovinen Faktor Xa stimmt mit dem Wert überein, der durch Aktivstellen-Titration mit p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoat gemäß Wun et al., J. Biol. Chem. 265, 16096-16101 (1990) erhalten wurde. Leerer Kreis: E. coli-TFPI; gefüllter Kreis: SK-TFPI.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich der Hemmaktivitäten von TFPI von SK-Hepatom in ganzer Länge und erneut gefaltetem E. coli-TFPI bei der Hemmung der Gewebefaktorinduzierten Koagulation von Humanplasma zeigt. Der Test für die Gewebefaktor-induzierte Koagulationszeit wurde wie nachstehend in METHODEN in BEISPIEL I beschrieben durchgeführt. Die TFPIs wurden mittels Aminosäureanalyse und Absorptionsmessung bei 280 nm quantifiziert, wobei es sich zeigte, daß 1 mA (1 · 10&supmin;³ Absorptionseinheit) TFPI äquivalent mit 34,5 nM war. Leerer Kreis: E. coli-TFPI; gefüllter Kreis: SK-TFPI.
Fig. 9 zeigt die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese-(SDS-PAGE)-Analyse des TFPI, der durch die Ausführungsformen (A) und (B) des Verfahrens der Erfindung, wie hierin beschrieben, hergestellt worden ist. Die Hauptbande des TFPI war auf reduzierten und nativen Gelen identisch. Es zeigt sich, daß auf nativen Gelen der durch die Ausführungsform (A), BEISPIEL I erzeugte TFPI einen höheren Gehalt der dimeren Art aufweist, wogegen man sieht, daß der durch die Ausführungsform (B), BEISPIEL II erzeugte TFPI einen höheren Gehalt der niedrigmolekulargewichtigen (C-terminal fragmentierten) Art aufweist. Die Molekulargewichtsbahnen sind links (2 Säulen) und rechts (1 Säule) gezeigt, und die Molekulargewichtsstandards sind auf der rechten Seite in Fig. 9 in Kilodalton (kDa) angegeben.
Fig. 10 ist ein schematisches Schaubild der Sekundärstruktur und zeigt die Sulfhydryl-Bindung für die drei Kunitz-Domänen des Ala-TFPI mit 277 Aminosäure-Resten [SEQ ID N0.1]. Die Reste 1 bis 276 entsprechen der veröffentlichten Sequenz von TFPI (LACI), wie hierin zuvor beschrieben, und das N-terminale Alanin ist mit -1 bezeichnet.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung, die die Karte von Plasmid pMON5557 zeigt, welches ein Expressionsvektor mit 3857 bp ist, der für die Insertion der TFPI-cDNA geeignet ist. pMON5557 ist ein auf pBR327 basierendes Plasmid, welches den recA-Promotor (PrecA), ein Translations-Enhancer-Element und eine Ribosomen-Bindungsstelle, vom Gen 10-Leader des Bakteriophagen T7 (G10L) stammend, und den T7-Transkriptions-Terminator (T7 term) enthält.
Fig. 12 ist eine schematische Darstellung, die die Karte von Plasmid pMON5766 zeigt, welches ein Expressionsvektor mit 3652 bp ist, der für die Insertion der TFPI-cDNA geeignet ist. pMONS766 ist ein auf pBR327 basierendes Plasmid, das PrecA, G10L, einen Mehrfachklonierungsstellen-Linker, und den M13- Replikationsursprung (ori-M13) enthält.
Um spezielle bevorzugte Ausführungsformen genauer zu veranschaulichen, wurde die folgende beispielhafte präparative Laborarbeit durchgeführt, obwohl die Erfindung selbstverständlich nicht auf diese spezifischen Beispiele oder die darin beschriebenen spezifischen Details eingeschränkt ist. BEISPIEL I veranschaulicht die Ausführungsform (A), und BEISPIEL II veranschaulicht die Ausführungsform (B) der Erfindung.

BEISPIEL I

MATERIALIEN

Harnstoff (Sequenzierungs-Reinheit) und das nicht-ionische grenzflächenaktive Agens Brij 35 wurden von Pierce erhalten. Der Mischbettharz-AG501-XS-Ionenaustauscher wurde von BioRad gekauft. Die Mono Q HR 5/5- und HiLoad Q Sepharose-Anionenaustauscherharze und die Mono 5 HR 5/5- und Mono S HR 10/16- Kationenaustauscherharze wurden von Pharmacia erhalten. Das Thromboplastin-Reagens (Simplastin Excel®) stammte von Organon Teknika Corp. Boviner Faktor Xa und Spectrozyme Xa wurden von American Diagnostica, Inc., geliefert. Das SDS-PAGE 10-20% Gradienten-Gel wurde von Integrated Separation Systems erhalten.

METHODEN

Expressionsvektoren und Klonierstrategien

Eine Human-TFPI-cDNA in ganzer Länge [Wun et al., J. Biol. Chem. 263, 6001-6004 (1988)] wurde als 1,4 kb EcoRI-Fragment in einen M13mp18-Phagen-DNA-Kloniervektor kloniert. Stellengerichtete Mutagenese [Oligonucleotid-gerichtetes in vitro-Mutagenese- System, Version 2; Amersham] wurde verwendet, um eine NcoI- Stelle am initiierenden ATG einzuführen. Das TFPI-Gen wurde dann als ein NcoI/glattes MaeIII-Fragment in pMON5557 (Fig. 11) kloniert, wobei sich NcoI und glatte Hindill-Enden im neuen Vektor pMON9308 ergaben. Die MaeIII-Stelle befindet sich 15bp stromabwärts vom Stop-Codon in der TFPI-cDNA. Der Expressionsvektor enthielt den recA-Promotor, ein Translations-Enhancer- Element und eine Ribosomen-Bindungsstelle, vom Gen 10-Leader des Bakteriophagen T7 stammend, wie von Olins und Rangwala, J. Biol. Chem. 264, 16973-16976 (1989) beschrieben, und den T7-Transkriptions-Terminator. Das Plasmid pMON5557 enthält auch eine irrelevante Sequenz, d.h. das bST-Gen (bovines Somatotropin), welches durch das TFPI-Gen ersetzt wird, um das Plasmid pMON9308 zu bilden.
Das NcoI/NsiI-Fragment von pMON9308 wurde dann durch ein synthetisches DNA-Fragment ersetzt, welches entworfen wurde, um (1) ein für Alanin codierendes Codon an der zweiten Position einzuführen, (2) den A-T-Gehalt des 5'-Teils des Gens zu erhöhen und (3) die E. coli-Codon-Verwendung zu verbessern. Vier Oligonucleotide wurden verwendet, zwei für jeden Strang. Alle Basen- Substitutionen (einschließlich der obere Fall) waren stille Veränderungen. ECTFPI 2 und 3 waren 5'-phosphoryliert [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]. ECTFPI 1 und 2 und ECTFPI 3 und 4 wurden im Kinase-Puffer durch 5minütige Inkubation bei 70ºC und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur angelagert. Diese Fragmente wurden in pMON9308 kloniert, welches mit NcoI/NsiI verdaut worden war. PCR-Amplifikation wurde verwendet, um eine HindIII-Stelle sowie ein TAA-Terminations- Codon am 3'-Ende des TFPI-Gens einzuführen. Die PCR-Primer TFPIterm und TFPIterm 2 sind nachstehend gezeigt. Das TFPI-Gen wurde dann als ein NcoI/HindIII-Fragment in pMON5766 eingeführt (Fig. 12). Das resultierende Plasmid war pMON6870.
pMON6870 wurde mit BglII/HindIII verdaut. Dieses Fragment, das die Expressionskassette enthielt, wurde in pMON6710 kloniert [Obukowicz et al., Biochemistry 29, 9737-9745 (1990)], welches mit BglII/HindIII verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pMON6875, inkludiert den tac-Promotor, den G10-Leader aus dem Bakteriophagen T7, Met-Ala-TFPI und den p22-Transkriptions- Terminator. Die Plasmide wurden in MON105 (rpoD + rpoH358) transformiert, das F' aus JM101 für die Expression von TFPI- Protein enthielt.

Fermentation

Zehn Liter-Fermentationen wurden in M9 minimalen Salz- Medien, ergänzt mit 20 g/l Casaminosäuren in Biostad-E- Fermentern (B. Braun) laufen lassen. Die Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 37ºC, 1000 U/min Bewegung, einer Luftströmungsrate von 15 l/min und 10 psi Gegendruck laufen lassen. Der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,0 gesteuert. Die restliche Glykose-Konzentration in der Fermentationsnährlösung wurde automatisch auf 1,0+/-0,1 g/l gesteuert. Bei einer optischen Dichte von 46,0 bei 550 nm wurde die Temperatur von 37ºC auf 30ºC verschoben, und Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) wurde in den Fermenter auf eine Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben. Die Kultur wurde vier Stunden nach der Induktion durch Konzentration in einem Amicon DC10L-Konzentrator, gefolgt von Zentrifugieren in einer Beckman J2-21-Zentrifuge, geerntet. Die 10-Liter-Fermentation ergibt 335-456 g (Durchschnitt von 376+/-46 g, n=6) Naßgewicht an Zellpaste. Die Zellpaste wurde bei -80ºC für die nachstehende Weiterbearbeitung gefroren.

Isolierung von Einschlußkörpern

Gefrorene E. coli-Zellpaste wurde in kaltem Milli-Q-Wasser mit einer Konzentration von 75 g/l resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem Homogenisator (Ultra-Turrax-Modell SD-45) 30 min lang auf Eis gründlich dispergiert. Die Zellen wurden durch dreimaliges Durchleiten durch den Manton-Gaulin-Homogenisator (Modell 15M-8TA) bei 12.000 psi mechanisch lysiert. Einschlußkörper wurden in der Sorvall RC-2B-Zentrifuge im GSA-Rotor bei 10.000 U/min (16.270 · g) 20 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Einschlußkörper-Pellets wurden gesammelt, in 1 l kaltem Milli-Q-Wasser resuspendiert und mit dem Ultra-Turrax-Homogenisator 30 min lang auf Eis dispergiert. Die Einschlußkörper wurden noch zweimal auf Eis durch den Manton-Gaulin-Homogenisator zykliert. Einschlußkörper wurden in der Sorvall RC-2B-Zentrifuge wie zuvor pelletiert. Etwa 60 mg Einschlußkörper wurden für jedes Gramm lysierter E. coli-Zellen gesammelt. Die Einschlußkörper wurden bei -80ºC gelagert.

Pufferherstellung

Alle für die Sulfonierung und die erneute Faltung von E. coli-TFPI verwendeten Puffer enthielten hohe Konzentrationen an Harnstoff. Harnstofflösungen wurden vor dem Mischen mit Puffern mit Bio-Rad-Mischbettharz AG501-X8 bei Raumtemperatur mindestens 20 min lang behandelt und durch 0,2 um-Filter filtriert. Alle für die Chromatographie verwendeten Lösungen wurden durch 0,2 um-Filter filtriert und unter Haus-Vakuum etwa 10 min lang mit Schall behandelt.

Sulfonierung von Einschlußkörpern

Ein Gramm Einschlußkörper (Naßgewicht) wurde in 40 ml einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris/HCl, pH 8, und 7,5 M Harnstoff durch Homogenisierung und Schütteln am Vortex dispergiert. Nachdem die Einschlußkörper weitgehend aufgelöst waren, wurden 800 mg Natriumsulfit zugegeben, und die Mischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden 400 mg Natriumdithionit zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Die Lösung wurde gegen 400 ml einer Lösung enthaltend 20 mM Tris/HCL, pH 8, und 4 M Harnstoff mehr als 5 h lang bei 4ºC unter Verwendung einer Spectrapor #2 = Membran dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 1 h lang bei 48.400 · g zentrifugiert, durch einen 0,2 um-Filter filtriert, in Aliquots unterteilt und bei -80ºC gelagert.

Anionenaustausch-Chromatographie von sulfoniertem TFPI

Die sulfonierten und dialysierten Einschlußkörper wurden in kleinem Maßstab auf einer Mono Q HR5/5-Anionenaustauscher-Säule fraktioniert. Die Säule wurde in einem Q-Puffer (20 mM Tris/HCL, pH 8,6 M Harnstoff, 0,01% Brij 35 nichtionisches grenzflächenaktives Agens), der 0,15 M NaCl enthielt, voräquilibriert. Zwei ml sulfonierte Einschlußkörper wurden auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 15 ml Äquilibrier-Puffer gewaschen und mit einem 30 ml-Gradienten (0,15-0,4 M NaCl) in Q-Puffer eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt. In großem Maßstab wurden 40 ml sulfonierte Probe (äquivalent mit 0,56 g Naßgewicht-Einschlußkörpern) auf eine HiLoad Q Sepharose 16/10- Anionenaustauscher-Säule, die in 0,15 M NaCl enthaltendem Q- Puffer voräquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 240 ml Äquilibrier-Puffer gewaschen und dann mit einem 396 ml- Gradienten (0,15-0,4 M NaCl) in Q-Puffer eluiert. 9 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Beide Chromatographien wurden auf einem Pharmacia FPLC-System bei Raumtemperatur durchgeführt.

Erneute Faltung von sulfoniertem TFPI

Das Pool von sulfoniertem Gesamtlängen-TFPI in ganzer Länge aus der Anionenaustausch-Chromatographie wurde auf eine Absorption von 0,07 O.D.-Einheiten bei 280 nm mit 0,3 M NaCl enthaltendem Q-Puffer verdünnt. Festes L-Cystein wurde auf eine Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 h lang inkubiert, 1:1 mit Wasser verdünnt, 1 mM L-Cystein wurde zugegeben, bei Raumtemperatur weitere 24 h lang inkubiert und dann bei 4ºC bis zu 8 Tage lang inkubiert.

Mono-S-Chromatographie der erneut gefalteten Mischung

In Analyseläufen wurden 2 ml erneut gefaltete Mischung auf eine Mono S HR 5/5-Kationenaustauscher-Säule, die in S-Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 6,4, 6 M Harnstoff) voräquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 10 ml des Äquilibrier- Puffers gewaschen und mit einem 70 ml-Gradienten, bestehend aus 0-0,7 M NaCl in S-Puffer, eluiert. 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt. In präparativen Läufen wurde die erneut gefaltete Mischung auf pH 4,5 angesäuert, 75-fach konzentriert; auf eine Mono S HR10/16-Anionenaustauscher-Säule, die in 0,3 M NaCl enthaltendem S-Puffer voräquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 15 Säulen-Volumina des Äquilibrier-Puffers gewaschen und mit 0,3-0,5 M NaCl-Gradienten in S-Puffer eluiert.

Gewebefaktor-induzierter Gerinnuncrszeit-Test

Der herkömmliche Gerinnungszeit-Test wurde unter Verwendung eines Fibrometer (Becton Dickinson)-Clot-Zeitgebers durchgeführt. 90 ul gepooltes Humanplasma wurden mit 10 ul TFPI-Probe oder Kontroll-Puffer in der Vertiefung bei 37ºC 1 min lang gemischt, und 0,2 ml Gewebefaktor (Simplastin Excel, 1:60 verdünnt in einer Lösung, die 75 mM NaCl, 12,5 mM CaCh und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt) wurden zugegeben, um die Gerinnungsreaktion zu initiieren.

Amidolytischer Test der Faktor Xa-Hemmaktivität

Die Hemmaktivität gegenüber bovinem Faktor Xa von TFPI- Proben wurde mittels herkömmlicher Amidolyse von Spectrozyme Xa, wie zuvor von Wun et al., J. Biol. Chem. 265, 16096-16101 (1990) beschrieben, getestet, außer daß der Testpuffer aus 0,1 M Tris/HCl, pH 8,4 und 0,1% Triton X-100 nicht-ionischem grenzflächenaktiven Agens bestand.

Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentration wurde durch Absorption bei 280 nm und durch quantitative Aminosäureanalyse nach HCl/Dampfphasenhydrolyse bei 110ºC 24 h lang bestimmt.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS- PAGE

Für die SDS-PAGE wurden Dalichi-10-20% Gradienten-Fertig- Gele verwendet. Die Proben werden entweder nicht reduziert und nicht gekocht oder in 3,3% 2-Mercaptoethanol reduziert und 3 min lang vor der Elektrophorese gekocht. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt.

ERGEBNISSE

Expression von TFPI in E. coli

Drei Vektoren wurden konstruiert und für die Expression von TFPI in E. coli verwendet. Das erste Konstrukt, pMON9308, welches die ursprüngliche Human-TFPI-cDNA-Sequenz (außer dem initiierenden ATG) und den recA-Promotor enthielt, erreichte eine sehr geringe Expressionsmenge (< 0,5% des gesamten Zellproteins). Das zweite Konstrukt, pMON6870, welches dem ersten ähnlich war, aber durch Einführen eines Alanins an der zweiten Position, durch Erhöhen des A-T-Reichtums des 5'-Endes und durch Verbesserung der E. coli-Codon-Verwendung verändert war, erhöhte die Expressionsmenge nicht wesentlich. Das dritte Konstrukt, pMON6875, welches dem zweiten ähnlich war, doch einen tac-Promotor verwendete, erreichte eine Expressionsmenge von etwa 5-10% des gesamten Zellproteins und wurde hierin für weitere Tests verwendet. Der Großteil des TFPI (> 90%) schien in Einschlußkörpern in durch Disulfid-Brücken verbundener Polymer-Form sequestriert zu sein, da ein 32 kDa TFPI-Protein mittels SDS- PAGE und Western Blotten nur nach Reduktion nachgewiesen werden kann.

Sulfonieren des Einschlußkörpers und Reinigung von sulfoniertem TFPI in ganzer Länge

Bei anfänglichen Tests zeigte sich, daß E. coli-Lysate oder die isolierten Einschlußkörper sehr wenig TFPI-Aktivität enthielten, wie mittels anti-Faktor Xa und mittels Gewebefaktorinduzierten Gerinnungszeit-Tests gemessen. Erneutes Falten des TFPI durch Reduktion/Reoxidation und durch Sulfonierung/Disulfid-Austausch der rohen, solubilisierten Einschlußkörper führte zu einer sehr geringen Gewinnung von Aktivität. Daher versuchte man, den TFPI vor dem Schritt der erneuten Faltung, durch Sulfonierung gefolgt von Anionenaustausch-Chromatographie zu reinigen, wobei man sich die 18 hinzugefügten negativ geladenen Gruppen am sulfonierten TFPI zunutze machte. Die sulfonierten Einschlußkörper wurden zuerst auf einer analytischen Mono Q HR5/5-Anionenaustauschersäule fraktioniert, wie in Fig. 1 gezeigt. Der Durchfluß und die frühen Gradienten-Fraktionen enthielten viel der Verunreinigungen E. coli-Protein und fragmentiertes TFPI-Protein (letztere sind von niedrigerem Molekulargewicht und gegen anti-TFPI-Ig immunreaktiv). Das TFPI- S-Sulfonat in ganzer Länge eluierte bei etwa 0,28 M NaCl. Die Fraktionierung sulfonierter Einschlußkörper wurde maßstäblich um den Faktor 20 vergrößert, wobei ein Hiload Q Sepharose 16/10- Anionenaustauscher verwendet wurde, wie in Fig. 2 gezeigt. Das Chromatogramm schien etwas anders zu sein als das von Mono Q, doch schien die Fraktionierung des TFPI-S-Sulfonats in ganzer Länge vergleichbar zu sein, wie gemäß SDS-PAGE (Fig. 1(B) und Fig. 2, Insert) beurteilt.

Erneute Faltung des TFPI-S-Sulfonats

Sulfonierter TFPI machte nach dem Mischen mit einer geeigneten Konzentration von L-Cystein eine spontane erneute Faltung und Oxidation durch. Die Effizienz der erneuten Faltung, wie sie durch den Anstieg der TFPI-Aktivität widergespiegelt ist, variiert je nach den Bedingungen der erneuten Faltung stark. Zahlreiche Bedingungen der erneuten Faltung wurden hinsichtlich Temperatur, pH-Wert, Harnstoff, L-Cystein und Protein-Konzentration verglichen und optimiert. Ein 2stufiges Verfahren zur erneuten Faltung schien am besten zu sein. In der ersten Stufe wurde das Pool des TFPI-S-Sulfonats von ganzer Länge auf eine Absorption bei 280 nm von 0,07 O.D. Einheiten eingestellt, 2 mM frisches L-Cystein wurden zugegeben, und die Mischung wurde 24 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit stieg die TFPI-Aktivität von 0 auf etwa 12% des SK-Hepatom-TFPI in ganzer Länge an, der zum Vergleich als Standard diente. In der zweiten Stufe wurde die Lösung 1:1 mit Wasser verdünnt, und frisches L-Cystein wurde auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 h lang inkubiert, während welcher Zeit die spezifische Aktivität 2,6fach auf 31% jener von SK TFPI anstieg. Die Lösung wurde dann bei 4ºC mehrere Tage lang belassen, während welcher Zeit die TFPI-Aktivität auf etwa 60% jener von SK TFPI in den ersten 24 h anstieg, gefolgt von einem langsamen Anstieg auf etwa 68% des SK TFPI (Fig. 3).

Fraktionierung der erneut gefalteten Mischung durch Mono S- Chromatographie

Die spezifische Aktivität der erneut gefalteten Mischung war geringer als die von gereinigtem Säuger-SK-TFPT, was andeutet, daß erstere sowohl korrekt gefaltete als auch falsch gefaltete Moleküle oder nur teilweise aktive, falsch gefaltete Moleküle enthalten könnte. Die erneut gefaltete Mischung wurde auf einer analytischen Mono S-Kationenaustauscher-Säule fraktioniert, wie in Fig. 4 gezeigt. Bei Analyse der UV-absorbierenden Fraktionen auf TFPI-Aktivität wurde die höchste spezifische Aktivität einem spitzen Peak (Fraktion 52) zugeordnet, eluiert bei 0,52 M NaCl.
Alle anderen Fraktionen hatten eine spezifische Aktivität von weniger als 30% jener der Fraktion 52. Die SDS-PAGE-Analyse (Fig. 4, Insert) zeigte, daß die Fraktion 52 eine scharfe Bande enthielt und alle anderen Fraktionen, zusammen mit der erneut gefalteten Mischung vor der Säulenchromatographie, aus diffusen mehrfachen Banden unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestanden. Die diffusen Banden sind offenbar hauptsächlich TFPI in ganzer Länge in verschieden gefalteten Formen, da sie nach Reduktion zu einer scharfen Bande führen (vgl. die beiden letzten Bahnen auf der rechten Seite). Fig. 5 zeigt die Optimierung der Mono S-Chromatographie in analytischem Maßstab. Durch Abflachen des Gradienten wurde die Auflösung der Peaks besser, und alle Protein-Peaks schienen bei niedrigeren NaCl-Konzentrationen zu eluieren [Fig. 5 (A) und (B)]. Weiters war es möglich, den Großteil der Peaks geringer Aktivität mit 10 Säulen-Volumina von 0,3 M NaCl herauszuwaschen, bevor der aktive Peak mit einem flachen Gradienten eluiert wurde.
Aufgrund der obigen Ergebnisse wurde die Chromatographie unter Verwendung einer Mono S HR10/16-Kationenaustauscher-Säule maßstäblich vergrößert, wie in Fig. 6 gezeigt. Die Säule wurde mit 15 Säulen-Volumina von 0,3 M NaCl gewaschen, wodurch im wesentlichen alle Peaks geringer Aktivität herausgewaschen wurden. Danach eluierte ein flacher Gradient einen Protein-Peak, der den aktiven TFPI enthielt. Die SDS-PAGE-Analyse (Fig. 6, Insert) zeigt, daß der Peak unter entweder reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen eine deutliche Bande ergab. Das reduzierte und gekochte Protein wanderte in SDS-PAGE etwas langsamer.

Stöchiometrie der Wechselwirkung von erneut gefaltetem TFPI mit Faktor Xa

Die Hemmung von bovinem Faktor Xa durch den aktiven, erneut gefalteten E. coli-TFPI wurde durch Messung der restlichen amidolytischen Aktivität unter Verwendung von Spectrozyme Xa untersucht. Wie in Fig. 7 gezeigt, war das Molverhältnis von TFPI zu bovinem Faktor Xa, das zur vollständigen Hemmung des letzteren führte, 1:1 (leerer Kreis). Zum Vergleich war die Stöchiometrie der Wechselwirkung von SK TFPI mit bovinem Faktor Xa ebenfalls 1:1 (gefüllter Kreis).

Hemmung der Gewebefaktor-induzierten Gerinnung

Die Fähigkeit des aktiven, erneut gefalteten E. coli-TFPI zur Hemmung der Gewebefaktor-induzierten Gerinnung in Humanplasma wurde mit jener des gereinigten SK TFPI verglichen. Wie in Fig. 8 gezeigt, war die Aktivität des E. coli-TFPI etwa um das zweifache höher als SK-TFPI pro Mol, wie aus den Konzentrationen jedes TFPI, die dieselbe Verlängerung der Gerinnungszeit erzeugen, beurteilt. Tabelle 1: Zusammenfassung der erneuten Faltung und Reinigung von aktivem E. coli-TFPI
a Spezifische Aktivität wurde mittels Gewebefaktor-induziertem Gerinnungszeit-Test, wie in METHODEN beschrieben, bestimmt. Eine SK-Einheit ist definiert als die Menge an Aktivität, die jener äquivalent ist, die von 1 mA (1·10&supmin;³ Absorptionseinheit bei 280 nm oder 1,31 ug) von gereinigtem SK-Hepatom-TFPI in ganzer Länge erzeugt wird.

BEISPIEL II

Einschlußkörper, wie in obigem BEISPIEL I hergestellt, wurden den folgenden alternativen Reinigungsverfahren unterzogen:
Kationenaustauscherchromatographie vor der erneuten Faltung:
Gewaschene Einschlußkörper-Pellets wurden in 8 M Harnstoff, 0,05 M NaHPO&sub4;, 5% B-Mercaptoethanol (BME), pH 8,5 (60 ml Puffer für je 1 l Nährlösungs-Äquivalent von Einschlußkörpern) suspendiert. Die Lösung wurde 1 h lang bei 6-8ºC unter Verwendung eines Adams Nutator-Schütteltisches (Baxter/Scientific Products) sanft bewegt und 2 h lang bei 37.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde 10fach mit 6 M Harnstoff, 0,05 M NaHPO&sub4;, 5% BME, pH 7,0 (Äquilibrier-Puffer) verdünnt und durch 0,22 um Durapore- PVDF-Filtermedien (Polyvinyliden-Difluorid-Mikrofiltrationsmembranfilter von Millipore) filtriert. Die geklärte Lösung wurde auf eine Säule von SP-650-S-Kationenaustauscher-Gel-Harz (Toyopearl von TosoHaas, Tosoh Corp. und Rohm and Haas Co.), äquilibriert mit mindestens 15 Säulen-Volumina Äquilibrier- Puffer, geladen. Für Arbeiten in kleinem Maßstab wurde eine 4,4 · 16 cm-Säule mit dem Äquivalent von 5 l Nährlösung beladen. Für Arbeiten in großem Maßstab wurde eine 9,0 · 18 cm-Säule mit dem Äquivalent von 15-20 l Nährlösung beladen. Nach dem Beladen mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 10-15 cm/h wurde die Säule mit 10 Säulen-Volumina Äquilibrier-Puffer gewaschen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,14 M NaCl in Äquilibrier-Puffer mit einer Rate von 1 mM NaCl/Minute eluiert. Die NaCl-Konzentration wurde für 2 Säulen-Volumina auf 0,14 M gehalten, während der Haupt-Peak eluierte. 25-ml- Fraktionen wurden gesammelt und mittels RP-HPLC und SDS-PAGE vor dem Poolen auf den TFPI-Gehalt analysiert. Annehmbare Fraktionen wurden unter Verwendung gerührter Zellen (Amicon) auf 20 mg/ml konzentriert und in 6 M Harnstoff, 50 mM NaOAc, 0,5 M NaCl, pH 4,5 unter Verwendung von Bio-Rad P6DG-Entsalzungsgel einem Puffer-Austausch unterzogen. Diese Fraktionen wurden dann bei -40ºC gelagert, bis sie gebraucht wurden.

Erneute Faltung von TFPI:

Die obigen gefrorenen Fraktionen wurden aufgetaut, und die Protein-Konzentration wurde in einem Puffer bestehend aus 6 M Harnstoff, 0,05 M NaOAc, 0,5 M NaCl, 0,05 M NaPO&sub4;, pH 10,5, auf 0,3 mg/ml Protein eingestellt. L-Cystein (Sigma) wurde zum Erhalt einer Konzentration von 0,1 mM zugegeben, wobei frisch zubereitetes 0,1 M L-Cystein in 6 M Harnstoff, 50 mM NaOAc, 0,5 M NaCl, pH 4,5, verwendet wurde. Nach 10minütigem Mischen wurde die Lösung ohne Rühren bei 10-15ºC 48-72 h lang inkubiert. Die Reaktion wurde im Hinblick auf Prothrombin-Zeit(PT)-Aktivität überwacht, und sobald die PT-Aktivität ein Plateau erreicht hatte, wurde die erneute Faltung durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 mit 2,5 N HCl und Frieren bei -40ºC beendet.

Reinigung von aktivem TFPI aus roher, erneut gefalteter Mischung:

Rohe, erneut gefaltete Mischung wurde in gerührten Zellen unter Verwendung von Amicon YM10-Membranen auf 5 mg/ml konzentriert, und danach in 6M Harnstoff, 0,05 M NaOAc, pH 4,5, unter Verwendung eines Bio-Rad-P6DG-Harzes einem Pufferaustausch unterzogen. Für Chromatographie in kleinem Maßstab wurden 35 mg Protein auf eine Pharmacia MONO-S HR10/10-Säule, mit 2M Harnstoff, 50 mM NaOAc, pH 6,0, äquilibriert, geladen. Für die Präparation in größerem Maßstab wurden 500 mg Protein auf eine Pharmacia HiLoad 26/10 S-Sepharose, im selben Puffer äquilibriert, geladen. Die Elution erfolgte durch rasches Erhöhen der NaCl-Konzentration auf 460 nM (33 mM/min) und 10 Säulen-Volumina lang gehalten, während der Haupt-Peak eluierte. Die Sammlung von Fraktionen wurde am Anfang des isokratischen Schrittes begonnen, wobei die Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität an der hinteren Seite des Hauptprotein-Peaks eluierten.
Die Fraktionen wurden aufgrund spezifischer Aktivität gepoolt und mit vier Volumina 6 M Harnstoff, 20 mM NaOAc, pH 6,0, verdünnt, bevor sie auf eine Pharmacia MONO-S HRlO/10- Säule, äquilibriert mit demselben Puffer, aufgetragen wurden. Die Elution bestand aus demselben, NaCl-enthaltenden Puffer, wobei ein linearer Gradient von 0-600 mM NaCl mit einer Rate von 3,6 mM/min verwendet wurde. Fraktionen von 2,5 ml wurden gesammelt und aufgrund PT-spezifischer Aktivität und SDS-PAGE gepoolt. Erneute Bearbeitung der Fraktionen unter Verwendung derselben MONO-S-Chromatographie in 6 M Harnstoff führte zur Gewinnung von zusätzlichem Protein mit hochspezifischer Aktivität.
Die durch die Ausführungsformen (A) und (B) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in den BEISPIELEN I und II erzeugten TFPI-Produkte wurden mittels mehrerer Verfahren mit folgenden Ergebnissen weiter untersucht:

1. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Analyse

Die primäre Bande des TFPI aus beiden Verfahren war auf reduzierten und nativen Gelen identisch. Auf nativen Gelen hatte jedoch der TFPI aus dem Verfahren von BEISPIEL I einen höheren Gehalt der dimeren Art, wogegen der gemäß dem Verfahren von BEISPIEL II erzeugte TFPI einen höheren Gehalt der niedrigmolekulargewichtigen (C-terminal fragmentierten) Art hatte. Vgl. Fig. 9.

2. Revers-Phasen-Analyse

Eine Revers-Phasen-Analyse des mittels des Verfahrens von BEISPIEL I erzeugten TFPI zeigte einen einzigen spitzen Peak (was eine hohe Reinheit andeutet), wogegen der mittels des Verfahrens von BEISPIEL II erzeugte TFPI einen primären und einen sekundären Peak zeigte (was einen bedeutenden Grad an Heterogenität andeutet). Aus dem SK-Hep-Säugersystem erzeugter TFPI zeigte einen breiten primären Peak und mehrere sekundäre Peaks (was einen bedeutenden Grad an Heterogenität andeutet).

3. Kationenaustausch-Analyse

Eine Kationenaustausch-Analyse zeigte keine Unterschiede zwischen den TFPI, die nach den Verfahren von BEISPIEL I und II hergestellt waren. In beiden Fällen wurde ein einziger symmetrischer Peak erzeugt. Roher SK Hep-TFPI, der auf dieselbe Weise charakterisiert wurde, ergab jedoch einen primären und einen sekundären Peak, was eine Heterogenität andeutet.

4. Elektrospray-Massenspektralanalyse

Eine Elektrospray-Analyse von TFPI deutete darauf hin, daß die Masse der primären Komponente des TFPI, die von beiden Verfahren hergestellt wurde, die gleiche war. Das gemäß dem Verfahren von BEISPIEL II erzeugte Material enthielt bis zu 30% der heterogenen Art, wogegen das gemäß dem Verfahren von BEISPIEL I erzeugte Material im wesentlichen homogen zu sein schien (> 95%). Eine Elektrospray-Analyse von SK Hep-TFPI kann wegen des hohen Ausmaßes der Heterogenität der Kohlehydratketten nicht durchgeführt werden.

BEISPIEL III

Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion eines alternativen Expressionsvektors, der die für TFPI codierende cDNA enthält, nämlich das Plasmid pMON6890. pMON6890 enthält einen hybriden Promotor, der aus einem veränderten recA-Promotor in Verbindung mit dem lac-Operator besteht. Die folgende Sequenz wurde zusammengesetzt, um die -35-Region des recA-Promotors zu optimieren und eine lexA (Repressor)-Bindung zu eliminieren.
Der Basenaustausch, der in der -35-Region von PrecA angedeutet ist, machte es mit der -35-Konsensus-Sequenz identisch. Es zeigte sich, daß die in der lex-Box (Stelle, an welcher der lexA-Repressor bindet) angedeutete Basen-Substitution in einer konstitutiven recA-Expression resultierte. Die Zugabe der lac- Operator-Sequenz stellte den recA-Promotor unter die Steuerung des lac-Repressors. Diese Sequenz wurde als ein BamHl/XbaI- Fragment in pMON6870 kloniert (wie in obigem BEISPIEL I beschrieben), welches mit BamHl/XbaI verdaut worden war. Der TFPI- Expressionsvektor 6890 ist ein auf pBR327 basierendes Plasmid, das den reclac-Promotor, den Bakteriophagen-T7-Gen-10-Leader und den M13-Replikationsursprung enthält.
Für den Fachmann werden nach Lesen der vorliegenden Offenbarung verschiedene andere Beispiele offensichtlich sein, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzugehen. Alle derartigen anderen Beispiele sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sein.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors des Gewebefaktor-Reaktionsweges
(ii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 9
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 277 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA;
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.2:
CATGGCTGAT TCTGAAGAAG ATGAAGAACA TACTA 35
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.3:
AGTGATAATA GTATGTTCTT CATCTTCTTC AGAATCAGC 39
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.4:
TTATCACTGA TACTGAACTG CCACCGCTGA AACTGATGCA 40
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.5:
TCAGTTTCAG CGGTGGCAGT TCAGTATC 28
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.6:
ATAACAAAGC TTACATATTT T 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.7:
ATATATCCAT GGCTGATTCT 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 64 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.8:
GGATCCGCGG CAACAATTTC TACAAAACAC TTGACACTGT ATGAGCATGC AGTATAATTG 60
CTTC 64
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID N0.9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0.9:
AATTGTGAGC GGATAACAAT T 21

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer nicht-glykosylierten Form eines Inhibitors des Gewebefaktor-Reaktionsweges (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), welches die Züchtung von E. coli- Wirtszellen, die mit einem replizierbaren Expreesionsvektor transformiert worden sind, der die für diesen TFPI codierende cDNA enthält, unter Fermentationsbedingungen, die zur Herstellung dieses TFPI ausreichen, das Ernten der E. coli-Zellen, das Isolieren der Einschlußkörper aus den geernteten E. coli- Zellen und die Durchführung einer stufenweisen Reinigung der Einschlußkörper umfaßt, welche Reinigung entweder die Reihenfolge (A) oder die Reihenfolge (B), wie folgt, umfaßt

(A)

(1) Sulfitolyse der Einschlußkörper zur Bildung von TFPI-S- Sulfonat,

(2) Reinigung des TFPI-S-Sulfonats durch Anionenaustauschchromatographie,

(3) erneute Faltung des TFPI-S-Sulfonats durch Disulfid- Austauschreaktion und

(4) Reinigung von aktivem, erneut gefaltetem TFPI durch Kationenaustauschchromatographie, oder

(B)

(1) Reduktion der Einschlußkörper mit β-Mercaptoethanol in Harnstoff zur Bildung von reduziertem TFPI,

(2) Reinigung des reduzierten TFPI durch Kationenaustauschchromatographie,

(3) erneute Faltung des reduzierten TFPI durch Disulfid- Austauschreaktion in Harnstoff und

(4) Reinigung des aktiven, erneut gefalteten TFPI durch Kationenaustauschchromatographie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sulfitolyse durch Umsetzung der Einschlußkörper mit Natriumsulfit und Natriumdithionit durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anionenaustauschchromatographie durch Chromatographie des TFPI-S-Sulfonats auf einer Säule mit quaternärem Amin-Anionenaustauschharz durch geführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1; wobei die erneute Faltung des TFPI-S-Sulfonats durch Umsetzung des TFPI-S-Sulfonats mit L- Cystein durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kationenaustauschchromatographie durch Chromatographie des erneut gefalteten TFPI auf einer Säule eines Kationenaustauschharzes mit Sulfonsäuregruppen durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sulfitolyse durch Umsetzung der Einschlußkörper mit Natriumsulfit und Natriumdithionit durchgeführt wird, die Anionenaustauschchromatographie durch Chromatographie des TFPI-S-Sulfonats auf einer Säule mit quaternärem Amin-Anionenaustauschharz durchgeführt wird, die erneute Faltung durch Umsetzung des TFPI-S-Sulfonats mit L- Cystein durchgeführt wird, und die Anionenaustauschchromatographie durch Chromatographie des erneut gefalteten TFPI auf einer Säule eines Kationenaustauschharzes mit Sulfonsäuregruppen durchgeführt wird.

7. Verfahren zur Herstellung einer nicht-glykosylierten Form eines Inhibitors des Gewebefaktor-Reaktionsweges, welches die Züchtung von E. coli-Wirtszellen, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor transformiert worden sind, der die für diesen TFPI codierende cDNA enthält, unter Fermentationsbedingungen, die zur Herstellung dieses TFPI ausreichen, das Ernten der E. coli-Zellen, das Isolieren der Einschlußkörper aus den geernteten E. coli-Zellen und die Durchführung einer stufenweisen Reinigung der Einschlußkörper umfaßt, welche Reinigung die Reihenfolge (B), wie folgt, umfaßt:

(B)

(2) Reinigung des reduzierten TFPI durch Kationenaustauschchromatographie,

(3) erneute Faltung des reduzierten TFPI durch Disulfid-Austauschreaktion in Harnstoff und