PT1941867E - Polipeptídeo contendo um domínio kunitz modificado - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

POLIPEPTÍDEO CONTENDO UM DOMÍNIO KUNITZ MODIFICADO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As proteases estão envolvidas numa ampla variedade de vias biológicas. Em particular as protéases de serina, como calicreina, plasmina, elastase, ativador de plasminogénio uroquinase, trombina, inibidores de coagulação humana associada à lipoproteína, e fatores de coagulação como os fatores Vila, IXa, Xa, XI, Xlla têm sido implicados em vias que afetam o fluxo sanguíneo, por exemplo, isquemia geral e focal, invasão tumoral, ibrinólise, perda de sangue peri-operatório e inflamação. Inibidores de proteases de serina específicos têm, portanto, recebido atenção como alvos potenciais dos fármacos para diversas doenças isquémicas.

Um tal inibidor, a aprotinina (também chamado de inibidor de tripsina pancreática bovina ou BPTI), obtido a partir do pulmão bovino, foi aprovado nos Estados Unidos para uso profilático na redução da perda de sangue peri-operatório e a necessidade de transfusão em pacientes submetidos à circulação extracorpórea (CPB), por exemplo, no curso de uma cirurgia de revascularização miocárdica. A aprotinina está disponível comercialmente sob o nome comercial de TRASYLOL® (Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut) e foi previamente aprovada para uso no tratamento da pancreatite. A eficácia da aprotinina está associada às suas capacidades relativamente não específicas para inibir uma variedade de proteases de serina, incluindo calicreina plasmática e plasmina. Essas proteases são importantes num número de vias do sistema de ativação de contato (CAS). 1 A CAS é inicialmente ativada quando o sangue total contata a superfície de substratos externos (por exemplo, caulino, vidro, sulfato de dextrano ou superfícies ósseas danificadas) . A calicreína, uma protease serina, é uma enzima do plasma que inicia a cascata da CAS levando à ativação dos neutrófilos, plasmina, coagulação, e diversas cininas. A calicreína é segregada como uma proenzima (pré-calicreína) que circula como uma molécula inativa até ser ativada por um evento proteolítico no início da cascata de CAS. Claramente, a inibição específica da calicreína seria uma abordagem muito atraente para controlar a perda de sangue associada à CPB e o início da resposta inflamatória sistémica (SIR), como seria encontrado durante, por exemplo, vários procedimentos cirúrgicos invasivos.

Apesar de ser o único composto licenciado para a prevenção da perda sanguínea peri-operatória na CPB para revascularização do miocárdio (CABG), a aprotinina não é tão amplamente utilizada como seria de esperar. Existem preocupações sérias quanto ao uso deste polipeptídeo bovino em pacientes que necessitam de CPB, e em particular o uso deste composto dos procedimentos de CABG. A aprotinina não é específica para a calicreína, mas interage com enzimas adicionais (por exemplo, plasmina) em múltiplas vias. Assim, o mecanismo de ação da aprotinina é em grande parte especulativo, e a falta de compreensão precisa do que é afetado durante o tratamento com a aprotinina produz o risco de complicações durante o tratamento. Uma complicação frequentemente citada é a trombose descontrolada, devido às ações da aprotinina sobre a via f ibrinolítica. Há uma preocupação não só sobre tais eventos hiperagudos como a trombose dos vasos maiores no período peri-operatório, mas 2 também sobre a patência do enxerto após o procedimento de CABG. Além disso, como uma proteína natural obtida a partir do pulmão bovino, a administração de aprotinina em seres humanos pode provocar reações graves de hipersensibilidade ou anafiláticas ou anafilactóides após o primeiro e, mais frequentemente, após a administração repetida aos pacientes. Isto é particularmente preocupante num grande número de pacientes que têm de repetir os procedimentos de CABG. Além disso, há uma crescente preocupação do público a respeito do uso de material derivado de fontes bovinas como um vetor potencial para a transmissão da encefalopatia espongiforme bovina aos seres humanos.

Estas preocupações deixam claro que continua a ser uma necessidade a existência de meios mais eficazes e mais específicos e métodos para prevenir ou reduzir a perda de sangue peri-operatório e o início da SIR num paciente submetido à cirurgia, resultando em ativação do CAS, tais como procedimentos CABG em pacientes de CPB, ou substituição da anca.

RESUMO DA INVENÇÃO

Esta descrição, incluindo a invenção, é baseada na descoberta de peptídeos que inibem as proteases de serina. As proteases de serina tais como, por exemplo, a calicreína, estão envolvidas em, por exemplo, vias que levam à perda excessiva de sangue peri-operatório e o início da resposta inflamatória sistémica. Inibidores do peptídeo da calicreína preferidos incluem aqueles descritos nas Patente US 6333402 e 6057287 de Markland et al. A presente descrição é dirigida, em parte, ao uso dos 3 peptideos em métodos terapêuticos e composições adequadas para o uso na ewliminação e redução de isquemias variadas, incluindo, mas não limitado a, perda de sangue peri-operatório, e o inicio da resposta inflamatória sistémica. A perda de sangue peri-operatório resulta de procedimentos cirúrgicos invasivos que levam ao contato com a ativação de componentes do complemento e os sistemas de coagulação/fibrinólise. Mais especificamente, a presente descrição fornece métodos de utilização de inibidores da calicreina para reduzir ou evitar a perda de sangue peri-operatório e uma resposta inflamatória sistémica em pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos invasivos, especialmente cirurgias cardiotorácicas.

Numa modalidade, a presente descrição é direcionada para um método para prevenir ou reduzir a isquemia num paciente compreendendo administração ao paciente de uma composição que compreende um polipeptideo que compreende a sequência de aminoácidos: Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 XaalO Xaall Gly Xaal3 Cys Xaal5 Xaal6 Xaal7 Xaal8 Xaal9 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID N°: 1), em que Xaal, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 Xaa58 são cada um aminoácido ou ausente; XaalO é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Asp e Glu; Xaall é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em: Asp, Gly, Ser, Vai, Asn, Ile, Ala e Thr; Xaal3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys e Gin; Xaal5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn e Gin; Xaal6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: 4

Ala, Gly, Ser, Asp e Asn; Xaal7 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Ala, Asn, Ser, lie, Gly, Vai, Gin e Thr; Xaal8 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: His, Leu, Gin e Ala; Xaal9 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Pro, Gin, Leu, Asn e Ile; Xaa21 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Trp, Phe, Tyr, His e Ile; Xaa22 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr e Phe; Xaa23 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr e Phe; Xaa31 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Ala, Vai, Leu, Ile e Thr; Xaa32 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Glu, Gin, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly e Vai; Xaa34 é um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de: Thr, Ile, Ser, Vai, Ala, Asn, Gly e Leu; Xaa35 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr, Trp e Phe; Xaa39 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em: Glu, Gly, Ala, Ser e Asp; Xaa40 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Gly e Ala; Xaa43 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Asn e Gly; Xaa45 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Phe e Tyr; e em que o polipeptideo inibe a calicreina.

Numa concretização particular, a isquemia é a perda de sangue peri-operatório devido a um procedimento cirúrgico realizado no paciente. 0 procedimento cirúrgico pode ser uma cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo, a circulação extracorpórea ou cirurgia de revascularização miocárdica. 5

Numa concretização particular, posições de aminoácidos individuais da SEQ ID N° : 1 podem ser uma ou mais das seguintes: XaalO é Asp, Xaall é Asp, Xaal3 é Pro, Xaal5 é Arg, Xaal6 é Ala, Xaal7 é Ala, Xaal8 é His, Xaal9 é Pro, Xaa21 é Trp, Xaa31 é Glu, Xaa32 é Glu, Xaa34 é Ile, Xaa35 é Tyr, Xaa39 é Glu.

Numa outra modalidade, a presente descrição é direcionada para um método para prevenir ou reduzir o inicio da resposta inflamatória sistémica associada a um procedimento cirúrgico num paciente compreendendo administração ao paciente de uma composição que compreende um polipeptideo que compreende a sequência de aminoácidos: Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 XaalO Xaall Gly Xaal3 Cys Xaal5 Xaal6 Xaal7 Xaal8 Xaal9 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID N°: 1), em que Xaal, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 ou Xaa58 são cada individualmente um aminoácido ou ausente; XaalO é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Asp e Glu; Xaall é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Asp, Gly, Ser, Vai, Asn, Ile, Ala e Thr; Xaal3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys e Gin; Xaal5 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn e Gin; Xaal6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Ala, Gly, Ser, Asp e Asn; Xaal7 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Vai, Gin e Thr; Xaal8 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: His, Leu, Gin e Ala; Xaal9 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Pro, Gin, Leu, Asn e 6

Ile; Xaa21 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Trp, Phe, Tyr, His e Ile; Xaa22 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr e Phe; Xaa23 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr e Phe; Xaa31 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Ala, Vai, Leu, Ile e Thr; Xaa32 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Glu, Gin, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly e Vai; Xaa34 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Thr, Ile, Ser, Vai, Ala, Asn, Gly e Leu; Xaa35 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Tyr, Trp e Phe; Xaa39 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Glu, Gly, Ala, Ser e Asp; Xaa40 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Gly e Ala; Xaa43 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Asn e Gly; Xaa45 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: Phe e Tyr; e em que o polipeptideo inibe a calicreina. Numa concretização particular, o procedimento cirúrgico pode ser uma cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo bypass, cardiopulmonar ou cirurgia de revascularização miocárdica. Numa concretização particular, posições de aminoácidos individuais da SEQ ID N°: 1 podem ser uma ou mais das seguintes: XaalO é Asp, Xaall é Asp, Xaal3 é Pro, Xaal5 é Arg, Xaal6 é Ala, Xaal7 é Ala, Xaal8 é His, Xaal9 é Pro, Xaa21 é Trp, Xaa31 é Glu, Xaa32 é Glu, Xaa34 é Ile, Xaa35 é Tyr, Xaa39 é Glu.

Em ainda outra modalidade, a presente descrição é direcionada para um método para prevenir ou reduzir o inicio da resposta inflamatória sistémica associada a um procedimento cirúrgico num paciente compreendendo administração ao paciente de uma composição que compreende um polipeptideo que consiste na sequência de aminoácidos: 7

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N° : 2), em que o polipeptídeo inibe a calicreina. Numa modalidade, o procedimento cirúrgico é uma cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo bypass cardiopulmonar ou cirurgia de revascularização miocárdica.

Em ainda outra modalidade, a presente descrição é direcionada para um método para prevenir ou reduzir o inicio da resposta inflamatória sistémica associada a um procedimento cirúrgico num paciente compreendendo administração ao paciente de uma composição que compreende um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos: Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 5-60 da SEQ ID N°: 2), em que o polipeptídeo inibe a calicreina. Numa modalidade, o procedimento cirúrgico é uma cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo bypass, cardiopulmonar ou cirurgia de revascularização miocárdica.

Numa outra modalidade, a presente descrição é direcionada para um método para prevenir ou reduzir a isquemia num paciente compreendendo a administração ao paciente de uma composição que compreende um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos: Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys 8

Thr Arg Asp (aminoácidos 5-60 da SEQ ID N°: 2), em que o polipeptideo inibe a calicreina. Numa concretização particular, a isquemia pode ser a perda de sangue peri-operatório devido a um procedimento cirúrgico realizado no paciente. Numa modalidade, o procedimento cirúrgico é uma cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo bypass, cardiopulmonar ou cirurgia de revascularização miocárdica.

Baseada na descrição aqui referida, a presente invenção fornece:

Um polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 da SEQ ID N°: 2), em que o polipeptideo inibe a calicreina.

Numa modalidade o polipeptideo consiste na sequência de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 da SEQ ID N°: 2).

Numa modalidade o polipeptideo consiste na sequência de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N°: 2). 9 A presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreende um polipeptideo da invenção e um ou mais tampões farmaceuticamente aceitáveis, transportadores e excipientes. A presente invenção fornece ainda um recipiente compreendendo a composição farmacêutica da invenção. A presente invenção fornece ainda uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo da invenção.

Outros aspectos e modalidades da presente invenção são apresentados nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um diagrama simplificado das principais vias múltiplas e eventos relacionados envolvidos no sistema de ativação de contato e resposta inflamatória sistémica (SIR) que podem surgir num paciente submetido a traumatismo de tecidos moles e osso, como o associado a uma cirurgia de revascularização miocárdica (CABG), especialmente quando o procedimento CABG envolve a circulação extra-corpórea do sangue, tais como o bypass cardiopulmonasr (Dispositivo de bypass). As setas indicam a ativação de um componente ou um evento para outro componente ou evento na cascata. As setas em ambas as direções indicam efeitos de ativação de componentes ou eventos em ambas as direções. As setas quebradas indicam a participação provável de um componente ou evento na ativação de outro componente ou evento. As abreviaturas são as seguintes: "tPA" = ativador do plasminogénio tecidual; "C5a" = componente de uma proteína 10 do sistema de complemento; "fXIIa" = proteína ativadora da pré-calicreína para formar a calicreína ativa; "extrínseca" = sistema de coagulação extrínseca; "intrínseca" = sistema de coagulação intrínseco. A FIG. 2 mostra uma parte de um ADN e a correspondente sequência de aminoácido deduzida para um Kl de polipeptídeo da invenção em plasmídeo pPIC-K503. 0 ADN inserido codifica o sinal peptídeo mata prepro de Saccharomyces cerevisiae (sublinhado) fundida em moldura para o terminal amino do polipeptídeo PEP-1 Kl tendo a sequência de aminoácidos delimitada pela área do rectângulo. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo PEP-1 Kl mostrado na região do rectângulo é a SEQ ID N° : 2, e a correspondente sequência de codificação de nucleotídeos do polipeptídeo Kl é a SEQ ID N°: 3. As setas tracejadas indicam a localização e a direção de duas sequências de iniciadores PCR em regiões AOX que foram usados para produzir modelos de sequenciamento. A sequência de ADN para toda a sequência de nucleotídeos da figura compreende a sequência de codificação estrutural para a proteína de fusão e é designada por SEQ ID N°: 27. A dupla porção sublinhada da sequência indica uma sequência de sonda de diagnóstico. BstBI EcoRI indicam locais dos seus respectivos sítios palindrómicos, hexaméricos, de restrição de endonuclease na sequência. Os asteriscos denotam códons de parada de translação.

As FIGS. 3A e 3B mostram um alinhamento das sequências de aminoácidos das modalidades preferidas da presente descrição, a sequência LACI nativa a partir da qual estas variantes foram derivadas (SEQ ID N°: 32), e outros domínios Kunitz conhecidos (SEQ ID N°s: 29-31 e 33-53). Os resíduos de cisteína estão realçados. 11

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Segue-se uma descrição das modalidades preferidas da presente invenção. A presente descrição, incluindo a invenção, é baseada na descoberta de um grupo de polipeptideos inibidores da calicreina (Kl) que inibem a calicreina plasmática com uma especificidade que permite a sua utilização na melhoria dos métodos de prevenção ou redução de isquemia, como, por exemplo, perda de sangue peri-operatório e/ou uma resposta inflamatória sistémica (SIR) induzida pela calicreina, especialmente, por exemplo, em pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos e, particularmente, envolvendo procedimentos cirúrgicos de cirurgia cardiotorácica, por exemplo, a circulação extracorpórea (CPB), como um enxerto de revascularização do miocárdio (CABG) . Os KIs podem ser usados especificamente para, por exemplo, cirurgia cardíaca pediátrica, transplante pulmonar, artroplastia total da anca e transplante de fígado, e para reduzir ou prevenir o AVC peri-operatório durante o CABG, oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) e acidentes vasculares cerebrais (AVC) durante esses procedimentos. A cirurgia Cardiotorácica é a cirurgia da área do peito, mais comummente do coração e pulmões. As doenças típicas tratadas por cirurgia cardiotorácica incluem doença arterial coronária, tumores e cancros do esófago, pulmão e da parede do peito, coração e anormalidades da válvula, e defeitos de nascimento envolvendo o peito ou o coração. Onde a cirurgia cardiotorácica é utilizada para tratamento, incorre-se no risco de perda de sangue (por exemplo, 12 isquemia induzida pela cirurgia) e o inicio de uma resposta inflamatória sistémica (SIR). A SIR induzida pela cirurgia pode resultar em disfunção orgânica grave (sindrome da resposta inflamatória sistémica; SIRS).

Polipeptídeos úteis de acordo com a presente invenção

Os polipeptídeos Kl úteis na presente invenção compreendem polipeptídeos de domínio Kunitz. Numa modalidade desses domínios Kunitz são formas variantes da estrutura furada compreendendo domínio Kunitz 1 da proteína inibidora da coagulação humana associada à lipoproteína (LACI). A LACI contém três estruturas internas furadas de peptídeo, bem definidas, que são paradigma dos domínios Kunitz (Girard, T. et al. , 1989 Nature, 338:518-520). Os três domínios Kunitz de LACI conferem a capacidade de ligar e inibir a calicreína, embora não com afinidade excepcional. Variantes do domínio Kunitz 1 de LACI aqui descritas foram selecionadas, da calicreína isolada e ligada com maior afinidade e especificidade (ver, por exemplo, Patentes US 6333402 e 6057287). Um exemplo de um polipeptídeo preferido útil de acordo com a presente invenção, e que é um polipeptídeo da invenção, tem a sequência de aminoácidos definida pelos aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2.

Cada polipeptídeo útil de acordo com a presente invenção liga a calicreína, e polipeptídeos preferidos também são inibidores da calicreína (Kl), como determinado por ensaios ligação e inibição da calicreína conhecidos na técnica. A maior afinidade e especificidade para calicreína dos polipeptídeos da variante de domínio Kunitz aqui descrita fornece a base para a sua utilização em cirurgia 13 cardiotorácica, por exemplo, CPB e especialmente procedimentos cirúrgicos CABG, para prevenir ou reduzir a perda sanguínea peri-operatória e/ou o início da SIR em pacientes submetidos a tais procedimentos. Os polipeptídeos Kl usados de acordo com a presente invenção têm ou compreendem a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo da variante do domínio Kunitz isolada originalmente por bibliotecas de triagem do fago pela capacidade de ligar a calicreína.

Os polipeptídeos Kl úteis nos métodos e composições da presente invenção compreendem um polipeptídeo de domínio Kunitz que compreende a sequência de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 XaalO Xaall Gly Xaal 3 Cys Xaal 5 Xaalé Xaal7 Xaal8 Xaal9 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa2S Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa4? Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ED NO:l) "Xaa" refere-se a uma posição numa cadeia de peptídes que pode ser qualquer uma de uma série de diferentes aminoácidos. Por exemplo, para os peptídeos Kl aqui descritos, XaalO pode ser Asp ou Glu; Xaall pode ser Asp, Gly, Ser, Vai, Asn, Ile, Ala ou Thr; Xaal3 pode ser Pro,

Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys ou Gin; Xaal5 pode ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn ou Gin; Xaal6 pode ser Ala, Gly, Ser, Asp ou Asn; Xaal7 pode ser Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Vai, Gin ou Thr; Xaal8 pode ser His, Leu, Gin ou Ala; Xaal9 pode ser Pro, Gin, Leu, Asn ou Ile; Xaa21 pode ser Trp, Phe, Tyr, His ou Ile; Xaa31 pode ser Glu,

Asp, Gin, Asn, Ser, Ala, Vai, Leu, Ile ou Thr; Xaa32 pode 14 ser Glu, Gin, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly ou Vai; Xaa34 pode ser Ile, Thr, Ser, Vai, Ala, Asn, Gly ou Leu; Xaa35 pode ser Tyr, Tip ou Phe; Xaa39 pode ser Glu, Gly, Ala, Ser ou Asp. Os aminoácidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41,

Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52,

Xaa53 e Xaa54 podem ser qualquer aminoácido. Além disso, cada um dos quatro primeiros e dos últimos três aminoácidos da SEQ ID N°: 1 podem, opcionalmente, estar presentes ou ausentes e podem ser quaisquer aminoácidos, se houver.

Os peptideos definidos de acordo com a SEQ ID N°; 1 formam um conjunto de polipeptideos que se liqam à calicreina. Por exemplo, numa modalidade preferida da presente invenção, um polipeptideo Kl útil nos métodos e composições da presente invenção tem as seguintes posições variáveis: Xaall pode ser Asp, Gly, Ser ou Vai; Xaal3 pode ser Pro, Arg, His ou Asn; Xaal5 pode ser Arg ou Lys; Xaal6 pode ser Ala ou Gly; Xaal7 pode ser Ala, Asn, Ser ou Ile; Xaal8 pode ser His, Leu ou Gin; Xaal9 pode ser Pro, Gin ou Leu; Xaa21 pode ser Trp ou Phe; Xaa31 é Glu; Xaa32 pode ser Glu ou Gin; Xaa34 pode ser Ile, Thr ou Ser; Xaa35 é Tyr, e Xaa39 pode ser Glu, Gly ou Ala.

Uma modalidade mais especifica da presente invenção é definida pelos seguintes aminoácidos em posições variáveis: XaalO é Asp; Xaall é Asp; Xaal3 pode ser Pro ou Arg; Xaal5 é Arg; Xaal6 pode ser Ala ou Gly; Xaal7 é Ala; Xaal8 é His; Xaal9 é Pro; Xaa21 é Trp; Xaa31 é Glu; Xaa32 é Glu; Xaa34 pode ser Ile ou Ser; Xaa35 é Tyr; e Xaa39 é Gly. 15

Também englobado dentro do escopo da presente invenção são peptideos que compreendem partes dos polipeptídeos aqui descritos. Por exemplo, polipeptídeos que poderiam incluir domínios de ligação de epítopos de calicreína específicos. Tais fragmentos dos polipeptídeos aqui descritos também seriam abrangidos.

Os polipeptídeos Kl úteis nos métodos e composições descritos aqui compreendem um domínio Kunitz. Um subconjunto das sequências abrangidos pela SEQ ID N°: 1 são descritos pela seguinte (onde não é indicado "Xaa" refere-se ao mesmo conjunto de aminoácidos que são permitidos para a SEQ ID N°: 1):

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Xaa 10 Xaal 1 Gly Xaal 3 Cys XaalS Xaa 16 Xaa 17 XaalS Xaal 9 Arg Xaa21 Phe Phe Asa De Phe Thr Arg Gin Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Gly Aso Gin Asa Arg Phe Glu Scr Leu

Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:33).

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Aso He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (anho acids 3-60 of SEQ ID NO :2),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Asn His Leu Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg

Asp (SEQ ID NG:4), 16

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Aso His Gin Arg Phe Phe Phe Asn He Phe Thi Arg Gin Cys GIu Glu Phe Thr Tyr Gly Giy Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQID NO: 5),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gin Arg Phe Phe Phe Am Be Phe Thr Arg Gin Cys Glu Gin Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Gin Asa Arg Phe Glu Ser Lm Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:6),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala SerLeuPro Arg Phe Phe Phe Asn Be Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Be Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Am Gin Am Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SBQIDNO:?),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gin Arg Phe Phe Phe Asn Be Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 8),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ E) NO: 9),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Arg Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ B> NO: 10), 17

Met His Ser Phe (¾¾ Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Axg Gly Ala His Pro Arg Tip Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQID NO: 11),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Ttp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 12),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Vai Gly Arg Cys Arg Gly Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 13),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Vai Gly Arg Cys Arg Gly Ala Gin Pro Arg Phe Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp {SEQ SDD NO: 14),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Ser Cys Arg Ala Ala His Leu Arg Trp Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 15), 18

Met His Ser Phe Cys Aía Phe Lys Ala Glu Gly Gly Ser Cys Arg Ala Ala His Gin Arg Tip Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N0:16),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn He Phe 1¼ Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Sor Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SBQ D> NO: 17),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Arg Gly Ala Leu Pro Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu (¾¾ Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 18),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Ser Gly Asn Cys Arg Gly Asn Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ BD NO: 19),

Met His Ser Phe Cys Aía Phe Lys Ala Asp Ser Gly Arg Cys Arg Gly Asn His Gin Arg Phe Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Aso Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 20),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg Ala He Gin Pro Arg Trp Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:21), 19

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gíy Arg Cys Arg Gly Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Be Phe Thr Arg GIjq Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu d» Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ CD NO:22).

As FIGS. 3A e 3B fornecem um alinhamento de sequências de aminoácidos destas sequências, a sequência LACI nativa a partir da qual estas variantes foram derivadas (SEQ ID N°: 32), e outros domínios Kunitz conhecidos (SEQ ID N°s: 29-31 e 33-53).

Os polipeptídeos Kl úteis nos métodos e composições descritos neste documento, incluindo os polipeptídeos Kl da presente invenção, podem ser feitos de forma sintética, usando qualquer protocolo padrão de síntese de polipeptídeos e equipamentos. Por exemplo, a síntese progressiva de um polipeptídeo Kl descrita aqui pode ser realizada através da remoção de um grupo protetor terminal amino (N) , a partir de um aminoácido inicial (ie, carboxi-terminal), e o seu acoplamento com a extremidade carboxilo do próximo aminoácido na sequência do polipeptídeo. Este aminoácido é também adequadamente protegido. 0 grupo carboxil do aminoácido de entrada pode ser ativado para reagir com o N-terminal do aminoácido ligado pela formação num grupo reativo como a formação numa carbodiimida, um anidrido simétrico, ou um grupo "ativo de éster" como o hydroxibenzotriazole ou ésteres pentafluorofenyl. Métodos de síntese de peptídeos em fase sólida preferidos incluem o método BOC, que utiliza tert-butiloxicarbonil como grupo de proteção de α-amino, e o método FMOC, que utiliza 9-fluorenilmetloxicarbonil para proteger o α-amino dos resíduos de aminoácidos. Ambos os métodos são bem conhecidos pelos peritos na técnica (Stewart, J. and Young, 20 J., Solid-Phase Peptide Synthesis (W.H. Freeman Co., San Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky, M. e Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York 1984). Se desejar, terminal amino e/ou carboxi adicionais de aminoácidos podem ser concebidos para a sequência de aminoácidos e acrescentados durante a síntese de polipeptídeos.

Alternativamente, os polipeptídeos de domínio Kunitz e polipeptídeos Kl úteis nas composições e métodos da presente invenção podem ser produzidos por métodos recombinantes utilizando qualquer de um número de células e vetores de expressão correspondente, incluindo mas não limitado a vetores de expressão bacteriana, vetores de expressão de levedura, vetores de expressão de baculovírus, vetores de expressão virai de mamíferos, e assim por diante. Os polipeptídeos de domínio Kunitz e polipeptídeos Kl úteis nas composições e métodos da presente invenção também podem ser produzidos transgenicamente usando moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação para um domínio Kunitz ou polipeptídeo Kl aqui descrito, em que a molécula de ácido nucleico pode ser integrada e expressa a partir do genoma de um animal hospedeiro através de métodos transgênicos disponíveis na técnica. Em alguns casos, pode ser necessário ou vantajoso fundir a sequência de codificação para um polipeptídeo de domínio Kunitz ou um polipeptídeo Kl compreendendo o domínio Kunitz para outra sequência de codificação num vetor de expressão para formar um polipeptídeo de fusão que é facilmente expresso numa célula hospedeira. De preferência, a célula hospedeira que expressa tal polipeptídeo de fusão também processa o polipeptídeo de 21 fusão para produzir um domínio Kunitz ou um polipeptídeo Kl úteis na presente invenção, que contém apenas a sequência de aminoácido desejada. Obviamente, se qualquer outro aminoácido (s), continuar ligado ao domínio Kunitz expresso ou polipeptídeo Kl, tal aminoácido (s) adicional não deve diminuir a ligação de calicreína e/ou a atividade inibitória da calicreína do domínio Kunitz ou polipeptídeo Kl de modo a impedir o uso do polipeptídeo nos métodos ou composições da presente invenção.

Um sistema de expressão recombinante preferido para a produção de polipeptídeos Kl úteis nos métodos e composições aqui descritos é um vetor de expressão de levedura, que permite que uma sequência de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo Kl ou polipeptídeo de domínio Kunitz a ser ligado no mesmo quadro de leitura com uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de peptídeo líder mata prepro de Saccharomyces cerevisiae, que por sua vez está sob o controlo de um promotor de levedura operacional. 0 plasmídeo de expressão de levedura recombinante resultante pode então ser transformado por métodos padrão nas células de um hospedeiro de levedura apropriado e compatível, cujas células são capazes de expressar a proteína recombinante a partir da expressão do vetor de levedura recombinante. De preferência, uma célula de levedura hospedeira transformada com tal vetor de expressão recombinante também é capaz de processar a proteína de fusão para fornecer um polipeptídeo Kl ativo útil nos métodos e composições da presente invenção. Uma levedura hospedeira preferida para a produção de polipeptídeos recombinantes de domínio Kunitz e polipeptídeos Kl compreendendo tais domínios Kunitz é a Pichia pastoris. 22

Como mencionado acima, os polipeptideos Kl que são úteis em métodos e composições descritos neste documento podem incluir um polipeptideo de domínio Kunitz aqui descrito. Alguns polipeptideos Kl podem incluir uma sequência de acompanhamento adicional, de preferência de 1-6 aminoácidos de comprimento, na extremidade amino e/ou carboxi terminal, desde que esse aminoácidos adicionais não diminuam significativamente a afinidade de ligação da calicreína ou atividade de inibição da calicreína, de modo a impedir o uso nos métodos e composições descritos neste documento. Tais aminoácidos adicionais podem ser deliberadamente adicionados para expressar um polipeptideo Kl numa célula hospedeira recombinante especial ou podem ser adicionados para fornecer uma função adicional, por exemplo, para fornecer um peptídeo para ligar o polipeptideo Kl a outra molécula ou para fornecer uma porção de afinidade que facilita a purificação do polipeptideo. De preferência, o aminoácido adicional (s) não inclui cisteína, o que poderia interferir com as pontes dissulfeto do domínio Kunitz.

Um exemplo de um polipeptideo de domínio Kunitz preferido útil nos métodos e composições da presente invenção, e que é um polipeptideo da presente invenção, tem a sequência de resíduos de aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2. Quando expressos e processados num sistema de expressão de levedura de proteína de fusão (por exemplo, com base na expressão integrante do plasmídeo pHIL-D2), um tal polipeptideo de domínio Kunitz retém um terminal amino adicional de dipeptídeo Glu-Ala a partir da fusão com a sequência de peptídeo líder mata prepro de S. cerevisiae. Quando segregado da célula de levedura hospedeira, a maioria do peptídeo líder é processado a partir da proteína 23 de fusão para produzir um polipeptideo Kl funcional (aqui referido como "PEP-1") com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 (ver região retangular na FIG. 2).

Polipeptideos Kl particularmente preferidos úteis nos métodos e composições descritos neste documento têm uma afinidade de ligação para a calicreina que é da ordem de 1000 vezes maior do que a aprotinina, que está atualmente aprovada para uso em procedimentos CABG para reduzir a perda de sangue. As afinidades ligação de polipeptideos Kl surpreendentemente elevadas como aqui descritas indicam que tais polipeptideos Kl apresentam um alto grau de especificidade para a calicreina com a exclusão de outros alvos moleculares (ver Tabela 1, abaixo). Assim, a utilização de tais polipeptideos de acordo com a presente invenção reduz grande parte da especulação sobre os possíveis alvos terapêuticos num paciente. O menor grau de especificidade exibida, por exemplo, pela aprotinina, leva a possíveis efeitos colaterais pleiotrópicos e ambiguidade quanto ao seu mecanismo terapêutico.

Os polipeptideos definidos, por exemplo, na SEQ ID N°: 1 contêm posições invariantes, por exemplo, as posições 5, 14, 30, 51 e 55 pode ser apenas Cys. Outras posições, como, por exemplo, as posições 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53 e 54 podem ser qualquer aminoácido (incluindo aminoácidos de ocorrência não natural). Numa modalidade particularmente preferida, um ou mais aminoácidos correspondem a uma sequência nativa (por exemplo, SEQ ID N°: 32, ver Fig. 3) . Numa modalidade preferida, pelo menos uma posição variável é diferente daquela da sequência nativa. Em ainda outra 24 modalidade preferida, os aminoácidos podem ser cada um individual ou coletivamente substituídos por uma substituição do aminoácido conservadora ou não conservadora. Substituições de aminoácidos conservadoras substituem um aminoácido por outro aminoácido de estrutura química semelhante e podem não ter nenhum efeito sobre a função da proteína. Substituições de aminoácidos não conservadoras substituem um aminoácido por outro aminoácido da estrutura química diferente. Exemplos de substituições conservadoras de aminoácidos incluem, por exemplo, Asn-> Asp, Arg->Lys e Ser->Thr. Numa modalidade preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e/ou 21 destes aminoácidos pode ser independente ou coletivamente, em qualquer combinação, selecionados para corresponder à posição correspondente da SEQ ID N°: 2.

Outras posições, por exemplo, as posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 e 45, podem ser qualquer de um conjunto selecionado de aminoácidos. Assim, a SEQ ID N°: 1 define um conjunto de

sequências possíveis. Cada membro desse conjunto contém, por exemplo, uma cisteína nas posições 5, 14, 30, 51 e 55, e qualquer um de um conjunto específico de aminoácidos nas posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 221, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 e 45. Numa modalidade preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e/ou 19 destes aminoácidos pode ser independentemente ou coletivamente, em qualquer combinação, selecionados para corresponder à posição correspondente da SEQ ID N° : 2. O peptídeo tem de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade da SEQ ID N° : 2 . 25 Métodos e composições A presente invenção é também dirigida a métodos para prevenir ou reduzir a isquemia. Preferidos são os métodos para prevenir ou reduzir a perda de sangue peri-operatória e/ou uma resposta inflamatória sistémica (SIR) num paciente, especialmente associados com a cirurgia cardiotorácica. Um método para o tratamento envolve a administração de um polipeptideo Kl compreendendo um domínio Kunitz. Uma modalidade do método envolve o uso de um peptídeo contendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, que tem uma afinidade para calicreína que é aproximadamente 1000 vezes ou mais superior ao de uma ampla gama de serina protease, por exemplo, a aprotinina, que é isolado do pulmão bovino e atualmente aprovada para uso em procedimentos CABG (TRASYLOL®, Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut).

Os pacientes submetidos a qualquer de uma série de procedimentos cirúrgicos, especialmente aqueles envolvendo circulação extracorpórea, por exemplo cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo, a CPB e/ou trauma ósseo, como a divisão do esterno ou substituição da anca, estão em risco de perda de sangue peri-operatória e inflamação. 0 contato do sangue de um paciente com as superfícies de corte do osso ou equipamentos de CPB é suficiente para ativar uma ou várias respostas em cascata indesejáveis, incluindo um sistema de ativação de contato (CAS), que pode levar à perda de sangue peri-operatório extensa necessitando de transfusão de sangue imediata, bem como uma resposta inflamatória sistémica (SIR) , que, por sua vez, pode resultar em danos permanentes nos tecidos e órgãos. Embora não desejando ser limitado a qualquer mecanismo 26 específico ou teoria, parece que a perda de sangue que ocorre associada à cirurgia cardiotorácica, por exemplo, a CPB, como num procedimento CABG, provavelmente resulta de extravasamento capilar extenso, que pode resultar em perda significativa de sangue que deve ser substituído por transfusão de sangue imediata.

Os métodos descritos aqui são úteis para prevenir ou reduzir isquemias diversas, incluindo, por exemplo, perda de sangue peri-operatório e SIR num paciente submetido a um procedimento cirúrgico, e, especialmente, em que o procedimento cirúrgico requer circulação extracorpórea, por exemplo, cirurgia cardiotorácica, como, por exemplo, CPB. Os métodos da presente invenção são particularmente úteis para prevenir ou reduzir a perda de sangue peri-operatória e/ou SIR num paciente submetido a um procedimento CABG exigindo CPB, ou outras cirurgias cardíacas.

Composições preferidas para uso médico compreendem um polipeptídeo Kl aqui descrito. Tais composições úteis podem ainda compreender um ou mais tampões farmaceuticamente aceitáveis, transportadores e excipientes, que podem proporcionar uma característica desejável à composição, incluindo, mas não limitado a, administração melhorada da composição a um paciente, reforço da circulação de meia-vida do polipeptídeo Kl da composição, compatibilidade melhorada da composição com a química do sangue do paciente, melhor armazenamento da composição, e/ou eficácia melhorada da composição para a administração a um paciente. Além de um polipeptídeo Kl descrito aqui, as composições podem ainda compreender um ou mais outros compostos farmaceuticamente ativos que proporcionam um benefício 27 profilático ou terapêutico adicional a um paciente sujeito a um procedimento cirúrgico invasivo.

Composições úteis nos métodos da presente invenção compreendem qualquer um dos polipeptideos de domínio Kunitz ou polipeptideos Kl compreendendo tais polipeptideos de domínio Kunitz aqui descritos. Particularmente preferidos são os polipeptideos Kl compreendendo um polipeptídeo de domínio Kunitz tendo uma sequência de aminoácido 58 de aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2. Um exemplo de um tal polipeptídeo Kl particularmente preferido útil nos métodos e composições da presente invenção, e que é um polipeptídeo Kl da presente invenção, é o polipeptídeo ΚΙ PEP-1 tendo a sequência de aminoácido 60 da SEQ ID N°: 2. A sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 2 é fornecida na SEQ ID N°: 3 (ver, por exemplo, nucleotídeos 309-488 na FIG 2.). Entende-se que, com base no código genético conhecido, a presente invenção também fornece formas degeneradas da sequência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 3 simplesmente substituindo um ou mais dos códons degenerados conhecidos para cada aminoácido codificado pela sequência de nucleotídeos. Os nucleotídeos 7-180 da SEQ ID N°: 3, e suas formas degeneradas, codificam polipeptídeo de domínio Kunitz de ocorrência não-natural tendo a sequência de aminoácido 58 de aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2.

Qualquer de uma variedade de moléculas de ácido nucleico pode compreender a sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 7-180 da SEQ ID N°: 3, formas degeneradas, e partes dele, incluindo mas não limitado a, genomas fago recombinantes, vetores mamíferos virais recombinantes, 28 vetores de insetos virais recombinantes, mini-cromossomas de levedura, e vários plasmideos. Tais plasmideos incluem aqueles usados para clonar e/ou expressar tais sequências de codificação de nucleotideos. Vetores de expressão fornecem um promotor, que pode ser operacionalmente ligado a uma determinada sequência de nucleotideos e uma célula hospedeira apropriada, que é capaz de transcrever a sequência de codificação de nucleotideos especifica num ARN mensageiro funcional (mARN) e também traduzir o mARN no polipeptideo correspondente. Um polipeptídeo assim produzido pode ser isolado da célula hospedeira. Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio Kunitz ou um polipeptídeo Kl descrito aqui podem ser feitas por métodos padrão de síntese de ácido nucleico, metodologias de ADN recombinante, métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR), e suas combinações.

Perda de sangue peri-operatória e redução do fluxo sanguíneo do coração

Devido a muitos avanços na medicina, uma série de procedimentos cirúrgicos altamente invasivos são realizadas a cada dia e resultam em perda de sangue, ou colocam os pacientes em alto risco de perda de sangue. Tais pacientes devem ser cuidadosamente monitorizados para restaurar e manter o suprimento de sangue normal e a hemostasia, pudendo precisar de transfusões de sangue. Procedimentos cirúrgicos que envolvem perda de sangue incluem os que envolvem métodos de circulação extracorpórea, como a cirurgia cardiotorácica, por exemplo, a CPB. Em tais métodos, o coração de um paciente é interrompido e a circulação, oxigenação e manutenção do volume de sangue são 29 realizadas artificialmente usando um circuito extra-corpóreo e um oxigenador de membrana sintética. Estas técnicas são comumente usados durante a cirurgia cardíaca. Além disso, é evidente que a cirurgia envolvendo trauma extenso do osso, como a divisão esternal necessária em CABG ou procedimentos de substituição da anca, também está associada com a ativação do CAS, que pode resultar numa variedade de distúrbios no sangue e vasculatura. A doença coronária aterosclerótica (CAD) causa um estreitamento do lúmen de uma ou várias das artérias coronárias; o que limita o fluxo de sangue para o miocárdio (ou seja, o músculo do coração) e pode causar angina, insuficiência cardíaca, e infartos do miocárdio. Na fase final da aterosclerose da artéria coronária, a circulação coronária pode ser quase completamente obstruída, causando angina COM risco de vida ou insuficiência cardíaca, com uma mortalidade muito alta. Os procedimentos CABG podem ser necessários para fazer a ponte com o vaso sanguíneo obstruído e restaurar sangue para o coração; estes são potencialmente salvadores da vida. Os procedimentos CABG estão entre as cirurgias mais invasivas em que uma ou mais veias ou artérias saudáveis são implantadas para fornecer um "bypass" em torno da área obstruída do vaso doente. Os procedimentos CABG carregam com eles um risco peri-operatório pequeno, mas importante, mas são muito bem sucedidos em fornecer aos pacientes um alívio imediato da mortalidade e morbilidade da doença cardiovascular aterosclerótica. Apesar destes resultados muito animadores, a repetição dos procedimentos CABG é frequentemente necessária, como indicado por um claro aumento do número de pacientes que são, eventualmente, submetidos a um segundo e mesmo terceiro procedimento; a mortalidade peri-operatória 30 e morbidade observada em procedimentos de CABG primários aumenta nesses procedimentos repetidos.

Tem havido melhorias em técnicas cirúrgicas minimamente invasivas para CAD não complicada. No entanto, quase todos os procedimentos CABG realizados para doença cardíaca valvular e/ou congénita, transplante cardíaco, e grande procedimentos aórticos, ainda são realizadas em pacientes apoiados por CPB. Na CPB, cânulas grandes são inseridas nos grandes vasos de um paciente para permitir o bombeamento mecânico e a oxigenação do sangue através de um oxigenador de membrana. 0 sangue é devolvido ao paciente sem fluir através dos pulmões, que são hipo-perfundidos durante este procedimento. O coração é parado usando uma solução cardioplégica, o paciente é arrefecido para ajudar a prevenir danos cerebrais, e o volume de circulação periférica aumentado por um circuito extracorpóreo, ou seja, o circuito CPB, o que requer "priming" com o sangue do doador e misturas salina usadas para preencher o circuito extracorpóreo. A CPB tem sido amplamente utilizada numa variedade de procedimentos realizados durante quase meio século, com resultados de sucesso. A interação entre superfícies artificiais, células do sangue, proteínas do sangue, endotélio vascular danificado, e os tecidos extravasculares, tais como os ossos, perturba a hemostasia e frequentemente ativa o CAS, que, como mencionado acima, pode resultar numa variedade de distúrbios no sangue e vasculatura. Essas perturbações levam ao excesso de sangramento peri-operatório, que então exige transfusão de sangue imediata. Uma consequência da circulação de sangue total por meio de um circuito extracorpóreo em CPB pode também incluir a resposta inflamatória sistémica (SIR), que é iniciada pela ativação de contato de sistemas de 31 coagulação e do complemento. De facto, grande parte da morbidade e mortalidade associada a procedimentos cirúrgicos de CPB aparentemente mecanicamente bem sucedidos é o resultado dos efeitos da ativação da coagulação, a fibrinólise, ou sistemas de complemento. Esta ativação pode danificar o sistema pulmonar, levando à sindrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), comprometimento dos rins e da circulação esplâncnica e a indução de uma coagulopatia geral levando à perda de sangue e à necessidade de transfusões. Além dos perigos de perda de sangue peri-operatório, patologias adicionais associados com SIR incluem déficits neurocognitivos, acidente vascular cerebral, insuficiência renal, infarto agudo do miocárdio, e danos no tecido cardíaco.

As transfusões de sangue também apresentam um risco significativo de infeção e elevam o custo de CABG ou outros processos semelhantes que exigem CPB. Na ausência de qualquer intervenção farmacológica, 3três a sete unidades de sangue devem normalmente ser gastas num paciente, mesmo com excelentes técnicas cirúrgicas. Assim, há um incentivo considerável para o desenvolvimento de novos e melhorados compostos farmacologicamente eficazes para reduzir ou prevenir o sangramento peri-operatório e SIR em pacientes submetidos a procedimentos de CPB e CABG.

Considerações sobre a dministração e dosagem de polipeptideos Kl

Os polipeptideos Kl aqui descritos podem ser administradas a um paciente antes, durante e/ou após um procedimento cirúrgico numa composição farmaceuticamente aceitável. 0 32 termo composição "farmaceuticamente aceitável" refere-se a um transportador não tóxico ou excipiente que pode ser administrado a um paciente, juntamente com um composto desta invenção, e em que o transportador ou excipiente não destrói a atividade biológica ou farmacológica da composição. Os polipeptideos Kl aqui descritos podem ser administrados localmente ou sistemicamente por qualquer meio adequado para a entrega de uma quantidade de polipeptideos Kl inibidores da calicreina a um paciente, incluindo mas não limitado a administrações sistémicas, como, por exemplo, por via intravenosa e inalação. A administração parenteral é particularmente preferida.

Para a administração parenteral, os polipeptideos podem ser injetados por via intravenosa, via intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea. A administração intravenosa é preferida. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão isotónico estéril aquoso. Outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina e solução salina tamponada (incluindo tampões como o fosfato ou o acetato), álcool, óleos vegetais, glicóis de polietileno, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina, etc. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local como a lidocaína para aliviar a dor no local da injeção, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sais, lubrificantes, etc., desde que não reajam deleteriamente com os compostos ativos. Da mesma forma, a composição pode compreender excipientes convencionais, por exemplo, substâncias transportadoras orgânicas ou inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis adequadas para a aplicação 33 parenteral, enteral ou intranasal que não reajam deleteriamente com os compostos ativos. Geralmente, os ingredientes serão fornecidos separadamente ou misturados em forma de unidade de dosagem, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou água livre concentrada num recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou embalagem indicando a quantidade de agente ativo em unidades de atividade. Quando a composição seja para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo "água para injeção" farmacêutica estéril ou salina. Quando a composição seja para ser administrada por injeção, pode ser fornecida uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

De preferência, os métodos da presente invenção compreendem a administração de um polipeptideo Kl a um paciente como uma perfusão intravenosa de acordo com qualquer procedimento aprovado. Assim, um polipeptideo IC aqui descrito pode ser administrado a um paciente submetido a um procedimento CABG nos momentos semelhantes aos usados atualmente em protocolos aprovados para administrar aprotinina e numa quantidade necessária para fornecer ao paciente um número necessário ou uma concentração de unidades inibidoras da calicreina (KIU). De acordo com a invenção, um polipeptideo Kl aqui descrito também pode ser administrado a um paciente no período pós-operatório imediato, quando as anormalidades de sangramento podem ocorrer como consequência de efeitos a jusante do SIR. Por exemplo, num procedimento que envolve CPB, um polipeptideo Kl aqui descrito pode ser administrado a um paciente como uma dose de carga inicial, por exemplo, uma quantidade eficaz ao longo de um tempo conveniente, tais como 10 34 minutos, antes da indução da anestesia. Então, na indução da anestesia, pode ser injetada uma segunda dose de polipeptideo Kl no fluido "priming" CPB ("volume de bomba primário"). 0 paciente pode então ser colocado numa dose de infusão continua e controlada por via intravenosa durante a duração do procedimento cirúrgico, e após o procedimento, se indicado.

Atualmente, existem dois regimes aprovados nos Estados Unidos para administrar a aprotinina num paciente submetido a um procedimento CABG (ver, rótulo do produto e literatura inclusa do TRASYLOL®, Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut). Em tal regime aprovado é usada uma dose intravenosa de 2 milhões KIU, 2 milhões KIU no volume da bomba principal, e 500 mil KIU por hora de cirurgia. Outro regime aprovado usa uma dose intravenosa de 1 milhão KIU, 1 milhão de KIU no volume da bomba principal, e 250 mil KIU por hora de cirurgia. Como estes regimes são baseados em KIU, os regimes são facilmente adaptados a qualquer polipeptideo Kl aqui descrito uma vez que a atividade especifica e KIU de um polipeptideo Kl em particular tenha sido determinados por ensaios padrão. Devido à afinidade de ligação melhorada e à atividade inibitória em polipeptideos Kl representativos aqui descritos em relação à aprotinina, espera-se que tais composições e métodos da presente invenção sejam suscetíveis de exigir menos miligramas (mg) por paciente para fornecer a um paciente o número exigido ou concentração de KIU. Várias considerações a respeito da dosagem com um polipeptideo Kl em métodos da invenção podem ser ilustradas 35 por meio de exemplo com o polipeptídeo PEP-1 Kl representativo da invenção tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 (peso molecular de 7.054 Daltons). A Tabela 1, abaixo, apresenta uma comparação da afinidade (Ki,app) do polipeptídeo PEP-1 Kl para a calicreína e onze outras proteases plasmáticas conhecidas.

Tabela 1

Substrato de Protease PEP-1 Ki,app (pM) Aprotinina Ki,app (pM) calicreína plasmática humana 44 3,OxlO4 calicreína da urina humana >1 X 108 4X103 calicreína pancreática suína 2,7x107 550 Clr humano, ativado >2,0x108 >1,OxlO7 Cls humano, ativado >2,0x107 >1,OxlO8 Plasma humano fator Xla 1,0x104 ND Plasma humano fator XIIa >2,OxlO7 >1,OxlO8 Plasmina humana 1,4xl05 894 Tripsina pancreática humana >2xl07 ND Quimotripsina pancreática >2,OxlO7 7,3x105 humana Neutrófilo elastase humano >2,OxlO7 1,7xl06 Trombina plasmática humana >2,OxlO7 >1,OxlO8 ND - não determinado Claramente, o polipeptídeo PEP-1 Kl é altamente específico para a calicreína plasmática humana. Além disso, a afinidade (Ki,app) do PEP-1 para a calicreína é 1000 vezes maior do que a afinidade da aprotinina para a calicreína: o Ki,app do PEP-1 para a calicreína é cerca de 44 pM (Tabela 1), enquanto o Ki,app da aprotinina para a calicreína é de 36 30000 pM. Assim, uma dose de PEP-1 poderia ser aproximadamente 1000 vezes menor do que a utilizada para a aprotinina numa base molar. No entanto, a consideração de vários outros fatores podem fornecer uma estimativa mais precisa da dose de PEP-1 necessária na prática. Tais fatores incluem a quantidade de calicreina ativada durante a CPB num paciente em particular, a concentração de calicreina necessária para obter uma SIR, e a biodisponibilidade e distribuição farmacológica do PEP-1 num paciente. No entanto, o uso de um polipeptideo Kl em métodos de acordo com a presente invenção e fornecidos em doses atualmente aprovadas para o uso da aprotinina ainda é esperado fornecer melhorias significativas sobre o uso atual da menos especifica e de menor afinidade, aprotinina bovina.

Por exemplo , a quantidade total de circulação de pré- calicreina no plasma é estimada em cerca de 500 nM (Silverberg, M. et al, "The contact System and Its Disorders", em Blood: Principies and Practice of Hematology, Handin, R. et al., eds., JB Lippincott «·. o o Filadélfia, 1995). Se toda a pré-calicreína for ativada, então seria necessário pelo menos 500 nM de PEP-1 para uma inibição estequiométrica da calicreina. Um indivíduo que tem 5 litros de plasma exigiria, portanto, cerca de 18 mg de PEP-1 para atingir uma concentração plasmática de 500 nM.

Outro fator a considerar é o limiar de concentração de calicreina necessário para induzir uma SIR num paciente. Se a concentração de calicreina ativa deve ser mantida abaixo, por exemplo, de 1 nM, em seguida, devido à sua elevada 37 afinidade para a calicreína, o PEP-1 oferece uma vantagem significativa sobre a aprotinina na quantidade de proteína que seria necessária para inibir a SIR. Em particular, uma concentração de PEP-1 de lnM inibiria 99,6% da calicreína presente no 1 nM (ou seja, somente 0,4 pM de calicreína livre ficaria no sangue), enquanto uma concentração de 1 nM aprotinina só inibe a 24,5% do calicreína presente no 1 nM. Para a aprotinina inibir 99% da calicreína em 1 nM, é necessário uma concentração de aprotinina no plasma de pelo menos 3 M (ou seja, uma concentração 3000 vezes superior ao PEP-1).

Para um paciente submetido a CPB, uma dose inicial clínica de PEP-1 pode ser estimada a partir de um esquema terapêutico recomendado de aprotinina (1 x 106 KIU) mencionado acima. A aprotinina é relatada na literatura inclusa como tendo atividade inibitória específica de 7143 KlU/mg determinada usando um ensaio de pressão sanguínea num cão. Portanto, 1 x 106 KIU de aprotinina é equivalente a 140 mg de aprotinina (isto é, 1 x 106 KIU/7143 KlU/mg = 14 0 mg de aprotinina). Num paciente tendo um volume de plasma sanguíneo de 5 litros, 140 mg corresponde a aproximadamente 4,3 μΜ aprotinina (o peso molecular da aprotinina é de 6512 Daltons) . A atividade específica de aprotinina no ensaio padrão de inibição utilizado para PEP-1 é de 0,4 KlU/mg de polipeptídeo. A dose de 140 mg corresponderia a uma dose de carga de aprotinina de 56 KIU (140 mg x 0,4 KlU/mg = 56 KIU). Em contraste, uma vez que a atividade específica do polipeptídeo PEP-1 Kl é de 10 KlU/mg no ensaio de inibição padrão, uma dose de apenas 5,6 mg de PEP-1 seria obrigada a fornecer o número de KIUs equivalente a 140 mg de aprotinina. Num paciente com um volume de plasma de 5 litros, o que corresponde a cerca de 38 160 nM de ΡΕΡ-1 (peso molecular do PEP-1 é de 7054 Daltons), apesar de uma dose mais elevada do polipeptideo Kl PEP-1 pode ser necessário se toda a calicreína plasmática (500 nM) for ativada e/ou se este polipeptideo Kl for mal distribuída num paciente.

Além disso, os polipeptídeos Kl podem ser de ocorrência não-natural, e podem ser produzidos sinteticamente ou de forma recombinante, como indicado acima, evitando assim a possível contaminação de doenças transmissíveis que podem surgir durante o isolamento de uma proteína de uma fonte animal natural, tais como no caso de aprotinina, que é isolada do pulmão bovino. Cada vez mais importante para a aceitação pública de um tratamento ou composição farmacêutica compreendendo um polipeptideo é a prevenção da possível contaminação com e a transmissão para pacientes humanos de vários agentes patológicos. De particular interesse para a segurança das proteínas isoladas a partir de um tecido bovino é a eliminação dos possíveis riscos de exposição a doenças mediadas virais, doenças mediadas bacterianas, e, especialmente, encefalopatia espongiforme bovina.

Como variantes do domínio Kunitz 1 da proteína LACI humana, são esperados menos efeitos colaterais ao administrar os polipeptídeos Kl aos pacientes do que a aprotinina, que é uma proteína bovina que é documentada, causar reações anafiláticas e anafilactóides em pacientes, especialmente nas administrações repetidas, como os procedimentos CABG repetidos. Além disso, a ligação altamente específica dos polipeptídeos Kl descritos aqui para a calicreína limitam ou eliminam efetivamente as tendências trombóticas 39 observadas com a aprotinina, e reduzem os problemas observados com a patência do enxerto após os procedimentos CABG. A invenção será descrita mais adiante, com referência aos exemplos, não limitativos, a seguir.

EXEMPLIFICAÇÃO

Exemplo 1: Um polipeptídeo Kl representativo

Um polipeptídeo Kl de ocorrência não natural (PEP-1) útil nas composições e métodos da presente invenção foi identificado como um polipeptídeo que liga a calicreína exibido num fago recombinante de uma biblioteca de exibição de fago. 0 PEP-1 tem a seguinte sequência de aminoácido: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro

Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg

Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N°: 2) . 0 peso molecular do PEP-1 é de 7054 Daltons. A sequência de nucleotídeos (SEQ ID N°: 3) do ADN do fago recombinante que codifica a sequência de aminoácidos PEP-1 (aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2) foi isolada e sequenciada por métodos padrão determinados a partir do ADN do fago recombinante. O PEP-1 foi produzido em quantidades úteis para uma melhor caracterização como uma proteína recombinante em células de fenótipo hospedeiro His4 de um a estirpe de levedura Pichia pastoris. 40

Exemplo 2: Construção de um plasmideo recombinante para expressar os polipeptideos Kl 0 plasmideo inicial, pHIL-D2, é resistente à ampicilina e contém um alelo do tipo selvagem de His4 de P. pastoris. A sequência final de ADN compreendendo a sequência de codificação para a proteína de fusão mata prepro-PEP-1 recombinante na expressão do plasmideo pPIC-K503 é mostrado na FIG. 2. A sequência de ADN de Phil-D2 foi modificada para produzir pPIC-K503, como segue: 1. 0 sítio BstBI na região 3Ά0Χ1 de pHIL-D2, localizado a jusante do gene His4, foi removido por digestão de restrição parcial, preenchimento, e ligação, alterando a sequência de TTCGAA (SEQ ID N° : 23) para TTCGCGAA (SEQ ID N° 24). Esta modificação foi feita para facilitar e direcionar a clonagem da cassete de expressão para o plasmideo. 2. 0 sítio Aatll tendo o gene bla localizado a jusante de His4 foi removido por digestão de restrição, preenchimento, e ligação, modificando a sequência de GACGTC (SEQ ID N°: 25) para GACGTACGTC (SEQ ID N° : 26) . Esta modificação foi feita para facilitar a clonagem de cassetes de expressão tendo sitios Aatll no plasmideo. A codificação de ADN PEP-1 foi sintetizada com base na sequência de nucleotídeos do fago original de exibição da ligação da calicreína e consistiu em 450 pares de base (bp) . A sequência final de ADN da inserção no plasmideo Phil-D2 é ladeada por uma sequência 5ΆΟΧ1 e uma sequência 3ΆΟΧ1 (partes das quais são mostradas na FIG. 2) e codificam uma proteína de fusão compreendendo peptídeo de sinal mata prepro de S. cerevisiae fundida com a sequência de codificação 41 estrutural para o polipeptideo PEP-1 Kl. 0 peptideo de sinal foi adicionado para facilitar a secreção de PEP-1 a partir de células hospedeiras de levedura. Os oligonucleotideos para formar a inserção foram sintetizados e obtidos comercialmente (Genesis Labs, The Woodlands, TX), e a inserção foi gerada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) . 0 ADN sintético ligado que codifica a proteína de fusão mata prepro/PEP-1 foi em seguida incorporado por ligação no plasmídeo pHIL-D2 modificado entre os sítios BstBI e EcoRI.

Os produtos de ligação foram usados para transformar a estirpe Escherichia coli XL1 Blue. Um ensaio de PCR foi utilizado para exibir os transformantes de E. coli para a construção de plasmídeo desejada. 0 ADN a partir de extratos de células foi amplificado por PCR usando iniciadores contendo sequências 5Ά0Χ1 e 3' A0X1 (ver acima e FIG. 2). Os produtos de PCR do número correto de pares de base foram sequenciados. Além disso, cerca de 20-50 pb em cada lado dos sítios de clonagem foram sequenciados, e foi obtida a sequência prevista. A sequência final de ADN da inserção no plasmídeo pHIL-D2 (para produzir o plasmídeo pPIC-K503) é mostrada na FIG. 2 juntamente com porções de acompanhamento das sequências 5' e 3Ά0Χ1 e sequência de aminoácido correspondente da proteína de fusão que compreende o peptideo de sinal mata prepro de S. cerevisiae fundida com a sequência de codificação estrutural para o polipeptideo PEP-1 Kl. Um transformante com a construção de expressão de plasmídeo desejada, o plasmídeo pPIC-K503, foi selecionado para preparar linhas de células de levedura para a produção de rotina de PEP-1. 42

Exemplo 3: Fabricação de PEP-1 a partir da linha celular de levedura recombinante

Esferoplastos de P. pastoris GS 115 tendo o fenótipo His4~ foram transformados com a expressão do plasmídeo pPIC-K503 (acima) seguinte à linearização do plasmídeo no sítio Saci e recombinação homóloga do ADN plasmidial no hospedeiro locus 5' A0X1. O fenótipo da estirpe de produção é His4+. 0 plasmídeo inteiro foi inserido na sequência genómica 5Ά0Χ1 da levedura.

Os isolados da transformação foram selecionados para o crescimento na ausência de histidina exógena com metanol como única fonte de carbono. Mais do que 95% dos transformantes mantiveram a capacidade do tipo selvagem para crescer com metanol como única fonte de carbono, demonstrando assim que o plasmídeo foi inserido no genoma do hospedeiro por recombinação homóloga, em vez de por transplantação. Estes transformantes não exigiam histidina exógenos para o crescimento, demonstrando assim que o plasmídeo tinha-se integrado no genoma do hospedeiro. As colónias selecionadas foram clonadas. Foram realizados estudos de expressão de pequenas culturas para identificar clones segregando os mais altos níveis de ativos PEP-1 no meio de cultura. Os níveis de secreção PEP-1 em soluções de cultura sobrenadante clarificadas foram quantificados para níveis de PEP-1 por eletroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e avaliadas quanto à inibição da calicreína. Um clone de levedura foi selecionado para a produção de PEP-1 com base no seu alto nível de expressão de PEP-1 entre as culturas amostradas. 43

Os bancos de células principais e de trabalho de P. pastoris para a produção de PEP-1 foram preparados comercialmente (MDS Pharma Services, Bothell, Washington). A produção padrão de PEP-1 na levedura compreende três etapas da seguinte forma: (1) preparação da cultura de sementes, (2) de fermentação, e (3) recuperação da cultura. A etapa de semente da cultura consistiu na inoculação de seis frascos (300 mL cada) contendo caldo de inoculo esterilizado (base de levedura de nitrogénio, fosfato, potássio e glicerol, PH = 5) com o conteúdo de um único frasco de um banco de células de trabalho P. pastoris produzindo PEP-1. Os frascos foram inoculados num agitador orbital (300 rpm) por cerca de 13 horas a 30°C ± 2°C.

As fermentações foram realizadas num fermentador fechado Braun de 100 litros cheio de caldo estéril. Cada fermentação foi iniciada com a transferência do conteúdo dos seis frascos de cultura de semente para o fermentador. Após aproximadamente 24 horas, o glicerol no fermentador ficou exausto e foi adicionado glicerol durante aproximadamente 8 horas adicionais. A fase de alimentação mista, que durou aproximadamente 83 horas, foi então iniciada pela adição de uma alimentação de glicerol e metanol. No final deste tempo, a fermentação terminou, e os conteúdos do fermentador foram diluídos com água purificada. A purificação e processamento de PEP-1 consistiu em cinco etapas da seguinte forma: (1) cromatografia de leito expandido (2), cromatografia de troca catiónica (3), cromatografia de interação hidrofóbica 44 (HIC), (4) ultrafiltração e diafiltração, e (5) filtração final e embalagem. 0 passo inicial de purificação consistiu na cromatografia de leito expandido. A cultura fermentada foi aplicada à coluna equilibrada embalada com resina Streamline SP (Amersham Phannacia Streamline, coluna cromatográfica 200, Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey). A coluna foi então lavada (50 mM de ácido acético, pH = 3,0 - 3,5) num modo de fluxo para lavar as células de levedura do leito expandido. O adaptador superior foi levantado acima do leito expandido para melhorar a lavagem. O fluxo foi interrompido e o leito foi deixado em repouso. 0 adaptador foi movido para baixo de modo a ficar um pouco acima do leite instalado. A direção do fluxo foi invertida. O efluente foi recolhido. A lavagem foi continuada num modo de baixo usando 50 mM de acetato de sódio, pH 4.0. O efluente foi recolhido. O PEP-1 foi eluido da coluna utilizando 50 mM de acetato de sódio, pH 6,0. O eluato foi recolhido num recipiente de 50 litros. 0 eluato foi então filtrado por um filtro de 0,22 num recipiente limpo localizado no sitio de purificação. Amostras adicionais foram recolhidas para a determinação da concentração do PEP-1. Uma etapa de cromatografia de troca catiónica foi então realizada utilizando-se o eluido filtrado da coluna de leito expandido. PEP-1 foi eluido da coluna com 15 mM de citrato trissódico, pH 6.2.

As proteínas adicionais foram removidas da preparação de PEP-1 por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Antes da HIC, o eluato da coluna de troca catiónica foi diluído com sulfato de amónio. 0 eluato foi aplicado à 45 coluna, e o PEP-1 foi eluido utilizando sulfato de amónio (0,572 M) em fosfato de potássio (100 mM), pH 7.0. 0 eluato foi recolhido em frações com base nos valores A280. Todas as frações foram recolhidas em frascos PETG estéreis, pré-pesados .

As frações selecionadas foram agrupadas num recipiente limpo. O tanque foi concentrado por ultrafiltração. A preparação de PEP-1 concentrado foi imediatamente diafiltrada contra dez volumes de PBS, pH 7.0. A etapa final de filtração foi realizada antes da embalagem a fim de minimizar o número de organismos contaminantes no volume de PEP-1. A solução foi filtrada em bloco através de um filtro de 0,22 e recolhida num frasco PETG estéril, pré-pesado. Uma amostra foi retirada para testar a libertação dos lotes. 0 volume restante foi dispensado de forma asséptica em garrafas PETG estéreis e armazenado a -20°C.

Exemplo 4: Teste de Inibição da calicreina.

Um teste de cinética foi utilizado para medir a atividade inibitória dos polipeptideos Kl, tal como PEP-1. 0 ensaio cinético mede a fluorescência a seguir à clivagem da calicreina mediada de um substrato, a cumarina metil prolilfenilalanilarginil amino. Uma quantidade conhecida de calicreina foi incubada com uma série de polipeptideo Kl diluído como padrão de referência ou amostras de polipeptideo Kl em série diluídas, num tampão de reação adequado numa placa de microtitulação. Cada amostra foi executada em triplicado. A solução de substrato foi 46 usando um adicionada, e a placa lida imediatamente, comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Pelo menos duas de cada uma das curvas padrão de referência e amostra foram obrigadas a ter um valor de R-quadrado de 0,95 para serem consideradas válidas.

Enquanto esta invenção foi particularmente apresentada e descrita com referências a modalidades preferidas, será entendido pelos peritos na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas em se afastar do âmbito de aplicação da invenção abrangido pelas reivindicações em anexo. 47

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Ghi Phe He Tyr Gíy Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Gin Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2), em que o polipeptídeo inibe a calicreína plasmática.
2. 2. Polipeptídeo da reivindicação 1, em que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pio Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Ghi Ser Leu Gin Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2).
3. 3. Polipeptídeo da reivindicação 1, em que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gíy Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N°: 2).
4. 4. Composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo da reivindicação 1 e um ou mais tampões farmaceuticamente aceitável, transportadores e excipientes.
5. 5. Composição farmacêutica da reivindicação 4, em que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos: 1 MetHisSerPheCys AlaPheLys AlaAsp AspGlyPro CysÁrgAiaAlaHisPro Arg Trp Phe Phe Asn Se Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly €5« Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Gk Cys Lys Lys Met Cys Ur Arg Asp (aminoácidos 30-60 da SEQ ID N°: 2).
6. 6. Composição farmacêutica da reivindicação 4, em que o polipeptideo consiste na sequência de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg Gin Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID N°: 2).
7. 7. Composição farmacêutica de qualquer das reivindicações 4 a 6, em que a composição é um pó liofilizado.
8. 8. Composição farmacêutica de qualquer das reivindicações 4 a 6, em que a composição é formulada para administração subcutânea.
9. 9. Recipiente contendo a composição farmacêutica de qualquer das reivindicações 4 a 8.
10. 10. Recipiente da reivindicação 9, em que este é uma garrafa de infusão.
11. 11. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo de qualquer das reivindicações 1 a 3.
12. 12. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 11, em que o a dita sequência de ácido nucleico codifica o polipeptideo da reivindicação 3. 2