DD157612A5

DD157612A5 - Verfahren zur herstellung eines insulinvorlaeufers

Info

Publication number: DD157612A5
Application number: DD81228622A
Authority: DD
Inventors: Bruce H Frank
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1982-11-24
Also published as: NO811039L; AU540644B2; FI810917L; YU76881A; IL62486A0; IE810679L; PL127843B1; EP0037255A1; HU185249B; GR73517B; PT72732A; KR830005251A; NO151898C; DK149863C; GB2073204B; GB2073204A; KR840000946B1; AU6871981A; EG15310A; EP0037255B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Insulinvorlaeufers, durch das sich die hierzu erforderliche Reduktion und Oxidation praktisch einstufig durchfuehren laesst. Erfindungsgemaess wird hierzu ein entsprechender S-Sulfonatinsulinvorlaeufer mit einer solchen Menge eines Mercaptans, die etwa 1 bis 5 Reste -SH pro Rest -SSO tief 3- ergibt, in einem waessrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 11,5 und bei einer S-Sulfonatkonzentration von bis zu etwa 10 mg/ml waessrigem Medium umgesetzt. Als Insulinvorlaeufer werden Verbindungen verstanden, die (1) eine Kette A von Insulin und eine Kette B von Insulin enthalten, (2) wenigstens drei Disulfidbindungen aufweisen, durch welche die Schwefelatome der einzelnen Cys-Reste in den Ketten A und B an den Stellungen (a) A-6 und A-11, (b) A-7 und B-7 oder (c) A-20 und B-19 miteinander verbunden sind, und (3) eine entfernbare Bruecke aufweisen, die sich zwischen der Kette A des Insulins an der Aminogruppe von A-1 und der Kette B des Insulins an der e-Aminogruppe des Lysinrestes an B-29 oder an der Carboxylgruppe des Aminosaeurerestes an B-30 befindet.

Description

-f-

X-5499A

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung: Verfahren zur Herstellung eines Insulinvorläufers Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung, eines Insulinvorläufers.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Während der letzten Jahre wurden die verschiedensten Versuche zur synthetischen oder halbsynthetischen Herstellung von Insulin vorangetrieben. Insulin ist ein Molekül mit zwei Peptidketten, nämlich einer Α-Kette aus 21 Aminosäureresten und einer B-Kette aus 30 Aminosäureresten. Diese Ketten enthalten drei Disulfidbrüeken, die jeweils von zwei

Cysteinylresten gebildet werden. 2'wei dieser Disulfidbrükken verbinden die Α-Kette mit der B-Kette. Die.von den Cysteinylresten gebildeten Brücken befinden sich in den Stellungen A-6 und A-11, A-7 und B-7 oder A-20 und B-19.

Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Insulin be- steht über Proinsulin oder ein proinsulinähnliches Molekül. Proinsulin ist ein einkettiges Polypeptide bei welchem das endständige Stickstoffatom der Kette A des Insulins über ein Brückenpeptid mit dem endständigen Kohlenstoffatom der Kette B des Insulins verbunden ist, wobei die entsprechenden Cysteinreste durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind. Humanproinsulin hat beispielsweise 86 Aminosäurereste, von denen 35 das Brückenpeptid bilden. Die Synthese verschiedener Brückenpeptide und von Humaninsulin wird beispielsweise in Diabetes 27 (Suppl. 1) 149 bis 160 (1978) beschrieben. , ·

Aus der Literatur gehen auch bereits andere proinsulinähnliche Moleküle hervor, deren wesentlicher Unterschied zum Proinsulin in der Struktur der-Brücke, die die Ketten A und B des Insulins verbindet,,und in der Position dieser Verbindung besteht. .

In Biochemistry 15, No. 8, 1649 bis 1657 (1976) wird von einer Brücke aus zwei Methionylresten berichtet, die an ihrem endständigen Stickstoffatom über eine Carbonylgruppe verbunden sind, wobei die sich hierdurch ergebende Brücke an das N^ -Endglied des A-1-Glycyls und das N —Endglied des B-29-Lysyls gebunden ist.

In ähnlicher Weise sind auch bereits andere Brücken beschrieben worden. Im einzelnen wird hier beispielsweise hingewiesen auf Biochem. and Biophys. Res. Comm. 55, 60 bis 66 (1973); Hoppe - Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 354, 613 bis

** J "

627 (1973); US-PS 3 847 893; US-PS 3 907 763; US-PS 3 883 496; US-PS 3 883 500 und US-PS 3 884 897.

Bei allen diesen Versuchen zur Herstellung von Insulin über eine einzelne Kette, die aus einer Kette A und einer Kette B von Insulin besteht, welche durch eine definierte Brücke verbunden sind, muß eine direkte Verbindung der Ketten A und B von Insulin durch Bildung von drei Disulfidbrücken durchgeführt werden, die von den sechs Cysteinylresten stammen, welche an den Ketten A und B vorhanden sind. Nach erfolgter Bildung der Disulfidbindungen wird die ursprüngli-• ehe Brücke unter Bildung von Insulin entfernt.

Zur Durchführung dieses Verfahrens zur Herstellung von Insulin braucht man unbedingt ein wirkungsvolles und einfaches ' Verfahren, durch welches sich die erforderlichen Disulfidbrücken sauber bilden lassen. Die in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bildung von Disulfidbrücken bestehen im allgemeinen in einer Luftöxidation der entsprechenden -SH-Strukturen. Die -SH-Struktur ist bekanntlich instabil, und der Vorläufer wird daher gewöhnlich mit einer S-Schutzgruppe gebildet, und zwar am besten mit einem S-Sulfonatrest (-S-SO₃ ). Diese literaturbekannten Methoden bestehen daher aus zwei Verfahrensstufen, nämlich einer Reduktion des S-Sulfonats zu -SH durch Behandlung mit einem Mercaptan und einer anschließenden Oxidation der hierdurch gebildeten- -SH-Verbindung mit Luft.

Eine mögliche Ausnahme von der bekannten und allgemein zweistufigen Verfahrensfolge, die jedoch in einer Kombination von Insulinketten A und B besteht und in keiner Disulfidbil— dung aus einem geradkettigen S-SuIfonatinsulinvorläufer, wird in Nature 188, 721 bis 724 (1950) beschrieben, worin möglicherweiseauch die Bildung von Insulin durch Kombination von A-^ und B-Ketten-S-Sulfonaten in einer einzelnen Lösung be-

inhaltet ist. . Die Einzelheiten dieses bekannten Verfahrens sind jedoch ziemlich skizzenhaft, wobei die auf lediglich die Wirksamkeit des gewonnenen Produkts bezogene Ausbeute nur 1 bis 2 % beträgt. In Proc. Intern. Congr. Endocrinal., 1207 bis 1215 (1965) wird dann eine gewisse Klarstellung der Einzelheiten dieses Verfahrens versucht, wobei in der auf Seite 1211 befindlichen Tabelle IV ein zweistufiges Verfahren vorgeschlagen wird, das in einer anaeroben S-Sulfonatreduktion und einer anschließenden Oxidation zum Disulfid besteht.

Aufgabe der Erfindung:

Die Erfindung hat sich nun die Aufgabe gestellt, ein einfaches und hochwirksames Verfahren zur direkten Umwandlung des S-Sulfonatinsulinvorläufers zum gewünschten Disulfidinsulinvorläufer zu schaffen. Es soll hierzu keine in zwei Stufen ablaufende Reduktion und Oxidation erforderlich sein. Statt dessen soll dieses Verfahren einen direkten Austausch unter Bedingungen ermöglichen, unter denen, wenn auch nicht unbedingt, so doch vorzugsweise in Abwesenheit eines Oxidationsmittels gearbeitet werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Insulinvorläufers der allgemeinen Formel

(5-1) R-HN-Phδ-

'A-s) 'yvs—S-(A-?).' Cys Cys-

(A-ii)

-Ly 3-

-X

(A-20) XA-21}

-Asr,-

-Cy₅-

(s-₁₉)

worin R Wasserstoff, ein chemisch oder enzymatisch abspaltbarer Aminosäurerest oder ein chemisch oder enzymatisch abspaltbarer Peptidrest mit wenigstens zwei Aminosäureresten

ist, Y für -Lys Z- steht, worin Z AIa, Thr oder Ser

(B-29) (B-30)

bedeutet, wobei die sich von A-1 bis A-21 erstreckende Brükke eine Kette A von Insulin ist, die sich von B-1 bis B-30 erstreckende Brücke eine Kette von Insulin B darstellt und X eine Brücke ist, welche an. der Aminogruppe von A-1. an die Kette A von Insulin und an der £-Aminogruppe von B-29 oder der Carboxylgruppe von B-30, an die Kette B von Insulin gebunden ist, wobei.diese Brücke enzymatisch oder chemisch ohne Zerstörung der Kette A und der Kette B gespalten werden kann,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein S-Sulfonat der allgemeinen Formel

( A-I) γ i y-N H -^- -

I · (Α-δ) .Cy s-S-SO ~ S-SO ~

ι ³I³

(n—7,i ^y S— — — — —w'y 3—

(Α—ι ι)

^;,3—ι; R-fiN-Phe-

(A-^o) (A-ai) -Cv s As η—OH

S-30

. 3

3-S0 "

I β)

worin R, X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer solchen Menge eines Mercaptans, die etwa 1 bis 5 Reste. -SH pro Rest -SSO-, ergibt, in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 11,5 und bei einer S-SuIfonatkonzentration von bis zu etwa 10 mg/ml wäßrigem Medium umsetzt.

Unter Insulinvorläufer wird vorliegend ein Molekül verstanden, das (1) eine Kette A von Insulin und eine Kette B von Insulin enthält, (2) wenigstens drei Disulfxdbindungen aufweist, durch welche die Schwefelatome der einzelnen Cys-Reste in den Ketten A und B an den Stellungen (a) A-6 und A-11, (b) A-7 und B-7 oder (c) A-20 und B-1'9 miteinander verbunden sind, und (3) eine entfernbare Brücke aufweist, die sich zwischen der Kette A des Insulins an der Aminogruppe von A-1 und der Kette B des Insulins an der £-Aminogruppe des Lysinrests an B-29 oder an der Carboxylgruppe des Aminosäurerests an B-30 befindet. .

Die Gruppe Z, die den B-30-Aminosäurerest von Insulin.definiert, kann AIa, Thr öder Ser sein. Diese Reste kommen bei den natürlichen Insulinen vor,· nämlich Thr bei Humaninsulin, AIa bei Rinderinsulin oder Schweineinsulin und Ser bei Haseninsulin.

Beim Rest R handelt es'sich um Wasserstoff., einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest mit wenigstens zwei Aminosäureresten. Bedeutet R einen. Aminosäurerest oder einen Peptidrest, dann stellt dieser Rest R eine Gruppe dar, die sich nach dem erfxndungsgemäßen Verfahren ohne Beeinträchtigung der Integrität der restlichen Insulinstruktur vom Insulinvorläufer abspalten läßt. Unter die Definition der Gruppe R fallen alle Aminosäurereste, wie sie bei Peptid-

resten verkommen. Beispiele für solche abspaltbare Aminosäurereste sind die Grundaminosäuren, wie Arginin (Arg) oder Lysin (Lys), sowie die Peptidreste, die an ihrer Carboxylgruppe durch solche Aminosäurereste abgeschlossen sind. Alle Reste dieser Art sind bei Behandlung mit dem proteolytischen Enzymtrypsin einer Spaltung zugänglich. Ein anderes Beispiel für einen solchen spaltbaren Aminosäurerest ist Methionin (Met) oder wiederum ein Peptidrest, dessen endständige Carboxylgruppe durch Met abgeschlossen ist. Solche Reste lassen- sich durch Behandlung mit Cyanogenbromid entfernen. Ein weiteres Beispiel ist Tryptophan (Trp) oder ein Peptidrest, dessen endständige Carboxylgruppe durch Trp abgeschlossen ist. Reste dieser Art können durch Behandlung mit N-Bromsuccinimid entfernt werden.

Die Verbindungsbrücke X zwischen dem Insulinvorläufer und dem geradkettigen S-Sulfonatinsulinvorläufer kann irgendeine Struktur haben. Vorzugsweise handelt es sich bei der Brücke X um ein Polypeptid. Dieses Polypeptid besteht im all-⁵ geme'inefi'aus wenigstens 2, vorzugsweise aus etwa 2 bis 35, und insbesondere aus etwa 6 bis 35, Aminosäurere"sten. Die Brücke X ist an die Kette A über die Aminogruppe von A-1 und an die Kette B über die Carboxylgruppe von B-30 gebunden. Stellt die Brücke X ein Peptid dar, dann handelt es sich hierbei insbesondere um ein natürliches Brückenpeptid eines Insulinvorläufers, und zwar im allgemeinen eines Insulins mit einer oder zwei Ketten A und/oder B, an die diese

Brücke gebunden ist. Beispiele für natürlich vorkommende Brückenpeptide sind folgende: .

Hase

Mensch :

Esel :

Pferd :

Ratte I :

Ratte II:

Schwein

Rind, : Lamm

-Arg-Arg-Glu-Val-Giu-Glu-Leu-Gln-Val-Gly-

Gln-Ala-Glu-Leu-Gly-Gly-GIy-Pro-Gly-Ala-

Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Ser-Ala-Leu-Glu-Ala-

Leu-Gln-Lys-Arg-. ·

-Ärg-Arg-Glu-Ala-Glü-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-

Gln-Val-Glu-Leu-Gly-GIy-Gly-Prc-Gly-Ala-

Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-

Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-P.ro-Gln-Val-Gly-

Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-

Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Aia-Leu-Glu-Gly-

Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-GIy-

Glu-Val-Glu-Leu-Gly-C-ly-Gly-Pro-Gly-Leu-

Gly-Gly-Leu-Glr.-Pro-Leu-Ala-Leu-Ala-Gly-

Pro-Gln-Gln-Lys-Arg-.

-Arg-Arg-Giu-Val-GIu-Asp-Pro-Gin-VaI-Pro-

Gln-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Glu-Ala-

Gly-Asp-Lsu-Gln-Thr-Leu-Ala-Leu-Glu-Val-

Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-,

-Arg-Arg-GIu-VaI-Gl u-Asp-Fr C-GIn-⁷VaI-AIa-

Gln-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-

GIy-Asp-Leu-Gln-Thr~Leu-Ala-Leu-Glu-Val-

Ala-Arg-Gln-Lys-Arg~.

-Arg-Arg-Glu-Äla-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Öly-

Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-

Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-

Gln-Lys-Arg-.

-Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gln-Val-Gly-Aia-Leu-.Glu-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Prc-Gln-Lys-Arg-.

Hund : -Arg-Arg-Asp-VaI-C-lu-Leu-Äla-Gly-AIa-Pr;

GIy-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu· Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-. Meerschweinchen:^: . -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-

Glu-Gln-Thr-Glu-Leu-Gly-Met-Gly-Leu-Gly· AIa-Gl y-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Glr.-Gly-Ala· Leu-Gln-Lys-Arg-.' Chinchilla : -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-

) Gly-Gln-Ala-Asp-Pro-Gly-Val-Val-Pro-Glu

Ala-Gly-Arg-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu

i Met-Thr-Leu-Gln-Lys-Arg-.

Ente ; : . -Arg-Arg-Asp-VaI-Glu-Gln-Prc-Leu-Val-

Asn-Gly-Pro-Leu-His-Gly-Glu-Val-GIy-Glu Leu-Pro-Phe-Gln-His-Glu-Giu-Tyr-Gln-Lys Arg-.

Die Aminosäuresequenz gemäß A-1 bis A-21, X und B-1 bis B-30 entspricht insbesondere der. natürlich vorkommenden Sequenz für die Kette A₇ die Peptidbrücke und die Kette B von Schweineproinsulin, Rinderproinsulin oder Humanproinsulin, und sie stammt vor allem von Humanproinsulin.

Die Verwendung der natürlichen Brückensequenz wird obigen Angaben zufolge zwar bevorzugt, doch lassen sich als Brükkenpeptid auch wesentlich kürzere Peptidsequenzen verwenden. Einzige Erfordernisse hierfür sind,daß diese Brückenpeptide (1) so lang sind, daß sie eine saubere Bildung der Disulf id'bindungen zwischen den Ketten A⁺ und B ermöglichen, und (2) vom Insulinvorläufer unter Bildung des gewünschten Insulins abspaltbar sind. Ein hierzu geeignetes typisches Dipeptid ist -Arg-Arg-. Ferner lassen sich auch Abwandlungen dieses Dipeptids mit der allgemeinen Formel -Arg-X'-Argverwenden, worin X¹ für wenigstens einen Aminosäurerest steht. Besonders bevorzugte Brückenpeptide sind -Arg-Arg-

Lys-Arg- und längerkettige Peptide der Struktur '-Arg-Arg-X -

- ίο -

Lys-Arg-, worin X wenigstens em Aminosäurerest ist und vorzugsweise zwei Aminosäurereste bedeutet. Hierzu gehören natürlich auch die natürlichen Brückenpeptide, von denen einige oben bereits beschrieben wurden.

Unter Voraussetzung der obigen Kriterien lassen sich auch hier wiederum die verschiedensten anderen Brückenreste verwenden. Handelt es sich bei diesen Brückenresten um ein PoIypeptid, dann sind die Verknüpfungsstellen "jeweils die endständige Aminogruppe der Kette A (A-1) und die endständige Carboxylgruppe der Kette B (B-30). Da der B-29-Aminosäurerest (Lys) jedoch eine £-Aminogruppe enthält, kann die Verbindung sbrücke an die Ketten A und B jedoch auch über die Aminogruppen bei A-1 und B-29 gebunden sein. Beispiele für bei diesem letztgenannten System brauchbare Brückenreste sind daher unter anderem Garbonylbis(methionyl) gemäß Biochemistry 15, No. 8, 1649 bis 1657 (1976), 2 ,2'-Sulfonylbis(ethoxycarbonyl) gemäß Hoppe-Sayler's Z. Physiol. Chem. 356, 1631 bis 1634 (1975) oder 2,7-Diaminosuberoyl gemäß Biochem. and Biophys. Res. Comm. 55, 60 bis 66 (1973).

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der geradkettige S-Sulfonatinsulinvorläufer mit einem Mercaptan in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 11,5 behandelt. Unter einem hierzu geeigneten Mercaptan wird selbstverständlich eine Verbindung verstanden, die wenigstens eine Gruppe -SH enthält. Einziger begrenzender Faktor für das bei diesem Verfahren einzusetzende Mercaptan ist, daß es wasserlöslich sein muß.

Beispiele für hierzu geeignete wasserlösliche Mercaptane sind Dithiothreitol, Dithioerythritol, 2-Mercaptoethanol, Methylthioglycolat, 3-Mercapto-1,2-propandiol oder 3-Mercaptopropionsäure. Es können zwar Mercaptane mit mehreren Mercaptogruppen verwendet werden, wie Dithiothreitol, wo-

bei Mercaptane mit einer einzigen Mercaptogruppe jedoch bevorzugt sind. Von diesen wird wiederum das 2-Mercaptoethanol besonders bevorzugt. .

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, dessen pH-Wert im allgemeinen durch Zugabe eines geeigneten Puffermittels auf dem jeweils gewünschten Wert gehalten wird. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums kann zwischen etwa 7 und 11,5 liegen. Ein pH-Wert von etwa 9,5 bis 10,5 wird bevorzugt. Erfindungsgemäß lassen sich daher alle Puffermittel verwenden, die über ein Puffervermögen innerhalb des oben erwähnten breiten pH-Bereichs verfügen. Beispiele für hierzu geeignete Puffermittel sind Phosphatpuffer, Tri(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), Boratpuffer oder Glycin.

Die Konzentration des Puffermittels im wäßrigen Medium ist im allgemeinen bis zu etwa 0,5-normal. Vorzugsweise ist das Puffermittel in einer etwa 0,005 bis 0,5-normalen Konzentration, und insbesondere in einer etwa 0,005 bis 0,1-normalen Konzentration vorhanden.

Der geradkettige S-Sulfonatinsulinvorläufer wird in das wäßrige Medium in einer Konzentration von nicht über etwa 10 mg/ml eingebracht. Vorzugsweise wird mit niedrigerer Konzentration gearbeitet, so daß die Konzentration im allgemeinen etwa 0,05 bis 2 mg/ml ausmacht.

Wichtig beim erfindungsgemäßen Verfahren ist die Anwendung einer bestimmten Menge an Mercaptan im Verhältnis zum geradkettigen S-Sulfonatinsulinvorläufer. Bei den bekannten Verfahren zur Reduktion von S-Sulfonat zu -SH wird mit einem sehr großen Überschuß an Mercaptan im Verhältnis zum S-Sulfonat gearbeitet. Ein so' großer Mercaptanüberschuß führt jedoch gewissermaßen zu einer Überschwemmung des als

Ausgangsmaterial· zu verwendenden S-SuIfonats, wodurch dieses S-Sulfonat vollständig zur entsprechenden Mercaptoverbindung reduziert wird. Infolgedessen mußte die als Zwischenprodukt auftretende M'ercaptoverbindung isoliert oder das Reaktionsgemisch hoch verdünnt· und dann in einer getrennten Stufe im allgemeinen unter Verwendung von Luft oxidiert werden, um hierdurch das -SH-Z'wischenprodukt zur gewünschten -S-S-Verbindung umzuwandeln. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf J. Biol. Chem. 238, 622 bis 627 (1963); Proc. Nat ¹I Acad. Sei. U.S.A. 60, 622 bis 629 (1968) und Diabetes 27 (Suppl. 1), 149 bis 160 (1978). ;

Beim erfindungsgemäßen Verfahren muß dagegen nur mit einer Mercaptanmenge gearbeitet werden, die-etwa 1 bis 5 Mercaptogruppen pro Gruppe -S-SO₃", und vorzugsweise etwa 2 bis 4 Mercaptogruppen pro Gruppe -SSO₃", ergibt. Durch Verwendung einer solchen Mercaptanmenge läßt sich der geradkettige S-Sulfonatinsulinvorläufer leicht und in. hoher Ausbeute direkt zum gewünschten Disulfidinsulinvorläufer umwandeln. Da die als Teil des geradkettigen S-SuIfonatinsulinvorEufers vorhandenen Ketten A und B.des Insulins sechs S-Sulfonatgruppen enthalten, würde beispielsweise ein Mercaptan, das nur eine einzige Mercaptogruppe enthä,lt, zur Erzielung der benötigten Mercaptanmenge unter einem Molverhältnis von etwa 6:1 bis 30:1 angewandt werden.

Die gegenseitige Beziehung von pH-Wert, Pufferstärke und Konzentration des .geradkettigen S-SuIfonatvorläufers ist für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wichtig, jedoch nicht unbedingt ausschlaggebend. Mit zunehmender Konzentration des geradkettigen S-Sulfonatinsulinvorläufers sollte man daher im allgemeinen den pH-Wert erhöhen und die Pufferstärke herabsetzen.

Ein ganz wesentlicher Unterschied zu den bekannten Verfahren ist für das vorliegende Verfahren darin zu sehen, daß hierbei nicht unbedingt in einer oxidierenden Atmosphäre gearbeitet werden muß. Es kann zwar hierbei auch ein Oxidationsmittel, wie Luft, im Reaktionsmedium vorhanden sein. Besonders bevorzugt wird das vorliegende Verfahren jedoch" in praktischer Abwesenheit von Luft oder einem sonstigen Oxidationsmittel durchgeführt. Unter einer solchen praktischen Abwesenheit wird verstanden, daß Luft nicht speziell zugesetzt wird. Dies läßt sich beispielsweise erreichen, indem man die Umsetzung in einem geschlossenen System durchführt, welches den Zugang von Luft oder einem sonstigen Oxidationsmittel ausschließt. Zu einer weiteren 'Sicherstellung einer Abwesenheit von Luft kann man das wäßrige Medium vor Zugabe der Reaktanten mit Stickstoff spülen oder von Gas befreien.

Ein weiteres zweckmäßiges, jedoch nicht unbedingt wesentliches Merkmal des vorliegenden Verfahrens ist die Einhaltung einer bestimmten Temperatur. Im allgemeinen wird dieses Verfahren bei Temperaturen zwischen etwa 0⁰C und 37°C durchgeführt. Bevorzugt wird eine Reaktionstemperatur am unteren Ende dieses Bereichs, nämlich eine Temperatur von etwa 2 bis 8⁰C, und insbesondere etwa 4 bis 6⁰C. Vorzugsweise wird das Verfahren jedoch bei zwei Temperaturbereichen durchgeführt. Das Reaktionsgeraisch wird bei etwa Raumtemperatur hergestellt, worauf man es auf etwa 2 bis 8⁰C abkühlt und während des Rests der Umsetzungszeit auf diesem Bereich hält.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher am besten so durchgeführt, daß man zunächst ein wäßriges Medium mit dem jeweils gewünschten pH-Wert bereitet, was sich beispielsweise durch Verwendung von Glycin in einer etwa 0,05-normalen Konzentration erreichen läßt. Das auf diese Weise hergestellte wäßrige Medium wird dann im allgemeinen auf einer Temperatur

von etwa 0⁰C bis 37⁰C, und vorzugsweise auf etwa Raumtemperatur, gehalten, von Gas befreit, mit Stickstoff gespült und erneut von Gas befreit. Sodann löst man den geradkettigen S-Sulfonatinsulinvorläufer in dem wäßrigen Medium in einer die gewünschte Konzentration ergebenden Menge, beispielsweise in einer Menge von etwa 0,1 mg/ml Medium. Das Mercaptan wird in solcher Menge zugesetzt, daß sich bis zu etwa fünf Gruppen -S.H pro Gruppe -S-SG-. ergeben. Das entstandene Gemisch wird dann praktisch frei von Luft oder einem sonstigen Oxidationsmittel gehalten, auf etwa 4 bis 6⁰C abgekühlt und bis zur Beendigung der Umsetzung auf dieser Temperatur belassen. Dies dauert im allgemeinen etwa 5 bis 72 Stunden, vorzugsweise etwa 15 bis 24 Stunden, und insbesondere etwa 18 bis 20 Stunden.

Nach beendeter Umsetzung kann man den als Produkt erhaltenen Insulinvorläufer in irgendeiner zur Reinigung von Insulin bekannten Weise isolieren. Am besten geschieht dies durch chromatographische Techniken unter Einschluß von beispielsweise Gelfiltration und lonenaustauschchromatographie.

Der erhaltene Insulinvorläufer läßt sich entweder enzymatisch oder chemisch unter Anwendung literaturbekannter Techniken in Insulin überführen. Hierzu gehört beispielsweise eine Spaltung unter Einsatz einer Kombination aus Trypsin und Carboxypeptidase B, wie dies aus. J. Biol. Chem. 246, 6786 bis 6791 (1971) hervorgeht.

Das in obiger Weise als Produkt erhaltene Insulin läßt sich bezüglich Reinheit und relativer Wirksamkeit durch Anwendung üblicher Methoden untersuchen, beispielsweise durch Elektrophorese mit Polyacrylamidgel, durch Aminosäureanalyse, durch einen Radiorezept'orversuch, einen Radioimmunversuch, durch Hochlexstungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Ultraviolettspektrum, Dansylierung, oder durch einen Hasen-

blut-glucose-Versuch.

Die als Ausgangsmaterialien benötigten geradkettigen S-SuIfο-natinsulinvorläufer sind durch Rekombinations-DNA-Methodologie zugänglich. Sie können ferner auch aus natürlichen Insulinen und Proinsulinen hergestellt werden sowie durch klassische Peptidsynthesen unter Anwendung von entweder Lösungstechniken oder Festphasentechniken.

Zur Herstellung eines geradkettigen S-Sulfonatinsulinvorläufers aus Proinsulin geht man beispielsweise wie folgt vor:

Man versetzt 100 ml einer abgekühlten und von Ionen befreiten wäßrigen 7-molaren Harnstofflösung mit 786 mg Natriumsulfit. Es wird solange gerührt, bis alles in Lösung gegangen ist. Sodann gibt man Natriumtetrathionat (59 4 mg) zu. Nach entsprechendem Rühren ist der Großteil des Natriumtetrathionat s in Lösung gegangen, die Lösung jedoch immer noch trüb. Hierauf wird der pH-Wert der Lösung mittels Eisessig auf 7,7 eingestellt. Unter Rühren gibt man dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigtes Rinderproinsulin (503 mg) zu. Sodann stellt man den pH-Wert der Reaktionslösung unter Verwendung·von 2-normalem Natrxumhydroxxd auf 7,6 ein. Die erhaltene leicht trübe Lösung wird dann 18 Stunden bei 6⁰C gerührt. .

Etwa die Hälfte, des in obiger Weise erhaltenen Reaktionsgemisches stellt man hierauf mit 2-normalem Natriumhydroxid auf pH 9,1 ein und gibt das Ganze dann auf eine mit Sephadex G-25 Grobkorn gefüllte Säule. Die chromatographische Reinigung wird.unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = 0,05-molares Ammoniumbicarbonat, pH-Wert =9,0, Säulengröße = 2 χ 90 cm, Temperatur. = 21°C> Fließgeschwindigkeit = 18,5 ml/min. Die zu Anfang kommende Eluatmenge von 120 ml wird verworfen, während man die danach kommenden 75 ml

Eluat auffängt-und aufhebt. Im Anschluß daran wird die Säule mit weiteren 400 ml 0,05-molarem Ammoniumbicarbonat vom pH-Wert 9,0' gewaschen. Dieses Verfahren wird auch für die zweite Hälfte der Reaktionslösung wiederholt. Durch ultraviolettspektroskopische Untersuchung der hierbei erhaltenen Materialien ergibt sich eine gesamte Produktmenge von 4 01 mg. Diese Materialien werden vereinigt und zur Trockne lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu insgesamt 445,7 mg trockenem und von Salz befreitem Produkt. Hierbei handelt es sich um cferadkettiges S-sulfoniertes Rinder-proinsulin_r das kein Ausgangsmaterial mehr enthält, was durch Elektrophorese mit Celluloseacetat und durch Gelelektrophorese mit PoIyacrylamidblättchen bestätigt wird.

Das geradkettige S-sulfonierte Rinderproinsulin wird durch Chromatographie mittels DEAE-Cellulose gereinigt. Zu diesem Zweck löst man das Rohmaterial (443 mg) in 10 ml einer Lösung, die 7,5-molar an Harnstoff, 0,01-molar an Tris und 0,001-molar an EDTA ist und einen pH-Wert von 8,5 hat, und bringt diese Lösung dann auf eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule auf. Die chromatographische Reinigung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = Lösung mit einem pH-Wert von 8,5, die 7,5-molar an Harnstoff, 0,01-molar an Tris und 0,001-molar an EDTA ist, wobei unter einem 0 bis 0,35-molaren Natriumchloridgradienten gearbeitet wird, Säulengröße = 2,5 χ 90 cm, Temperatur.= 4⁰C, Fließgeschwindigkeit = etwa 0,9 ml/min, Fraktionsvolumen = 5,3 ml.

Die Absorption bei 276 rau einer jeden Fraktion, aufgetragen gegen die Fraktionsnummer, ergibt einen großen Peak, der etwas ausschweift. Im UV~Spektrum zeigt sich, daß es sich bei diesem großen Peak um das gewünschte Produkt handelt. Die Fraktionen' 199 bis 240, die einem Eluatvolumen von 1069 bis 1291 ml entsprechen, werden vereinigt. Durch UV-Spektroskopie ergibt sich, daß in dem hierdurch erhaltenen Material

355 mg des gewünschten Produkts enthalten sind.

Das vereinigte Produkt wird zur Entsalzung auf eine mit Sephadex G-25 Grobkorn gefüllte Säule gegeben. Die chromatographische Reinigung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = 0,05-molares Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 8,0, Säulengröße = 3,7 χ 105 cm, Temperatur = 4°C, Fließgeschwindigkeit =16 ml/min. Die zu Beginn kommenden 395 ml Eluat werden verworfen, während man die danach kommenden 250 ml Eluat auffängt und aufbewahrt. Sodann wäscht man die Säule mit weiteren 2000 ml 0,05-molarem Ammoniumbicarbo.nat mit einem pH-Wert von 8,0. Durch UV-Spektroskopie der hierdurch erhaltenen Probe ergibt sich, daß sie 321 mg des gewünschten Produkts enthält. Die Probe wird zur Trockne lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu insgesamt 373 mg trockenem Material. Durch Gelelektrophorese mittels Polyacrylamidscheiben und durch Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie auf Basis der Elutionsstellung wird die Identität dieses Produkts bestätigt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.

.-18 - ζ-/ ö ο Z Z I

Äusführungsbeispiele: .

Beispiel 1 Anwendung einer Konzentration von 0,1 mg/ml .

Man löst 1,61 mg geradkettiges S-SuIfonatrinderproinsulin in 16/1 ml von Gas befreitem 0,05-molarem Glycin mit einem pH-Wert von 9,5. Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit 0,158 ml einer Vorratslösung von wäßrigem 2-Mercaptoethanol, die aufgrund einer Titration mit Ellman-Reagens über eine Mercaptankonzentration von 2,11 mg/ml verfügt. Dies entspricht 4 Äquivalent 2-Mercaptoethanol pro -SSO- im geradkettigen S-SuIfonatrinderproinsulin. Der pH-Endwert beträgt 9,46. Die bei Raumtemperatur hergestellte Lösung wird mit einer Parafolie verschlossen und dann unter Kühlen 19 Stunden bei 6⁰C gerührt.

Das Reaktionsgemisch wird anschließend mittels konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und 0,5-normalem Natriumhydroxid auf pH 4,0 -h 0,1 (Temperatureinstellung) angesäuert. Zur Isolierung und Kenntlichmachung des hierbei erhaltenen Produkts bedient man sich einer Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie, die unter folgenden Bedingungen durchgeführt wird: Säule = 1,1 χ 54 cm Glassäule, die mit LP-1/C..g gefüllt ist, das einen Kohlenstoffgehalt von 16,6 % aufweist, Lösungsmittel = 30 % Acetonitril und 70 % 0,1-molares Ammoniumformiat mit einem pH-Wert von 4,25, Temperatur = 21°C, Druck = 8028 g/cm², Fließgeschwindigkeit = 2,40 ml/min. Durch einen 5 ml Probeninjektor werden auf die Säule entsprechende Proben aufgegeben, die man bei 28 0 nm überwacht.

Die erste aufgegebene Probe' besteht aus 5 ml einer Vorratslösung von Rinderproinsulin mit einer nominalen Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml. Die zweite aufgegebene Probe be-

steht aus 5 ml des'angesäuerten Reaktionsgemisches. Die Gegenwart von monomerem Rinderproinsulin im Reaktionsgemisch wird'auf Basis der Elutionsposition verifiziert. Durch entsprechende Ausrechnung der Flächen der Peaks der beiden hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographischen Untersuchungen ergibt sich im Reaktionsgemisch eine Ausbeute an Rinderproinsulin von 82,6 %.

{ Beispiel 2

Anwendung einer Konzentration von 0,5 mg/ml

Man löst 25,07 mg geradkettiges S-SuIfonatrinderproinsulin in 50,14 ml von Gas befreitem 0,05-molarem Glycin mit einem pH-Wert von 10,51. Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit 1,302 ml einer Vorratslösung von wäßrigem 2-Mercaptoethanol, die aufgrund einer Titration mit Ellman-Reagens über eine Mercaptankonzentration von 2,10 mg/ml verfügt. Dies entspricht 2,1 Äquivalent 2-Mercaptoethanol pro "SSO₃ im geradkettigen S-SuIfonatrinderproinsulin. Der pH-Endwert beträgt 10,47. Die bei-Raumtemperatur hergestellte Lösung wird mit einer Parafolie verschlossen und dann unter Kühlen 18 Stunden bei 6⁰C gerührt. . '

Das Reaktionsgemisch wird dann auf pH 4,0 + 0,1 (Temperatureinstellung) unter Verwendung vonkonz. Chlorwasserstoffsäure und 0,1-.normaler Chlorwasserstoff säure angesäuert. Eine sich daran anschließende hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographische Analyse ergibt im Reaktionsgemisch eine Ausbeute an Rinderproinsulin von 69 %.

Nach entsprechender Entsalzung, wird'das Produkt durch Gelfiltrationschromatographie isoliert. Hierzu wird das Reaktionsgemisch mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 9,0

. - 20 -

eingestellt und auf eine mit Sephadex G-25 Grobkorn gefüllte Säule gegeben. Zur Entsalzung werden folgende chromatographische Bedingungen angewandt: Lösungsmittel = 0,05-molares Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 9,0, Säulengröße = 2 χ 90 cm, Temperatur = 21⁰C, Fließgeschwindigkeit = 18,5 ml/min. Die zuerst kommenden 120 ml Eluat werden verworfen, während man die danach kommenden 75 ml Eluat sammelt und aufhebt (Proteinsammlung). Sodann wäscht man die Säule mit weiteren 4 00 ml 0,05-molarem Ammoniumbicarbonat vom pH 9,0. Eine anschließende UV-spektroskopische Untersuchung der Proteinsammlung ergibt 21,6 mg an gewonnenem Protein. Die Proteinsammlung wird zur Trockne lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu insgesamt 22/21 mg trockenem und von Salz befreitem Protein.

Ein Teil dieses Materials (14,84 mg) wird in 5,5 ml 1,0-molarer Essigsäure gelöst. Durch UV-Spektroskopie der klaren Lösung ergibt sich eine Proteinkonzentration von 2,56 mg/ml. 5 ml dieser Lösung (12,8 mg durch UV-Analyse ermittelt) gibt man auf eine mit Sephadex G-50 Superfeinkorn gefüllte Säule auf. Die chromatographische Reinigung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = 1-molare Essigsäure, Säulengröße = 1,5 χ 100 cm, Temperatur = 21⁰C, Fließgeschwindigkeit = 0,19 ml/min, Fraktionsvolumen = etwa 1,9 ml.

Die Säule wird über Nacht mit 1-molarer Essigsäure eluiert, wobei man die Absorption bei 280 nm überwacht. Die hierdurch erhaltene Kurve weist zwei Peaks auf. Der erste kleinere Peak zeigt die aggregierten Formen von Rinderproinsulin. Der zweite Peak ist monomeres Rinderproinsulin. Durch Sammlung der den beiden Peaks entsprechenden Proben und Vereinigung der dabei erhaltenen Fraktionen ergeben sich folgende Eluatvolumina:

Sammlung I : Fraktionen 30 bis 46 (55,0 bis 84,0 ml, Peak = 70,4 ml)

Sammlung II: Fraktionen 47 bis 62 (84,0 bis 112,0 ml, · Peak = 99,8 ml).

Durch UV-Spektroskopie ergibt sich in der Sammlung I eine Produktmenge von 1,94 mg und in der Sammlung II eine Produktmenge von 10,11 mg. Dies macht insgesamt 12,05 mg Produkt aus und entspricht einer 94,1 %-igen Gewinnung der auf die Säule aufgegebenen gesamten Menge. Vom gesamten gewonnenen Produkt sind 83,9 % monomeres. Rinderproinsulin.

Beide Sammlungen werden zur Trockne lyophilisiert. Das in der Sammlung II enthaltene Produkt wird auf Basis der EIutionsstellung bei einer hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographischen Analyse als Rinderproinsulin verifiziert. Es wird ferner auch durch Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase.B unter Anwendung des Literaturverfahrens zur Herstellung von Rinderinsulin identifiziert.

Beispiel 3

Temperatureinfluß

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, um hierdurch den Einfluß der" Temperatur auf die Ausbeute an Rinderproinsulin aus geradkettigem S-SuIfonatrinderproinsulin zu bestimmen. Es wird unter folgenden Reaktionsbedingungen gearbeitet: Proteinkonzentratiori =0,1 mg/ml, Puffer = 0,05-molares Glycin, pH-Wert = 9,5, Mercaptan = 2-Mercaptoethanol in einer Menge von 4 Äquivalent -SH pro -SSO., , Zeit'= 18 Stunden.

Wird das Verfahren.bei· einer Temperatur von 21⁰C durchgeführt, dann ergibt.sich eine durch hochleistungsflüssigkeitschromatographische Analyse ermittelte Ausbeute an Proinsulin von 47 %. Vermischt man die Reaktanten dagegen bei 21⁰C und erniedrigt die Temperatur des Reaktionsgemisches dann auf 6⁰C, dann beträgt die Ausbeute 77 %.

/ Beispiel 4

Einfluß des pH-Werts

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, um hierdurch den Einfluß des pH-Werts auf die Ausbeute an Rinderproinsulin aus geradkettigem S-Sulfonatrinderproinsulin anhand einer Reihe gleichzeitig durchgeführter Umsetzungen zu zeigen. Es wird unter folgenden Reaktionsbedingungen gearbeitet: Proteinkonzentration = 0,5 mg/ml, Puffer = 0,05-molares Glycin, Mercaptan = 2-Mercaptoethanol in einer Menge von 2 Äquivalent an -SH pro "SSO₃ , Reaktionszeit =18 Stunden, Reaktionstemperatur = 6⁰C.

Aufgrund einer Bestimmung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergeben sich folgende Ausbeuten an Proinsulin:

Ausbeute in %

43,1 44,3 66,7 76,0 61,0

pH-Wert	9/0
	9,5
	0,0
1	0,5
1	1,0
1

• - 23 -

Beispiel Einfluß der Proteinkonzentration

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird zur Bestimmung des Einflusses der Proteinkonzentration auf die Ausbeute an Rinderproinsulin aus geradkettigem S-SuIfonatrinderproinsulin bei 'einer Reihe gleichzeitig durchgeführter Umsetzungen wiederholt. Hierbei werden folgende Reaktionsbedingungen angewandt: Puffer = 0,05-molares Glycin, pH-Wert = 9,5, Mercaptan = 2-Mercaptoethanol in einer Menge von 4 Äquivalent -SH pro -SSO₃", Reaktionszeit =18 Stunden, Temperatur = 6⁰C.

Durch Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie ergeben sich folgende Ausbeuten an Proinsulin:

Proteinkonzentration in mg/ml Ausbeute in %

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1/0

Eine Weitere Versuchsreihe wird unter Verwendung von 2 Äquivalent -SH pro -SSO., und Anwendung eines pH-Werts von 10,5 durchgeführt, wodurch man zu folgenden Ergebnissen gelangt:

78	,6
63	,4
46
37
25
12

.- 24 - i£ ö D £ L £

Proteinkonzentration in mg/ml Ausbeute in %

0,5 77,2

0,96 58,3

1,83 ' 19,5

4,2* 20,1

7,4* 19,6

* Verhältnis von -SH zu -SSO₃" = 1,2.

Beispiel 6 . Einfluß des Verhältnisses von -SH zu -SSO-."

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird zur Bestimmung des Einflusses des Verhältnisses von -SH zu -SSO₃ auf die Ausbeute an Rinderproinsulin aus geradkettigem S-Sulfonatrinderproinsulin anhand einer Reihe von gleichzeitig durchgeführten Reaktionen wiederholt. Es werden folgende Bedingungen angewandt: Proteinkonzentration = 0,5 mg/ml, Puffer = 0,05-molares Glycin, pH-Wert = 9,5, Reaktionszeit = 18 Stunden, Reaktionstemperatur = 6⁰C.

Durch Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie ergeben sich dabei folgende Ausbeuten an Proinsulin:

Verhältnis von -SH' zu -SSO., Ausbeute in %

4,0 30,8

2,0 ' 44,7

1/0 . 37,0

0,5 ' 4,5

Beispiel 7

Einfluß der Art des Mercaptans

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird zur Bestimmung des Einflusses der jeweiligen Struktur des Mercaptans auf die Ausbeute an Rinderproinsulin aus geradkettigem S-Sulfonatrinderproinsulin anhand einer Reihe von gleichzeitig durchgeführten Umsetzungen wiederholt. Es wird unter folgenden Reaktionsbedingungen gearbeitet: Proteinkonzentration = 0/1 mg/ml, Puffer = 0,05-molares Glycin, pH-Wert = 9,5, Mercaptan = 4 Äquivalent -SH pro -SSO₃", Reaktionszeit =18 Stunden, Reaktionstemperatur = 6⁰C.

Mercaptan Ausbeute in %

Dithiothreitol 39,3

Dithioerythritol " 34,9

Methylthioglycolat ' 56,1

3-Mercapto-1,2-propandiol 65,5

3-Mercaptopropionsäure 65,3

2-Mercaptoethanol 64,1

Beispiel 8 Einfluß der Art des Proteins

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird zur Ermittlung des Einflusses der Art des jeweiligen Proteins auf die Ausbeute an Proinsulin aus geradkettigein S-SuIfonatproinsulin bei einer Reihe von gleichzeitig durchgeführten Umsetzungen

wiederholt. Es wird unter folgenden Reaktionsbedingungen gearbeitet: Proteinkonzentration = 0,1 mg/ml, Puffer = 0,05-molares Glycin, pH-Wert = 9,5, Mercaptan = 2-Mercaptoethanol in einer Menge von 4 Äquivalent -SH pro "SSO₃ , Reaktionszeit =18 Stunden, Reaktionstemperatur = 6°C.

Durch Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie ergeben sich folgende Ausbeuten an Proinsulin: .

Geradkettiges S-SuIfonatproinsulin Ausbeute in %

Rind i 60,6

Schwein . 65,8

Beispiel 9

Herstellung von Humanproinsulin.

Man löst 169,3 mg biosynthetisch hergestelltes geradkettiges S-SuIfonathumanproinsulin in 338,6 ml von Gas befreitem 0,05-molarem Glycin mit einem pH-Wert von 10,54. Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit 7,71 ml einer Grundlösung von wäßrigem 2-Mercaptoethanol, die aufgrund einer Titration mit Ellrnan-Reagens eine Mercaptankonzentration von 2,08 mg/ml aufweist. Dies entspricht 2 Äquivalent 2-Mercaptoethanol pro -SSO-." in dem geradkettigen S-Sulfonathumanproinsulin. Mittels 5-normalem Natriumhydroxid stellt man den pH-Wert dann schließlich auf 10,52 ein. Die so erhaltene Lösung wird mit einer Parafolie verschlossen und 18 Stunden bei 6°C gerührt.

Das Reaktionsgemisch wird anschließend unter Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstöfsäure auf pH 2,9 +0,1.(Temperatureinstellung) angesäuert. Die erhaltene klare Lösung

- 27 - "

wird zur Entsalzung auf eine mit. Sephadex G-25 Grobkorn gefüllte Säule gegeben. Die chromatographische Reinigung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = .2 %-ige Essigsäure (Volumen/Volumen), Säulengröße = 5 χ 100 cm, Temperatur = 25°C, Fließgeschwindigkeit = 28,8 ml/ min, Fraktiorisvolumen = 20,2 ml.. .

Die zuerst kommenden 77 9 ml Eluat werden verworfen, während man die danach kommenden 464 ml Eluat sammelt und aufhebt. Auf Basis der überwachung der optischen Dichte bei 280 nm ergibt sich, daß es sich hierbei um die ProteinSammlung handelt. Die Säule wird mit weiteren 2500 ml 2 %-iger Essigsäure gewaschen. Entsprechende Berechnungen auf Basis des UV-Spektrums der ProteinSammlung ergeben eine Proteinmenge von 164 mg, was 101,9 % der auf die Säule aufgebrachten Proteinmenge entspricht (nämlich die theoretische Ausbeute der Reformationsreaktion) . Diese Sammlung wird eingefroren und zur Trockne lyophilisiert.

Das getrocknete Produkt wird durch Gelfiltrationschromatographie isoliert. Das getrocknete Material (ungewogen) wird in 20 ml 1-molarer Essigsäure gelöst. Die dabei erhaltene klare Lösung wird auf eine mit Sephadex G-50 Superfeinkorn gefüllte Säule gegeben.: Die chromatographische Reinigung wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel = 1-molare Essigsäure, Säulengröße = 2,5 χ 125 cm, Temperatur = 25°C, Fließgeschwindigkeit = ungefähr 0,82 ml/min, Fraktionsvolumen = ungefähr 4,92 ml.»

Die Säule wird über Nacht mit 1-molarer Essigsäure eluiert, wobei man die Absorption bei 28 0 nm überwacht. Die hierdurch erhaltene Kurve weist'zwei Peaks auf. Der erste kleinere Peak zeigt die aggregierten Formen'von Humanproinsulin. Der zweite Peak ist monomeres Humanproinsulin. Er weist ferner auch eine Frontseitenschulter auf. Drei Sammlungen von Fraktionen

werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt, wodurch sich folgende Elutionsvolumina ergeben:

Sammlung I : Fraktionen 46 bis 67 (218 bis 325,5 ml) Sammlung II : Fraktionen 68.bis.81 (325,5 bis 395,5 ml) Sammlung III: Fraktionen 82 bis 100 (395,5 bis 490,3 ml)

Anhand der UV-Spektren dieser Sammlungen werden folgende Proteinmengen errechnet:

Sammlung I : 22,1 mg Sammlung II : 28,3 mg Sammlung III: 103,6 mg

Hierdurch ergeben sich insgesamt 154 mg, was einer Rückgewinnung von 94 % der auf die Säule aufgegebenen Menge entspricht. Von dieser rückgewonnenen Produktmenge sind 67,3 % monomeres Humanproinsulin. Alle drei Sammlungen werden eingefroren und zur Trockne lyophilisiert.

Von der Sammlung III erhält man insgesamt 106,55 mg trockenes Material. Durch Aminosäureanalyse und Gelelek'trophorese mit Polyacrylamidscheiben ergibt sich, daß es sich hierbei um Humanproinsulin handelt. Ferner läßt sich dieses Material bei einer Hochleistungsflüssxgkeitschromatographie an einer Stelle eluieren, von der man weiß, daß sich hier im Verhältnis zu Rinderproinsulin nur Humanproinsulin eluieren läßt. Die Identität dieses Materials wird weiter auch durch Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase B unter Bildung von Humaninsulin verifiziert.

Claims

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Insulinvorläufers der allgemeinen Formel

(A-i) γ ί V-MH-

I
(A-s) ys—S-

(Α-7)

R-fW-Phe-

ys- Cy s

(A—305 (A—21 j

y s- Asn-r-GH

(3—?)

. (B-13/·

worin R Wasserstoff, ein chemisch oder enzymatisch abspaltbarer Aminosäurerest oder ein chemisch oder enzymatisch abspaltbarer Peptidrest mit wenigstens zwei Aminosäureresten ist, Y für -Lys-

-Z- steht, worin Z AIa, Thr oder Ser

(B-29) (B-30)

bedeutet, wobei die sich von A-1 bis A-21 erstreckende Brükke eine Kette A von Insulin ist, die sich von B-1 bis B-30 erstreckende Brücke eine Kette ^B.. von Insulin darstellt und X eine Brücke ist, welche an der Aminogruppe von A-1 an die Kette A von Insulin und an der C-Aminogruppe von B-29 oder der Carboxylgruppe von B-30, an die Kette B von Insulin gebunden ist, wobei .diese Brücke enzymatisch oder chemisch ohne Zerstörung der Kette. A und der Kette B gespalten werden kann,

dadurch gekennzeichnet, daß.man ein S-Sulfonat der allgemeinen Formel

(A-i) CfIy-N K-

ι · — —· i

(A-3> Cys-S-SO S-SO j

j ³ j . ³ (A-so) ίΑ-si) i

(A-?) Cys- Cy= ---Cys- Asn—CH \

R-H-N-Phe : -Cys- — .-Cys '.

worin R, X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer solchen Menge eines Mercaptans, die. etwa 1 bis 5 Reste -SH pro Rest -SSO₃" ergibt, in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 11,5 und bei einer S-SuIfonatkonzentration von bis zu etwa 10 mg/ml wäßrigem Medium umsetzt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Peptidbrücke ist, die an die Kette B des Insulins an.der Carboxylgruppe von B-30'gebunden ist.
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß

X für -Arg-X'-Arg- steht, wobei X¹ we-nigstens ein Aminosäurerest ist.
4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß

2 2

X für -Arg-Arg-X -Lys-Arg- steht, worin X wenigstens einen Aminosäurerest bedeutet.
5. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei .einem pH-Wert von etwa 9,5 bis 10,5 durchgeführt wird. .
6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Mercaptanmenge von etwa 2 bis 4 Mercaptogruppen pro Rest -SSO-. arbeitet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, dadurch 'gekennzeichnet, daß man die Umsetzung unter praktischer Abwesenheit eines Oxidationsmittels durchführt.
8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Konzentration von S-SuIfonat von etwa 0,05 bis 2 mg/ml wäßrigem Medium arbeitet.
9. Verfahren nach Punkt 1,2, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mercaptan 2-Mercaptoethanol verwendet.
10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 0⁰C bis 37⁰C durchführt.
11. Verfahren nach Punkt 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 2 bis 8°C durchführt.
12. Verfahren nach Punkt 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch bei etwa Raumtemperatur herstellt und die Umsetzung dann unter Kühlung auf eine Temperatur von etwa 2. bis 8⁰C durchführt.
13. Verfahren nach Punkt 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch durch Zugabe eines Puffermittels in einer etwa 0,005 bis 0,5-normalen Konzentration auf dem jeweiligen pH-Wert hält.

· - 32 -
14. Verfahren nach Punkt 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffermittel Glycin verwendet.
15. Verfahren nach einem der.vorhergehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, daß man ein S-SuIfonat verwendet, dessen Insulinketten A und B die Struktur von Humaninsulin haben.
16. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß X das Brückenpeptid von Humaninsulin ist.