HU185249B

HU185249B - Process for producing insulin precursor

Info

Publication number: HU185249B
Application number: HU81770A
Authority: HU
Inventors: Bruce H Frank
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1984-12-28
Also published as: EP0037255B1; DE3161475D1; EG15310A; PL230292A1; RO81951A; GB2073204B; PT72732A; IE51172B1; YU76881A; AR224933A1; RO81951B; DK149863C; PT72732B; GB2073204A; KR830005251A; AU6871981A; PL127843B1; ES8201957A1; KR840000946B1; FI810917L

Description

ElI LILLY AND COMPANY '/t jelentése -Lys-Ala- vagy -Lys-Thr, gyök jelentése egy inzulin A-lánc, gyök jelentése egy inzulin B-Iánc, és

X jelentése humán peptidszekvencia, sertés peptidszekvencia vagy szarvasmarha peptidszekvencia.

A találmány szerint egy II általános képletű S-szulfonátot, ahol a képletben X és Y, valamint az A—1 -tői Α-12-igés Β—1 -tői Β-30-ig gyök jelentése a fenti, vizes közegben, 7 és 11,5 közötti pH-értéknél, és ahol az S-szulfonát koncentrációja legfeljebb 2-merkapto-etanollal, ditiotreitollal, ditioeritriollal, metil-tioglikoláttal, 3-merkapto-l,2-propándiolla! vagy 3-merkapto-propionsavval 10 mg/ml, reagáltatjuk, és a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazzuk, melynél egy —SSO₃ ionra 1-5—SH csoport jut.

A kapcsolódó természetes peptidszekvenciák a következők:

Humán: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp, Leu-GlnVal-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-GlyGly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GlnPro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-LeuGln-Lys-Arg- (III képlet).

Ser és: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-GInAla-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly(A-<) Gly-NH---x

I (A-t,) c₃.-S-5 (*-,«,) _Ca-m) (A-7) Cys---Cm----Ctj» —Asn—OH (»-«) 1 í 1 (Β-ύ | | t^-Pha---Cy»---------Cy.--------Y (B-’) (B-n) ¢,) (A-ι) Gly-HH(A-í) Cy»-S-SO* 5-SOj -C_ai(A-ll) . 1- ' 1

Cy* C_a*--Cy» —A*n— OH s-so:

S-SO* (B-<) |

Ítfl-Phe---Cy*-(b-Ő

S-5O, s-so:

--Cy»-(B-ia) (i0

-1185 249

Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-LeuAla-Leu-Glu-Giy-Pro-Pro-Gln-LysArg- (IV képlet).

Szarvasmarha:

-Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-GlnVal-Gly-Ala-Leu-Glu-Leu-Aln-GlyGly-Pro-Gly-Ala-GIy-Gly-Leu-GluGly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg(V képlet).

A találmány tárgya eljárás új inzulin prekurzorok előállítására.

Az utóbbi években sokan próbálkoztak az inzulin szintetikus vagy féí-szintetikus úton való előállításával. Az inzulin molekula két pepiid láncot tartalmaz, az A-láncot, mely 21 aminosav maradékból és a B-láncot, mely 30 aminosav maradékból áll. Ezek a láncok három diszulfid hidat tartalmaznak, melyek mindegyike két-két ciszteinil maradékot köt össze. Két diszulfid híd kapcsolja az A-láncot a B-lánchoz. A cisztein maradékokat összekötő hidak az A-6 és B-19 helyen vannak.

Egy általános eljárás szerint az inzulint proinzulinból vagy egy proinzulinhoz hasonló molekulából állítják elő. Proinzulin egy olyan egyes polipeptid lánc, amelyben az inzulin Á-lánc N-terminális része egy pepiiden keresztül kapcsolódik az inzulin B-lánc C-terminális részéhez és a megfelelő cisztein maradékok diszulfid kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. Humán proinzulinnál, például amelyik 86 aminosav maradékból áll, a kapcsolódó peptidlánc 35 tagból áll. Yanaihara és munkatársai., Diabetes 27 (Pótl. 1) 149-160 (1978) egy kapcsolódó peptidlánc és humán proinzulin szintézisét ismerteti.

Az irodalomban más proinzulin-szerü molekulákat is leírtak, melyek a proinzulintól főleg a következőkben térnek el: más az inzulin A- és B-láncot összekötő csoport struktúrája és ez a csoport a lánc más pontjait kapcsolja össze.

így, Busse és munkatársai., Biochemistry 15. 8, 1649-1657 (1976) egy olyan kapcsolódást ismertet, ahol két metionil maradék az Ν-tenninális részhez egy karbonilcsoporttal kötődik és a maradék az A-l glicil N-terminális részhez és a B-29 lysil N-terminális részhez kötődik.

Hasonlóképpen, más kapcsolódó csoportok is ismeretesek. Lásd például, Geiger és munkatársai., Biochem., and Biophys, Rés. Comm. 55, 60-66 (1973); Brandenburg és munkatársai., HoppeSeyler’s Z. Physiol. Chem. 354, 613-627 (1973); 3 847 893, 3907 763, 3883496, 3 883 500 és

884897 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást.

Ha az inzulint egy meghatározott csoporttal öszs/.ekötölt inzulin A- és inzulin B-láncból álló egyes láncból állítjuk elő, akkor az inzulin A- és B-lánc közötti direkt kapcsolódást úgy kell létrehozni, hogy az A- és B-láncon lévő hat cisztein maradékot 3 diszulfid híd kösse össze. A diszulfid kötés kialakítása után pedig az eredeti összekötő csoportot az. inzulin képzéssel el kell távolítani.

Az inzulin előállításakor kívánatos, hogy megfelelő diszulfid hidak kialakítása egy hatásos és köny2 nyen elvégezhető eljárással történjen. Az irodalomban általában a diszulfid hidak kialakítására olyan módszereket írnak le, melyek során a megfelelő —SH struktúrákat levegőn történő oxidációnak vetik alá. Továbbá, az—SH struktúra instabilitása miatt a prekurzort szokásosan egy S-védőcsoporttál, jellegzetesen egy S-szulfonáttal (—S—SO₃) képzik. így az irodalomból ismert eljárások két egymás után következő műveletet foglalnak magukba, mégpedig az S-szulfonátnak egy merkaptánnal való kezelés során—SH-vá történő redukcióját és az ily módon nyert —SH vegyületnek levegő-oxidációját.

Kísérleteink’ során kidolgoztunk egy könnyen elvégezhető és igen hatásos eljárást az S-szulfonátnak a kívánt diszulfid inzulin prekurzorrá történő közvetlen átalakítására, mely eljárás nem redukción, illetve oxidáción alapul. Ez a direkt átalakítás olyan reakciókörülmények között hatásos, melynél, bár nem alapvető, oxidálószer nincs jelen. Ez az eljárás az, melyre a jelen találmány vonatkozik,

Dixon és munkatársai., Natúré 188, 721-724 (1960) a szokásosan alkalmazott két műveletből álló eljárás helyett egy más típusú eljárást ír le, melynél az inzulin A- és B-lánc egyesítését és nem a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzorból a diszulfid képzést alkalmazzák. Az eljárás szerint az A- és B-láncú S-szulfonátokat egy oldatban egyesítik. A leírás azonban az eljárást csak vázlatosan ismerteti, és a kitermelés, mely a visszanyert termék aktivitásán alapul, csak 1-2%. Egy későbbi publikáció, Dixon, Proc. Intern. Congr. Endocrinal. 2, London, 1964, 1207-1215 (1965), kissé részletesebben ismerteti az eljárást (a IV. táblázatban és a 1211. oldalon), mely két műveletből áll, mégpedig egy anaerob S-szulfonát redukcióból és az ezt követő oxidációból, és ily módon a kívánt diszulfid terméket állítják elő.

A jelen találmány tárgya eljárás I általános képletü inzulin prekurzor előállítására, ahol a képletben

Y jelentése -Lys-Ala- vagy -Lys-Thr,

A-2Hg jelentése egy inzulin A-lánc;

B^Vig ^^0^ jelentése egy inzulin B-lánc; és

X jelentése 111 képletü humán peptidszekvencia, IV képletü sertés peptidszekvencia vagy V képletü borin peptidszekvencia, mely eljárás során egy II általános képletü S-szulfonátot, ahol a képletben

X és Y, valamint az A-1-től Α-21-ig és B-1-től B-30-ig gyök jelentése a fenti, vizes közegben, 7 és

11,5 közötti pH-értéknél, és ahol az S-szulfonát koncentrációja legfeljebb 10 mg/ml, 2-merkaptoetanollal, ditiotreitollal, ditioeritriollal, metil-tioglikoláttal, 3-merkapto-l,2-propándiol!al vagy 3-merkapto-propionsavval reagáltatjuk, és a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazzuk, melynél egy—SSO₃-ionra 1-5—SH csoport jut.

A jelen munkában használt „inzulin prekurzor” kifejezés egy olyan molekulát jelent, amely (1) egy inzulin A-láncot és egy inzulin B-láncot tartalmaz, (2) legalább három diszulfid kötése van, és ezek az

185 249

A- és B-láncban (a) az A-6 és A-l 1-nél, (b) az A-7 és Β-7-nél, illetve (c) az A-20 és B I9-nél lokalizált Cys csoportok kénatomjait kapcsolják össze, és (3) egy eltávolítható kapcsolódó csoportot tartalmaz, mely összeköti az inzulin A-láncot az inzulin B-lánccal, azaz az A-l amino-csoportot a B-29 helyen lévő lizin maradék -amino-csoporljával, vagy a B-30 helyen lévő aminosav maradék karboxil-csoportjával köti össze.

Az inzulin prekurzor és a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor X kapcsolódó csoportja egy polipeptid. Az X csoport az A-lánchoz az Α-Γ amino-csoportnál és a B-lánchoz a B-30 karboxicsoportnál kapcsolódik, és az egy inzulin prekurzor természetes kapcsolódó peptidje. Az inzulin általában az A- és B-lánc közül az egyikkel vagy mindkettővel jellemezhető. A természetes kapcsolódó peptidek a következők:

Humán: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-GlnVal-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-GlyGly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GlnPro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-LeuGln-Lys-Arg- (III képlet).

Sertés: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-GInAla-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-GlyG ly- Leu-G ly-G ly- Leu-G In-Alá- LeuAla-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-LysArg- (IV képlet).

Szarvasmarha:

-Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-GlnVal-Gly-Ala-Leu-Glu-Leu-Aln-GlyGly-Pro-Gly-AIa-Gly-Gly-Leu-GluGly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg(V képlet).

Az aminosav sorrend tehát az A-l-től A-21-ig, a B-1 -tői Β-30-ig és az X csoportnál megegyezik a sertés, szarvasmarha vagy humán proinzulin, legelőnyösebben a humán proinzulin A-láncánál, kapcsolódó peptidjénél és a B-láncanál természetes úton kialakult aminosav sorrenddel.

A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél az egyenes láncú S-szulfonát inzulin prekurzort vizes közegben, 7 és 11,5 közötti pH-értéknél, egy merkaptánnal kezeljük. A merkaptán természetesen egy olyan vegyületet jeleni, mely legalább egy—SH csoportot tartalmaz. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazható merkaptánnak vízoldhatónak keli lennie.

Ilyen vízoldható merkaplánként ditiotreitol, ditioeritriol, 2-merkaptoetanol, metil-tioglikolát, 3-merkapto-l,2-propándiol és 3-merkapto-propionsav alkalmazható. Ezek közül igen előnyös a 2-merkaptoetanol.

A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél felhasznált vizes közeghez általában egy pufferoló szert adunk azért, hogy a kívánt pH-érték ne változzon. A közeg pH-ja 7 és 11,5 közötti érték lehet, de előnyösen a pH = 9,5-10,5. így a találmány szerinti eljárásban bármely olyan pufferoló szer alkalmazható, melynek puffer-kapacitása a fent említett tartományon belül van. Alkalmas pufferoló szerek például a foszfát pufferek, tri (hidroximetil).annnomelán (Tris), borát pufferek, glicin és hasonlók.

A vizes közegben a pufferoló szer koncentrációja általában legfeljebb 0,5 n, előnyösen 0,005 n és 0,5 n közötti érték, még előnyösebben pedig 0,005 n és körülbelül 0,1 n közötti érték.

A lineáris láncú S szulfonát inzulin prekurzor koncentrációja a vizes közegben legfeljebb 10 mg/ml. Előnyösen azonban í koncentráció alacsonyabb érték, általában 0,05 mg/ml és 2 mg/ml közötti érték.

A jelen találmány szerinti eljárás egy fontos eleme a felhasznált merkaptánnak az egyenes láncú S-sz.ulfonát inzulin prekurzorhoz viszonyított mennyisége. Az eddig alkalmazott módszereknél az S-szuífonátnak —SH-vá történő redukcióját az S-szulfonáthoz viszonyítva nagy feleslegben alkalmazott merkaptánnal végezték. Nyilvánvalóan ilyen nagy feleslegben alkalmazott merkaptán hatására az S-szulfonát kiindulási vegyület teljes mértékben a megfelelő —SH vegyületté redukálódott. Ez viszont szükségessé tette az —SH intermedier izolálását vagy a reakcióelegy nagymértékű felhígítását és ezután pedig az oxidációt, általában levegőn történő oxidációt azért, hogy az—SH vegyület a kívánt —S—S— vegyületté átalakuljon. Lásd például a Creslfteld és munkatársai, J. Biot Chem. 238, 622-627 (1963); Sleiner és munkatársai, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 60, 622-629 (1968); és Yanaihara és munkatársai Diabetes 27 (1. melléklet) 149-160 (1978).

A találmány szerinti eljárásnál kívánatos a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazni, hogy minden —S—SO₃ ionra 1-5 —SH csoport jusson és előnyösen olyan mennyiségben, melynél egy —SSO, ionra 2-4—SH csoport jut. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a merkaptánt a fenti mennyiségben alkalmazva a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor direkt módon igen jó hatásfokkal és könnyen átalakítható a kívánt diszulfid inzulin prekurzorrá. Mivel az inzulin A- és B-lánc, mely a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor részeként van jelen, ha S-szulfonát csoportot tartalmaz, így a merkaptánt, ha az csak egy —SH csoportot tartalmaz, természetesen olyan mennyiségben kell alkalmazni, hogy a mól arány 6 : 1 és 30 : 1 értékek között legyen.

Mivel a pH-érték a puffer erőssége és a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor koncentráció értéke lényeges, bár nem alapvető, a reakció kivitelezésénél ezeket kell figyelembevenni. Általában előnyös a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor koncentrációjának növelésével a pH-értéket növelni és a puffer erősségét csökkenteni.

Teljesen eltérően az irodalomban eddig ismertetett eljárásoktól, a találmány szerinti eljárásnál nem alapvetően lényeges, hogy azt valamely oxidáló atmoszférában végezzük. Bár egy oxidálószer, például levegő, a reakcióközegben jelen lehet, vizsgálataink azt mutatták, hogy előnyös a reakció kivitelezését lényegileg levegő- vagy más oxidálószertől mentes körülmények között végezni. A „lényegileg mentes” kifejezés csak azt jelenti, hogy bvegö-hozzáadást kerülni kell. Ezt például elérhetjük oly módon, hogy a reakciót zárt rendszerben végezzük és így megakadályozzuk azt, hogy a levegő vagy más oxidálószer rendelkezésre álljon. Továbbá a levegő mentes közeget úgy is biztosíthatjuk, hogy a reagensek hozzáadása előtt a vizes közeget nitrogéngázzal átfúvatjuk, majd a gázt eltávolítjuk.

Igen lényeges még, bár ez sem alapvető, hogy a találmány szerinti eljárást milyen hőmérsékleten végezzük. Az eljárást általában 0 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Előnyös, ha a reakcióhőmérséklet minél kisebb érték, általában 2 °C és 8 °C közötti, még előnyösebben 4 ’C és 6 °C közötti érték. Ennél is előnyösebb, ha az eljárásnál két hőmérsékletértéket alkalmazunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten állítjuk elő, majd 2 °C és 8 ’C közötti értékre lehűtjük és a hőmérsékletet a reakció ideje alatt ezen az értéken tartjuk.

A jelen találmány szerinti eljárásnál tehát először előállítjuk a kiválasztott pH-jú vizes közeget, mely például körülbelül 0,05 n-nak megfelelő mennyiségű glicint tartalmaz. Az így előállított vizes közegből, melyet általában 0 °C és 37 °C közötti hőmérsékletértéken, előnyösen szobahőmérsékleten tartunk, a gázokat eltávolítjuk, azután nitrogéngázzal átfúvatjuk, majd újból gáztalanítást végzünk. Ezután a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzort feloldjuk a vizes közegben, mégpedig olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja például 0,1 mg/ml legyen, majd annyi merkaptánt adunk hozzá, hogy egy —S—SO₃ ionra legfeljebb öt —SH csoport jusson. Az így nyert reakcióelegyet, melyet lényegileg levegőtől vagy más oxidálószertől mentes körülmények között tartunk, lehűtjük 4 °C és 6 °C közötti értékre és ezen a hőmérsékleten tartjuk addig, míg a reakció teljesen végbemegy. A reakció általában 5-72 óra alatt, rendszerint 15-24 óra alatt és szokásosan 18-20 óra alatt megy végbe.

Miután a reakció reljesen végbement, az inzulin prekurzor terméket számos módszerrel izolálhatjuk, melyek jól ismertek és amelyek az inzulin tisztítására felhasználhatók. E célra leggyakrabban kromatográfiás eljárásokat, például gél-szürésí és ioncserélő kromatográfiát alkalmazunk.

Az ily módon,előállított inzulin prekurzor vagy enzimatikusan vagy kémiai úton, az irodalomban leírt eljárások valamelyikével, inzulinná átalakítható. Ilyen eljárás például az, melynél a hasításra tripszin és karboxipeptidáz B kombinációját használják, ahogyan azt Kemmier és munkatársai, J. Bioi. Chem. 246, 6786-6791 (1971) ismerteti.

Az inzulin termék tisztasága és relatív aktivitása például poliakrilamid-gél elektroforézis, aminosav analízis, radioreceptor-vizsgálat, radioimmun-vizsgálat, nagyteljesítményű folyadék-kromatográfia (HPLC), ultraibolya spektrum, fajsúlymérés, nyúl vércukorszint vizsgálat és más hasonló módszer alkalmazásával vizsgálható.

A lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor kiindulási anyagok előállíthatok DNS rekombinációs módszerekkel, továbbá természetes inzulinokból és proinzulinokból, valamint számos ismert peptid-szintézissel is, így például oldat vagy szilárdfázisú technikák alkalmazásával.

Egy lineáris láncú 3-szulfonát inzulin prekurzort proinzulinból az alábbiak szerint állítottunk elő: 100 ml hirtelen lehűtött, 7 molos karbamid-oldathoz hozzáadtunk 786 mg nátriumszulfitot és a teljes oldódásig kevertük. Ezután 594 mg nátriumtetratio4 nátot adtunk hozzá és addig kevertük, míg a nátriumteírationát legnagyobb része feloldódott, azonban az oldat így is zavaros volt. A pH-t jégecettel 7,7-re beállítottuk, majd keverés közben 503 mg HPLC szerint tiszta szarvasmarha proinzulint adtunk hozzá. Az oldat pH-ját 2 n nátriumhidroxiddal 7,6-ra állítottuk és az így nyert enyhén zavaros oldatot 6 °C hőmérsékleten 18 órán át kevertük.

A reakcióelegynek körülbelül felét 2 n nátriumhidroxiddal kezeltük úgy, hogy a pH 9,1 legyen, majd Sephadex G-25 Coarse oszlopon kromatografáltuk. A kromatográfiás reakciókörülmények a következők voltak: oldószer 0,05 mólos ammóniumhidrogénbikarbonát; pH 9,0; 2 x 90 cm-es oszlop; 21 °C-os reakcióhőmérséklet; 18,5 ml/perces átfolyási sebesség. Az eluátum első 120 ml-ét elöntöttük, a következő 75 ml-t egyesítettük és eltettük. Az oszlopot ezután további 400 ml 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonáttal (pH 9,0) mostuk. Ezt az eljárást a reakcióelegy másik felével megismételtük, A két eljárás során nyert eluátumokat, melyek az UV spektrum szerint összesen 401 mg anyagot tartalmaztak, egyesítettük és liofilizálással szárítottuk. Ily módon összesen 445,7 mg száraz sómentes terméket nyertünk. Cellulóz-acetát elektroforézissel és poliakrilamid gél-lemezes elektroforézissel igazoltuk, hogy a reakció során előállított termék a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulin és kiindulási anyag már nem volt jelen.

A lineáris láncú S-szulfonált szarvasmarha proinzulint DEAE cellulóz kromatográfiás eljárással tisztítottuk. A nyers mintát (443 mg) feloldottuk

7,5 mól karbamid-0,01 mól trísz 0,001 mól EDTA elegyben, a pH 8,5 volt, és az oldatot egy DEAE cellulóz oszlopra vittük fel. A kromatográfiás eljárást a következő reakciókörülmények között végeztük: az oldószer 7,5 mól karbamíd - 0,01 mól trisz-0,001 mól EDTA; pH 8,5, 0-0,35 mól nátriumklorid grádienssel; oszlop mérete 2,5 x 90 cm; hőmérséklet 4 °C; átfolyási sebesség 0,9 ml/perc; frakciótérfogat 5,3 ml.

276 nm-nél megmértük az egyes frakciók abszorpcióképességét és ezt a frakciók számának függvényében ábrázolva egy enyhe lefutású görbét kaptunk, melynek egy nagy csúcsa (maximuma) volt. Az UV spektrumon lévő csúcs a terméket jelezte. Az 1069-1291 ml térfogatú, 199-240 frakciókat egyesítettük. Ez az UV spektrum szerint 355 mg terméket tartalmazott.

A terméket tartalmazó eluátumot Sephadex G-25 Coarse oszlopon sómentesítettük. A kromatográfiás eljárás reakciókörülményei a következők voltak: oldószer 0,05 mól ammóniumhidrogénkarbonát; pH 8,0; oszlop mérete 3,7 x 10 cm; hőmérséklet 4 °C; átfolyási sebesség 16,0 ml/perc. Az eluátum első 395 ml-ét elöntöttük, a következő 250 ml-t összegyűjtöttük és eltettük. Az oszlopot ezután további 2000 ml 0,05 mólos ammóniurnhidrogénkarbonáttal mostuk (pH 8,0). Az eluátumot, mely az U V spektroszkópiás vizsgálat szerint 321 mg anyagot tartalmazott, liofilizáltuk. Az ily módon nyert 373 mg vízmentes termék azonosságát poliakrilamid gél-lemezes elektroforézises vizsgálattal és az eluátumnak nagy teljesítményű kis nyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálatával igazoltuk.

185 249

Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás további magyarázatául szolgálnak, de nem korlátozzák annak oltalmi körét.

1. példa

0,1 mg/ml-es koncentráció

1,61 mg lineáris láncú S-szulfonát bovin proinzulint feloldunk 16,1 ml gázmentesített 0,05 mólos glicinben, a pH 9,5; és ehhez az oldathoz hozzáadunk 0,158 ml vizes 2-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman’s reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,11 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy 4 mól 2-merkaptoetanol jut egy —SSO₃ ionra, mely a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinban van. A reakcióelegy pH-ja 9,46. A szobahőmérsékleten előállított oldatot tartalmazó edényt paraffinfilmmel lezárjuk, majd 6 °C-ra lehűtve 19 órán át keverjük.

A reakcióelegyet ezután koncentrált sósav és 0,5 N nátriumhidroxid felhasználásával megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 4,0 ±0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). A terméket izoláljuk és nagy teljesítményű kisnyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLPLC) vizsgáljuk. A HPLPLC-nél a reakciókörülmények; oszlop, 1,1x54 cm-es üveg oszlop, mely 16,6% széntartalmú LP--1/C,₈ töltetet tartalmaz oldószer 30% acetonitril 70% 0,1 mólos ammóniumformiát, pH 4,25; hőmérséklet 21 °C; nyomás 8028 g/cm²; átfolyási sebesség 2,40 ml/perc. A mintákat egy 5 rnl-es fecskendővel visszük fel az oszlopra és a vizsgálatot 280 nm-nél végezzük.

Az első vizsgált minta egy 0,1 mg/ml-es nominális protein koncentrációjú szarvasmarha proinzulin törzsoldat 5 ml-e és a második minta 5 ml megsavanyított reakcióelegy. A reakcióelegyben a monomer szarvasmarha proinzulin jelenlétét az eluálás alapján igazoljuk. A két HPLPLC görbe csúcsának területéből kiszámítható, hogy a szarvasmarha proinzulin kitermelése (a reakcióelegyben) 82,6%.

2. példa:

0,5 mg/ml-es koncentráció

25,07 mg lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulint feloldunk 50,14 ml gázmentesített 0,05 mólos glicinben, pH 10,51 és ehhez az oldathoz hozzáadunk 1,302 ml vizes 3-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,10 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy 2,1 mól 2-merkaptoetanoÍ jut egy —SSO₃ ionra. A reakcióelegy pH-ja 10,47. A szobahőmérsékleten előállított oldatot tartalmazó edényt paraffinfilmmel lezárjuk, majd 6 °C-ra lehűtve 18 órán át keverjük.

A reakcióelegyet ezután koncentrált sósav és 0,1 N sósav felhasználásával megsavanyitjuk úgy, hogy a pH 4,0 ±0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). A reakcióelegynek HPLPLC-vel történő vizsgálata szerint a szarvasmarha proinzulin kitermelése 69%.

A terméket, sómentesítés után gél-szüréses kromatográfia alkalmazásával izoláljuk. A reakcióelegy pH-ját koncentrált ammóniumhidroxiddal

9,0-re beállítjuk és egy Sephadex G-25 Course oszlopon kromatografáljuk. A sómentesítést szolgáló kromatográfiás eljárás körülményei a következők: oldószer 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonát; pH 9,0; oszlop mérete 2 x 90 cm; hőmérséklet 21 °C; átfolyási sebesség 18,5 ml/perc. Az eluátum első 120 ml-él elöntjük, a következő 75 ml-t egyesítjük és eltesszük. Ezután az oszlopot további 400 ml 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonáttal mossuk, pH érték 9,0. A protein tartalmú eluátum UV spektroszkópíás vizsgálata szerint a visszanyert protein 21,6 g. Az eluátumot liofilizáljuk és ily módon 22,21 mg száraz, sómentes proteint nyerünk.

Ebből az anyagból 14,84 mg-ot 5,5 ml 0,1 mólos ecetsavban feloldunk és az így nyert tiszta oldatban a protein koncentráció 2,56 mg/ml. Ebből az oldatból 5 ml-t (UV vizsgálat szerint 12,8 mg) Sephadex G- 50 Superfine oszlopon kromatografálunk. A kromatográfiás reakció körülményei a következők: oldószer 1 mólos ecetsav; oszlop mérete

1,5 x 100 cm; hőmérséklet 21 °C; átfolyási sebesség 0,19 ml/perc; frakció térfogata körülbelül 1,9 ml.

Az oszlopot egy éjszakán át 1 mólos ecetsavval elváljuk és az eluátumnak 280 nm-nél mért abszorpcióját grafikonon ábrázoljuk. A görbén látható két csúcs körül az első a kisebb csúcs, az agregált szarvasmarha proinzulint, és a második pedig a monomer szarvasmarha proinzulint jelzi. A frakciókat egyesítjük és ezek térfogata a következő:

Eluátum I: 30^16 frakciók (55,0-84,0 ml; csúcs 70,4 ml)

Eluátum II: 47-62 frakciók (84,0-112,0 ml; csúcs 99,8 ml).

Az UV spektroszkópíás vizsgálat szerint az eluátum I-ben 1,94 mg és az eluátum II-ben 10,11 mg van, mely összesen 12,05 mg és ez azt jelenti, hogy az oszlopra felvitt mennyiség 94,1%-át nyerjük vissza. Ennek a visszanyert anyagnak 83,9%-a monomer szarvasmarha proinzulin.

Mindkét eluátumot liofilizáljuk. Az eluátum Il-nek HPLPLC-vel történő vizsgálata megerősítette, hogy ez termékként szarvasmarha proinzulint tartalmaz. Igazolja ezt az állítást az is, ha ezt az irodalomból ismert eljárás alkalmazásával tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel kezeljük, akkor szarvasmarha inzulint nyerünk.

Az aminosav-atialízis az alábbi eredményeket adta (összehasonlításként a természetes szarvasmarha inzulin és a természetes proinzulinból készített szarvasmarha inzulin analízisét is elvégeztük):

	Természetes inzulin	Inzulin természetes proinzulin- ból	Inzulin az előállított proinzulinból
Alá	2,93	2,92	2,93
Asp	2,97	2,98	2,98
Thr	0,96	0,91	0,93
Ser	2,56	2,57	2,60
Glu	7,11	7,16	7,14
Pro	0,88	0,85	0,79
Gly	4,04	4,02	4,02
’/’ Cys	5,47	5,00	5,45

	Természetes inzulin	Inzulin természetes proinzulin- ból	Inzulin az előállított proinzulinból
Val '	4,49	4,54	4,51
lle	0,54	0,58	0,55
Leu	5,87	5,83	5,86
Tyr	3,90	3,84	3,93
Phe	2,88	2,83	2,89
His	1,93	1,90	1,99
Lys	0,99	1,06	1,19
Arg	0,99	0,98	0,99

3. példa:

A hőmérséklet hatása

5. példa:

A protein hatása ₅ Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk a protein koncentrációnak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. Több reakciót egy_1C időben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaptoetanol, melynél egy —SSÓ7 ionra 4 mól —SH csoport jut; reakcióidő

1₅ 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C.

A proinzulin terméket, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint az alábbi kitermelésben nyertük:

Az 1. példa szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a hőmérsékletnek a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. A reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaptoeíanol, melynél egy —SSO₃ ionra 4 mól —SH cső port jut; reakcióidő 18 óra.

Ha a reakció kivitelezését 21 °C hőmérsékleten végeztük, akkor a proinzulin kitermelés HPLPLC vizsgálat szerint 47% volt. Ha a reagenseket 21 °C-on elegyítettük, majd az elegy hőmérsékletét 6 °C-ra csökkentettük, akkor a kitermelés 77% volt.

Protein koncentráció (mg/ml) Kitermelés (%)

0,1 78

0,2 63

0,3 46

0,4 37,6

0,5 25,4

1,0 12

Egy másik reakció-sorozatnál, ahol egy — SSO, ionra 2 mól — SH csoport jutott és ahol a pH 10,5 volt, az alábbi eredményeket nyertük:

Protein koncentráció (mg/ml) Kitermelés (%)

4. példa:

A pH hatása

Az 1. példa szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a pH-nak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított bovin proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0.5 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaploetanol, hogy egy —SSO,” ionra 2 mól —SH csoport jusson; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C.

PH

Kitermelés (%)

9,0

9.5 10,0

10.5 11,0

43,1

44,3

66,7

76,0

61,0

0,5

0,96

1,83

4,2*

7,4* * — SH:—SSO; arány = 1,2

77.2

58.3

19.5 20,1

19.6

Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk az —SH: —SSO₃ aránynak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,5 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; reakcióidő 18 óra; reakcióhömérséklet 6 ’C.

A proinzuünl, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük:

— SH:—SSO, arány

4,0

2,0

1,0

0,5

Kitermelés (%) '”10,8

44,7

37,0

4,5

7. példa:

A merkaptán reagens hatása

Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk, hogy a lineáris láncú S-szulfonát szarvas65 marha proinzulinból előállított szarvasmarha pro-6185 249 inzulin kitermelésre a különböző típusú merkaptánok milyen hatással vannak. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán, egy —SSO ónra 4 mól —SH csoport jut; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C.

A proinzulint, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük: Merkaptán Kitermelés (%)

ditiotreitol	39,3
ditioeritritol	34,9
metil-tioglikolát	56,1
3-merkapto-1,2-propándiol	65,5
3-merkaptopropionsav	65,3
2-merkaptoetanol	64,1

8. példa:

A protein hatása

A.T. 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk, hogy a különböző típusú proteinek a lineáris láncú S-szulfonát proinzulinból előállított proinzulin kitermelésre milyen hatással vannak. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptánként olyan mennyiségű 2-merkaptoetanol, hogy egy —SSO₃ ónra 4 mól —SH csoport jusson; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 ’C.

A proinzulint, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük:

Lineáris láncú S-szulfonát proinzulin_Kitermelés (%) szarvasmarha 60,6 sertés 65,8

9. példa:

Humán proinzulin előállítás

169,3 mg lineáris láncú S-szulfonát humán proinzulint feloldunk 338,6 ml gázmentesitett 0,05 mólos glicinben, pH = 10,54 és ehhez az oldathoz hozzáadtunk egy vizes 2-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,Ö8 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy egy — SSO; ionra, mely a lineáris láncú S-szulfonát humán proinzulinban van, 2 mól 2-merkaptoetanol jut. A reakcióelegyet 5 n nátriumhidroxiddal kezelve a pH-t 10,52-re állítjuk be. Az oldatot tartalmazó edényt paraffin filmmel lezárjuk és 6 °C-on 18 órán át kevertetjük.

A reakcióelegyet ezután koncentrált sósavval megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 2,9 ± 0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). Az így nyert tiszta oldatot egy Sephadex G-25 Coarse sómentesítő oszlopon kromatografáljuk, mely műveletnél a reakciókörülmények a következők: oldószer 2%-os ecetsav (térf/térf); oszlop mérete 5 x 100 cm; rcakcióhőmérséklet 25 °C;

átfolyási sebesség 28,8 ml/perc; frakciótérfogata 20,2 ml.

Az eluátum első 779 ml-cl elöntjük, a következő 464 ml-t összegyűjtjük és eltesszük, mivel a 280 nmnél vizsgált optikai sűrűség alapján ez tartalmazza a proteint. Az oszlopot ezután további 2500 ml 2%-os ecetsavval mossuk. A protein tartalmú eluátum, az UV spektrumból kiszámolva, 164 mg proteint tartalmaz, mely a kromatográfiás eljárásnál alkalmazott mennyiségnek 101,9%-a (az újraképződési reakciónál az elméleti kitermelés). Ezt az eluátumot megfagyasztjuk és liofilizáljuk.

A kívánt terméket gél-szüréses kromatográfia alkalmazásával izoláljuk. A száraz anyagot (méretlenül) feloldjuk 20 ml 1 mólos ecetsavban és az így nyert tiszta oldatot Sephadex G-50 Superfine oszlopon kromatografáljuk. A reakció körülményei a következők: oldószer 1 mólos ecetsav; oszlop mérete 2,5 x 125 cm; reakcióhömérséklet 25 °C; átfolyási sebesség 0,82 ml/perc; frakciótérfogat 4,92 ml.

Az oszlopot egy éjszakán át 1 mólos ecetsavval eluáljuk és az eluátum abszorpcióját 280 nm-nél mérjük. Az egyes frakcióknak 280 nm-nél mért abszorpcióképességét a frakciók számának függvényében ábrázolva egy olyan görbét kapunk, melynek két fő csúcsa (maximuma) van. Az első (a kisebb) csúcs az. agregált humán proinzulint, a második csúcs pedig a monomer humán proinzulint jelzi. A görbe első részén van még egy legömbölyített vállrész. Az alábbi frakciók egyesítésével nyerjük az eluátum I-et, az eluátum ΙΙ-t és az eluátum 111-t, ahol zárójelben a térfogatot is feltüntetjük:

eluátum I : 46-67 frakciók (218-325,5 ml) eluátum II : 68-81 frakciók (325,5-295,5 ml) eluátum III: 82-100 frakciók (395,5-490,3 ml) Az eluátumok az UV spektrum alapján, az alábbi protein mennyiségeket tartalmazzák: eluátum I : 22,1 mg eluátum II : 28,3 mg eluátum 111: 103,6 mg

Ez. összesen 154 mg, mely a kromatográfiás eljárásnál alkalmazott mennyiségnek 94%-a. Ennek a visszanyert mennyiségnek 67,3%-a monomer humán proinzulin. Mindhárom eluátumot, az I, II és a Ill-t, megfagyasztjuk és liofilizáljuk.

Az eluátum III-ból összesen 106,55 mg száraz anyag nyerhető, mely anyag az aminosav analízis és poliakrilamid gél-lemezes elektroforézis szerint humán proinzulin. HPLC-vel végzett vizsgálatnál az anyag arról a helyről eluálható, ahol a bovin proinzulinhoz viszonyítva a humán proinzulin várható. Meghatározható továbbá oly módon is, hogy tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel kezeljük és így termékként humán inzulint nyerünk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

'. Eljárás I általános képletű inzulin prekurzor előállítására, ahol a képletben

Y jelentése -Lys-Ala- vagy -Lys-Thr,

A-2Ng jelentése egy inzulin A-lánc;

gyök jelentése egy inzulin B-lánc; és

-7185 249

X jelentése III képletü humán peptidszekvencia,

IV képletü sertés peptidszekvencia vagy V képletü szarvasmarha peptidszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy II általános képletü S-szulfonátot, ahol a képletben X és Y, valamint az A-l-től Α-21-ig és B-l-től Β-30-ig gyök jelentése a fenti, előnyösen oxidálószer,kizárásával, vizes közegben, 7 és 11,5 közötti pH-értéknél - kívánt esetben puffer jelenlétében és ahol az S-szulfonát koncentrációja legfeljebb 10 mg/1, 2-merkapto-etanollai, ditiotreitollal, ditioeritriollal, metil-tioglikoláttal, 3-merkapto-l,2propándiollal vagy 3-merkapto-propionsavval reagáltatjuk, és a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazzuk, melynél egy —SSÖ, ionra 1-5 —SH ¹csoport jut.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 9,5 és 10,5 közötti pH-érléknéí végezzük.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazzuk, melynél a II általános képletü vegyület 1 —SSO₃~ ionjára 2-4—SH csőport jut.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót oxidálószer kizárásával végezzük. ^c (Elsőbbsége: 1980. március 27.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzaljellemezve, hogy a II általános képletü S-szulfonátot olyan mennyiségben használjuk, hogy koncentrációja a reakcióközegben 0,05-2 mg/ml ^clegyen.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
6. Az 1., 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy merkaptánként 2-merkaptoetanolt használunk.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 0 ’C és 37 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
8. A 7. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 2 °C és 8 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
9. Az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyet szobahőmérsékleten állítjuk elő, majd a reakciót 2 °C és 8 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
10. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakció elegyhez 0,005-0,5 n koncentrációban pufferoló szert adunk.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
11. A 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy pufferként glicint alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1980. március 27.)
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletü inzulin prekurzor előállítására, ahol a képletben

Y, az A-I-től A 21-ig gyök és B-l-től Β-30-ig gyök jelentése az 1. igénypontban megadott, és

X jelentése humán peptidszekvencia, azzal jellemezve, hogy olyan II általános képletü vegyületböl indulunk ki, ahol Y, az A-l-től A—21-ig gyök és B-l-től B—30-ig gyök az 1. igénypontban, és X a fent megadott.