JPS5811428B2 - インシユリンケイカゴウブツノセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的は一般式Ｉ （式中ＹはＨあるいはアシル残基であり、Ｒはスルホニ
ルジエチルビスオキシカルボニル残基（Ｓｄｃ残基） を意味する） を有する化合物をアルカリもしくは第四級有機塩基でｐ
Ｈ１３以上で処理することを特徴とするインシュリン、
インシュリン類縁体およびインシュリン誘導体の製法に
ある。

バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｒｒｍｕｎ、）第５５巻（１９７３）、第６０頁の
記載によれば、Ａ−鎖のα−アミノ基とＢ−鎖のε−ア
ミノ基とをα、α′−ジアミノジカルボン酸を介して相
互に結合させ、脱水によりインシュリンのジスルフイツ
ド橋を式に合せて正しく閉じ、続いてα、α′−ジアミ
ノジカルボン酸をエドマン分解により分解させることに
よりインシュリンがその画鋲から製造され得る。

この方法を用いてインシュリンの画鋲がはじめて高収量
で結合された。

収量のある減少は避けがたいが、エドマン分解は成功す
る。

本発明方法によれば今や画鋲の結合が同一の高い収量で
行われる。

しかしながら、架橋試薬の分解に際しては上述の場合に
おけるよりさらに高い収量が得られる。

その理由は該分解は単一の非常に速い反応において、塩
基を触媒としてβ−説離機構を経由して行われるからで
ある。

この方法においては、収量は副反応およびそれらの副生
物によってはほとんど影響されない。

何故ならそれらはむしろとるに足らないからである。

従って、反応生成物の精製もまた単純化される。

α−アミン基が保護基で保護されていない場合には、エ
ドマン分解の際にＢ−鎖の第一アミノ酸例えはフェニル
アラニンが同時に分解されるが、Ｓｄｃ残基を使用して
いる場合にはこの分解は起こらない。

しかしながら、この場合にもまたＢ−鎖のα−アミン基
を保護することが円滑な反応進行のために好都合であり
得る。

インシュリンのＡ−４たはＢ−鎖と二官能性架橋分Ｒと
の結合の連続による一般式Ｉの化合物の製造の際の反応
の原理はすでに上述の文献ならびにドイツ特許出願公開
公報箱２，２５２，１５７号明細書に記載されている。

一般式Ｉの化合物の製造のためには、例えはトリチル、
ジフェニルメチル、１〜４個の炭素原子を有するＳ−ア
ルキル、ピコリル、アセトアミドメチルあるいはスルホ
ネートのような既知のＳ−保護基によりそのＳＨ基が保
護されているインシュリン−Ａ−鎖を一般式■ （式中Ｒは前述の意味を有し、Ｏ■はスルホニルジエチ
ルビスオキシカルボニル成分のエステル例えばＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミドエステル、ニトロフェニル−、ト
リクロルフェニル−、ペンタクロルフェニル−あるいは
ペンタフルオルフェニルエステルの残基を表わす） を有する試薬の過剰と反応させる。

その際一般式■ （式中ＸはＳ−保護基を意味する） を有する化合物が生成する。

この反応の溶媒としては好ましくはジメチルスルホキシ
ド （ＤＭＳＯ）あるいはジアルキルカルボン酸アミド特に
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）あるいはりん酸トリス
ジメチルアミドが使用される。

反応は室温でも進行するわずかに高められた温度も用い
ら得る。

次で反応する方法により一般式■の化合物をｐＨ約８〜
１１において、またはＮ−エチルモルホリンのような第
三有機塩基添加の下にＤＭＳＯあるいはＤＭＦ中でイン
シュリン−Ｂ−鎖と反応させて一般式■ （式中ＲおよびＹは前述の意味をあられす）を有する化
合物を生成させる。

Ｎ−保護基（Ｘ）としては例えば第三ブチルオキシカル
ボニル（Ｂｏｃ）−、フタロイル、トリル−またはメチ
ルスルホニルエチルオキシカルギニルーあるいはトリフ
ルオルアセチル残基があげられる。

ＹがＮ−保護基である場合には、前述の反応順序はまた
逆の順序すなわちまずＢ−鎖との結合続いてＡ−鎖との
結合の順序であってもよい。

反応生成物を、場合によってはまだ存在している保護基
を分解し、そして場合によってはクロマトグラフィー精
製を行なった後、８Ｍ尿素水溶液あるいはｐＨ５〜９の
水中にとる。

Ｘが例えは−８Ｏ３Ｈである場合、窒素気流の下０〜６
０℃で５０〜１００倍過剰のチオグリコールあるいは計
算量の１〜５倍のトリアルキルホスフィン例えばトリブ
チルホスフィンを加え、還元終了後酢酸性アセトンで沈
澱させ、遠心分離しそして酢酸性アセトンで数回洗う。

次で可能な限り少量の水性ＮＨ３中に溶かし０．０５Ｍ
（ＮＨ４）ＨＣＯ３で希釈し、ｐＨ１０〜１０．６なら
びにペプチド濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍｌに調整し、緩
徐な空気流の下で一夜０〜２０℃においてかきまぜる。

より低いｐＨ例えば８〜１０で操作することもできるが
、その場合には約１５０時間までのより長い反応時間を
必要とする。

続いてＩＮ−酢酸を用いてｐＨ４〜５．５に調整し、得
られる一般式Ｉの化合物を凍結乾燥するかあるいは真空
中蒸発乾固させる。

粗生成物をｎ−ブタノール：氷酢酸：水（２：１：１０
）の系中セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２
０（登録商標）を使用するかあるいはＩＮ〜２Ｎ酢酸と
共にセファデックスＧ５０（登録商標）またはＧ７５（
登録商標）を使用する分配クロマトグラフィーにより精
製する（カラム：４×１００〜４×２００ｃｍ）。

「インシュリンピーリ」（約７０％まで）は、まちがっ
て再結合している生成物（約３０％まで）を還元後新た
に再結合させるようにしてさらに処理される。

一般式■を有する化合物からの残基Ｒの本発明による分
解は例えば０．２Ｎ−Ｎ ＮａＯＨにより０°Ｃで短
期間処理することにより行なわれる。

このためには、場合によってはジメチルホルムアミドの
添加下に一般式Ｉの化合物をＨ２Ｏに溶かし、この溶液
を０℃に冷却し、氷冷した苛性ソーダを用いて使望の規
定度に調整する。

２〜１０分なかんずく２〜３分後、冷却下当量の１ＮＨ
Ｃ１で中和する。

溶媒を真空中留去する。残留物または沈澱を少量の希酢
酸中にとりセファデックスＧ５０またはＧ７５でクロマ
トグラフィーする。

希酢酸を用いて溶離し、インシュリン含有フラクション
を合し、ｐＨを５．２に調整する。

その際はじめに無定形に析出するインシュリンは数時間
内に結晶化する。

収率は、用いられるインシュリン−Ａ−または−Ｂ−鎖
に基づき約５０％である。

本発明方法により得られる結晶化したインシュリンは家
兎の血糖降下の測定による生物学的活性の測定において
２４〜２５ＩＥ／■を有する。

アミノ酸分析は正確に計算値と一致する。

本発明方法によれは、インシュリン自体の他にインシュ
リン類縁体およびインシュリン誘導体が製造され得る。

インシュリン類縁体としては１〜数個のアミノ酸がその
他のなかんずくより簡単なアミノ酸と交換されている化
合物、さらに変形なかんずく短縮された鎖長を有するイ
ンシュリンが包含される。

従って、すでに文献から知られているように、例えばＡ
−鎖においてＧ１ｎ５およびＧ１ｎ１５がＧｌｕによっ
て、５ｅｒ１２．Ｔｙｒ１４．Ａｓｎ１８およびＡｓｎ
２１がＡｌａによって、ＶａｌｌｏがＬｅｕもしくは他
の疎水性アミノ酸によって、さらに −Ｔｙｒ１９がＰ
ｈｅによって置換されることができる。

Ｂ−鎖においてはＰｈｅ”、Ｖａ１２．Ａｓｎ３゜Ｇｉ
ｎ’、Ｈｉｓ５，５ｅｒ９．Ｈｉｓｌｏ、Ｔｈｒ２７お
よびＰｒｏ２８のより簡単なアミノ酸なかんずくアラニ
ンによる置換が可能である。

アミノ酸１〜４および３０はまた脱離され得る。

ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＢ７のＡｌａによる置換さえも
可能である。

インシュリン誘導体としては、置換された官能基を有す
る化合物が包含される。

従って、例えばＢ−鎖のα−アミン基はドイツ特許出願
公開公報第２，０４２，２９９号明細書におけると同様
のアシル残基により置換され得る。

同じことが上記のインシュリン類縁体にも適用される。

インシュリン−Ｂ−鎖のα−アミン基の任意の残基Ｙに
よる置換はその生物学的活性に関し臨界的ではないの才
、Ｙはペピチド化学において典型的なＳ−保護基の１種
であり得るだけでなく、また、その空間的な範囲は限定
されなければならないことはいうまでもないが、任意の
生理学的に受容され得るアシル残基をも表わし得る。

この限界は例えば脂肪族アルカノイルあるいはアルキル
オキシカルボニル残基に対しては炭素原子約６個にあり
、シクロアルカノイル残基あるいは芳香族または複素環
式カルボン酸の残基に対しては炭素原子約１０個にある
。

Ｙはまた天然に存在するα−アミノ酸もしくはそのＤ−
鏡像体および約６個までの炭素原子を有するω−アミノ
カルボン酸のアミノアシル残基、ならびに約４個までの
炭素原子を有するそのＮ−アルカノイル−あるいはＮ−
アルキルオキシカルボニル化合物、シクロアルカノイル
あるいは約７個までの炭素原子を有する芳香族もしくは
複素環式カルボン酸の残基であってもよい。

かかる置換に際しては常に、インシュリンの生物学的活
性は減少されないかあるいは本質的には減少されないと
いう前提がある。

その際「生物学的活性」なる用語には血糖降下が理解さ
れるべきであるのみならずまた例えばかかる化合物の、
存在する抗体に対するハプテンとしての能力も理解され
るべきである。

本発明方法により得られるインシュリンあるいはその類
縁体および誘導体は膵臓から得られる物質の代りに糖尿
病の治療に用いられるか、あるいは極く一般的には、例
えはショックの発生のために血糖が降下されなければな
らない場合に使用される。

インシュリン−Ａ−および−Ｂ−鎖は文献記載の多数の
方法の一つにより製造され得る。

本発明による方法を説明するためには例えばインシュリ
ンからスルフィトリシスにより容易に製造され得る天然
の鎖から出発するのがより簡単である。

合成により調整されるインシュリン鎖は天然物質と同様
に作用する。

同じことはその鎖から製造されるインシュリンの生物学
的活性に対する決定的な構造上の指標をその鎖がまだ有
している限り変形された鎖にもまたあてはまる。

一般式■の試薬は既知のスルホニルジェタノールとホス
ゲンとの反応およびジクロル炭酸エステルヲ所望の活性
エステル、例えはビス−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
エステルに変換することにより製造される。

第二の調製法は活性エステルの既知のクロル炭酸エステ
ルから出発する。

これを既知方法によりピリジン中スルホニルジェタノー
ルと反応させる。

両反応を以下の式に示す。

実施例 １ 架橋試薬の調製 ａ） スルホニルジエチル−ビス−オキシカルボニル−
ジーＮ−ヒドロキシサクシネート ザ・ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミストリー２
８巻、１１４０頁（１９６３）の記載により調整された
スルホニルジェタノール１５．４ｇをテトラヒドロフラ
ン９゛０ｒｒＬｌ中に溶かし、かきまぜながらテトラヒ
ドロフラン２００ｍ１中のホスゲ゛ン２２ｇの溶液中に
３０分以内で滴下する。

温度は一１０’Ｃ〜−１５℃に保つ。

−１０℃で３０分間かきまぜ、次に室温でさらに１時間
かきまぜる。

溶媒を真空中留去する。

粘稠な油２６ｇが残留する。

これをテトラヒドロフラン２７ｍ１および塩化メチレン
１５０ｍ１中にとりピリジン１２１ｒＬ１１Ｎ−ヒドロ
キシコハク酸イミド１７ｇおよび塩化メチレン５２ｍ１
からなる溶液を一１０℃で１５分以内でかきまぜながら
滴下する。

反応混合物を１５時間＋４℃に保つ。

その際はじめに油として析出する生成物が結晶化する。

これをろ過し、氷冷したテトラヒドロフランで洗い乾燥
する。

ｍ、ｐ、１３４〜１３７℃（分解）。

元素分析値は計算値と一致する。

実施例 ２ 牛−インシュリン ａ） 牛−インシュリンーＡ−鎖一テトラスルホネネー
ト 牛−インシュリンからの調製は既知の方法例えはツアイ
トシュリフト・フユア・ナチュアフオルシュウング（Ｚ
、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、）１８ ｂ巻（１９６３）
、９７８頁記載の方法により行なわれる。

ｂ）ＮＢ１−トリフルオルアセチル−Ｂ−鎖一ジスルホ
ネール（牛） 既知方法によるＮＢ１” ”） ＩＪフルオルアセチル
−インシュリン（牛）のスルフィトリシスによる調製。

この出発物質は以下のようにして得られる。

ホッパ・ザイラー（Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ’。のツ
アイトシュリフト・フユア・フイジオロジツシエ・ヘミ
−（Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、’Ｃｈｅｍ、）３５２巻（１
９７１，）、１４８７頁の記載により調製されるＮ ａ
Ａｌ 、ＮεＢ２９−ビスーＢｏｃ−インシュリンをジ
メチルホルムアミド中に溶かし約５当量のトリフルオル
酢酸−メチルエステルと反応させる。

その際Ｎα”、ＮεＢ２９−ビスーＢｏｃ−ＮαＢ１−
トリフルオルアセチル−インシュリン（牛）が生ずる。

トリフルオル酢酸を用いて４５分間処理することにより
Ｂｏｃ−基を分解後、生成物をセファデックスＬＨ−２
０（登録商標）を用いて系ｎ−ブタノール−氷酢酸−水
（２：１：１０）中分配クロマトグラフィーにより精製
する。

Ｃ）牛インシュリン 前記２ａ）により調製されるＡ−鎖一テドラスルホネー
ト２．８２ｇをジメチルスルホキシド２００ｍ１中Ｎ−
エチルモルホリン１．１１ｍ１を添加してｐＨ〜９とな
し、実施例１ｃ）により調製されたＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドエステル１．４ｇとかきまぜる。

２０時間後エーテル／メタノール（１０：１）を用いて
沈澱させる。

再びジメチルスルホキシド２００ｍ１中にとり、前記２
）により調製されたＮ、”−トＩＪフルオルアセチルー
Ｂ−鎖−ジスルホネート３．４５ｇおよびＮ−エチルモ
ルホリン１．１ｍｌを加え室温で６〜２４時間かきまぜ
る。

次でエーテル／メタノール（１０：１）により沈澱させ
る。

収量５．２ｇ。

ｐＨ８，５〜９の０．０５Ｍ（ＮＨ４）ＨＣＯ３−緩衝
液中におけるセファデックスＧ−５０（登録商標）での
カラムクロマトグラフィー（カラム：ｌ＝４ｍ、φ＝４
ｃｒｎ）および凍結乾燥後、生成物をｐＨ８，６の水０
．２５ＡＩ’中にとる。

チオ。グリコール５０Ｉ７１１を加え、窒素気流の下で
６時間保持し、１０〜２０倍量の酢酸性アセトンを用い
て沈澱させ、遠心分離し、チオグリコールがなくなるま
で酢酸性アセトンで洗う。

次いで少量の１Ｎ−ＮＨ３中に溶かし、２５１に希釈。

し、ｐＨ９に調整しわずかな空気流下室温で約１００時
間かきまぜる。

この条件下でトリフルオルアセチル基が同時に分裂され
る。

酢酸を用いてｐＨ５，５に調整し凍結乾燥する。

残留物を１０％酢酸あるいはぎ酸５０ｍ１中に溶かし４
×２００ｃｒｒＬのカラム中セファデックスＧ５０ある
いはＧ７５（登録商標）、ファインによりクロマトグラ
フィーにかける。

系ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１０）における
セファデックスＬＨ−２０を用いる分配クロマトグラフ
ィーによっても良好な精製が行なわれる（カラム：４×
１００〜４×２００）。

カラムを交さ結合したインシュリンで検定する。

予ピーク（０，：ｌ）の後、交さ結合したインシュリン
（４，２ｇ）のピークが現われる。

前記予ピークをザ゛・ジャーナル・オブ・ジ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサエティ９３巻（１９７１）、３０８
０頁の記載に従い液体ＮＨ３中１．４−ジチオートレイ
トールを用いるかあるいは希Ｎ′Ｈ３水溶液中トリブチ
ルホスフィンを用いてｐＨ８〜１ｏにおいて還元しそし
て前述の方法によりｐＨ９において水中酸化する。

交さ結合試薬を分裂させるために、生成物を水およびジ
メチルホルムアミド（２：１）から成る混合物７５ｍ１
中に溶かしこの溶液を０℃に冷却し氷冷した４、Ｎ７Ｎ
ａＯＨ２５ｍｌを加える。

２〜５分後この混合物を強く冷却しながら２Ｎ−ＨＣｌ
、５０ｍ１を用いて中和し、溶媒を真空中留去する。

残留物を１０係酢酸中に溶かしカラム（４×２００ｃｒ
ｆＬ）上セファデックスＧ５０（登録商標）を用いて精
製する。

溶離剤としては１０％酢酸を用いる。

インシュリン含有フラクションを合し、真空巾約４０ｒ
ｒｔｌｑで濃縮し、若干量のｚｎｃ、、６．２を添加し
てｐＨを５．２に調整し１日室温に放置する。

形成される結晶を非結晶性の物質から遠心分離により分
離し、結晶化をくり返す。

収量２．９７ｇ（４９％）。インシュリンの生物学的活
性は２５１．Ｕ、／Ｔｎ９であった。

以下に本発明により開示された新規な技術的事項を要約
して示す。

１、一般式Ｉ （式中ＹはＨあるいはアシル残基であり、Ｒは 式の
スルホニルジエチルビスオキシカルボニル残基を意味す
る） を有する化合物をｐＨ１３以上においてアルカリもしく
は第四級有機塩基で処理することを特徴とするインシュ
リン、インシュリン類縁体およびインシュリン誘導体の
製法。

２、一般式Ｉ （式中ＹはＨあるいはアシル残基であり、Ｒはスルホニ
ルジエチルビスオキシカルボニルを意味する） を有するインシュリン誘導体。

３、一般式■ （式中Ｒはスルホニルジエチルビスオキシカルボニルを
意味し、０■はスルホニルジエチルビスオキシカルボニ
ル成分のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド−、ニトロフェ
ニル−、トリクロルフェニル−、ペンククロルフェニル
ー、あるいハヘンタフルオルフェニルエステルのような
活性エステルの残基を表わす） を有する、インシュリン、インシュリン類縁体あるいは
インシュリン誘導体のＡおよびＢ−鎖を結合させるため
の試薬。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式Ｉ （式中ＹはＨあるいはアシル残基であり、Ｒは式 のスルホニルジエチルビスオキシカルボニル残基を意味
   する） を有する化合物をｐＨ１３以上においてアルカリもしく
   は第四級有機塩基で処理することを特徴とするインシュ
   リン、インシュリン類縁体およびインシュリン誘導体の
   製法。