DK149863B - Fremgangsmaade til fremstilling af et insulin-forstadium - Google Patents

Description

149863 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et insulin-forstadium med den i krav l's indledning angivne almene formel, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's 5 kendetegnende del angivne.

I løbet af de seneste år har man gjort en lang række forskellige forsøg på at fremstille insulin ad syntetisk eller semi-syntetisk vej. Insulin er et molekyle, som indeholder to peptidkæder, en A-kæde inde-10 holdende 21 aminosyrerester og en B-kæde indeholdende 30 aminosyrerester. Disse kæder indeholder tre di-sulfidbroer, som hver er dannet ud fra to cysteinyl-restsr. To af disse disulfidbroer forbinder A-kæden og B-kæden. Broerne er dannet ud fra cysteinyl-rester-15 ne ved henholdsvis A-6 og A-ll, A-7 og B-7 og A-20 og B-19.

Ved en generel fremgangsmåde til fremstilling af insulin går man ud fra proinsulin eller et molekyle af proinsulin-typen. Proinsulin er et enkeltkædet poly-20 peptid, hvori N-terminalen i insulinets A-kæde via et sammenknyttende peptid er bundet til C-terminalen i insulinets B-kæde, idet de ovennævnte cystein-rester er sammenknyttet med disulfidbindinger. Humant proinsulin indeholder eksempelvis 86 aminosyrerester, af 25 hvilke de 35 udgør det sammenknyttede peptid. Yanai- hara et al., Diabetes 27, (suppl. 1) 149 - 160 (1978), beskriver syntesen af et antal sammenknyttende peptider samt humant proinsulin.

Også andre molekyler af proinsulin-typen er beskrevet 30 i litteraturen, idet de væsentligste forskelle fra proinsulin ligger i strukturen af den gruppe, som forbinder insulinets A- og B-kæder, samt de steder, hvor sammenbindingen foregår.

2 149863 Således beskriver Busse et al., Biochemistry Γ5, No.

8, 1649 - 1657 (1976), en sammenknyttende gruppe bestående af to methionylgrupper, som via deres N-terminaler er sammenknyttet af en carbonylgruppe, idet gruppen er 5 forbundet med Nff-terminalen af A-l-glycyl og med N£-terminalen af B-29-lysyl.

På lignende måde er andre sammenknyttende grupper blevet beskrevet. Se f. eks. Geiger et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 55^ 60 - 66 (1973); Branden-10 burg et al., Hoppe - Seyler's Z. Physiol. Chem.

bd. 354, 613 - 627 (1973) samt US patentskrifterne nr.

3 847 893, 3 907 763, 3 883 496, 3 883 500 og 3 884 897.

Ued ethvert af disse forsøg på at fremstille insulin via en enkelt kæde bestående af insulinets A- oc B-15 kæder forbundet ved hjælp af en veldefineret gruppe er det nødvendigt at foretage den direkte sammenkobling af insulinets A- og B-kæder ved dannelse af tre disulfidbroer ud fra de seks cysteinyl-rester, som findes på A- og B-kæderne. Efter dannelsen af 20 disulfidbindingen fjernes den oprindelige sammenknyt tende gruppe under samtidig dannelse af insulin.

Ued udførelsen af denne kendte fremgangsmåde til fremstilling af insulin er det særdeles ønskeligt at tilvejebringe en effektiv og bekvem metode til sikring af den 25 korrekte dannelse af disulfidbroer. De i litteraturen beskrevne metoder til dannelse af disulfidbroer omfatter generelt luftoxidation af de tilsvarende -BSH-struk-turer. Da det endvidere er velkendt, at -BSH-struk-turen er ustabil, dannes forstadiet normalt med en 30 S-beskyttende gruppe, typisk en S-sulfonatgruppe (-S-SO-j ). De i litteraturen beskrevne metoder omfatter således en totrins-sekvens, nærmere bestemt en reduktion af S-sulfonatet til -SH ved behandling med en mercaptan efterfulgt af en luftoxidation af den 3 149863 dannede -SH-forbindelse.

Det har nu vist sig, at det er muligt at tilvejebringe en bekvem og særdeles effektiv metode til direkte omdannelse af S-sulfonatet til det ønskede disulfid-5 insulin-forstadium. Processen indbefatter ikke en re-duktions-oxidations-sekvens. I stedet sker der en direkte udveksling under betingelser, hvorunder man foretrækker, at der ikke er et oxidationsmiddel til stede, om end dette fravær af oxidationsmiddel ikke er væsentligt.

10 En fremgangsmåde af denne art er genstand for den. forelig gende opfindelse.

Indenfor den kendte teknik findes en mulig undtagelse fra den generelle totrins-metode, som imidlertid anvendes til kombination af insulinets A- og B-kæder 15 og ikke til disulfid-dannelse ud fra et ligekædet S-sulfonat-insulin-forstadium. Denne undtagelse er beskrevet af Dixon et al., Nature 188, 721 - 724 (1960) og indebærer muligvis en dannelse af insulin ved kombination af A- og B-kædernes S-sulfonater i en enkelt op-20 løsning. Detaljerne ved denne kendte metode er temmelig overfladiske, og udbyttet, som udelukkende er baseret på aktiviteten af det udvundne produkt, andrager kun omkring 1 - 2%. En senere publikation, Dixon, Proc.

Intern. Congr. Endocrinal. 2nd, London 1964, 1207 -25 1215 (1965), synes til en vis grad at klarlægge de taljerne ved denne metode, idet der i tabel IV på side 1211 foreslås en totrins-proces, som omfatter en anaerob reduktion af S-sulfonatet efterfulgt af en oxidation af disulfidet. 1

Betegnelsen "insulin-forstadium" refererer til et mole kyle, som (1) indeholder en insulin-A-kæde og en insu-lin-B-kæde, (2) har mindst tre disulfidbindinger repræsenteret ved en sammenknytning af svovlatomerne på hver af Cys-grupperne lokaliseret på A- og B-kæderne ved 149863 4 henholdsvis (a) A-6 og A-ll, (b) A-7 og B-7 og (c) A-20 og B-19 og (3) har en fjernelig sammenknyttende gruppe, som er bundet til insulinets A-kæde ved amino-gruppen ved A-l og til insulinets B-kæde ved £-amino-5 gruppen i lysin-resten ved B-29 eller ved carboxylgrup-pen i aminosyreresten ved B-30.

Gruppen Z, som definerer B-30-aminosyreresten i insulin, er en af grupperne Ala, Thr eller Ser. Disse rester repræsenterer naturligt forekommende insuliner, 10 idet Thr forekommer i humant insulin, Ala i okseinsu lin og svineinsulin og Ser i kanininsulin.

Gruppen R betegner hydrogen, en aminosyrerest eller en peptidrest indeholdende mindst to aminosyrerester. I de tilfælde, hvori R betegner en aminosyrerest eller en pep-15 tidrest, er R en gruppe, som kan spaltes kemisk eller en zymatisk fra det insulin-forstadium, som er produktet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, uden at der sker tab af integriteten af den tiloversblevne insulinstruktur.

En lang række - forskellige aminosyrerester og peptidgrup-20 per falder indenfor definitionen af gruppen R. Som eksemp ler på aminosyrerester og peptidrester, som kan spaltes fra er basiske aminosyrer såsom arginin (Arg) og lysin (Lys) såvel som peptidgrupper, der ved C-terminalen afsluttes af sådanne aminosyrerester. Sådanne rester kan 25 underkastes en fraspaltning ved behandling med det pro- teolytiske enzym trypsin. Et andet eksempel på en aminosyrerest, som kan fraspaltes, er methionin (Met), såvel som en peptidgruppe, der indeholder Met ved carboxyterminalen.

Disse syrerester kan fjernes ved behandling med cyanogen-50 bromid. Som endnu et eksempel kan anføres tryptophan (Trp) eller en peptidgruppe indeholdende Trp ved carboxyterminalen. Denne syrerest fjernes ved behandling med N-bromsuccinimid.

Den sammenknyttende gruppe X, som indgår i insulin- «r 5 149863 forstadiet og i det ligekædede S-sulfonat-insulin-for-stadium, er en peptidrest. Denne peptidrest indeholder mindst 2 og fortrinsvis mellem 2 og 35 aminosyrerester.

Særligt foretrukne peptidrester indeholder mellem ca.

5 6 og ca. 35 aminosyrerester. Gruppen X er forbundet med A-kæden ved aminogruppen i A-l og med B-kæden ved carboxylgruppen i B-30. Det foretrækkes specielt, at den sammenknyttende peptid i et naturligt forekommende insulin-forstadium, og generelt i det insulin, som re-10 præsenteres ved den ene eller begge A- og B-kæder, hvortil den er knyttet. Som eksempler på naturligt forekommende sammenknyttende peptider kan anføres følgende:

Kanin: -Arg-Arg-Glu-Val-Giu-GIu-Leu-Gln-Vai-Gly-

Gln-Ala-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Ser-Ala-Leu-Gl'd-Ala-Leu-Gln-Lys-Argr.

Menneske: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-

Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Giy-Gly-Pro-Gly-AIa-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-

Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

/\be: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp*-Pro-Gln-VaI-Giy-

Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-GIy-Pro-Gly-Ala~ Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

Hest: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-GIn-Val-Gly-

Glu-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Leu-Gly-Gly-Lau-Gln-Fro-Leu-Ala-Leu-Ala-Gly-

Pro-Gln-Gln-Lys-Arg-.

Rotte I: -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Asp-Pro-Gln-Vai-Prc-

Gln-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Glu-Ala-Gly-Asp-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Lsu-Glu-Val-: Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-.

6 149863

Rotte IIϊ -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Ala-

Gln-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Asp-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Leu-Glu-Val-Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-.

Svin: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly- - Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Lau-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-.

Okse, lam: -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gln-Val-Gly-

Ala-Leu-Glu-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Prc-Gln-Lys-Arg-.

Hunc). -Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-

Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Prc-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-.

Marsvin: -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-

Glu-Gln-Thr-Glu-Leu-Gly-Met-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Gln-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-.

Chincilla: -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-

Gly-Gln-Ala-Asp-Pro-Gly-Val-Val-Pro-Glu-Ala-Gly-Arg-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Met-Thr-Leu-Gln-Lys-Arg-.

And: -Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Gln-Pro-Leu-Val-

Asn-Gly-Prc-Leu-His-Gly-Glu-Val-Gly-Glu-Leu-Prc-Phe-Gln-His-Glu-Glu-Tyr-Gln-Lys-Arg-.

7 149863

Det foretrækkes særligt, at den aminosyresekvens, som er repræsenteret ved A-l til A-21, X og B-l til B-30, er den naturligt forekommende sekvens for A-kæden, det sammenknyttende peptid samt B-kæden fra svine-, okse-5 eller humant proinsulin, idet humant proinsulin især foretrækkes.

Selv om man foretrækker at anvende den naturligt forekommende sammenknyttende sekvens, som anført ovenfor, er det muligt at anvende meget kortere peptidsekvenser 10 til det sammenknyttende peptid. De eneste krav i så henseende er, (1) at de er af en tilstrækkelig længde til at muliggøre en passende dannelse af en disul fidbinding imellem A- og B-kæderne, og (2) at de kan spaltes fra insulin-forstadiet under samtidig dannelse 15 af insulin. Et typisk dipeptid, som kan anvendes til dette formål, er -Arg-Arg. Desuden kan man anvende modifikationer af dette dipeptid med formlen -Arg-X'-Arg- , hvori X' betegner mindst en aminosyrerest. Særligt foretrukne sammenknyttende peptider er Arg-Arg-Lys-Arg- 20 såvel som peptider med længere kæder, som har strukturen 2 2 -Arg-Arg-X -Lys-Arg-, hvori X betegner mindst en aminosyrerest og fortrinsvis 2 aminosyrerester. Disse sidstnævnte omfatter naturligvis de naturligt forekommende peptider, af hvilke mange er beskrevet i det 25 foregående.

Ued fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandles det ligekædede S-sulfonat med den i krav l's kendetegnende del angivne almene formel med en vandopløselig mercaptan i et vandigt medium ved en pH-værdi på mellem ca. 7 30 og ca. 11,5. Ued en mercaptan forstår man naturligvis en forbindelse, som indeholder mindst en -SH-gruppe.

Som eksempler på typiske vandopløselige mercaptaner kan nævnes dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercapto-ethanol, methylthioglycolat, 3-mercapto-l,2-propandiol 35 og 3-mercaptopropionsyre· Selv om man kan anvende mer- 8 149863 captaner med flere -SH-grupper, såsom dithiothreitol, foretrækker man at anvende en mercaptan, som kun indeholder en enkelt -SH-gruppe. Blandt disse mercapta-ner foretrækker man i særdeleshed 2-mercaptoethanol.

5 Den omhandlede fremgangsmåde gennemføres som nævnt i et vandigt medium, som holdes ved den ønskede pH-værdi ved tilsætning af en passende puffer. Man foretrækker, at pH-værdien ligger på mellem ca. 9,5 og ca. 10,5.

Enhver puffer, hvis pufferkapacitet ligger indenfor 10 ovennævnte brede pH-interval, kan således anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Som eksempler på egnede puffere kan anføres phosphatpuffere, tri(hydroxy-methyl)aminomethan (Tris), boratpuffere og glycin.

Koncentrationen af pufferen i det vandige medium er 15 højst ca. 0,5 N. Fortrinsvis er koncentrationsområdet mellem ca. 0,005 N og ca. 0,5 N, og et særligt foretruk-kent koncentrationsområde er fra omkring 0,005 N til omkring 0,1 N.

Det ligekædede S-sulfonat inkorporeres i det vandige 20 medium i en koncentration, som ikke overstiger ca. 10 mg pr. ml. Fortrinsvis er koncentration en lavere, almindeligvis i området fra omkring 0,05 mg til omkring 2 mg pr, ml.

Et vigtigt element ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 25 har relation til mængden af mercaptan, som anvendes i forhold til mængden af lineært S-sulfonat. De hidtil kendte metoder til reduktion af S-sulfonatet til -SH har gjort brug af meget store overskud af mercaptan i forhold til S-sulfonatet. Det er klart, at så store over-30 skud har oversvømmet S-sulfonatet, hvilket har ført til en fuldstændig reduktion af S-sulfonatet til den tilsvarende -SH-forbindelse. Dette har atter nødvendiqgjort en iso 9 149863 lation af -SH-mellemproduktet eller en kraftig fortynding af reaktionsblandingen efterfulgt af et adskilt oxidations-trin, almindeligvis under anvendelse af luft, til omdannelse af -SH-mellemproduktet til den ønskede -S-S-forbindelse.

5 I denne henseende kan eksempelvis henvises til Crestfield et al., J. Biol. Chem. 238, 622 - 627 (1963); Steiner et al., Proc. Nat'l Sci. U.S.A. 60, 622 - 629 (1968) og Yanai-hara et al., Diabetes 27_, (Suppl. 1), 149 - 160 (1978).

Derimod kræver fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at mer-10 captanen indgår i en mængde, som tilvejebringer mellem ca.

1 og ca. 5 -SH-grupper for hver -S-SO-j-gruppe, fortrinsvis i en mængde, der tilvejebringer fra ca. 2 til ca. 4 -SH-grupper pr. -S-S0^-gruppe. Når man anvender mercap-tanen i en mængde som anført ovenfor, har det vist sig, 15 at det er muligt med en høj grad af effektivitet og på bekvem måde at omdanne det ligekædede S-sulfonat direkte til det ønskede disulfid-insulin-forstadium. Eftersom insulinets A- og B-kæder, som er til stede som en del af det ligekædede S-sulfonat, indeholder 6 S-sulfonat-20 grupper, vil man, med henblik at nå op til det ovenfor beskrevne interval, anvende en mercaptan med en enkelt-SH-gruppe og det ligekædede S-sulfonat i et molært forhold på mellem ca. 6:1 og 30:1.

Den indbyrdes relation imellem pH, pufferstyrke og kon-25 centration af det ligekædede S-sulfonat er en vigtig, om end ikke altafgørende, faktor ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Generelt foretrækker man således at forøge pH-værdien og formindske pufferstyrken med stigende koncentration af det ligekædede S-sulfonat. 1

Den omhandlede fremgangsmåde adskiller sig fuldstændig fra de hidtil kendte fremgangsmåder derved, at det ikke er nødvendigt at gennemføre processen i en oxiderende atmosfære. Selv om et oxidationsmiddel, eksempelvis 10 149863 luft, kan være til stede i reaktionsmediet, har det overraskende vist sig at være særligt fordelagtigt at gennemføre reaktionen i næsten fuldstændigt fravær af luft eller andre oxidationsmidler. Ved "næsten fuldstæn-5 digt fravær" menes blot, at man søger at undgå en bevidst tilførsel af luft. Dette kan f.eks. opnås ved at gennemføre reaktionen i et lukket system, som gør det umuligt for luft eller andre oxidationsmidler at trænge ind. Med henblik på yderligere at sikre fravær af luft kan man 10 rense det vandige medium med nitrogen og derefter afgas- se mediet inden tildækningen af reaktanterne.

Generelt gennemføres fremgangsmåden ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 37° C. Fortrinsvis ligger reaktions-temperaturen i den laveste ende af dette interval, almin-15 deligvis fra omkring 2 til omkring 8° C og særligt fore- trukkent mellem ca. 4 og ca. 6° C. Imidlertid foretrækker man især at gennemføre processen i 2 forskellige temperaturområder. Reaktionsblandingen fremstilles ved omkring stuetemperatur, hvorefter den afkøles til en tempe-20 ratur på mellem ca. 2 og ca. 8° C, ved hvilken temperatur den holdes i den resterende del af reaktionsperioden.

Ved gennemførelsen af den omhandlede fremgangsmåde fremstiller man derfor typisk et vandigt medium med den ønskede pH-værdi under anvendelse af eksemplevis glycin i en 25 koncentration på omkring 0,05 N. Det således fremstillede vandige medium, som generelt holdes ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 37° C og fortrinsvis ved omkring stuetemperatur, afgasses, renses med nitrogen og afgasses på ny. Det ligekædede S-sulfonat-insulin-forstadium opløses 30 i det vandige medium i en mængde, som sikrer den ønskede koncentration, f.eks. Omkring 0,1 mg/ml medium. Mercapta-nen tilsættes i en mængde, som tilvejebringer mellem ca.

1 og ca. 5-SH-grupper for hver -S-SO^-gruppe. Den resulterende blanding, som i det væsentlige holdes fri for luft 11 149863 eller andre oxidationsmidler, afkøles til en temperatur på omkring 4 - 6° C og holdes i dette temperaturområde indtil reaktionen er fuldstændig. Dette tager almindeligvis mellem ea. 5 og ca. 72 timer og mere generelt mellem 5 15 og ca. 24 timer, almindeligvis omkring ca. 18 til ca.

20 timer.

Efter afslutningen af reaktionen kan insulin-forstadiet isoleres ved en række forskellige metoder, som alle er velkendte indenfor insulinrensning. De hyppigst anvendte 10 metoder er chromatografiske teknikker, herunder eksempelvis gelfiltrering og ionbytterchromatografi.

Det resulterende insulin-forstadium kan omdannes til insulin, og denne omdannelse kan foregå enten enzymatisk eller kemisk ved anvendelse af teknikker, som kendes fra 15 litteraturen. Disse metoder omfatter eksempelvis spaltning ved anvendelse af en kombination af trypsin og carboxypep-tidase B som beskrevet af Kemmler et al., i J. Biol.

Chem. 246, 6786 - 6791 (1971).

Insulinproduktet kan afprøves for renhed og relativ akti-20 vitet ved velkendte metoder såsom polyacrylamidgel-elek- troforese, aminosyreanalyse, radioreceptorprøve, readioim-munoprøve, højtryksvæskechromatografi (HPLC), ultraviolet spektrum, dansylation, glucoseprøve på kaninblod og lignende .

25 Det ligekædede S-sulfonat-insulin-forstadium, som anvendes som udgangsmateriale, kan fremstilles ved rekombinant DNA-metodik. Udgangsmaterialerne kan også fremstilles ud fra naturlige insuliner og proinsuliner såvel som ved klassiske peptidsyntesemetoder, såvel i opløsning som i fast fase. 1

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

12 149863

Eksempel la

Et ligekædet S-sulfonat-insulin-forstadium blev fremstillet ud fra proinsulin på følgende måde: Til 100 ml afkølet de-ioniseret 7M urinstof blev sat 786 mg natriumsiilfit. Opløs-5 ningen blev fuldstændig ved omrøring. Derefter tilsattes 594 mg natriumtetrathionat. Efter omrøring gik det meste af det tilsatte natriumtetrathionat i opløsning, selv om opløsningen stadig væk var tåget. Ved hjælp af iseddikesy-' re indstilledes pH-værdien til 7,7. Under omrøring tilsat-j[g tes 503 mg okseproinsulin, som var renset ved højtryksvæ-skechromatografi. Reaktionsblandingens pH-værdi blev gen-justeret til 7,6 ved hjælp af 2N natriumhydroxid. Den resulterende let uklare opløsning blev omrørt ved 6° C i 18 timer.

15 Omkring halvdelen af reaktionsblandingen blev justeret til pH 9,1 ved hjælp af 2N natriumhydroxid og overført til en Sephade>@ G25 kolonne. De chromatografiske betingelser var følgende: Opløsningsmiddel 0,05 M ammoniumbi-carbonat, pH 9,0, kolonnestørrelse 2 x 90 cm, temperatur 20 21° C og gennemstrømningshastighed 18,5 ml pr. minut. De første 120 ml, som passerede igennem kolonnen, blev borthældt, mens de følgende 75 ml blev opsamlet og opbevaret.

Derefter blev kolonnen vasket med yderligere 400 ml 0,05 M ammoniumbicarbonat (pH 9,0). Denne procedure blev genta-25 get med den anden halvdel af reaktionsopløsningen. UV- spektroskopi af de 2 portioner viste, at der ialt var opsamlet 401 mg. De 2 portioner blev kombineret og lyofili-seret til tørhed. Der opnåedes ialt 445,7 mg af det tørre afsaltede produkt. Det blev vist ved celluloseacetat-elek-30 troforese og ved polyacrylamid-gelelektroforese, at produktet var ligekædet S-sulfoneret okseproinsulin, og at der ikke var udgangsmateriale til stede.

Det ligekædede S-sulfonerede okseproinsulin blev renset 13 149863 ved diethylaminoethyl-cellulosechromatografi. Den rå prøve (443 mg) blev opløst i 10 ml af en opløsningsmiddelblanding bestående af urinstof (7,3 M), Tris (0,01 M) og EDTA (0,001 M) ved pH 8,5 og overført til en diethylaminoethyl-5 cellulosekolonne. De chromatografiske betingelser var føl gende: Opløsningsmiddelblanding bestående af urinstof (7,5-M), TRis (0,01M) og EDTA (0,001M), pH 8,5, med en gradient på 0 til 0,35 M natriumchlorid, kolonnestørrelse 2,5 x 90 cm, temperatur 4° C, strømningshastighed omkring 0,9 ml/ Ϊ0 minut og fraktionsvolumen 5,3 ml.

For hver fraktion målte man absorbansen ved 276 nm og afsatte denne som funktion af fraktionsnummeret, og denne afbildning gav en stor top, som delvis fladede ud. UV-spektroskopi viste, at den store top skyldtes produktet.

15 Fraktionerne 199 - 240 med udløbsvolumener på 1069-1291 ml blev kombineret. LH/-spektroskopi viste, at der var 355 mg i denne prøve.

Den portion, som indeholdt produktet, blev afsaltet på en Sephadex^G-25 kolonne. De chromatografiske betingelser 20 var følgende: Opløsningsmiddel 0,05 M ammoniumbicarbonat, pH 8,0, kolonnestørrelse 3,7 x 105 cm, temperatur 4° C og strømningshastighed 16,0 ml pr. minut. De første 395 ml af den udstrømmende væske blev borthældt, mens de følgende 250 ml blev opsamlet og opbevaret. Derefter blev kolonnen 25 vasket med yderligere 2000 ml 0,05 M ammoniumbicarbonat, pH 8,0. UV-spektroskopi af den samlede portion viste, at der var 321 mg produkt til stede. Prøven blev lyofiliseret til tørhed. Der opsamledes ialt 273 mg tørt materiale. I-dentiteten af produktet blev eftervist ved polyacrylamid-30 gelelektroforese og ved lavtryksvæskechromatografi på ba sis af eluringspositionen.

14 149863 EKSEMPEL 1 S-sulfonat-koncentration 0,1 mg/ml

Der fremstilledes en opløsning af 1,61 mg ligekædet S-sulfoneret okse-proinsulin opløst i 16,1 ml afgasset 5 0,05 M glycin, pH 9,5. Til denne opløsning sattes 0,158 ml af en vandig stamopløsning af 2-mercapto-ethanol, som ved titrering med Ellman's reagens viste sig at have en mercaptan-koncentration på 2,11 mg/ ml. Dette svarer til 4 ækvivalenter 2-mercaptoethanol 10 pr. ækvivalent -S-SO^ i det ligekædedé S-sulfonerede okse-proinsulin. Den afsluttende pH-værdi var 9,46.

Opløsningen, som var fremstillet ved stuetemperatur, blev forseglet med "parafilm" (en elastomer-modificeret paraffinvoks) og derefter omrørt under afkøling ved 15 6° C i 19 timer.

Reaktionsblandingen blev derefter gjort sur til pH 4,0+- 0,1 (temperatur justeret) ved anvendelse af koncentreret saltsyre og 0,5 N natriumhydroxid. Produktet blev isoleret og karakteriseret ved anvendelse 20 af lavtryksvæskechromatografi med høj effekt (HPLPLC). Chromatograferingsbetingelserne var følgende: Kolonnen var en 1,1 x 54 cm glaskolonne pakket med LP-l/CigSilicagel forhandlet af Quantum. Opløsningsmidlet var 30¾ acetonitril og 70¾ 0,1 M ammoniumformiat (pH 25 4,25), temperaturen var 21° C, trykket var 8028 g/cm2, og strømningshastigheden var 2,40 ml/minut. Prøverne blev overført til kolonnen ved hjælp af en 5 ml sløjfeformet injektionsanordning, og prøverne blev målt ved 280 nm. 1

Den første prøve var 5 ml af en stamopløsning af okse- proinsulin, som havde en nominel proteinkoncentration på 0,1 mg/ml. Den anden prøve var 5 ml af den sure 15 149863 reaktionsblanding. Tilstedeværelsen af monomert okse-pro-insulin i reaktionsblandingen blev eftervist på basis af elueringspositionen. Ved at beregne arealerne af de opnåede toppe ved de 2 HPLPLC-chromatograferin-5 ger kunne man beregne, at der var et udbytte på 82,6% okse-proinsulin i reaktionsblandingen.

EKSEMPEL 2 S-sulfonat-koncentration 0,5 mg/ml

Der fremstilledes en opløsning af 25,07 mg ligekædet 10 S-sulfoneret okse-proinsulin opløst i 5.0,14 ml af- gasset 0,05 M glycin med pH 10,51. Til opløsningen sattes 1,302 ml af en vandig stamopløsning af 2-mer-captoethanol, som ved titrering med Ellman's reagens viste sig at have en koncentration af mercaptan på :2,10 mg/ml. Dette svarer til 2,1 ækvivalenter 2-mer-captoethanol pr. ækvivalent -S-SO^ i det ligekædede S-sulfonerede okseproinsulin. Den afsluttende pH-værdi var 10,47. Opløsningen, som blev fremstillet ved stuetemperatur, blev forseglet med "parafilm" og om-20 .rørt under afkøling ved 6° C i 18 timer.

Derefter blev reaktionsblandingen gjort sur til pH

4,0 + 0,1 ( temperatur justeret) ved anvendelse af koncentreret saltsyre og 0,1 N saltsyre. En analyse ved HPLPLC viste et udbytte af okse-proinsulin på 69% 25 i reaktionsblandingen.

Efter afsaltning blev produktet isoleret ved gelfil-treringschromatografi. Reaktionsblandingen blev indstillet til pH 9,0 ved hjælp af koncentreret ammoni- (g) umhydroxid og overført til en Sephadex G-25 kolonne.

30 De chromatografiske betingelser ved afsaltningen var følgende: Opløsningsmiddel 0,05 M ammoniumbicarbonat, 16 149863 pH 9,0, kolonnestørrelse 2 x 90 cm, temperatur 21° C og strømningshastighed 18,5 ml/minut. De første 120 ml af den udstrømmende væske blev bortkastet, mens de følgende 75 ml blev opsamlet og opbevaret (protein-por-5 tion). Kolonnen blev derpå vasket med yderligere 400 ml 0,5 M ammoniumbicarbonat, pH 9,0. UV-spektroskopi af den proteinholdige portion viste, at der var udvundet 21,6 mg protein. Denne portion blev lyofiliseret til tørhed. Herved opnåedes ialt 22,21 mg tørt afsaltet 10 protein.

En portion af dette materiale (14,84 mg) blev opløst i 5,5 ml 1,0 M eddikesyre. UV-spektroskopi af den klare opløsning viste en koncentration af protein på 2,56 mg/ml.

5 ml af denne opløsning (12,8 -mg ved UV-analyse) 15 blev overført til en Sephadex® G-50 kolonne. De chro-matografiske betingelser var følgende: Opløsningsmiddel 1 N eddikesyre, kolonnestørrelse 1,5 x 100 cm, temperatur 21° C, strømningshastighed 0,19 ml/minut og fraktionsvolumen omkring 1,9 ml.

15 Absorbansen ved 280 nm blev registreret, idet kolon nen blev elueret natten over med 1 M eddikesyre. Den resulterende grafiske afbildning viste 2 toppe. Den første top, som var den mindste, repræsenterede de aggregerede former af okse-proinsulin. Den anden 20 top svarede til monomert okse-proinsulin. Der opsamledes portioner svarende til de 2 toppe. Fraktionerne blev kombineret, og deres volumener var følgende:

Portion I: Fraktionerne 50 - 46 (55,0 - 84,0 ml; top 70,4 ml) 1

Portion II: Fraktionerne 47 - 62 (84,0 - 112,0 ml; top 99,8 ml).

U9863 17 UV-spektroskopi viste tilstedeværelsen af 1,94 mg i portion I og 10,11 mg i portion II. Dette gav ialt 12,05 mg og svarede til en udvinding af 94,1¾ af den mængde, som var overført til kolonnen. Af den totale 5 udvundne mængde svarede 83,9¾ til monomert okse-proinsu- lin.

Begge portioner blev lyofiliseret til tørhed. Produktet i portion II blev vist at være okse-proinsulin på basis af elueringspositionen i en HPLPLC-chromatogra-10 fering. Dette blev ligeledes eftervist ved behand ling med trypsin og carboxypeptidase B ved anvendelse af den i litteraturen beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af okseinsulin.

EKSEMPEL 3 15 Temperatureffekt

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev benyttet til at bestemme temperaturens indvirkning på udbyttet af okse-proinsulin ud fra ligekædet S-sulfoneret okse-proinsulin. Reaktionsbetingelserne var følgende: 20 Proteinkoncentration 0,1 mg/ml, puffer 0,05 M glycin, pH 9,5. Mercaptan i form af 2-mercaptoethanol var til stede i en mængde, som tilvejebragte 4 ækvivalenter -SH pr. ækvivalent -S-S0^-. Reaktionstiden var 18 timer. 1 Når reaktionen blev gennemført ved 21° C, var udbyttet af proinsulin 47¾ bestemt ved HPLPLC. Når reaktanterne blev blandet ved 21° C, og temperaturen af blandingen derefter blev nedsat til 6° C, var udbyttet 77¾.

EKSEMPEL 4 18 149863 pH-værdiens indflydelse

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev benyttet til bestemmelse af pH-værdiens indflydelse på udbyttet 5 af okse-proinsulin ud fra ligekædet S-sulfoneret okse-proinsulin i en række reaktioner, som blev gennemført samtidigt. Reaktionsbetingelserne var følgende: Proteinkoncentration 0,5 mg/ml, puffer 0,05 M glycin, reaktionstid 18 timer og temperatur 6° C. Mercaptan i form 10 af 2-mercaptoethanol var til stede i en mængde, som tilvejebragte 2 ækvivalenter -SH pr. ækvivalent -S-SO^

Der opnåedes de følgende udbytter af proinsulin bestemt ved HPLPLC: pH Udbytte % 9,0 43,1 9,5 44,3 10,0 66,7 10.5 76,0 11.5 61,0 EKSEMPEL 5 15 Proteinkoncentrationens indflydelse

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev benyttet til at bestemme proteinkoncentrationens indflydelse på udbyttet af okse-proinsulin ud fra ligekædet S-sul-foneret okse-proinsulin i en række reaktioner, som blev 19 149863 udført samtidigt. Reaktionsbetingelserne var følgende:

Puffer 0,05 M glycin, pH 9,5, reaktionstid 18 timer og temperatur 6° C. Mercaptan i form af 2-mercaptoethanol var til stede i en mængde, som tilvejebragte 4 ækvi-5 valenter -SH pr. ækvivalent -S-SO^-.

Der opnåedes de følgende udbytter af proinsulin bestemt ved HPLPLC:

Proteinkoncentration, mq/ml Udbytte % 0,1 78 0,2 63 0,3 46 0,4 37,6 0,5 25,4 1,0 12

Der gennemførtes endnu en forsøgsrække med 2 ækvivalenter -SH pr. ækvivalent -S-SO^ og pH 10,5 med føl-10 qende resultater:_

Proteinkoncentration, mq/ml Udbytte % 0,5 77,2 0,96 58,3 1,83 19,5 4,2* 20,1 7,4* 19,6 * -SH: -S-S03 -forhold = 1,2 EKSEMPEL 6

Betydningen af forholdet imellem -SH og -S-SO^"

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev benyttet til at bestemme betydningen af forholdet imellem 15 -SH og -S-S03” for udbyttet af okse-proinsulin ud fra 149863 20 ligekædet S-sulfoneret okse-proinsulin i en række reaktioner, som bleu udført samtidigt. Reaktionsbetingelserne uar følgende: Proteinkoncentration 0,5 mg/ml, puffer 0,05 M glycin, pH 9,5, reaktionstid 18 timer 5 og temperatur 6° C.

Der opnåedes de følgende udbytter af proinsulin bestemt ued HPLPLC:

Forhold -SH: -S-S0^~ Udbytte % 4.0 30,8 2.0 44,7 1.0 37,0 0,5 4,5 EKSEMPEL 7

Mercaptan-typens betydning 10 Den i eksempel 1 beskreune fremgangsmåde bleu benyttet til bestemmelse af mercaptanstrukturens induirkning på udbyttet af okse-proinsulin i en række forsøg, som bleu udført samtidigt. Reaktionsbetingelserne uar følgende: Proteinkoncentration 0,1 mg/ml, puffer 15 0,05 M glycin, pH 9,5, reaktionstid 18 timer og temperatur 6° C. Mercaptanen tiluejebragte 4 ækuiualenter -SH pr. ækuiualent -S-SO-j-.

Der opnåedes følgende udbytter af proinsulin bestemt ued HPLPLC: 21 149863

Mercaptan Udbytte %

Dithiothritol 39,3

Dithioerythritol 34,9

Methylthioglycolat 56,1 3-mercapto-l,2-propandiol 65,5 3-mercaptopropionsyre 65,3 2-mercaptoethanol 64,1 EKSEMPEL 8

Proteintypens betydning

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev benyttet til at bestemme proteintypens indvirkning på udbyttet 5 af proinsulin ud fra ligekædet S-sulfoneret proinsulin i en række reaktioner gennemført samtidigt. Reaktions-betingerlserne var følgende: Proteinkoncentration 0,1 mg/ml, puffer 0,05 M glycin, pH 9,5, reaktionstid 18 timer og temperatur 6° C. Mercaptan i form af 10 2-mercaptoethanol var til stede i en mængde, der tilvejebragte 4 ækvivalenter -SH for hver ækvivalent -s-so3“.

Der opnåedes de følgende udbytter af proinsulin bestemt ved HPLPLC:

Ligekædet 5-sulfoneret proinsulin Udbytte % okseinsulin 60,6 svineinsulin 65,8 15 EKSEMPEL 9

Fremstilling af humant proinsulin

Der fremstilledes en opløsning af 169,3 mg biosyntetisk fremstillet ligekædet S-sulfoneret humant proinsulin opløst i 338,6 ml afgasset 0,05 M glycin, pH 10,54.

22 U9863

Til denne opløsning sattes 7,71 ml af en vandig stamop-løsning af 2-mercaptoethanol, som ved titrering med Ellman's reagens viste sig at have en mercaptankoncentration på 2.08 mg/ml. Dette svarer til 2 ækvivalenter 2-mercapto-5 ethanol pr. ækvivalent -S-SO^ i det ligekædede S-sul- fonerede humane proinsulin. Den afsluttende pH-værdi på 10,52 blev opnået ved en svag justering ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. Denne opløsning blev forseglet med "parafilm" og omrørt ved 6° C i 18 timer.

10 Derefter blev reaktionsblandingen gjort sur til pH

2.9 + 0,1 (temperatur justeret) ved anvendelse af saltsyre. Den resulterende klare opløsning blev overført til en Sephadex^ G-25 afsaltningskolonne. De chro-matografiske betingelser var følgende: Opløsningsmiddel 15 2% eddikesyre (v/v), kolonnestørrelse 5 x 100 cm, temperatur 25° C, strømningshastighed 28,8 ml/minut og fraktionsvolumen 20,2 ml.

De første 779 ml af den gennemstrømmende væske blev borthældt, mens de næste 464 ml blev opsamlet og op-20 bevaret. På basis af målinger af den optiske densitet ved 280 nm viste denne fraktion sig at være den protein-holdige portion. Kolonnen blev vasket med yderligere 2500 ml 2% eddikesyre. Beregninger foretaget på basis af den proteinholdige portions UV-spektrum viste et 25 udbytte på 164 mg protein, hvilket svarede til 101,9¾ af den mængde, som var overført til kolonnen (det teoretiske udbytte af gendannelsesreaktionen). Denne portion blev frosset og lyofiliseret til tørhed.

Det ønskede produkt blev isoleret ved gelfiltrerings-30 chromatografi. Det tørre uvejede materiale blev opløst i 20 ml 1 M eddikesyre. Den resulterende klare opløsning blev overført til en Sephade>^ G-50 kolonne. De chromatografiske betingelser var følgende: Opløsningsmiddel 1 M eddikesyre, kolonnestørrelse 2,5 x 35 125 cm, temperatur 25° C, strømningshastighed ca.

23 149863 0,82 ml/minut og fraktionsvolumen ca. 4,92 ml.

Absorbansen ved 280 nm blev registreret, idet kolonnen blev elueret med 1 M eddikesyre natten over. Den resulterende grafiske fremstilling af absorbansen ved 280 nm 5 som funktion af fraktionsnummeret viste 2 hovedtoppe. Den første top (som var den mindste) repræsenterede de aggregerede former af humant proinsulin. Den anden top var monomert humant proinsulin. Denne top havde endvidere en skulder. Der opsamledes 3 portioner af frak-10 tioner. De kombinerede fraktioner og deres volumener var følgende:

Portion I: fraktionerne 46 - 67 (218 - 325,5 ml)

Portion II: fraktionerne 68 - 81 (325,5 - 395,5 ml)

Portion III: fraktionerne 82 - 100 (395,5 - 490,3 ml).

Ud fra UV-spektrene af disse portioner kunne de følgende proteinmængder beregnes:

Portion I: 22,1 mg Portion II: 28,3 mg Portion III: 103,6 mg.

v

Dette gav ialt 154 mg svarende til et udbytte på 15 94¾ af den mængde, som var overført til kolonnen. Af den udvundne produktmængde bestod 67,3¾ af monomert humant proinsulin. Alle 3 portioner blev frosset og lyofiliseret til tørhed.

Der opnåedes ialt 106,55 mg tørt materiale fra portion 20 III, Dette materiale viste sig at være humant proinsulin, hvilket blev eftervist ved aminosyreanalyse og polyacrylamid-gelelelctroforese . Produktet lod sig også eluere ved højtryksvæskechromatografi i en position, hvor humant proinsulin måtte forventes at 25 lade sig eluere i forhold til okse-proinsulin. Produktet var endvidere i stand til ved behandling med trypsin og carboxypeptidase B at producere humant insulin.

Claims (5)

149853 Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et insulin-forstadium med den almene formel (A-i) (fly-—-----X • I (A-e) Cys—S—5 I I (A-20) (A-2l) (A—7) yys----Cys-------Cys-Asn—OH $ (A-n) S (B—1) \ I R—Phe---Cys-----------Cys---Lys—Z O-?) (S-13) (B-29)(B-30) hvori R betegner hydrogen, en kemisk eller enzymatisk fraspaltelig aminosyrerest eller en kemisk eller enzy-5 matisk fraspaltelig peptidrest indeholdende mindst to aminosyrerester, Z betegner Ala, Thr eller Ser, gruppen fra A-l til A-21 er-en insulin-A-kæde, gruppen fra B-l til B-30 er en insulin-B-kæde, og X er en peptidrest, som er knyttet til insulinets A-kæde ved aminogruppen i 10 A-l og til insulinets B-kæde ved cårboxylgruppen i B-30, hvilken peptidrest kan spaltes enzymatisk eller kemisk fra såvel A-kæden som B-kæden, uden at disse kæder brydes, kendetegnet ved, at man omsætter et S-sulfonat med den almene formel 149863 (A-ο (fly---:: (A-a) yys-3-SO ” 5 -SO " I 3 Ϊ 3 (A—49) (A-ai) (A—7) Cys—.----iys-----Cys-:Asn—OH S-SO ” ^A“1} $-50 ” 3 3 S-SO “ S-SO ” (e—1) | 3 | 3 R-Phe—- -Cys-----------Cys---Lys-Z (8-v) ' (B—19) (B-29)(B-30) hvori R, X og Z har de ovenfor angivne betydninger, med en vandopløselig mercaptan i en mængde, som tilveje-bringer mellem ca. 1 og ca. 5 -SH-grupper for hver -S-SO^ -gruppe , i et vandigt medium ved en pH-værdi på 5 mellem ca. 7 og ca. 11,5, idet der anvendes en puffer i en koncentration på højst ca. 0,5 N, ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 37 °C og ved en S-sulfonat-koncen-tration på højst ca. 10 mg pr. ml vandigt medium.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at X betegner det sammenknyttende peptid i svine-pro- insulin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betegner det sammenknyttende peptid i okse-pro-insulin. 1 2 3 4 5 6

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende 2 tegnet ved, at reaktionen gennemføres ved en pH- 3 værdi på mellem ca. 9,5 og ca. 10,5. 4

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at mercaptanen er til stede i en mængde, som til- 6 vejebringer mellem ca. 2 og ca. 4 -SH-gruppsr for hver -S-SO^-gruppe.'