DE2209836A1

DE2209836A1 - Verfahren zur herstellung von neuen insulinderivaten sowie ihre verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE2209836A1
Application number: DE2209836A
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dipl Chem Brandenburg; Walter Dr Puls
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-01
Filing date: 1972-03-01
Publication date: 1973-09-06
Also published as: IL41614A0; DK145854B; IL41614A; NL7302899A; DK145854C; DE2209836B2; US3847893A; AT324589B; FR2181779B1; BE795998A; JPS4897890A; CH579917A5; GB1374562A; FR2181779A1; SE420087B

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKU S EN-Bayerwerk

2 9. FEB. 1972

Patente, Marken und Lizenzen

IVTd (Pha) Er/Mx

Verfahren zur Herstellung von neuen Insulinderivaten sowie ihre Verwendung als Arzneimittel

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein neues, chemisch eigenartiges Verfahren zur Herstellung von neuen, antidiabetisch wirksamen Insulinderivaten sowie ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Antidiabetika.

Es ist "bereits "bekannt geworden, daß man die Insulin-A-Kette mit der Insulin-B-Kette vereinigen kann und dabei zum Teil Insulin erhält. Bei allen "bisher "bekannten Verfahren werden die getrennten Ketten vereinigt. Die Ausbeuten an Insulin sind in allen Fällen sehr niedrig, weil theoretisch eine sehr große Zahl von Disulfiden entstehen"kann, die A- und B-Ketten in unterschiedlichen Molverhältnissen enthalten. Hauptsächlich entstehen Kombinationsprodukte aus polymeren B-Ketten- und oligomeren A-Kettendisulfiden. Durch die Kombination von reduzierter B-Kette mit einem 1.5-fachen Überschuß an reduzierter Α-Kette läßt sich die Ausbeute an Insulin steigern (Y.-c. Du, R.-q. Jiang und C-I. Tsou, Scientia Sinica U, 229 (1965), jedoch selbst bei der Verwendung eines fünffach molaren Überschusses an A-Kette konnten nur 26 $ Insulin isoliert werden, wenn natürliche Ketten eingesetzt wurden (P. G. Katsoyannis, A. C. Trakatellis, S. Johnson, C. Zalut und G. Schwartz,

Le A U 218

309836/1 167

Biochemistry 6>, 2642 (1967)). Bei synthetischen Ketten lagen die Ausbeuten noch tiefer.

Als Hauptnachteil der bisherigen Verfahren sind niedrige Ausbeuten anzusehen, die auch durch ein wirtschaftlich nicht vertretbares Verwenden überschüssiger. Α-Kette nicht entscheidend gesteigert werden können.

Es ist weiterhin bekannt geworden, daß bei der Oxydation von reduziertem Proinsulin in vitro (D. P. Steiner und J. L. Clark, Proc, Nat. Acad, Sei. USA 60, 622, (1968)) Proinsulin in einer Ausbeute von 50 bis 80 % zurückgebildet wird. Proinsulin ist der einkettige· Vorläufer des Insulins in der Biosynthese.

Hohe Kombinationsausbeuten an synthetischem Insulin sind im Prinzip über synthetisches Proinsulin erreichbar, dieser Weg weist jedoch die folgenden Nachteile auf:

1. Bis heute ist noch kein synthetisches Proinsulin bekannt.

2. Es bedeutet einen sehr hohen experimentellen Aufwand, eine Sequenz von 30 bis 33 Aminosäuren zusätzlich zu synthetisieren, um diese als Brücke zwischen dem Aminoende der Α-Kette und dem Carboxylende der B-Kette zur Erhöhung der Kombinationsausbeute zu verwenden.

3· Proinsulin ist biologisch kaum aktiv, es muß in weiteren ■ Reaktionsschritten enzymatisch zu Insulin gespalten werden. Ein spezifisches Spaltenzym ist noch nicht bekannt.

Le A U 218 -2-

309836/1167

Es wurde gefunden, daß man vernetzte Insuline der "vereinfachten Formel

11 -I 21

HIT-GIy Cys-Cys Cys- Cys-Asn

S.

•c,

It

-Phe Cys Cys—-

(D

in welchen die oUAminogruppe von Glycin £-Aminogruppe von Lysin
säuret»rücke der Formel

der Α-Kette mit der der B-Kette durch eine Dicarbon-

C-X-C-ir tt

(ID

verknüpft ist,

wo"bei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1-15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Yalenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Was.serstoffatonen und hydrophilen Gruppen a"bgesättigt sind, steht,

erhält, wenn Derivate der Insulin-A-Kette der Formel (vereinfachte Darstellung)

Y
S

Y S

H₂IT-GIy Cys-Cys Cys

21 Cys-ÄszL

(III)

Le A 14 218

-3-

309836/1167

in welcher Y eine abspaltbare Schwefelschutzgruppe darstellt,

mit einem Überschuß eines aktivierten Derivates von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

Z-C-X-C-Z (IV)

π ti

O O

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Z für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest·steht,

in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Pro-AI tonenakzeptoren so umsetzt, daß ein am Glycin monofunktionell substituiertes, aktiviertes A-Ketten-Derivat entsteht, dieses mit einem Derivat der Insulin-B-Kette der Formel (vereinfachte Darstellung)

Y Y

S S NH₉

H₀N-Phe Cys Cys Lys (V)

* 1 29

worin Y die oben angegebene Bedeutung besitzt,

in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Protonenakzeptoren reagieren läßt, vom so erhaltenen vernetzten Kettenderivat der Formel

YYYY SSS. S

til I

r Cys-Cys Cys Cys-Asn

(VI)

S S

Y Y

Le A 14 218

30 9 836/118 7

worin X und Y die oben angegebene Bedeutung haben,

die Schwefelschutzgruppen Y entfernt und die Disulfidbindungen im wäßrigen Medium bei alkalischem pH unter ■Verdünnungsbedingungen oxydativ schließt.

Bei diesem Verfahren werden die im natürlichen Insulin vorkommenden Disulfidbindungen bevorzugt gebildet. Das Insulinderivat der Formel' I wird vorzugsweise durch ein Verfahren, das Stoffe nach dem Molekulargewicht trennt, isoliert. Die Insulinderivate der Formel I weisen eine hohe zuckersenkende Wirkung auf..

Es ist als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß gemäß der erfindungsgemäßen Umsetzung die Insulin-A-Kette mit der Insulin-B-Kette gezielt und in hoher Ausbeute ohne

B1

temporären Schutz der Aminogruppe des Phenylalanine zwischen den Aminogruppen von Glycin und Lysin verknüpft werden kann, weil man im Hinblick auf den Stand der Technik erwarten mußte, daß auch eine Substitution am Phenylalanin in beträchtlichem Ausmaß eintreten würde (D. Levy und F. H. Carpenter, Biochemistry J5, 3559 (1967), D. G. Lindsay und S. Shall, Biochem. J. 121, 737 (1971)). Ebenso'unerwartet ist, daß Febenreaktionen an den OH-Gruppen der Tyrosin- und Serinreste (H. Zahn und F. Schade, Angew. Chem. 7JL> 377 (1963)) nicht auftraten.

Besonders überraschend ist ferner, daß bei der Oxydation eine spezifische Bildung der Disulfidbindungen zwischen den Halbcystinresten A6 und A11, A7 und B7 sowie A20 und B19 erfolgt und sich Insulinderivate der Formel I in hoher Ausbeute gewinnen lassen. Der Fachmann konnte zwar annehmen, daß sich unter Verdünnungsbedingungen die Bildung von ' polymeren Disulfiden zurückdrängen läßt, im Hinblick auf die zahlreichen statistischen Kombinationsmöglichkeiten

Le A U 218 -5-

309836/1167

mußte jedoch erwartet werden, daß die monomeren Produkte aus einem Gemisch zahlreicher Isomerer bestehen und nur einen kleinen Teil des gewünschten Insulinderivates der Formel I enthalten würden.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen auf. So gelingt einmal die gezielte Verknüpfung von A- und B-Ketten in hoher Ausbeute ohne Nebenreaktionen und ohne Schutz der Phenylalanin-aminogruppe. Nicht umgesetzte B-Kette wird in hoher Ausbeute zurückgewonnen. Entscheidend ist, daß die Bildung der Insulin-Disulfidbiiidungen in wesentlich höherer Ausbeute als bisher erreicht werden kann.

Von besonderer Bedeutung ist, daß die Brücke zwischen den Aminogruppen nicht in einer weiteren Reaktionsstufe abgespalten zu werden braucht, und daß es nicht erforderlich ist. Insulin selbst aus dem Reaktionsprodukt zu gewinnen, da sich die vernetzten Insuline als biologisch aktiv erwiesen.

Verwendet man Rinderinsulin-A-Kette in der Tetra-S-sulfonatfonn, Rinderinsulin-B-Kette in der Bis-S-sulfonatform und Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester als Brückenreagenz, so kann der Reaktionsablauf durch das folgende (vereinfachte) Formelschema wiedergegeben werden:

Y S

Y
S

V Y Y V 21 Cys-Cys Cys Cys-Asn (III)

Le A H 218

-6-

309836/1167

5^

YY YY

SS SS

Il ti

-Cys-Cys Cys-—Cys-Asn

Y S

/~B (SY)₂7

Y S

■Cys— —Lys-Ala
29 30

YY SS

HN-GIy Cys-Cys

Y Y

S S

Cys Cys-Asn

!I

H₉U-Phe Cys Cys Lys-Ala

(VI)

Ie A 14 218

C CJCf

1
HlI-GIy

H S

Cys Cys-Asn

(VII)

Cys ; Cys-

t (

NH.
t
Lys-Ala

S H

1 I j 21

HlT-GIy Cys-Cys Cys Cys-Asn

(D

Cys Cys Lys-Ala

29 50

In der Formel III steht A(S-Y). für die Rinderinsulin-AKette in der Tetra-S-sulfonatform (Y = SO,"*), in der die Aminogruppe und alle anderen funktioneIlen Gruppen in freier Form (ungeschützt) vorliegen. Außer der Rinderinsulin-A-Kette können ebensogut die Α-Ketten mit der Sequenz anderer Insuline Anwendung finden, zum Beispiel von Human-, Schaf-, Schweine-, Wal- oder Fischinsulin. '

Die Ketten können entweder in "bekannter Weise aus natürlichen: Insulin gewonnen werden, vorzugsweise durch oxydative SuI-phitolyse (J. L. Bailey und R. D. Cole, J. Biol. Chem. 234, ¹735t ·959)), oder mittels bekannter Nethoden der Peptid-

-S-

309836/1167

chemie aufgetaut werden (ζ. B. H. Zahn, Vf. Danho und B. Gutte, Z. Naturforsch. 2Tb, 763 (1966)).

Y kann außer SO,™ auch andere, abspaltbare-Schwefelsehutzgruppen bedeuten, wie sie in der Peptidchemie üblich sind, zum Beispiel SCHpCH, (U. Weber, Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 350, 1421 (1969))· Die Aminogruppe muß frei sein, alle anderen funktionellen Gruppen können mit den in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen substituiert sein.

Entsprechend stellt 3(S-Y)₂.die Pänderinsulin-B-Kette vorzugsweise in-der Bis-S-sulfonatform. dar~(hier ist Y = SO·,""),

"POO 2

in der die £-Aminogruppe am Lysin ^ in freier Form vorliegt und auch alle anderen funktioneilen Gruppen ungeschützt sind.

Ebenso können B-Ketten mit der Sequenz anderer Insuline Anwendung finden, zum Beispiel von Human-, Schaf-, Schweine-, Wal- oder Fischinsulin.

Die Ketten können entweder in bekannter Weise aus natürlichem Insulin gewonnen werden, vorzugsweise durch oxydative Sulphitolyse, oder mittels bekannter Methoden der Peptidchemie aufgebaut werden (zum Beispiel H. Zahn und G. Schmidt, Tetrahedron letters 5095 (1967)).

Y-kann außer SO-,"" auch andere, abspaltbare Schwefelschutzgruppen bedeuten, wie sie in der Peptidchemie üblich sind, zum Beispiel SSHpCH-r (IT. Weber, Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 350, H21 (1969)).

Die ^-Aminogruppe am Lysin muß frei vorliegen, alle anderen funktioneIlen Gruppen können mit den in der- Peptidchemie üblichen Schutzgruppe!! versehen

sein

Le A H 218 ~9-

3 0 S £ 3 8 / 1

Die erfindungsgemäß verwendbaren bifunktionellen Verbindungen sind bereits bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden (H. Zahn und P. Schade, Chem. Ber. j?6, 1747 (1963), J. Schnell und H. Zahn, Kolloid-Z. 203, 27 (1965), H. Zahn und M. Bahra, Forschungsber. des Landes Nordrhein-Westfalen Nr. 1897, L. Brandt, Herausg., Westdeutscher Verlag, Köln und Opladen, 1967), in der Regel aus der Dicarbonsäure, dem substituierten Phenol und Dicyclohexylcarbodiimid.

Als Beispiele seien genannt: ·*·

Aliphatische Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel ZOC-(CHp)-COZ, in denen die Carboxylgruppe durch den Rest Z aktiviert ist, Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester, Pimelinsäure-bis-N-hydroxysuccinimidester, Korksäure-bis-2,4,5-trichlorphenylester, Azelainsäure-bis-pentachlorphenyl- . ester.

Als Verdünnungsmittel bei der Darstellung der Kettenderivate können alle polaren organischen Lösungsmittel verwendet werden, in denen sich die Insulinketten und ihre Derivate lösen. Als Beispiele seien Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid genannt.

Die mercaptolytische Abspaltung der Schwefelschutzgruppen sowie die Bildung der Disulfidbindungen erfolgt im wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten Medium.

Als Protonenakzeptoren können alle bei der Peptidsynthese üblichen basischen Verbindungen verwendet werden, zum Beispiel Triäthylamin oder N-Methylmorpholin. Bei der Schutzgruppenabspaltung und Bildung der Disulfidbindungen im wäßrigen Medium können beispielsweise Ammoniumhydroxid oder Alkalihydroxide, wie Natriumhydroxid,

Le A 14 218 -10-

309836/1167

2209838

Hydrogencarbonate, wie Amnoniumhydrogencarbonat, oder Carbonate, wie Natriumcarbonat verwendet werden. Ferner Puff er subs tanzen, wie Tris(liydro:cymet.riyl)aminomethan oder Glycin, sowie organische Basen, wie Metlivlamin.

Als Reduktionsmittel dienen beispielsweise Mercaptane wie ß-Mercaptoäthanol oder Thioglycolsäure, es kann auch elektrolytisch reduziert werden.

Als Denaturierungsmittel dient beispielsweise Harnstoff, als Oxydationsmittel für SH-G-rupp_en zum Beispiel Luftsauerstoff.

Bei der Darstellung der Kettenderivate arbeitet man im allgemeinen bei Temperaturen zwischen 0 und 40 C, bei der Reduktion zwischen 0 und 100 ⁰G, bei der Bildung der Disulfidbindungen durch Oxydation zwischen 0 und 30 C.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man das Kettenderivat der allgemeinen Formel (siehe Formel VI, Seite 7)

A(S-Y). -C-X-C- B(S-T)₀

ο ■ ο

her, indem man zu einer Lösung von 5 bis 20 mMol der aktivierten Dicarbonsäure, deren Konzentration vorzugsweise zwischen 0.05 vjia. 0.2 Mol/l beträgt, in vorzugsweise organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Dimethylsulfoxid, unter kräftigem Rühren eine Lösung von 1 zni-lcl Insulin-A-Eette mit reversibel geschützten SH-C-ruppen. zum Beispiel A-Eettentetra-S-sulfonat, und vorzugsweise 3 Ms 10 zaMol Säurebindsr._: zum Beispiel Triäthylamin, ini organischen Lösungsmittel tropft. Vorzugsweise wird las gleich·? Lösungsmittel verwendet, in diesem ?alle Dinethylsulfo^iia» untsr diesen Bedingungen reagiert das Biοarcölsäurederivat monofunktionell mit der Aminogruppe der A-Zette z~a eines aktivierten Derivat.

Le A 14 218 -ii-'

309836/116?

das durch Ausfällen mit beispielsweise Methanol/Äther (1 : 10), vorzugsweise 15 bis' 3*0 Minuten nach Beendigung der Zugabe des Dicarbonsäurederivates isoliert wird. Nach gründlichem Waschen mit zum Beispiel-Methanol/Äther wird das aktivierte A-Kettenderivat im organischen .Lösungsmittel, vorzugsweise Dirnethylsulfoxid, gelöst, wobei die Konzentration vorzugsweise 10 bis 20 uMol/ml beträgt und zu einer gerührten Lösung von.1 bis 5, vorzugsweise 1,2 bis 1,3» Äquivalenten Insulin-B-Kette, zum Beispiel B-Ketten-bis-S-SuIfonat und 5 bis 15, vorzugsweise ca. 7 mMol/Base pro mMol B-Kette, bei einer Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10 uMol B-Kette/ml langsam zugetropft, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten.'

Nach einer weiteren Reaktionszeit von vorzugsweise 15 bis Stunden unter Rühren wird das Reaktionsprodukt durch ein nach dem Molekulargewicht oder der Ladung trennendes Verfahren isoliert, erforderlichenfalls durch eine Kombination von beiden. Beispielsweise wird an Sephadex G-50 fine in 0.05 Ammoniumbicarbonatlösung chromatographiert.

Die Abspaltung der Schwefelschutsgruppen Y, zum Beispiel der S-Sulfonatgruppen sowie die Oxydation der SH-Gruppen wird in Anlehnung an die von White (F. H. White, Methods in Enzymology Band VJ_, 481 (1967)) für Ribonuclease angegebenen Verfahren durchgeführt. Eine' Lösung des Kettenderivates, die zwischen 2 und 5 uKol/ml enthält, wird mit einem Überschuß eines Reduktionsmittels (40 bis 200 Mol des Reduktionsmittels pro Mol substituierte Schwefelgruppe), vorzugsweise eines Mercaptans wie Mercaptoäthanol in Gegenwart eines Denaturierungsmittels wie Harnstoff, bei pH-Werten zwischen 7 und 9, vorzugsweise bei pH 8,5 und einer Temperatur zwischen 0 und 40 C, vorzugsweise bei Raumtemperatur zwischen 3 und 10 Stunden umgesetzt. Dann isoliert man das reduzierte Kettenderivat durch Ausfällen,

Le A 14 218 -12-

309836/1167

vorzugsweise durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wobei zugleich zur Vermeidung einer Oxydation der SH-G-ruppen "bei saurem pH-Wert gearbeitet wird (beispielsweise nach F. H. White,- J· Biol. Chem. 236, 1353 (1961), mittels Aceton/HCl) oder durch Gelfiltration im sauren Medium.

Die Bildung der erfindungsgemäßen Insulinderivate erfolgt durch Oxydation der reduzierten Kettenderivate unter Verdünnungsbedingungen (zwischen 0,01 und 0,05, vorzugsweise 0,02 uMol Kettenderivat pro ml) vorzugsweise im alkalischen Medium (zwis-chen pH 7,5 und pH 10*8, insbesondere bei pH 8.5 bis 9.0) und bei Temperaturen zwischen 0 und 30 ⁰C, vorzugsweise zwischen 18 und 25 ⁰C. Die Isolierung der Insulinderivate erfolgt durch Gefriertrocknung und einer Trennung nach Molekulargewicht, zum Beispiel an Sephadex G-50 fine in 10 $iger Essigsäure.

Die neuen Wirkstoffe weisen eine blutglucosesenkende Wirkung auf. Sie eignen sich deshalb zur Behandlung von Diabetikern im allgemeinen und besonders solchen, die infolge Antikörp'erbildung gegen Hinder- und/oder Schweineinsulin hohe Dosen herkömmlicher Insulinpräparate benötigen, deren Bedarf aber erfahrungsgemäß nach Umstellung auf ein neues Präparat, gegen das keine Antikörper gebildet werden, durch niedrigere Dosen zufriedenstellend gedeckt ist.

Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen und Suspensionen, besonders Kristallsuspensionen.

Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere zur parenteralen Injektion.·

Le A U 218 -13-

309836/1167

Versuchsanordnung zur Untersuchung des Insulingehaltes von Insulinderivaten

Insulin senkt die Blutglucose von Ratten. Diese Wirkung ist , in einem "bestimmten Bereich dosisabhängig. Durch vergleichen de Berechnung der Blutglucosesenkung "bei Ratten nach subcutaner Injektion von Präparaten mit unbekannter Insulinwirksamkeit und der Blutglucosesenkung nach subcutaner Injektion von Insulin mit "bekanntem Wirkstoffgehalt, wird die "blutglucosewirksame Insulinaktivität der Insulinder- rivate ermittelt. Einzelheiten sie H. Zahn, E. Drechsel und W. Puls: Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 349, 385-389 (1968).

Wirkstoff blutglucosewirksame Insulin-

i aktivität/1 mg in # vom ■ Insulinstandard (25,4 IE/mg)

N^eB29-Adipoylinsulin 41

Le A 14 218 -H-

309836/1167

Beispiel 1

£B29
, N -Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-

bis-S-sulfonat ' - ^ "

Zu einer Lösung von 38.8 mg (100 uMol) Adipinsäure-bis-pnitrophenylester in 1 ml Dirnethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine "Lösung von 28 mg (ca. 10 uMol) Rinderinsulin-A-Kette in der Tetra-S-sulfonatform in 1.5 ml Dirnethylsulfoxid und 7 ul Triäthylamin innerhalb von 15 Minuten bei Raumtemperatur getropft. Die Rsaktionsmischung wurde noch' 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das A-Kettenderivat durch Zugabe von Ither, der 10 fo Methanol enthielt, gefällt, abzentrifugiert und mehrfach mit Äther gewaschen. Der Rückstand wurde in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Rinderinsulin-B-Kette (ca. 27 uMol) in der Bis-S-sulfonatform und 25 ul Triäthylamin in 4 ml Dimethylsulfoxid getropft.

Die Reaktionsmischung wurde noch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann eine Stunde gegen fließendes Wasser und zweimal je eine Stunde gegen 1 Liter 0.05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung (pH 8.2) dialysiert. Sodann wurde die Lösung auf eine Säule (3 x 200 cm) mit Sephadex G-50 fine, im gleichen Lösungsmittel äquilibriert,' aufgetragen und chromatographiert (Abb. 1).

Nach der Gefriertrocknung wurden erhalten: Fraktion 1 29-3 mg (44 $> d. Th.) 1T^^A1, U^sS29-Adipoyl-A-(schraffiert) ^etten-tetra-S-sulf onat-B-ketten-bis-S-sulf onat

Fraktion 2 65 ng B-ketten-bis-sulfonat

Le A 14 218 -15-

309836/1167

Analyse der Fraktion 1 :

Papierelektrophorese bei pH 2: Reinheit 90 fO

R. (relative Beweglichkeit der Bande, bezogen auf A-Kettentetra-S-sulfonat)= 0.4

UV-Spektrum, Extinktion bei 276 nm:

^£276 = ^56O°

Figur 1 zeigt das Elutionsdiagramm der Gelchromatographie des Rohproduktes aus der Synthese in Beispiel 1 an Sephadex G-50 fine (Säulendimensionen 3 x 200 cm) in 0.05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung vom pH 8.2.

Durchlauf geschwindigkeit: 9-0 ml/Stunde

Abszisse: Elutionsvolumen in ml

Ordinate: Extinktion bei 254 nm (Nanometer)

1. Maximum (schraffiert): H⁰^¹, N^£B29-Adipoyl-A-ketten-tetra-

S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat

2. Maximum: nicht umgesetztes B-Ketten-bis-S-

sulfonat

Beispiel 2
, N^EB29-Azelaoyl-A-kett.en-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis

S-sulfona

Zu einer Lösung von 107.5 mg (250 uMol) Azelainsäure-bis-pnitrophenylester in 3 ml Dimethylsulfoxid v/urde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 70 mg (26 uMol) Α-Kette in der S-sulfonatform und 20 ul Triäthylamin in 4 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 20 Minuten getropft. Nach weiterem Rühren für 20 Minuten wurde das Kettenderivat mit Methanol/Äther

Le A 14 218 -16- .

309836/1167

(1 : 10) ausgefällt, abzentrifugiert, gründlich mit Methanol/ Äther gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.

Das Kettenderivat wurde in 1.5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung getropft, die 115 ng (32 uMol) B-Kette'in der S-sulfonatform und 30 ul Triäthylamin in 5 ml Dimethylsulfoxid enthielt. Die· Mischung wurde noch 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann eine' Stunde gegen fließendes Wasser und 2x je eine Stunde gegen 1 Liter 0.05 M Ammonium-

hydrogencarbonatlösung dialysiert. Anschließend wurde die Lösung (25 ml) auf eine Säule (*3 x 200 cm) mit Sephadex G-50 aufgetragen und wie bei Beispiel 1 beischrieben, chromatographiert.

Ausbeuten

Praktion 1 64 mg (39.2 <?o d. Th.) U^¹, K^£B29-Azelaoyl-

A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-

S-sulfonat

Fraktion 2 54 mg B-ketten-bis-S-sulfonat

Analyse der Fraktion 1: .

TJV:Spektrum, Extinktion bei 276 nm:
= 5340

R_A - 0.5

elektrophoretische Reinheit: 95

Le A H 218 -17-

309836/1167

Beispiel 3

_Ν<*-Α1 ^ fl^£B29_sifoeroyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat

Zu einer Lösung von 208 mg (500 uKol) Korksä'ure-bis-pnitrophenylester in 6 ml Dimethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 135 mg (50 uMol) A-Kettentetra-S-sulfonat (aus Rinderinsulin) 'und 40 ul Triäthylamin in 7 ml Diinethylsulfoxid innerhalb von 20 Minuten bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionsmischung wurde noch 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in 3·5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 230 mg (62 u Mol) B-Ketten-bis-S-sulfonat in 10 ml Dirnethylsulfoxid und 60 ul Triäthylamin bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionslösung wurde noch 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie bei Beispiel 1 beschrieben, dialysiert und chromatographiert. Nach der Gefriertrocknung wurden erhalten: .

Fraktion 1 153.4 mg (48 <fo d. Th.) Η*^Α1, N^^B29-Suberoyl-

A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-kettenbis-S-sulfonat

64 mg B-ketten-bis-S-sulfonat

Analyse der Fraktion 1:
UV-Spektrum, Extinktion bei 276 nm

R_A = 0.43

Elektrophoretische Reinheit: >■ 95

Le A 14 218 -18-

309836/1167

Beispiel 4 N^£B29-Adipoylinsulin

60 mg (ca. 8.5 uMol) des vernetzten Kettenderiyates Ii , N^eB29-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-siilfonat-B-ketten~bis-3~ sulfonat (siehe Beispiel 1) wurden in 3 al 8 M Harnstofflösung gelöst, die Lösung wurde mit Methylamin auf pH 6.6 eingestellt. Dann wurde 10 Minuten lang Stickstoff durciigeleitet, mit 200 ul (3·1 mMol) ß-Mereaptoäthanol versetzt und nochmals 10 Minuten lang Stickstoff durohgeleitet» Nach. dreieinhalbstündiger Reduktionsseit. wurde die Lösung auf ca. 0 ⁰C gekühlt und das Protein mit einem Gemisch aus kaltem Aceton und 1-NHCL (im Verhältnis 39 : 1) gefällt, abzentrifugiert, zweimal mit kaltem Äther gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.

Das reduzierte Kettenderivat wurde in 2 ml 1 U Ammoniak gelöst und die Lösung mit 600 ml Ammoniumbicarbonatlösung verdünnt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8.5 bis 8.6 blieb die Lösung zur Oxydation bei Raumtemperatur an der Luft stehen. Nach 5 Tagen wurde lyophilisiert. Auswaage: 141 mg, Proteingehalt (spektroskopisch bestimmt: ca. 36 <fo)

135 mg wurden in 2 ml Eisessig und 8-ml Wasser gelöst, der unlösliche Anteil (16.7 mg nach dem Trocknen) wurde abaentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule (3 χ 200 cm) mit Sephadex G-50 fine aufgetragen, die mit 10 $iger Essigsäure äquilibriert war, und im gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Das Eluat unter dem Maximum (siehe Pig. 2) wurde dreimal gegen je 1 Liter dest. Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

Ausbeute: 31-6 mg (57.5 f< > d. Th.' bei einem Proteingehalt von 90 fo)

Le A 14 218 -19-

309836/1167

Analyse des Adipoylinsulins:

UV-Spektrum, Extinktion bei 278 nm
^£ = ⁵⁵⁴°

Celluloseacetatelektrophorese "bei pH 2: eine scharfe Bande mit gleicher Beweglichkeit wie authentisches Adipoylinsulin, R* (Beweglichkeit, bezogen auf Insulin) = 0.74

Das Präparat kristallisiert aus zinksalzhaltigem Citratpuffer nach Schlichtkrull (Acta Chem. Scand. j_0, 1455, 1956) in der gleichen kugeligen Kristallform wie eine Parallelprobe aus authentischem Adipoylinsulin/;

Figur 2 zeigt das Elutionsdiagramm der Gelchromatographie des Oxydationsproduktes aus Beispiel 4 an einer Säule mit Sephadex G-50 fine (Dimensionen 3 x 200 cm) in 10 $iger Essigsäure. Durchflußgeschwindigkeit 35 ml/Stunde.

Abszisse: Elutionsvolumen in ml

Ordinate: Extinktion bei 254 nm (Nanometer)

Die Fraktion mit' dem Maximum bei 685 ml (schraffiert) enthält das N^¹, N^HB29-Adipoylinsulin.

/
Der zur Ordinate parallele Pfeil soll die Lage des Adsorptionsmaximums im Falle des nativen Rinderinsulins (bei 700 ml) markieren.

Le A 14 218 -20-

309836/1167

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von bifunktionell vernetzten Insulinderivaten der Formel

^S ^S 21 ·"

Cys-Cys Cys Cys-Asn

(D

H₅N-Phe
^ά 1- ·

in welchen die.ot-Aminogruppe von Glycin der A-Kette

poq
mit der -Aminogruppe von Lysin der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

C-X-C-

U Il

(II) 0 0

verknüpft ist,

wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 - "15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht,

dadurch gekennzeichnet, daß man Derivate der Insulin-AKette der Formel

Le A 14 218 -21-

309836/1167

YYI Y -· SS S S

'ft - ι t

ft ι t

Cys-Cys Cys Cys-Asn (III)

in welcher Y eine abspalfbare Schwefelschutzgruppe darstellt,

/ Z-C-X-C-Z (IV)

ti Il

O ·■ -* O

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Z für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht,

in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Protonenakzeptoren zu einem an Glycin monofunktionell substituierten aktivierten A-Kettenderivat umsetzt und dieses mit einem Derivat der Insulin-B-Kette der Formel

Y Y

.S S NH₂

H₉N-Phe Cys ■ r Cys ^-Lys (V)

^d 1

worin Y die oben angegebene Bedeutung besitzt,

Le A H 218 -22-

309836/1167

YYX Y

S S ' S S

iti ι

—-Cys-Cys Cys- Cys-Asn

3SH

--Cys -Cys-'——Lys-Ala

1 » ' «

S ■' " S

Y Y

worin X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen,

die Schwefelschutzgruppen Y entfernt und die Msulfidbindungen im wäßrig alkalischen Medium unter Verdünnungsbedingungen oxydativ schließt und die erhaltenen bifunktionell vernetzten Insulinderivate durch ein Verfahren, das Stoffe nach dem Molekulargewicht trennt, isoliert.

2. Bifunktionell vernetzte Insulinderivate gemäß Formel I im Anspruch 1." '

3- Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem bifunktionell vernetzten Insulinderivat gemäß Formel I im Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung von zuckersenkenden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man bifunktionell vernetzte Insulinderivate gemäß der Formel I im Anspruch 1 mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen vermischt.

Ie A H 218 ^: -23-

309836/1167

Leerseite