DK145854B - Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin - Google Patents

Description

i o 145854

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt, kemisk egenartet fremgangsmåde til fremstilling af visse hidtil ukendte bifunktionelt tværbundne insuliner, som er antidiabetisk virksomme og derfor kan finde anvendelse som 5 lægemiddel, især som antidiabetikum.

Det er allerede kendt, at man kan forene insulin-A--kæden med insulin-B-kæden og herved til dels få insulin.

Ved alle hidtil kendte fremgangsmåder forenes de adskilte kæder. Udbytterne af insulin er i alle tilfælde særdeles 10 lave, fordi der teoretisk kan opstå et meget stort antal disulfider, der indeholder A- og B-kæder i forskellige molforhold. Der opstår hovedsageligt kombinationsprodukter af polymere B-kæde- og oligomere A-kædedisulfider. Ved kombinationen af reduceret B-kæde med et 1,5-dobbelt over-15 skud af reduceret A-kæde kan insulinudbyttet forøges (Y.--c. Du, R.-q. Jiang og C.-l. Tsou, Scientia Sinica 14, 229 (1965)), endog selv ved anvendelse af et femfobbelt molært overskud af A-kæde har kun 26% insulin kunnet isoleres, når der er anvendt naturlige kæder (P.G. Katsoyannis, A.C. Trakatellis, S. Johnson, C. Zalut og G. Schwartz, Biochemistry £, 2642 (1967)). Ved syntetiske kæder lå udbytterne endnu lavere.

Lave udbytter, der end ikke ved en anvendelse af overskud af A-kæde, der ikke kan forsvares i økonomisk hen-25 seende, kan forøges afgørende, skal betragtes som hovedulempe ved de hidtidige fremgangsmåder.

Det er endvidere kendt, at der ved oxidationen af reduceret proinsulin in vitro (D.F. Steiner og J.L. Clark,

Proc. Nat. Acad.Sci. USA £0, 622 (1968)) gendannes pro-30 insulin i et udbytte på 50-80%. Proinsulin er den enkæ- dede forløber for insulin ved biosyntesen.

Høje kombinationsudbytter af syntetisk insulin kan i princippet opnås via syntetisk proinsulin, men denne vej frembyder dog nedenstående ulemper: 1. Hidtil har man ikke kendt noget syntetisk proinsulin.

35 2

O

145854 2. Det betyder en særdeles stor eksperimentel indsats at syntetisere en sekvens på 30-33 aminosyrer yderligere for at anvende disse som bro mellem A-kædens aminoende og B-kæ-dens carboxylende til forøgelse af kombinationsudbyttet.

5 3. Proinsulin er næppe aktivt i biologisk henseende, det skal spaltes enzymatisk til insulin ved yderligere reaktionstrin. Et specifikt spalteenzym kendes endnu ikke.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af bifunktionelt tværbundet insulin med formlen

10 S - S

1 I I 21 HN-Gly Cys-Cys---Cys-----Cys-Asn I (i) Y s S » lo « 15 S 0 -----

I ? I

HoN-Phe-------Cys-----------Cys--------Lys----Ala 1 29 hvor α-aminogruppen af'glycinAl i A-kæden er forbundet med £-ami- B29 nogruppen af lysin i B-kæden via en dicarboxylsyrebro med 20 formlen - C - X - C - (II) if ir 0 o 25 hvor X betyder en direkte carbon-carbon-binding eller en li-gekædet alkylengruppe med 1-15 carbonatomer, er ejendommelig ved, at et derivat af insulin-A-kæden med formlen (simplificeret gengivelse)

y Y y Y

30 , S S S S OT

x I I I f ^N-Gly----Cys-Cys---Cys-----Cys-Asn (III) hvor Y betyder en fraspaltelig svovlbeskyttelsesgruppe, omsættes med et overskud af et aktiveret derivat af en dicarb-35 oxylsyre med den almene formel o 3 145854 Z-C-X-C-Z (XV)

il II

o o hvor X har den ovenfor angivne betydning, og Z betyder en 5 gruppe, der aktiverer carboxylsyregruppen, i et polært organisk opløsningsmiddel i nærværelse af en protonacceptor, at

Al det dannede, ved glycin monofunktionelt substituerede, aktiverede A-kædederivat derefter omsættes med et derivat af insulin-B-kæden med formlen (simplificeret gengivelse)

10 Y Y

S S nh2 H2N -Phe------Cys-------Cys-----Lys Ala (V) 1 29 hvor Y har den ovenfor angivne betydning, i et polært orga-15 nisk opløsningsmiddel i nærværelse af en som protonacceptor virkende organisk base, svovlbeskyttelsesgruppen Y fjernes fra det på denne måde fremkomne tværbundne kædederivat med formlen

Y Y Y Y

20 S S S S

» t i i HNjiGly---Cys-Cys---Cys---—Cys-Asn " («)

0 " —»KH

0 * 25 HgN-Phe-------Cys-----------Cys------Lys-Ala * t s s

Y Y

hvor X og Y har den ovenfor angivne betydning, og disulfidbindingerne lukkes oxidativt i vandigt alkalisk medium ved 30 en temperatur på 0-30°C under fortyndingsbetingelser, og det fremkomne, bifunktionelt tværbundne insulin isoleres ved en fremgangsmåde, der skiller stoffer efter molekylvægten.

Insulinderivaterne med formlen (I) har en høj sukkersænkende virkning.

35 Det må betegnes som udtalt overraskende, at insulin- -A-kæden ved omsætningen ifølge opfindelsen kan forbindes 145854 4 o

Al med insulin-B-kæden mellem aminogrupperne af glycin og ly-B29 sin på tilsigtet måde og i højt udbutte uden midlertidig

Bl beskyttelse af aminogruppen i phenylalanin , fordi man under hensyntagen til den kendte teknik måtte forvente, at der 5 også i betragteligt omfang ville indtræde en substituering ved phenylalaninet (D. Levy og F.H. Carpenter, Biochemistry £, 3559 (1967), D.G. Lindsay og S. Shall, Biochem. J. 121, 737 (1971). Ligeså uventet er det, at der ikke optræder sidereaktioner ved OH-grupperne i tyrosin- og seringrupperne 10 (H. Zahn og F. Schade, Angew. Chem. 15, 377 (1963)).

Det er endvidere særlig overraskende, at der ved oxidationen ifølge opfindelsen sker en specifik dannelse af di-sulfidbindingerne mellem halvcystingrupperne A6 og All, A7 og B7 samt A20 og B19, og at insulinderivater med formlen (I) 15 kan udvindes i højt udbytte. En fagmand kunne ganske vist antage, at dannelsen af polymere disulfider lod sig trænge tilbage under fortyndingsbetingelserne, men under hensyntagen til de talrige statistiske kombinationsmuligheder måtte det dog forventes, at de monomere produkter ville bestå af en 20 blanding af talrige isomere og kun ville indeholde en lille del af det ønskede insulinderivat med formlen (I).

Den her omhandlede fremgangsmåde frembyder en række fordele. Således lykkes på én gang den tilsigtede sammenbinding af A- og B-kæder i højt udbytte uden sidereaktioner og 25 uden beskyttelse af phenylalanin-aminogruppen. Ikke-omsat B--kæde genvindes i højt udbytte. Det er afgørende, at dannelsen af insulin-disulfidbindinger kan opnås i væsentlig højere udbytte end hidtil.

Det er af særlig betydning, at broen mellem aminogrup-30 perne ikke behøver at fraspaltes i et yderligere reaktions-trin, og at det ikke er nødvendigt at udvinde selve insulinet fra reaktionsproduktet, da de tværbundne insuliner har vist sig som biologisk aktive.

Hvis der anvendes kvæginsulin-A-kæde i tetra-S-sulfo-35 natform, kvæginsulin-B-kæde i bis-S-sulfonatform og adipinsy- 5

O

145854 re-bis-p-nitrophenylester som broreagens, kan reaktionsforløbet gengives ved nedenstående (simplificerede) formelskema.

0 0 10 . I II I 21 - ft I I ^ 1 . .

HgN-G-ly----Cys-Cys----Cys-----Cys-Asn (III) _^ />(sy)47

II Y Y

15 _ SS SS

OgN-u^n-O-C- (CHg) ^-C-NH-Gly---Cys-Cys----Cys---Cys-Asn + 0 0 20

? ? - O2lf-(OV-OH

H0li-Phe------Cys-----------Cys-----Lys-Ala (V) 2 \_ZT

1 29 30 ^ 7"b (sy)27 25

Υ Υ Y Y

s s s s H^Bly---Cys-Cys---Cys-----Cys-Asn

3° C

o (CH2)^c (VI) o ---- -^

HpN-Phe-------Cys-----------Cys------Lys-Ala t t

35 SS

Y Y

145854 6

O

HH Η H

1 SS S s ' 1 t * » HN^Grly-----Ctys-Cys------Cys-—---Cys-Asn 5 («i) _>

0 ^ NH

t

HoK-Phe-----Cys-------------Cys-------Lys-Ala s s

10 Η H

S-S

1 | | 21 15 HH;-&ly-~-Cy^Cys---Cys---—Cys-Asn h^®2>4.0 i m i o (I) ® 0 f "^ΊΗ 20 HnN-Phe-------Cys-----------Cys--------lys-Ala ά 1 29 30 I formel (III) betyder A(S-Y)^ kvæginsulin-A-kæden i tetra-S-sulfonatformen (Y = SO^ ), hvor aminogruppen og alle 25 andre funktionelle grupper foreligger i fri form (ubeskyttet). Foruden kvæginsulin-A-kæden kan man lige så godt anvende A-kæ-der med en sekvens som i andre insuliner, f.eks. human-, fåre-, svine-, hval- eller fiskeinsulin.

Kæderne kan enten udvindes fra naturligt insulin på 30 kendt måde, fortrinsvis ved oxidativ sulfitolyse (J.L. Bailey og R.D. Cole, J. Biol. Chem. 234, 1733 (1959)), eller opbygges ved hjælp af kendte metoder inden for peptidkemien (f.eks. H. Zahn, W. Danho og B. Gutte, Z. Naturforsch. 21b, 763 (1966)).

35 Foruden S03” kan Y også betyde andre, fraspaltelige svovlbeskyttelsesgrupper, således som de er gængse inden for 7

O

145854 peptidkemien, f.eks. SC^CH^ (U. Weber, Hoppe-Seyler*s Z. physiol. Chem. 350, 1421 (1969)). Aminogruppen skal være fri, alle andre funktionelle grupper kan være substitueret med de inden for peptidkemien gængse beskyttelsesgrupper.

5 På tilsvarende måde betyder B(S-Y)2 kvæginsulin-B-kæ- den i bis-S-sulfonatformen (Y = SO, ), hvor £-aminogruppen B29 ^ ved lysin foreligger i fri form, og også alle andre funk tionelle grupper er ubeskyttet.

B-Kæder med en sekvens som i andre insuliner, f.eks.

10 human-, fåre-, svine-, hval- eller fiskeinsulin, kan ligeledes anvendes.

Kæderne kan enten udvindes fra naturligt insulin på kendt måde, fortrinsvis ved oxidativ sulfitolyse, eller ved hjælp af kendte metoder inden for peptidkemien (f.eks. H.

15 Zahn og G. Schmidt, Tetrahedron Letters 5095 (1967)).

Foruden SO^ kan Y også betyde andre, fraspaltelige svovlbeskyttelsesgrupper, således som de er gængse inden for peptidkemien, f.eks. SCH^CH^ (0. Weber, Hoppe-Seyler's Z.

physiol. Chem. 350, 1421 (1969)).

Ή2 9 20 £-Aminogruppen ved lysin skal foreligge i fri form, alle andre funktionelle grupper kan være forsynet med de inden for peptidkemien gængse beskyttelsesgrupper.

De bifunktionelle forbindelser, der er anvendelige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er allerede kendte el-25 ler kan fremstilles ved kendte fremgangsmåder (H. Zahl og F. Schade, Chem. Ber. £6, 1747 (1963)f J. Schnell og H. Zahn, Kolloid-Z. 203, 27 (1965), H. Zahn og M. Bahra, Forshungs-ber. des Landes Nordrhein-Westfalen Nr. 1897, L. Brandt, udgivet af Westdeutscher Verlag, Koln und Opladen 1967), i reg- 30 len ud fra dicarboxylsyre, substitueret phenol og dicyclo-hexylcarbodiimid.

Som eksempler skal nævnes:

Aliphatiske dicarboxylsyrer med den almene formel ZOC-(CH-) -C0Z, hvor carboxylgruppen er aktiveret af grup-35 ^ n pen Z, adipinsyre-bis-p-nitrophenylester, pimelinsyre-bis-N- o 8 1Λ585Λ -hydroxysuccinimidester, korksyre-bis-2,4,5-trichlorphenyl-ester, azelainsyre-bis-pentachlorphenylester.

Som fortyndingsmiddel ved fremstilling af kædederi-vateme kan man anvende alle polære organiske opløsningsmid-5 ler, hvor insulinkæderne og deres derivater opløser sig. Som eksempler skal nævnes dimethylsulfoxid og dimethylformamid.

Den mercaptolytiske fraspaltning af svovlbeskyttelses-grupperne samt dannelsen af disulfidbindingerne sker i vanddigt, eventuelt pufret medium.

10 Som protonacceptorer kan man anvende alle ved peptid syntesen gængse organiske baser, f.eks. triethylamin eller N-methylmorpholin. Ved beskyttelsesgruppefraspaltningen og dannelsen af disulfidbindingerne i vandigt medium kan der f.eks. anvendes ammoniumhydroxid eller alkalimetalhydroxider, 15 såsom natriumhydroxid, hydrogencarbonater, såsom ammoniumhy-drogencarbonat, eller carbonater, såsom natriumcarbonat. Endvidere pufferstoffer, såsom tris(hydroxymethyl)aminomethan eller glycin, samt organiske baser, såsom methylamin.

Som reduktionsmiddel tjener f.eks. mercaptaner, såsom 20 β-merc apto ethano1 eller thioglycolsyre, men der kan også re duceres elektrolytisk.

Som denatureringsmiddel tjener f.eks. urinstof, og som oxidationsmiddel for SH-gruppen f.eks. luftoxygen.

Ved fremstillingen af kædederivaterne arbejdes der al-25 mindeligvis ved temperaturer mellem 0 og 40°C, ved reduktion mellem O og 100°C og ved dannelse af disulfidbindingerne ved oxidation mellem O og 30°C.

Ved gennemførelsen af den her omhandlede fremgangsmåde fremstilles kædederivatet med den almene formel (jvf. for-30 mel (VI) , side 5 ) A(S-Y). - C - X - C - B(S-Y)0 ** II II ώ o o 35 f.eks. ved, at der til en opløsning af 5-20 mmol aktiveret di- 9 145854 o carboxylsyre, hvis koncentration fortrinsvis ligger mellem 0,05 og 0,2 mol/liter, i et polært organisk opløsningsmiddel, f.eks. dimethylsulfoxid, under kraftig omrøring ved stuetemperatur dryppes en opløsning af 1 mmol insulin-A-kæde med re-5 versibelt beskyttede SH-grupper, f.eks. A-kæde-tetra-S-sulfo-nat, og fortrinsvis 5-10 mmol syrebindende middel, f.eks. tri-ethylamin; i et organisk opløsningsmiddel. Der anvendes fortrinsvis samme opløsningsmiddel, i dette tilfælde dimethylsulfoxid. Under disse betingelser reagerer dicarboxylsyrederivatet mono-10 funktionelt med aminogruppen i A-kæden til et aktiveret derivat, der isoleres ved udfældning med f.eks. en blanding af methanol og ether i forholdet 1:10, fortrinsvis 15-30 minutter efter endt tilsætning af dicarboxylsyrederivatet. Efter grundig vask med f.eks. en blanding af methanol og ether opløses 15 det aktiverede A-kædederivat i et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis dimethylsulfoxid, idet koncentrationen fortrinsvis ligger på 10-20 ptiol/ml, og dryppes langsomt, fortrinsvis i løbet af 30 minutter, ved stuetemperatur til en omrørt opløsning af 1-5, fortrinsvis 1,2-1,3 ækvivalenter insulin-B-kæde, 20 f.eks. B-kæde-bis-S-sulfonat, og 5-15, fortrinsvis ca. 7 mmol base pr. mmol B-kæde, ved en koncentration på fortrinsvis 5-10 jimol B-kæde/ml.·

Efter en yderligere reaktionstid på fortrinsvis 15-20 timer under omrøring isoleres reaktionsproduktet ved en 25 fremgangsmåde, der skiller efter molekylvægt eller efter ladning, om nødvendigt ved en kombination af begge. F.eks. chro-matograferes der på "Sephadex G-50 fine" (registreret varemærke) i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning.

Fraspaltningen af svovlbeskyttelsesgrupperne Y, f.eks.

30 S-sulfonatgrupperne, samt oxidationen af SH-grupperne gennemføres i analogi med de af White (F.H. White, Methods in Enzy-mology, bind 11^ 481 (1967)) for ribonuclease angivne fremgangsmåder. En opløsning af kædederivatet, der indeholder mellem 2 og 5 pmol/ml, omsættes f.eks. med et overskud af et re-35 duktionsmiddel (40-200 mol reduktionsmiddel pr. mol substitue- o 10 145854 ret svovlgruppe), fortrinsvis en mercaptan, såsom mercapto-. ethanol, i nærværelse af et denatureringsmiddel, såsom urinstof, ved pH-værdier mellem 7 og 9, fortrinsvis ved en pH--værdi på 8,5, og ved en temperatur på mellem 0 og 40°C, for-5 trinsvis ved stuetemperatur, i mellem 3 og 10 timer. Dernæst isoleres det reducerede kædederivat ved udfældning, fortrinsvis ved tilsætning af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, idet der tillige til undgåelse af en oxidation af SH-gruppen arbejdes ved en sur pH-værdi (f.eks. ifølge 10 F.H. White, J. Biol. Chem. 236, 1353 (1961) ved hjælp af en blanding af acetone og HC1) eller ved gelfiltrering i surt medium.

Ifølge opfindelsen sker dannelsen af det bifunktionelt tværbundne insulin ved oxidation af de reducerede kædederiva-15 ter under fortyndingsbetingelser (mellem 0,01 og 0,05, fortrinsvis 0,02 ptiol kædederivat pr. ml) , i et alkalisk medium (ved en pH-værdi på mellem 7,5 og 10,8, især ved en pH-værdi på 8,5-9,0) og ved temperaturer mellem 0 og 30°C, fortrinsvis mellem 18 og 25°C. Isoleringen af insulinderivaterne sker ved 20 frysetørring og adskillelse efter molekylvægt, f.eks. på "Sephadex G-50 fine" i 10%'s eddikesyre.

De hidtil ukendte aktive forbindelser har en blodgluco-sesænkende virkning. De er derfor egnede til behandling af diabetikere i almindelighed og især sådanne, der som følge af an-25 tistofdannelse mod kvæg- og/eller svineinsulin kræver store doser af traditionelle insulinpræparater, men hvis behov erfaringsmæssigt efter omstilling til et nyt præparat, der ikke dannes antistoffer mod, dækkes tilfredsstillende med lavere doser.

30 De hidtil ukendte aktive forbindelser kan på kendt må de overføres i de gængse formuleringer, såsom opløsninger og suspensioner, især krystalsuspensioner.

De hidtil ukendte aktive forbindelser kan anvendes på gængs måde, især til parenteral injicering.

35 o u 14585Λ

Forsøgsarrangement til undersøgelse af insulinindholdet i insulinder ivater_

Insulin sænker blodglucosen hos rotter. Denne virkning er dosisafhængig i et vist område. Ved sammenlignende 5 beregning af blodglucosesænkningen hos rotter efter subcu-tan injicering af præparater med ukendt insulinvirkning og blodglpcosesænkningen efter subcutan injicering af insulin med kendt indhold af aktiv forbindelse konstateres den blod-glucosevirksomme insulinaktivitet af insulinderivaterne.

10 Nærmere enkeltheder i H. Zahn, E. Drechsel og W. Puls: Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 349, 385-389 (1968).

Blodglucosevirksom insulinaktivitet ved 1 mg i % af insu- 15 Aktiv forbindelse_linstandard (25,4 IE/mg)_ ΝαΑΐ, N B29-Adj poylinsulin 41

Eksempel 1 a) NqA1, N€B29-Adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-20 -sul fonat

Til en opløsning af 38,8 mg (100 pnol) adipinsyre-bis--p-nitrophenylester i 1 ml dimethylsulfoxid dryppes under kraftig omrøring en opløsning af 28 mg (ca. 10 pnol) kvæginsulin--A-kæde i tetra-S-sulfonatformen i 1,5 ml dimethylsulfoxid 25 og 7 pi triethylamin i løbet af 15 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen omrøres i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur. Derpå fældes A-kædederivatet ved tilsætning af ether, der indeholder 10% methanol, fracentrifugeres og vaskes flere gange med ether. Remanensen opløses i 1 ml dime-30 thylsulfoxid og dryppes i løbet af 30 minutter under kraftig omrøring til en opløsning af 100 mg kvæginsulin-B-kæde (ca.

27 pnol) i bis-S-sulfonatformen og 25 pi triethylamin i 4 ml dimethylsulfoxid.

Reaktionsblandingen omrøres i yderligere 4 timer ved 35 stuetemperatur og dialyseres dernæst 1 time mod rindende vand 12

O

145854 og to. gange 1 time mod 1 liter 0/05 M ammoniumhydrogencarbo-natopløsning (pH-værdi 8,21. Derpå påføres opløsningen en søjle (3 x 200 cm) med "Sephadex G-50 fine", som er bragt i ligevægt i samme opløsningsmiddel, og chromatograferes (fig.

5 1) .

Efter frysetørring fås:

Fraktion 1 29,3 mg (44% af det teoretiske) (skraveret) -adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-S--sulfonat 10 Fraktion 2 65 mg B-kæde-bis-sulfonat

Analyse af fraktion 1:

Papirelektroforese ved pH 2: Renhed 90% RÅ (relativ bevægelighed af båndene, beregnet på A-kæde-te-tra-S-sulf onat) = .0,4 15 UV-Spektrum, ekstinktion ved 276 nm: £276 = 5600

Fig. 1 viser elueringsdiagrammet for gelchromatogra-. fien af råproduktet fra syntesen i eksempel la) på "Sephadex G-50 fine" (søjledimensioner 3 x 200 cm) i 0,05 M ammo-niumhydrogencarbonatopløsning med en pH-værdi på 8,2.

20 Gennemløbshastighed: 90 ml/time Abscisse: Elueringsvolumen i ml Ordinat: Ekstinktion ved 254 nm (nanometer)

/v TV T C U O Q

1. maksimum (skraveret): Nu , IT' -adipoyl-A-kæde-tetra-S- -sulfonat-B-kæde-bis-S-sulfonat 25 2. maksimum: ikke-omsat B-kæde-bis-S-sulfonat b) N , N -Adipoylinsulm 60 mg (ca. 8,5 ^imol) af det tværbundne kædederivat aAl N , N -adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-30 sulfonat, jvf. afsnit a), opløses i 3 ml 8 M urinstofopløsning, opløsningen indstilles på en pH-værdi på 8,6 med me-thylamin. Derpå gennemledes nitrogen i 10 minutter, der tilsættes 200 jil (3,1 mmol) β-mercaptoethanol, og der gennemledes nitrogen i yderligere 10 minutter. Efter 3 1/2 times 35 reduktionstid afkøles opløsningen til ca. 0°C, og proteinet 13 145854 o fældes med en blanding af kold acetone og 1 N HC1 i forholdet 39:1, fracentrifugeres, vaskes to gange med kold ether og tørres kort i vakuum.

Det reducerede kædederivat opløses i 2 ml 1 N ammo-5 niak, og opløsningen fortyndes med 600 ml ammoniumbicarbonat-opløsning. Efter indstilling af en pH-værdi på 8,5-8,6 henstår opløsningen i luften ved stuetemperatur til oxidation.

Efter 5 dage lyofiliseres der.

Udbytte: 10 141 mg, proteinindhold (spektroskopisk bestemt): ca. 36% 135 mg opløses i 2 ml iseddike og 8 ml vand, og den uopløselige andel (16,7 mg efter tørring) fracentrifugeres. Remanensen anbringes på en søjle (3 x 200 cm) med "Sephadex G 50 fine", der er bragt i ligevægt med 10%'s eddikesyre, og 15 chromatograferes i samme opløsningsmiddel. Eluatet under maksimum (jvf. fig. 2) dialyseres tre gange mod 1 liter destilleret vand pr. gang og lyofiliseres dernæst.

Udbytte: 31,6 mg (57,5% af det teoretiske ved et proteinindhold på 90%).

20 Analyse af adipoylinsulin: UV-Spektrum, ekstinktion ved 278 nm: £278 = Celluloseacetatelektroforese ved pH-værdi på 2: et skarpt bånd med samme bevægelighed som autentisk adipoylinsulin, RJns (bevægelighed, beregnet på insulin) =0,74 25

Præparatet krystalliserer fra zinksaltholdig citratpuffer ifølge Schlichtkrull (Acta Chem. Scand. 10, 1455, 1956) i samme kuglerunde krystalform som en parallelprøve fra autentisk adipoylinsulin.

30 Fig. 2 viser eluatdiagrammet for gelchromatografien af oxidationsproduktet fra eksempel lb) på en søjle med "Sephadex G-50" (dimensioner 3 x 200 cm) i 10%'s eddikesyre. Gennemstrømningshastighed 35 ml/time.

Abscisse: Elueringsvolumen i ml 35 Ordinat: Ekstinktion ved 254 nm (nanometer) 14

O

145854

Fraktionen med maksimum ved 685 ml (skraveret) indeholder -TaAl ,.,£.B2 9 s. _ . . .

N , N -adipoylmsulmet.

Den med ordinaten parallelle pil skal markere adsorp- tionsmaksimets stilling ved det naturlige kvæginsulin (ved 5 700 ml).

Eksempel 2 a) NaÅ,J-, H^^-Azelaoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S--sulfonat 10 Til en opløsning af 107,5 mg (250/imol) azelainsyre- -bis-p-nitrophenylester i 3 ml dimethylsulfoxid dryppes under kraftig omrøring en opløsning af 70 mg (26 ;imol) A-kæde i S-sulfonatform (fra kvæginsulin) og 20 yul trietnylamin i 4 ml dimethylsulfoxid i løbet af 20 minutter. Efter yderligere 15 omrøring i 20 minutter udfældes kædederivatet med en blanding af methanol og ether i forholdet 1:10, fracentrifugeres, vaskes grundigt med en blanding af methanol og ether og tørres kort i vakuum.

Kædederivatet opløses i 1,5 ml dimethylsulfoxid og 20 dryppes i løbet af 30 minutter under kraftig omrøring til en opløsning, der indeholder 115 mg (32 pnol) B-kæde i S-sulfo- formen (fra kvæginsulin) og 30 ^ul triethylamin i 5 ml· dimethyl— sulfoxid. Blandingen omrøres i yderligere 3 1/2 time ved stuetemperatur og dialyseres dernæst i 1 time mod rindende 25 vand og 2 x 1 time mod 1 liter 0.,05 M ammoniumhydrogencarbo-natopløsning. Derpå anbringes opløsningen'(25 ml) på en søjle (3 x 200 cm) med "Sephadex G-50" og chromatograferes på den i eksempel la) beskrevne måde.

Udbytter 30 Fraktion 1 64 mg (39,2% af det teoretiske) N0^, N^B^-azela-oy1-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bi s-S-sulfonat Fraktion 2 54 mg B-kæde-bis-S-sulfonat Analyse af fraktion 1: UV-Spektrum, ekstinktion ved 276 nm: é-276 = ^340 35 Ra = 0,5 elektroforetisk renhed: 95%.

145854 15

O

b) NgA·*, N^B^-Azelaoylinsulin 60 mg (ca. 8,3 yumol) af det tværbundne kædederivat NaAl, N^B29-azelaoyl-Å-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S--sulfonat, afsnit a) , reduceres med 300 pi (4,25 mmol) 0-5 -mercaptoethanol som i eksempel 4b) beskrevet. Isoleringen af det reducerede derivat sker som i eksempel lb) beskrevet.

Det reducerede kaedederivat opløses i 3 ml 1 N ammoniak, og opløsningen fortyndes hurtigt med 600 ml af en 0,05 M ammoniumhydrogencarbonatopløsning. Ved tilsætning af ammoni- 10 ak indstilles en pH-værdi på 9. Opløsningen henstår i et åbent plastbægerglas i 120 timer ved stuetemperatur. Med mellemrum på 12-15 timer kontrolleres pH-værdien, som om nødvendigt korrigeres. Efter oxidationens afslutning syrnes med iseddike til en pH-værdi på 5, og der lyofiliseres.

15 Remanensen opløses som i eksempel lb) beskrevet, og der chromatograferes på "Sephadex G-50 fine" i 10%'s eddikesyre. Frysetørring af eluatet ved maksimum (elueringsvolu-men ca. 750 ml) giver 41,5 g (76% af det teoretiske).

Analyse af azelaoylinsulin: 20 UV-spektrum, ekstinktion ved 278 nm, ^278 = 5820·

Celluloseacetatelektroforese ved pH-værdi 2 giver et skarpt bånd, RJns (bevægelighed, henført til insulin) = 0,77. Krystalformen er meget små nåle.

25 Eksempel 3 a) NaA^, N^,B29-Suberoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis--S-sulfonat

Til en opløsning af 208 mg (500 ;umol) korksyre-bis--p-nitrophenylester i 6 ml dimethylsulfoxid dryppes under kraf- 30 tig omrøring en opløsning af 135 mg (50 jimol) A-kæde-tetra-S--sulfonat (fra kvæginsulin) og 40 pi triethylamin i 7 ml dimethylsulfoxid i løbet af 20 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen omrøres i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur og oparbejdes derpå som beskrevet i eksempel la).

oc

Remanensen opløses i 3,5 ml dimethylsulfoxid og dryppes i 10- 16

O

145854 bet af 30 minutter under kraftig omrøring til en opløsning af 230 mg (62 pnol) B-kæde-bis-S-sulfonat (fra kvæginsulin) i 10 ml dimethylsulfoxid og 60 jil triethylamin ved stuetemperatur. Reaktionsopløsningen omrøres i yderligere 17 timer 5 ved stuetemperatur og dialyseres og chromatograferes derpå som beskrevet i eksempel la). Efter frysetørring fås:

Fraktion 1 153,4 mg (48% af det teoretiske) NaA\ N^®^-su-beroyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sul-fonat 10 Fraktion 2 64 mg B-kæde-bis-S-sulfonat Analyse af fraktion 1: UV-Spektrum, ekstinktion ved 276 nm: ^76 = ®450 Ra = 0,43

Elektroforetisk renhed: >95%.

15 b) NaA^, N£B29-Suberoylinsulin 60 mg (ca. 8,3 jimol) af det tværbundne kædederivat NQA1f N^B29_suberoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S--sulfonat, afsnit a), reduceres med 300 jil β-mercaptoetha-20 nol (4,25 mmol) i 4 timer som i eksempel 4b) beskrevet. Det reducerede kædederivat isoleres og reduceres som i eksempel lb) beskrevet.

Det reducerede kædederivat opløses i 3 ml 1 N ammoniak, og opløsningen fortyndes hurtigt med 550 ml af en 0,05 M 25 ammoniumhydrogencarbonatopløsning, som med ammoniak er indstillet på en pH-værdi på 9,5. Derefter henstår opløsningen i et åbent plastbægerglas i 50 timer ved stuetemperatur i luften. Efter forløbet af dette tidsrum syrnes med iseddike til en pH-værdi på 5, og der lyofiliseres.

30 Remanensen opløses i 3 ml iseddike og 15 ml vand og chromatograferes på en søjle (3 x 200 cm) med "Sephadex G-50 fine" i 10%'s eddikesyre som i eksempel lb) beskrevet. Elue-ringsdiagrammet (fig. 2) viser kun ét maksimum (elueringsvo-lumen ca. 700 ml). Frysetørring af eluatet (som i eksempel 35 lb) beskrevet) giver 41 mg (76% af det teoretiske ved et proteinindhold på 90%).

17 o 145854

Analyse af suberoylinsulin: UV-spektrum, ekstinktion ved 278 ran, ^278 = 3^00. Celluloseacetatelektroforese ved pH-værdi 2 giver et skarpt bånd, RJns (bevægelighed, henført til insulin) = 0,75.

5 Præparatet krystalliserer i nåleform fra zinknitrat- holdig puffer, jfr. eksempel lb).

Eksempel 4 a) / N£B29_oxaiyi-Å_kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S- 10 -sulfonat

Til en opløsning af 86 mg (260 pmol) oxalsyre-bis-p--nitrophenylester i 5 ml dimethylsulfoxid dryppes i løbet af 20 minutter ved stuetemperatur under kraftig omrøring en opløsning af 70 mg (ca. 26 pmol) A-kæde-tetra-S-sulfonat (fra 15 svineinsulin) og 36 pi (260 pmol) triethylamin i 5 ml dime- thylsulfoxid. Reaktionsblandingen omrøres i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur og oparbejdes derpå som i eksempel .la) beskrevet. Remanensen opløses i 2,5 ml dimethylsulfoxid og dryppes ved stuetemperatur i løbet af 30 minutter under 20 kraftig omrøring til en opløsning af 187 mg (ca. 52 pmol) B-kæde-bis-S-sulfonat (fra kvæginsulin) i 8 ml dimethylsulfoxid og 87 pi (620 pmol) triethylamin. Reaktionsopløsningen omrøres i yderligere 17 timer ved stuetemperatur og dialyseres og chromatograferes derpå som i eksempel la) beskrevet.

25 Efter frysetørring fås:

Fraktion 1 88 mg (54% af det teoretiske) NaA1, N^2^-oxalyl--A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sulfonat. Fraktion 2 95 mg B-kæde-bis-S-sulfonat Analyse af fraktion 1: 30 UV-spektrum,ekstinktion ved 276 nm: ^76 = 533°*

Ra = 0,46.

Elektroforetisk renhed 90%.

O

U5854 18 b) N^B^-Oxalylinsulin 60 mg (ca. 8,5 pmol) af det tværbundne kædederivat NaA\ N^B^-oxalyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sul-fonat, afsnit a), opløses i 3 ml afluftet 8 M urinstofopløs-5 ning, som indeholder 300 pi (4,25 mmol) β-mercaptoethanol, og som med methylamin er indstillet på en pH-værdi på 8,6.

Med methylamin efterindstilles pH-værdien på 8,6, og dernæst ledes i 10 minutter nitrogen gennem opløsningen, som får lov at henstå i lukket beholder i 4 timer ved stuetemperatur.

10 Det reducerede kædederivat isoleres ved udfældning som i eksempel lb) beskrevet og opløses i ca. 3 ml 1 N ammoniak. Denne opløsning fortyndes hurtigt med 850 ml 0,05 M ammonium-hydrogencarbonatopløsning, og derefter indstilles pH-værdien på 8,5 med ammoniak. Opløsningen henstår i et åbent plastbæ-15 gerglas ved stuetemperatur, indtil thiolindholdet er faldet til 1% af begyndelsesværdien . Efter 110 timers forløb syrnes med iseddike til en pH-værdi på ca. 5, og der lyofiliseres.

Remanensen opløses som i eksempel lb) og chromatogra-feres på "Sephadex G-50 fine" i 10%'s eddikesyre. Eluerings-20 diagrammet viser kun ét maksimum (elueringsvolumen 770 ml) . Frysetørring af eluatet giver 39 mg (71% af det teoretiske) oxalylinsulin.

Analyse af oxalylinsulin: UV-Spektrum, ekstinktion ved 276 nm, £276 = ^940.

25 Celluloseacetatelektroforese ved pH-værdi 2 giver et skarpt bånd, RJns (bevægelighed, henført til insulin) = 0,77, identisk med autentisk oxalylinsulin.

Præparatet krystalliserer prismeformet fra zinksaltholdig citratpuffer.

30

Eksempel 5 a) NaA1, NfcB2^-Tridecandioyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde--bis-S-sulfonat

Til en opløsning af 110 mg (250 pmol) tridecandisyre-35 -bis-N-hydroxysuccinimidester i 5 ml dimethylsulfoxid dryppes

O

19 14585Λ i løbet af 30 minutter ved stuetemperatur under kraftig omrøring en opløsning af 135 mg (ca. 50 pmol) A-kæde-tetra-S--sulfonat (fra svineinsulin) og 56 pi triethylamin (400 pmol) i 5 ml dimethylsulfoxid. Reaktionsblandingen omrøres i yder-5 ligere 40 minutter ved stuetemperatur og oparbejdes derpå som i eksempel la) beskrevet. Remanensen opløses i 4 ml dimethylsulfoxid og dryppes ved stuetemperatur i løbet af 60 minutter under kraftig omrøring til en opløsning af 290 mg (ca. 80 pmol) B-kæde-bis-S-sulfonat (fra kvæginsulin) i 10 ml dimethylsulf-10 oxid og 112 pi (800 pmol) triethylamin. Reaktionsopløsningen omrøres i yderligere 20 timer ved stuetemperatur og dialyseres og chromatograferes derpå som i eksempel la) beskrevet.

Efter frysetørring fås:

Fraktion 1 196 mg (61% af det teoretiske) N01^, tride- 15 can dioyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sul- fonat

Fraktion 2 104 mg B-kæde-bis-S-sulfonat Analyse af fraktion 1: UV-spektrum, ekstinktion ved 276 nm, ^276 = 52^° 20 ra = 0,43.

Elektroforetisk renhed ca. 95%.

b) NaÅ\ N^^-Tridecandioylinsulin 60 mg (ca. 8,3 pmol) af det tværbundne kædederivat 25 ΝαΑ·*·, N^B^9-tridecandioyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis- -S-sulfonat, afsnit a)^ reduceres med 400 pi (5,7 mmol) β-mer-captoethanol i 4 timer som i eksempel 4b) beskrevet.

Det reducerede kædederivat isoleres ved udfældning som i eksempel lb) beskrevet og opløses i ca. 3 ml 1 N ammoniak.

30 Denne opløsning sættes hurtigt til 830 ml af en 0,05 M tris--hydroxymethylaminomethan-HCl-puffer med en pH-værdi på 8,5. Opløsningen henstår i et åbent plastbægerglas ved stuetemperatur i luften, indtil thiolindholdet er faldet til 2% af begyndelsesværdien. Efter 100 timers forløb dialyseres med 1%'s ed-35 dikesyre, hvorefter der lyofiliseres.

O

U5854 20

Remanensen opløses i 2 ml iseddike og 10 ml vand og chromatograferes som i eksempel lb) beskrevet på "Sephadex G-50 fine" i 10%'s eddikesyre. Eluatet ved maksimum (elue-ringsvolumen 760 ml) lyofiliseres og giver 38 mg (70% af det 5 det teoretiske) tridecandioylinsulin.

Analyse af tridecandioylinsulin: UV-spektrum, ekstinktion ved 276 nm, &276 = Celluloseacetatelektroforese ved pH-værdi 2 giver et skarpt bånd, Rjns (bevægelighed, henført til insulin) = 0,79.

10 Krystallerne er dråbeformede.

De i beskrivelse og krav anvendte formler for aminosyrer og peptider er opstillet i overensstemmelse med de i IUPAC-IUB Biokemisk Nomenklaturkomite foreslåede regler, så-15 ledes som disse fremgår af Biochem. Biophys. Acta 121 (1966), side 1-7.

Endvidere er til forøgelse af anskueligheden a-ami-nogrupperne og £B29-aminogruppen samt svovlatomet i cystein-resterne vist, dette sidste først og fremmest for at undgå 20 forvekslinger mellem cystein-S-sulfonat og cysteinsyre.

Claims (1)

1. 25. S S S S X I f I I Ål H2N-Gly---Cys-Cys---Cys-----Cys-Asn (III) hvor Y betyder en fraspaltelig svovlbeskyttelsesgruppe, omsættes med et overskud af et aktiveret derivat af en dicarb-30 oxylsyre med den almene formel Z-C-X-C-Z (IV) II II o o 35 hvor X har den ovenfor angivne betydning, og Z betyder en