DK146623B - Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin Download PDFInfo
- Publication number
- DK146623B DK146623B DK109173AA DK109173A DK146623B DK 146623 B DK146623 B DK 146623B DK 109173A A DK109173A A DK 109173AA DK 109173 A DK109173 A DK 109173A DK 146623 B DK146623 B DK 146623B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- insulin
- fraction
- cys
- group
- chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
( (19) DANMARK \f|
f(i2i FREMLÆGGELSESSKRIFT <,d1 46623 B
DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Patentansøgning nr.: 1091/73 (51) Int.CI.3: C 07 C 103/52 (22) Indleveringsdag: 28 feb 1973 (41) Aim. tilgængelig: 02 sep 1973 (44) Fremlagt: 21 nov 1983 (36) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 01 mar 1972 DE 2209835 (71) Ansøger: 'DEUTSCHES WOLLFORSCHUNGSINSTITUT AN DER RHEINISCH-WESTFAELISCHEN TECH-NISCHEN HOCHSCHULE AACHEN E.V.; D-5100 Aachen, DE.
(72) Opfinder: Dietrich 'Brandenburg; DE, Walter 'Puls; DE.
(74) Fuldmægtig: Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co (54) Fremgangsmåde til fremstilling af bifunktionelt tværbundet insulin
Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af insulin, som er bifunktionelt tværbundet via aminogrupper.
Det er allerede kendt, at insulin kan modificeres kemisk ved hjælp af monofunktionelle reagenser, at på denne måde fremstillede 2Q derivater også kan udvindes i ensartet form, og at sådanne insulin- derivater har ændrede biologiske egenskaber (jvf. f.eks. D. Levy N og F.H. Carpenter, Biochemistry 6, 3559 (1967); D.G. Lindsay og tø S. Shall, Biochem. J. 121, 737 (1971); og B. Africa og F.H. Car- J penter, Biochemistry 9, 1962 (1970)).
^ Der har dog hidtil ikke været noget kendt om en terapeutisk Q anvendelse af disse omsætningsprodukter af insulin med monofunk tionelle reagenser.
2 1Λ6623
Ved omsætningen af insulin med bifunktionelle reagenser har man hidtil kun kunnet fremstille heterogene blandinger og ingen fælles reaktionsprodukter (jvf. f.eks. østtysk patentskrift nr.
10.002* H. Zahn og J. Meienhofer, Makromol. Chem. 2(5, 153 (1958)).
Her har reagenserne altid reageret med forskellige funktionelle grupper i insulinmolekylet, og foruden monomere derivater er der også fremkommet højeremolekylære produkter med ubestemt polymerisationsgrad (jvf. f.eks. østtysk patentskrift nr. 10.002).
Endvidere er det kendt at omsætte insulin med bis-nitrophe-nylestere af dicarboxylsyrer i dimethylformamid/vand, jfr.
Angew. Chemie 75./ nr. 8 (1963), 377. Disse reaktioner er gennemført uden basetilsætning, og foruden aminogrupperne i lysin og glycin reagerede også aminogruppen i phenylalanin og en'del af tyrosinphenol- og serinhydroxygrupperne. Der er ikke isoleret veldefinerede omsætningsprodukter.
De to hidtil kendte ensartede insulinderivater med en intra-molekylær m-phenylendithiocarbamoylbro har vist sig at være biologisk inaktive (D. Brandenburg, H.G. Gattner, M. Weinert, L. Her-bertz, H. Zahn og A. Wollmer, Diabetes, Proc. 7th Congress Int.
Diabetes Fed. Buenos Aires, 1970. Excerpta Medica Xnt. Congr.
Series 231, 363 (1971)).
Det har nu vist sig, at hidtil ukendt, bifunktionelt tværbundet insulin med formlen (forenklet gengivet) 1 f f 21 HN-Gly---Cys-Cys---Cys-----Cys-Asn "χ {iii)
I O
S s I I TH 1 H„N-Phe--------Cys-----------Cys-------Ly s-Ala 2 1 30
Al hvor α-aminogruppen i glycin i A-kæden er forbundet med S-amino-B29 gruppen i lysin i B-kæden i insulinmolekylet via en dicarboxyl-syrebro med formlen 3 146623 - C - X - C - (I)
II II
o o hvor X betyder en direkte carbon-carbon-binding eller en ligekædet alkylengruppe med 1-15 carbonatomer, hvor eventuelt det ene eller begge carbonatomer i α-stilling til carbonylgruppen er substitueret med en aminogruppe, eller X betyder -ch2-ch2-s-s-ch2-ch-nh2 nh2 hvorhos de angivne aminogrupper, eventuelt er beskyttet med en benzyloxycarbonyl- eller t-butyloxycarbonylgruppe, har en høj sukkersænkende virkning.
Den her omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af insulin med formel (III) er ejendommelig ved, at insulin omsættes ved 0-40 C med mindst den ækvimolære mængde af et aktiveret derivat af en dicarbox-ylsyre med den almene formel Y-C-X-C-Y (II)
II II
o o hvor X har den ovenfor angivne betydning, og Y betyder en gruppe, der aktiverer carboxylsyregruppen; i et polært organisk opløsningsmiddel eller i en blanding af et organisk opløsningsmiddel med vand i nærværelse af en protonacceptor under fortyndingsbetingelser, hvorefter det fremkomne reaktionsprodukt isoleres ved en adskillelsesfremgangsmåde, der først differentierer efter molekylstørrelse og dernæst efter ladning.
Ved tværbindingsreaktionen ifølge opfindelsen dannes der overraskende alene intramolekylært tværbundet insulin, hvor aminogrup-Al B29 perne i glycin og lysin er forbundet. Man kan således give af-kald på den temporære beskyttelse af phenylalanin -aminogruppen, selv om det ifølge teknikkens stade måtte forventes, at denne aminogruppe i betragteligt omfang ville blive substitueret (D.G. Lindsay og S. Shall, Biochem. J. 121, 737 (1971); D. Levy og F.H.
Carpenter, Biochemistry 6j_ 3559 (1967)) . Lige så uventet er det, at der ikke optræder sidereaktioner ved tyrosin- og serin-OH-grup-perne (H. Zahn og F. Schade, Angew. Chem. 7_5, 377 (1963)).
4 146623
Det er endvidere særdeles overraskende, at det ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede insulin har en højere blodsukkersænkende virkning end de fleste monofunktionelt substituerede, kendte insulinderivater, og at de udviser en væsentlig højere blodsukkersænkende virkning end de hidtil kendte, bifunktionelt tvær-bundne insuliner.
Særlig gunstig er den uventede konstatering, at insulin med formel (III) kan krystalliseres fra zinksaltholdige opløsninger.
Herved fremkommer der en mulighed for indgift i form af krystalsuspensioner, der som bekendt anvendes ved insulin med henblik på en protraheret virkning.
De ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede forbindelse repræsenterer således en berigelse af farmacien.
Hvis der anvendes kvæginsulin og adipinsyre-bis-p-nitro-phenylester som udgangsstoffer, kan reaktionsforløbet gengives ved nedenstående simplificerede formelskema 5 146623 1 ? ? 21 H-N-Gly----Cys-Cys----Cys----Cys-Asn A-kæde
^ I I
S S
s s nh9 I I I ^ H„N-Phe--------Cys-----------Cys-----Lys-Ala B-kæde 29 30 + 0^-/3-0-0-(0^)^0-0-^3^ _^—' 0_o ^^ - 2 Ο,Ν-^-ΟΗ 1 ? ? 21 HN-Gly----Cys-Cys----Cys----Cys-Asn
(CH ) -C J
I II ^ * II |S.
so os
S S NH
I I I
H9N-Phe-------Cys-----------Cys-------Lys-Ala 1 30 6 146623 I formlerne (I) og (II) betyder X fortrinsvis "(CH2^n-' idet n kan betyde et helt tal indtil 15 samt nul. Y betyder fortrinsvis eventuelt substitueret phenoxy.
De bifunktionelle forbindelser, der er anvendelige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er allerede kendte eller kan fremstilles ved kendte fremgangsmåder (H- Zahn og P. Schade,
Chem. Ber. 96, 1747 (1963), J. Schnell og H. Zahn, Kolloid-Z. 203, 27 (1965), H. Zahn og M. Bahra, Forschungsber. des Landes Nordrhein-Westfalen Nr. 1897, L. Brandt, udgivet af Westdeutscher Verlag, Koln und Opladen (1967)) i reglen ud fra dicarboxyl-syre, substitueret phenol og dicyclohexylcarbodiimid.
Som eksempler skal nævnes:
Derivater af aliphatiske dicarboxylsyrer med den almene formel YOC - (CH0L - COY 2 n hvor carboxylgruppen er aktiveret af gruppen Y, såsom adipinsyre--bis-p-nitrophenylester, pimelinsyre-bis-N-hydroxysuccinimidester, korksyre-bis-2,4,5-trichlorphenylester, sebacinsyre-bis-pentachlor-phenylester, samt aminosyrer, der har to earboxylgrupper i aktiveret form, og i hvilke aminogruppen (-grupperne) er beskyttet, f.eks.
N,Ν'-bis-tert.butyloxycarbonyl-eystin-bis-2,4,5-trichlorphenyl-ester, N-benzyloxycarbonyl-glutaminsyre-a> γ-bis-p-nitrophenylester.
Som insuliner kan der f.eks. anvendes kvæginsulin, svine-insulin, fåreinsulin, hvalinsulin og fiskeinsuliner.
Som fortyndingsmiddel kan der anvendes alle polære organiske opløsningsmidler, hvori insulin opløser sig, samt blandinger af disse opløsningsmidler med vand. Som eksempel skal nævnes dime thyl sulf oxid og dimethylformamid.
Som protonacceptorer kan man anvende alle ved peptidsyntesen gængse basiske forbindelser, f.eks. organiske baser, såsom triethylamin eller N-methylmorpholin (sidstnævnte fortrinsvis, når der arbejdes med optisk aktiv carboxylsyre til undgåelse af race-misering), når der arbejdes i nærværelse af vand også alkalimetal-hydroxider, -hydrogencarbonater eller -carbonater, såsom natrium-hydrogencarbonat eller natriumcarbonat.
Almindeligvis arbejdes der ved temperaturer mellem 0 og 40°C, fortrinsvis ved l8 - 25°C.
Reaktionerne gennemføres sædvanligvis ved normaltryk.
Ved gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen an- 7 146623 vendes der pr. 1 mol krystalinsulin eller amorft insulin 1-2 mol, fortrinsvis 1,2 - 1,3 mol, af det aktiverede dicarboxylsyre-derivat, nemlig på den måde, at opløsningen af det aktiverede derivat dryppes langsomt, sædvanligvis i løbet af 1 - 5 timer, til den fortyndede opløsning af insulinet. Derpå lader man reaktionsblandingen yderligere henstå i flere timer, eventuelt under omrøring. Gunstigt, men ikke nødvendigt, er udelukkelse af lys og oxygen, dvs. arbejde i mørke og under beskyttelsesgas (f.eks. nitrogen) til undgåelse af sidereaktioner (f.eks. oxidative beskadigelser af insulinet).
Oparbejdningen sker enten ved udfældning af insulinderivaterne ved tilsætning af opløsningsmidler, der er blandbare med opløsningsmidlet, og som har den egenskab, at de udfælder insulinderivaterne, f.eks. methanol og ether. Man kan også dialysere reaktionsopløsningen mod vand i en dialyseslange og fraskille insulinderivaterne på denne måde. Til afbrydelse af reaktionen kan der syrnes før dialysens begyndelse, f.eks. med eddikesyre. En dialyse mod fortyndet ammoniumbicarbonatopløsning har også vist sig at være gunstig, idet resterende aktiverede grupper af dicarboxylsyren amino-lyseres.
Efter dialysen lyofiliseres der enten direkte, eller også udfældes insulinderivatet ved indstilling af pH-værdien på det iso-elektriske punkt.
Præparatet fraktioneres derpå enten fugtigt eller efter tørring ved en fremgangsmåde, der skiller molekylerne efter molekylvægten, fortrinsvis ved gelehromatografi under betingelser, ved hvilke insulin og derivaterne ikke aggregerer. Her anvendes der f.eks. "Sephadex^3-50 fine' i 10$'s eddikesyre. Det præparat, der fremkommer efter dialyse og frysetørring (monomerfraktion 3, jvf.' eksemplerne), fraktioneres yderligere ved fremgangsmåder, der skiller molekylerne efter ladningen. Til dette formål kan ionbytter-chromatografi eller elektroforetiske fremgangsmåder tjene. I surt medium anvendes fortrinsvis en ionbytterehromatografi, f.eks. på "SE-Sephadex^k 25" ved en pH-værdi på 3>° i eddikesyre/7 M urinstof med en NaCl-gradient.
Det produkt, der fremkommer efter dialyse, frysetørring og (eventuelt nødvendig) afsaltning ved hjælp af gelfiltrering, f.eks. på,lSephadex^l 25" eller ved isoelektrisk omfældning, kan om nødvendigt efterrenses ved ionbytterehromatografi i svagt alkalisk opløs- 3 146623 ning, f.eks. på'DEAE-Sephadex^k 25" ved en pH-værdi på 8,4.
Som hidtil ukendte, aktive forbindelser skal især nævnes:
NaA1, n£B29_oxaly1insulin (kvæg)
NaA1, NeB2^-suceinylinsulin (kvæg)
NaA1, NeB2^-glutarylinsulin (kvæg)
NaAl, N£B29_adip0ylinsulln ^vee!g^ får)
NaA1, n€B29_pjmeioyiinsulin (kvæg)
NaAl, MeB29-suberoylinsulin (kvæg)
NaA1, NeB29-azelaoylinsulin (kvæg) N0^1, j\feB29 _ s eb acoy 1 insul in (kvæg, svin)
NaA\ NeB29-undecandioy1insulin (kvæg)
NaAl, ^eB29 _^0(^β c andioyl insul in (kvæg) n°cA1, jjeB29_tri(jecan(ii0ylinsulin (kvæg)
NaAl, jj£B29_^n^n*_bis_tert.butyloxyearbonyl)-L-cystinylinsulin (kvæg) NaA\ NeB2^-L-cystinylinsulin (kvæg)
NaA1, NeB29-N-benzyloxycarbonyl-L-glutamylinsulin (kvæg) jjOAl, jjeB29_jj_glutaffly.linsulin (kvæg)
Kemisk strukturdokumentation for de covalent tværbundne insulinderivater___ a) Insulin og alle derivater, i hvilke aminogrupperne er monofunk tionelt substitueret, giver ved spaltning af disulfidbindingerne, f.eks. ved oxidativ sulfitolyse (L. Bailey og R.D. Cole, J. Biol. Chemistry 234, 1733 (1959)) tie adskilte A- og B-kæder som S-sulf-onater. Simplificeret skema A B (SS)^ sulfitolyse^ AiSSO^-)^ + BtSSO^'^ insulin A-kæde B-kæde
Ved et insulinderivat, der er forbundet ved hjælp af en bi-
Al Bl 329 funktionel bro mellem glycin og phenylalanin eller lysin må der kun optræde et^ kædederivat efter spaltningen r—A B (SS)3 sulfitolyse ^ *(330^),, i—C-X-C °9
0 0 X
OC—B(SS0^“)2 tværbundet insulin tværbundet kædederivat 9 146623
Alle præparater (eksempel 1 - 4 og 6 - 9) underkastes en sulfitolyse, elektroforesen viser kun ét^ bånd (jvf. fig. l, nr. 2). Kun de med cystin tværbundne derivater (eksempel li og.12) giver som ventet to bånd, fordi også den nyindførte bro spaltes.
b) Dokumentationen for, at broen udelukkende befinder sig
Al B29 Al mellem glycin og lysin J og ikke mellem glycin og phenyl-
Dl alanin , lykkes ved enzymatisk nedbrydning af de tværbundne kædederivater ved hjælp af trypsin og bekræftes ved bestemmelse af endegrupperne.
Adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sulfonat spaltes med trypsin ifølge S.S. Wang og P.H. Carpenter, Biochemistry 6, 215 (1967)· Spalteprodukterne skilles efter frysetørring ved papirelektroforese ved en pH-værdi på 2 (2,4 M myresyr e/7 M urinstof) (jvf. fig. 1, nr 5).
Man fandt kun de to i nedenstående tabel angivne spaltepeptider. Alle andre tværbundne insuliner (eksempel 1 - 4 og 6 - 9) giver samme resultater ved den elektroforetiske analyse og bestemmelsen af endegrupperne.
Nedenstående tabel viser aminosyresammensætningen af det ud fra adipoylinsulin ved oxidativ sulfitolyse fremkomne derivat NaA\ Ne^^-adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S--sulfonat (A - Ad - B) og de derudfra fremstillede tryptiske spaltepeptider NaA1, NeB29-adipoyl-A-kæde~tetra-S-sulfonat-B(2>-j50) /betegnelse: A - Ad - B(2^-50j^"og B(l-22)-bis-S-sulfonat /betegnelse: Β·(ΐ-22_)7".
10 146623
Aminosyreanalyse efter Moore og Stein. Hydrolysevarighed: 48 timer ved 110°C. Alle værdier er ukorrigerede og beregnet på glycin.
-i--i-1--
Aminosyre A — Ad — B , A — Ad — B (23—30) B (1—22) __j ---- LYS 1/08 j 0,97 0 HIS 2,05 0 + ARG 1,04 j 0 1,16 ASP 3,43 I 1,95 0,81 THR 1,13 j 1,07 1,69 SER 2,80 i 1,73 1,28 GLU 6,80 3,72 1,34 PRO 1,48 + 0 GLY 4,00 2,00 2,00 ALA 3,28 2,00 0,90
Halvcystin 4,72 3,61 + VAL 5,06 1,70 4,05 ILE 0,70 0 0 LEU 6,33 1,91 3,70 TYR 4,10 I 2,68 0,71 PHE_ 3,14 ’_2,03_1,50
Tegnet + betyder til stede, men ikke kvantitativt bestemt.
B(23“30) = aminosyresekvens 23-30 i B-kæden.
B(i-22) = aminosyresekvens 1-22 i B-kæden.
På tegningen viser fig. 1 fire papirelektroferogrammer ved en pH-værdi på. 2 (puffer: 2,4 M HC00H/7 M urinstof) af 1. A-kæde (til venstre) og B-kæde (til højre) i S-sulfonatformen 2. NaA1, Ne'B2^-adipoyl-A-kæde-tetra-S-sulfonat-B-kæde-bis-S-sulfonat 3· de herudfra ved trypsinnedbrydning fremkomne spaltepeptider og 4. de ud fra insulin-B-kæde-S-sulfonat med trypsin fremkomne spaltepeptider. B(l-22) (til venstre) og B(23-29) (til højre).
Der indfarves med diazoteret sulfanilsyre. Pilmarkeringen skal markere elektroforesens startlinie.
11 146623
Pig, 2 viser elueringsdiagrammet for gelehromatografi af ca. 600 mg råt azelaoylinsulin (eksempel 8) på en søjle (dimensioner: 5 x 150 cm) med‘'Sephade^®G-50 fine" i 10$'s eddikesyre. Gennemløb shastighed 100 ml/time, fraktioner 12 ml hver.
Abscisse: Praktionsnummer Ordinat: Ekstinktion ved 254 nm
Fraktion 1 indeholder oligomere, fraktion 2 hovedsageligt dimere og fraktion 3 monomere insulinderivater. Elueringsdiagram-merne for gelchromatografien af de andre bifunktionelt tværbundne insulinderivater viser et lignende forløb.
Pig. 3 viser elueringsdiagrammet for ionbytterehromatogra-fien af 320 mg råt suberoylinsulin (eksempel 7, fraktion 3) på en søjle (dimensioner 1,5 x 45 cm) medllSE-Sephade2^ed en pH-værdi på 3,0. Lineær natriumchloridgradient, puffer som angivet i eksempel 1. Gennemløbshastighed 30-35 ml/time, fraktioner på 6,8 ml, ekstinktionsmåling ved 254 nm.
Abscisse: Praktionsnummer
Ordinat: NaCl-Koncentration i mol/liter
Praktion med maksimum ved fraktionsnummer 60: Tilsigtet in-
A1 B2Q
sulinderivat med bro mellem glycin og lysin Elueringsdiagram-merne for ionbytterchromatografien af de andre bifunktionelt tværbundne insulinderivater viser et lignende forløb*
Pig. 4 viser UV-spektret af amorft insulin (-----), koncentration = 0,767 mg/ml, og glutarylinsulin (-), koncentration = 0,636 mg/ml i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning, ved en pH-værdi på 8,2.
Ordinat: Ekstinktion
Abscisse: Bølgelængde i nm (nanometer).
De hidtil ukendte aktive forbindelser udviser en blodglueose-sænkende virkning. De er derfor egnede til behandling af diabetikere i almindelighed og især sådanne, der som følge af antistofdannelse mod kvæg- og/eller svineinsulin kræver store doser af traditionelle insulinpræparater, men hvis behov erfaringsmæssigt efter omstilling til et nyt præparat, der ikke dannes antistoffer mod, dækkes tilfredsstillende med lavere doser.
De hidtil ukendte aktive forbindelser kan på kendt måde overføres i de gængse formuleringer, såsom opløsninger og suspensioner, især krystalsuspensioner.
De hidtil ukendte aktive forbindelser kan anvendes på gængs måde, især til parenteral injicering.
12 148623
Porsøgsarrangement til undersøgelse af insulininlholdet i insulinderivater
Insulin sænker blodglueosen hos rotter. Denne virkning er dosisafhængig i et vist område. Ved sammenlignende beregning af blodglucosesænkningen hos rotter efter subcutan injieering af præparater med ukendt insulinvirkning og blodglucosesænkningen efter subcutan injieering af insulin med kendt indhold af aktiv forbindelse konstateres den blodglucosevirksomme insulinaktivitet af insulinderivaterne. Nærmere enkeltheder i H. Zahn, E. Drechsel og W. Puls: Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chem. 3^9, 385-389 (1968).
I nedenstående tabel angives den blodglucosevirksomme insulinaktivitet af visse af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen i procent af insulinstandarden · (25 ,4 ΙΞ/mg):
Blodglucosevirksom insulinaktivitet i S af insulin-
Aktiv forbindelse____standarden (25,4 IE/mg)-
NaAl,NtB29-Oxalylinsulin (Kvæg) 52
NttAl,N cB29-Glutarylinsulin (Kvæg) 32
NaAl^N£B29_Adipoylinsulin (Kvæg) 41 N0tAlAN£B29_pimeiOyiiIlsuiin (Kvæg) 35
NaA1,NiB29-Suberoylinsulin (Kvæg) 100 N^^N^^-Azelaoylinsulin (Kvæg) 100
NaA1,N*B29-Sebacoylinsulin (Kvæg) 61
NaA1/N^B29-Undecandioylinsulin (Kvæg) 69
NaA1,N^B29-Dodecandioylinsulin (Kvæg) 46
NaAl^N£B29_Tridecandioylinsulin (Kvæg) 40
Eksempel 1
NgA1, N£B2^-0xalylinsulin (kvæg)
Til en opløsning af 640 mg (100 umol) krystallinsk kvæg-insulin og 150yul triethylamin i 75 ml dimethylsulfoxid sættes under omrøring.ved stuetemperatur dråbevis en opløsning af 39,8 mg (120 umol) oxalsyre-bis-p-nitrophenylester i 5 nil dimethylsulfoxid i løbet af 4 timer. Reaktionsopløsningen henstår i yderligere 60 timer ved stuetemperatur og dialyseres derefter først 2 timer mod rindende vand 13 146623 og derpå to gange 1 time mod 1 liter 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning. Opløsningen syrnes med fortyndet HC1 til en pH-værdi på 4,9, og det udfældede protein fracentrifugeres og vaskes med vand. Det fugtige produkt opløses i 5 ml iseddike og 17 ml vand og ehromatogra-feres på en søjle (5 x 150 cm) med *Sephade:5i®G-50 fine" i 10$'s eddikesyre. Eluatet dialyseres i 5 fraktioner (jvf. fig. 2) fire gange mod 1 liter vand hver gang og lyofiliseres dernæst.
Udbytter:
Praktion 1 70 mg
Praktion 2 216 mg
Fraktion 3 315 mg (49,3$ af det teoretiske) 310 mg af fraktion 3 opløses i 3 ml 1,5 M eddikesyre/7 M urin-stof/0,05 M NaCl (pH-værdi 3,0) og påføres en søjle (1,5 x 45 cm) med "Sephadex'/^om er bragt i ligevægt med samme puffer.
Elueringen sker ved hjælp af en lineær gradient ud fra 250 ml startpuffer og 250 ml tilløbspuffer, som har samme sammensætning som startpufferen, bortset fra at den er 0,2 M NaCl. Eluatet under maksimum (jvf. fig. 3) dialyseres tre gange 1 time mod 1 liter destilleret vand og lyofiliseres. Remanensen befries for resterende salt og urinstof ved chromatografi på en søjle (3 x 60 cm) med "Sephadeji^ G-25" i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning, og eluatet lyofiliseres.
Udbytte: 98,2 mg (15% af det teoretiske) ^278 = 5490 °f°5 M ammoniumbicarbonatopløsning, pH-værdi 8,2) (jvf. fig. 4).
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet Rjns (elektroforetisk bevægelighed, beregnet på insulin) = 0,74 Frie aminogrupper /[Dansylchloridmetode ifølge W.R. Gray, Methods in Enzymology, bind 11, 139 > (1967)/: Phenylalanin. Oxalylinsulin krystalliserer fra zinkionholdig citratpuffer [S. Schlichtkrull,
Acta Chem. Scand. 1£, 1455 (1956)/ i form af små prismer.
Eksempel 2
MaAl, n£B29-suecinylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes i løbet af 3 timer med 43,2 mg (120 μηιοί) ravsyre-bis-p-nitrophenylester under de i eksempel 1 beskrevne betingelser. Oparbejdning og gelchromatografi sker ligeledes på den i eksempel 1 beskrevne måde.
14 146623
Udbytter:
Fraktion 1 90 mg
Fraktion 2 105 mg
Fraktion 5 4-11 mg (64, 2$ af det teoretiske) 410 rag af fraktion 3 chromatograferes på “SE-Sephadej^g oparbejdes som beskrevet i eksempel 1. Hovedfraktionen (jvf. fig. 3) giver 139 mg (21,7$ af det teoretiske) suceinylinsulin efter chroma-tografi på "Sephade^b^sl e278 = 554-0 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet Rlns =°^7
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalforra: Sfærisk partikel
Eksempel'3 ccAl eB29 , .
N , U - -Glutarylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 44,8 mg (120 ixmol) glutarsyre-bis-p-nitrophenylester under de i eksempel 1 beskrevne betingelser. Oparbejdning og gelehromatografi sker ligeledes som beskrevet i eksempel 1.
Udbytter:
Fraktion 1 54 mg
Fraktion 2 195 mg
Fraktion 3 330 mg (51>6$ af det teoretiske) 320 mg af fraktion 3 chromatograferes på^E-Sephade^r og oparbejdes som beskrevet i eksempel 1. Efter afsaltning ved gelfiltrering på*Sephade:x@Cr-2511 efterfulgt af isoelektrisk omfældning ved en pH-værdi på 4,8 fås 110,3 mg (17,3$ af det teoretiske) glutaryl-insulin fra hovedfraktionen (jvf. fig. 3). e278 = 54-00 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning)
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet RIns =°>7*
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalform: Sammenfiltrede små nåle.
is 146623
Eksempel 4 ΝαΑ1, N£B29-Adipoylinsulin (kvæg) a) Til 1,27 g (200 μπιοί) krystallinsk kvæginsulin sættes i 140 ml dimethylsulfoxid i nærværelse af 0,3 ml triethylamin under omrøring ved stuetemperatur dråbevis en opløsning af 93*2 mg (240 μπιοί) adipinsyre-bis-p-nitrophenylester i 5 ml dimethylsulf-oxid. Efter 60 timers henstand ved stuetemperatur oparbejdes reaktionsopløsningen som beskrevet i eksempel 1. Efter gelchromatografi påuSephade:a®j-50 fine" i 10$'s eddikesyre fås:
Fraktion 1 304 mg Fraktion 2 335 mg
Fraktion 3 587 mg (46,2$ af det teoretiske). ^ 580 mg af fraktion 3 ehromatograferes på*SE-Sephadex&i to lige store dele som beskrevet i eksempel 1. Hovedfraktionerne (jvf. fig. 3) forenes efter frysetørringen og afsaltes ved gelfiltrering (jvf. eksempel l).
Udbytte: 294 mg (23$ af det teoretiske) adipoylinsulin e276 = 5650 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet RIns - °>V
Fri aminogruppe: Phenylalanin Krystalform: Små nåle samt sfæriske partikler b) Til en opløsning af 120 mg (18,7 μπιοί) krystallinsk kvæginsulin i 15 ml dimethylsulfoxid og 30^,ultriethylamin dryppes i løbet af 2 timer 7,8 mg (20 μπιοί) adipinsyre-bis-p-nitrophenylester i 2,5 ml dimethylsulfoxid under omrøring. Derpå tildryppes yderligere 7*8 mg ester i 2,5 ml dimethylsulfoxid i løbet af 1 time, . Reaktionsopløsningen får straks tilsat methanol/ether, det fremkomne insulinderivat vaskes med methanol/ether i forholdet 1:9 og tørres kort tid i vakuum. Derpå opløses det i en blanding af 1 ml _ iseddike og 9 ml vand og påføres en søjle (3 x 200 om) med'^Sephadex^ G-50 fine11 i 10$'s eddikesyre og ehromatograferes. Eluaterne (jvf. fig. 1) dialyseres og lyofiliseres.
Udbytter:
Fraktion 1 29 mg
Fraktion 2 14 mg
Fraktion 3 55 mg (45*8$ af det teoretiske).
Eksempel 5
HgAl, ^£B29_Adippyiinsulin (får) 16 146623
Til en opløsning af 320 mg krystallinsk fåreinsulin (50 pmol) i 35 ml dimethylsulfoxid og 75 ^μΐ triethylamin dryppes under omrøring ved stuetemperatur og i løbet af 4 timer en opløsning af 23,3 mg (60 ^miol) adipinsyre-bis-p-nitrophenylester i 4 ml dimethylsulfoxid. Reaktionsblandingen henstår i yderligere 48 timer ved stuetemperatur og oparbejdes dernæst som beskrevet i eksempel 1. Råproduktet chromatograferes på "Sephade^1 (søjle: 3 x 200 cm) som beskrevet i eksempel 1.
Udbytter:
Fraktion 1 88 mg
Fraktion 2 74 mg
Fraktion 3 94 mg (29,4$ af det teoretiske).
Fraktion 3 indeholder 59$ N0^, Ne®^-adipoylinsulin ifølge en kvantitativ papirelektroforese.
Eksempel 6
NgA1, N£B29-Pimeloylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 48,2 mg (120 μπιοί) pimelinsyre-bis-p-nitrophenylester under de i eksempel 1 beskrevne betingelser. Efter 44 timer oparbejdes reaktionsblandin· gen, og råproduktet chromatograferes.
Udbytter:
Fraktion 1 194 mg
Fraktion 2 111 mg
Fraktion 3 288 mg (45$ af det teoretiske).
28ο mg af fraktion 3 chromatograferes på 'SE.TSephadepd' ® som beskrevet i eksempel 1. Det ud fra hovedfraktionen (jvf. fig. 3) isolerede produkt af sal tes pållSephade2®G-25V.'
Udbytte: 132 mg (20,6$ af det teoretiske) e2j8 “ 5970 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2).
Elektroforetisk renhed: 95$
Rlns “
Fri aminogruppe: Phenylalanin Krystalform: Sammenfiltrede nåle.
17 146623
Eksempel 7 Να^]~, ^eB29-Suker oyl insul In (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 49,9 mg (120 μπιοί) korksyre-bis-p-nitrophenylester og oparbejdes efter 48 timer på den i eksempel 1 beskrevne måde. Efter gelfiltreringen fås:
Praktion 1 137 mg
Fraktion 2 122 mg
Praktion 3 331 mg (51»7$ af det teoretiske).
320 mg af fraktion 3 chromatograferes påuSE-Sephadex®som beskrevet i eksempel 1. Hovedfraktionen (jvf. fig. 3) afsaltes påuSephade3pG-25tt, omfældes derpå isoelektrisk ved en pH-værdi på 4,8 og lyofiliseres på ny.
Udbytte: 138,8 mg (21,6$ af det teoretiske) ε27δ = 5110 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Elektroforetisk renbed (ved en pH-værdi på 2): 98$
Rlns “ °>^
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalform: Små nåle.
Eksempel 8
Na^~, NeB^^-Azelaoylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 51,6 mg (120 μιποί) azelainsyre-bis-p-nitropbenylester som beskrevet i eksempel 1. Efter gelfiltreringen (jvf. fig. 2) fås:
Praktion 1 166 mg
Praktion 2 121 mg
Fraktion 3 311 mg (48$ af det teoretiske).
3OO mg af fraktion 3 chromatograferes påttSE-Sephade2®som beskrevet i eksempel 1. Oparbejdningen af hovedfraktionen (jvf. fig· 3) giver efter afsaltning 134,3 mg azelaoylinsulin (21$ af det teoretiske).
e278 = ^060 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning)
Elektroforetisk renhed (ved en pH-værdi på 2): 94$ RIns=0^
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalform: Små nåle.
Eksempel 9 ΝαΑ1, NeB29-Sebacoylinsulin (kvæg) 18 1Λ6623 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 53,5 mg (120 pmol) sebacinsyre-bis-p-nitrophenylester som beskrevet i eksempel 1. Afvigende sker oparbejdningen på en sådan måde, at reaktionsproduktet efter dialysen isoleres ved frysetørring. Råproduktet opløses i 4 ml iseddike og 16 ml vand og chromatografe-res på den i eksempel 1 beskrevne måde.
Udbytter:
Fraktion 1 175 mg
Fraktion 2 1K3 mg
Fraktion 5 278 mg (43$ af det teoretiske).
270 mg af fraktion 3 chromatograferes på MSE-Sephadex^om beskrevet i eksempel 1, og hovedproduktet (jvf. fig. 3) afsal tes på "sephadex^}-25^
Udbytte: 121,2 mg (19$ af det teoretiske) e278 = -^00
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet ' Rlns = °'78
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalform: Små nåle.
Eksempel 10
NaÅl, N€^^-Sebacoyl insul in (svin) 640 mg krystallinsk svineinsulin omsættes med 33,3 mg (120 pmol) sebaeinsyre-bis-p-nitrophenylester som beskrevet i eksempel 1. Efter 20 timers henstand ved stuetemperatur oparbejdes der. Udbytter efter gelfiltreringen:
Fraktion 1 190 mg
Fraktion 2 159 mg
Fraktion 3 280 mg ($3,7% af det teoretiske).
Fraktion 3 indeholder 70$ sebacoylinsulin ifølge en kvantitativ elektroforetisk analyse.
Eksempel 11 N£B29-(bis-N,N1 -tert.Butyloxycarbonyl)-cystinylinsulin (kvæg) a) Til en opløsning af 640 mg krystallinsk kvæginsulin i 75 ml 19 146623 dimethylsulfoxid og 150yul triethylamin dryppes under omrøring ved stuetemperatur en opløsning af 95,8 mg (120 μηιοί) N,N'-bis-tert. -butyloxycarbonyl-cystin-2,4,5-trichlorphenylester i 5 ml dimethylsulfoxid i løbet af 5 timer. Efter 22 timers henstand oparbejdes reaktionsblandingen som beskrevet i eksempel 1. Råproduktet chroma-tograferes på "Sephade^G-SO* i 10$’s eddikesyre.
Udbytter:
Fraktion a 1 191 mg
Fraktion a 2 132 mg
Fraktion a 5 2.61 mg (40,8$ af det teoretiske).
b) Reaktionen udføres under samme betingelser som i eksempel 11 a), dog under anvendelse af 110yalN-methylmorpholin som base. Udbytter:
Fraktion b 1 206 mg
Fraktion b 2 159 mg
Fraktion b 3 272 mg (42,5$ af det teoretiske).
25Ο mg af fraktion a 3 adskilles på *!3E-Sephadex“som beskrevet i eksempel 1. Hovedfraktionen afsaltes ved chromatografi på uSephadex% -25”
Udbytte.: 103,6 mg (l6,5$ af det teoretiske) e278 = 5^00 (i 0*05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Papirelektroforese (ved en pH-værdi på 2): ensartet Rlns =
Frie aminogrupper: Phenylalanin.
På samme måde fås ud fra 260 mg af fraktion b 3 94*8 mg (14,3$ af det teoretiske) (bis-butyloxycarbonyl)-cystinyl-insulin.
e278 = 59°°
Papirelektroforese (ved en pH-værdi på 2): ensartet Rlns - °>70
Fri aminogruppe: Phenylalanin.
Eksempel 12
NaA1, NeB2^-Cystinyl-insulin (kvæg) a) På den i eksempel 11 beskrevne måde fremstilles CCAl CB29 η , N -(bis-N,N'-tert.butyloxycarbonyl)-cystinylinsulin ud fra krystallinsk kvæginsulin.
b) Tert.butyloxycarbonylbeskyttelsesgrupperne fraspaltes på følgende måde: 20 146623 40 mg ΝαΑ1, (bis-butyloxycarbonyl)cystinyl- -insulin tørres i 15 timer i vakuum over °9 KOH. I cerxtri- fugerøret tilsættes derpå 0,3 ml trifluoreddikesyre, og opløsningen holdes ved stuetemperatur i 1 time. Proteinet udfældes derpå med 10 ml absolut ether, og remanensen fracentrifugeres og vaskes flere gange med ether.
Udbytte efter tørring i vakuum over P20,_ og KOH: 42 mg (ca. 96$ af det teoretiske) e278 = 5560 (i 0,05 M ammoniumbiearbonatopløsning)
Elektroforetisk renhed (ved en pH-værdi på 2): ensartet
Rlns = ^°·
Eksempel 13
Fremstilling af N0^, NeB^-(N-benzyloxyearbonyl)-glutamylinsulin (kvæg)___
Til en opløsning af 640 mg krystallinsk kvæginsulin i 75 ml dimethylsulfoxid og 110 pLN-methylmorpholin dryppes i løbet af 5 timer under omrøring og ved stuetemperatur en opløsning af 62,7 mg (120 pmol) N-benzyloxy carbonyl -giutaminsyre -a, γ-bis-p-nitrophenyl-ester. Efter 22 timers henstand oparbejdes og derpå chromatograferes der på den i eksempel 1 beskrevne måde.
Udbytter:
Fraktion 1 106 mg
Fraktion 2 129 mg
Fraktion 5 257 mg (40,2$ af det teoretiske).
250 mg af fraktion 5 chromatograferes på den i eksempel 1 beskrevne måde på“sE-Sephadex/P Efter afsaltningen ved chromatografi på,lSephadex%-25tt fås: 105 mg (16,4$ af det teoretiske).
Elektroforetisk renhed (ved en pH-værdi på 2): 95$
Rlns -°-76
Frie aminogrupper: Phenylalanin.
146623 21
Eksempel 14 ncxA1 f]flfcB29_unaecandioylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 55,0 mg (120 umol) undecandisyre-bis-p-nitrophenylester som beskreyet i eksempel 1, idet reaktionsopløsningen dog oparbejdes allerede 18 timer efter tilsætning af esteren. Efter gelfiltreringen (jvf. fig. 2) fås:
Fraktion 1 144 mg
Fraktion 2 117 mg
Fraktion 3 3H mg (48,6$ af det teoretiske).
300 mg af fraktion 3 chromatograferes med'lSP-Sephadex^på en søjle (2,7 x 40 om) som beskrevet i eksempel 1, idet voluminerne af de to pufferopløsninger andrager 700 ml hver. Oparbejdningen af hovedfraktionen (jvf. fig. 3) giver 139 mg (22,5$ af det teoretiske) undecandioylinsulin efter afsaltningen.
Papirelektroforese ved en pH-værdi på 2: ensartet e278 = 5390 (i 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Rlns = °’74
Frie aminogrupper: Phenyl al anin Krystalform: Sfærisk partikel.
Eksempel 15
NaAl, N£B2^-Dodeoandioylinsulin (kvæg) 640 mg krystallinsk kvæginsulin omsættes med 56,7 mg (120 pmol) dodecandisyre-bis-p-nitrophenylester som beskrevet i eksempel 1, idet reaktionsopløsningen dog oparbejdes 18 timer efter esterens tilsætning. Efter gelfiltreringen fås:
Fraktion 1 140 mg
Fraktion 2 157 mg
Fraktion 3 276 mg (4-3,1$ af det teoretiske).
260 mg af fraktion 3 chromatograferes på en søjle (2,7 x 40 cm) med llSP-SephadeJ!^om beskrevet i eksempel 1, idet puffervoluminerne andrager 700 ml hver. Oparbejdningen af hovedfraktionen (jvf. fig, 3) 22 146623 giver efter af saltningen 108 rag (17,9$ ai> det teoretiske) dodecan-dioylinsulin. ε2γ8 = °5 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-vsardi på 8,2)
Papirelektroforese (ved en pH-værdi på 2): ensartet *τηΒ=°·π
Frie arainogrupper: Phenylalanin Krystalforra: Sfærisk partikel.
Eksempel l6 N0^!, MeB29_rprideeandi0ylinsul^n (kvæg) 640 rag krystallinsk kvæginsulin omsættes med 58,4 mg (120 umol) tridecandisyre-bis-p-nitrophenylester,som beskrevet i eksempel 1, idet reaktionsopløsningen dog oparbejdes l8 timer efter esterens tilsætning. Efter gelfiltreringen fås:
Fraktion 1 145 mg
Fraktion 2 154 mg
Fraktion 5 297 mg (46,4$) 290 mg af fraktion 5 ehromatograferes på en søjle (2,7 x 40 cm) med "sP-Sephade^som beskrevet i eksempel 1, idet puffervoluminerne dog andrager 700 ml hver. Oparbejdningen af hovedfraktionen (jvf. fig. 5) giver 109 mg (17,4$ af det teoretiske) trideeandioylinsulin efter afsaltningen.
e278 = ^880 0,05 M ammoniumbicarbonatopløsning ved en pH-værdi på 8,2)
Papirelektroforese (ved en pH-værdi på 2): ensartet Rlns - °’75
Frie aminogrupper: Phenylalanin Krystalform: Sfærisk partikel.
De i beskrivelse og krav anvendte formler for aminosyrer og peptider er i overensstemmelse med de af IUPAC-IUB Biokemisk Nomenklaturkomite foreslåede regler, således som disse fremgår af Bio-Chem. Biophys. Acta 121 (1966), 1-7.
Med henblik på forbedret anskuelighed er der i insulinformlerne vist svovlatomerne i cystingrupperne samt de primære og substituerede aminogrupper.
Claims (2)
- 23 146623 Patentkrav. Fremgangsmåde til fremstilling af bifunktionelt tværbundet insulin med formlen S-S
- 1. I 21 HN-Gly---Cys-Cys Cys-----Cys-Asn ” ^4-c - X - c [ (III) I o o ηΚ. S S I I ,H H^N-Phe--------Cys-----------Cys-------Lys-Al a 1 30 Al hvor α-aminogruppen i glycin i A-kæden er forbundet med £-amino-gruppen i lysirP2® i B-kæden via en dicarboxylsyrebro med formlen - C - X - C - (I) II II o o hvor X betyder en direkte carbon-carbon-binding eller en ligekædet alkylengruppe med 1-15 carbonatomer, hvor eventuelt det ene eller begge carbonatomer i α-stilling til carbonylgruppen er substitueret med en aminogruppe, eller X betyder -ch2-ch2-s-s-ch2-ch- nh2 nh2 hvorhos de angivne aminogrupper eventuelt er beskyttet med en ben-zyloxycarbonyl- eller t-butyloxycarbonylgruppe, kendetegnet ved, at insulin omsættes ved 0-40°C med mindst den ækvimolære mængde af ét aktiveret derivat af en dicarboxylsyre med den almene formel Y-C-X-C-Y (II) il ir o o hvor X har den ovenfor angivne betydning, og Y betyder en gruppe, der aktiverer carboxylsyregruppen, i et polært organisk opløsnings-
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19722209835 DE2209835C3 (de) | 1972-03-01 | Insulinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende Arzneimittel | |
DE2209835 | 1972-03-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK146623B true DK146623B (da) | 1983-11-21 |
DK146623C DK146623C (da) | 1984-04-30 |
Family
ID=5837578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK109173A DK146623C (da) | 1972-03-01 | 1973-02-28 | Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3907763A (da) |
JP (1) | JPS4897889A (da) |
AT (1) | AT333987B (da) |
BE (1) | BE795997A (da) |
CH (1) | CH579916A5 (da) |
DK (1) | DK146623C (da) |
FR (1) | FR2181778B1 (da) |
GB (1) | GB1374385A (da) |
IL (1) | IL41615A (da) |
NL (1) | NL7302898A (da) |
SE (1) | SE421690B (da) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2428412A1 (de) * | 1974-06-12 | 1976-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
USRE32015E (en) * | 1974-06-12 | 1985-10-29 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the manufacture of insulin, analogs and derivatives thereof |
DE2439296A1 (de) * | 1974-08-16 | 1976-02-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
RO112873B1 (ro) * | 1993-09-17 | 1998-01-30 | Novo Nordisk As | Derivati de insulina |
US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
US20010041786A1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-11-15 | Mark L. Brader | Stabilized acylated insulin formulations |
US5898067A (en) * | 1997-02-07 | 1999-04-27 | Novo Nordisk A/S | Crystallization of proteins |
BR9813111A (pt) | 1997-10-24 | 2000-08-15 | Lilly Co Eli | Composições de insulina insolúveis |
US6531448B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
WO2011031662A1 (en) | 2009-09-08 | 2011-03-17 | Kent Stephen B H | Ester insulin |
US8748570B2 (en) * | 2010-05-25 | 2014-06-10 | Syngene Limited | Insulin analogues |
WO1990007280A1 (en) * | 2010-07-13 | 1990-07-12 | Victor Manuel Pracas | Confectionery storage and dispensing device |
CN108064173B (zh) | 2014-11-21 | 2021-05-18 | 默沙东公司 | 胰岛素受体部分激动剂 |
EP3448417A4 (en) | 2016-04-26 | 2019-12-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | SOUND CONJUGATES OF INSULIN-INCRETIN |
EP3463429A4 (en) | 2016-05-24 | 2020-07-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | PARTIAL INSULIN RECEPTOR AGONISTS AND GLP-1 ANALOGUES |
US10689430B2 (en) | 2016-05-25 | 2020-06-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3679653A (en) * | 1968-09-27 | 1972-07-25 | Monsanto Co | Hormonally-active reaction product of a polymer with a hormone |
IE36225B1 (en) * | 1971-01-28 | 1976-09-15 | Nat Res Dev | Improvements relating to insulin derivatives |
-
1973
- 1973-02-16 US US333361A patent/US3907763A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-02-26 IL IL41615A patent/IL41615A/xx unknown
- 1973-02-27 BE BE128128A patent/BE795997A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-02-27 CH CH284673A patent/CH579916A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-02-27 JP JP48022747A patent/JPS4897889A/ja active Pending
- 1973-02-28 DK DK109173A patent/DK146623C/da not_active IP Right Cessation
- 1973-02-28 SE SE7302818A patent/SE421690B/xx unknown
- 1973-02-28 GB GB972673A patent/GB1374385A/en not_active Expired
- 1973-03-01 FR FR7307334A patent/FR2181778B1/fr not_active Expired
- 1973-03-01 NL NL7302898A patent/NL7302898A/xx not_active Application Discontinuation
- 1973-03-01 AT AT184873A patent/AT333987B/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL41615A (en) | 1975-12-31 |
AT333987B (de) | 1976-12-27 |
ATA184873A (de) | 1976-04-15 |
FR2181778B1 (da) | 1976-12-03 |
DE2209835B2 (de) | 1976-04-29 |
US3907763A (en) | 1975-09-23 |
NL7302898A (da) | 1973-09-04 |
FR2181778A1 (da) | 1973-12-07 |
CH579916A5 (da) | 1976-09-30 |
JPS4897889A (da) | 1973-12-13 |
DE2209835A1 (de) | 1973-09-06 |
IL41615A0 (en) | 1973-04-30 |
GB1374385A (en) | 1974-11-20 |
DK146623C (da) | 1984-04-30 |
SE421690B (sv) | 1982-01-25 |
BE795997A (fr) | 1973-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK146623B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin | |
JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
JP3863579B2 (ja) | 正しく連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得る方法 | |
US5354900A (en) | An H-ANP peptide, pharmaceutical composition and method of use | |
US4093574A (en) | Somatostatin analogs and intermediates thereto | |
CS228140B2 (en) | Production of straight or monocyclic polypeptides | |
HU177435B (en) | Process for preparing somatostatin analoques | |
US4656158A (en) | Peptide, and production and use thereof | |
KR940001711B1 (ko) | 심방성 나트륨이뇨성 펩티드의 동족체 | |
JP2710653B2 (ja) | 新規ポリペプチド及びその製造法 | |
US3883496A (en) | Process for the manufacture of insulin, analogs and derivatives thereof | |
US4623716A (en) | Process for the preparation and purification of peptides | |
US3883500A (en) | Process for the manufacture of insulin, analogs and derivatives thereof | |
DE2702699A1 (de) | Neue peptidderivate und verfahren zur messung der collagenaseaktivitaet unter verwendung dieser verbindungen | |
SU1423000A3 (ru) | Способ получени пептидов | |
EP0292729B1 (de) | Neue Festphasen-Peptidsynthesemethoden | |
US5095004A (en) | Fluorine containing atrial natriuretic peptides | |
JPH111493A (ja) | ペプチドおよびこれを固定化してなる医療材料 | |
JPH0615558B2 (ja) | 新規ポリペプチド、その製造法および医薬 | |
DK145854B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af bifunktionelt tvaerbundet insulin | |
US4657891A (en) | Diuretic peptide, and production and use thereof | |
Wender et al. | Synthesis and characterization of poly (LysAla3) | |
AU628473B2 (en) | Process for renaturing incorrect recombinants of insulin precursors | |
AU643349B2 (en) | Short peptides with insulin activity | |
EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PBP | Patent lapsed |