DE2209835B2 - Insulinderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

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verknüpft ist, wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht.

2. Verfahren zur Herstellung von bifunktioneil vernetzten Insulinderivaten, in welchen die u- Aminogruppe von Glycin*¹ der Α-Kette mit der f-Aminogruppe von Lysin⁸²⁹ der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

—C—X—C—

(D

30

verknüpft ist, wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin mit aktivierten Derivaten von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel η Lew und F. H. Carpenter. Biochemistry, ft ««ί Γ1967]· D. G. Lindsay und S. Shall,

«· Λ I 121 737 [1971]; B. Africa und F. H. Biochem. J-, i^. '-" S-. j> ri<nrrh

Carpenter, Biochemistry 9, 1962 [1970]).

über eine therapeutische Verwendung dieser Umsetzungsprodukte von Insulin mit monofunktionellen Reagenzien ist bisher jedoch noch nichts bekannt-

^8eBdde!'umsetzung von Insulin mit bifunktionellen Reagenzien konnten bisher nur heterogene Mischungen und keine einheitlichen Reaktionsprodukte erhalfen werden (s zum Beispiel DL-PS 10002; H. Zahn und J M ei en h of erf Makromol. Chem., 26, 153 Γ1958Ϊ) Hierbei reagierten die Reagenzien immer mit verschieden«! funktioneilen Gruppen des Insulinmoleküls, und neben monomeren Derivaten entstanden auch höhermolekulare Produkte mit unbestimmtem Polymerisationsgrad (s. zum Beispiel DL-

^P Die beiden bisher bekannten einheitlichen Insulipdeiivate mit einer intramolekularen m-Phenylendithiocarbamoylbrücke erwiesen sich als biologisch inaktiv (D Brandenburg, H. G. Gatt η er, S Weinert, L. Herbertz, H Zahn und AW öl Im er. Diabetes, Proc 7th Congress Int. Diabetes Fed Buenos Aires, 1970. Excerpta Medica Int. Congr. Series, 231, 363 [1971]).

Es wurde gefunden, daß die neuen, bifunktioneil vernetzten Insulinderivate, in welchen die a-Aminogruppe von Glycin" der Α-Kette mit der _f-Aminoiruppe von Lysin⁸²⁹ der B-Kette des Insulinmoleküls durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

—c—x—c—

(D

Y—C—X—C

(Π)

45

wobei X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Y für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht, in polaren organischen Lösungsmitteln oder in Mischung organischer Lösungsmittel mit Wasser, in Gegenwart von Protonenakzeptoren unter Verdünnungsbedingungen umsetzt und die erhaltenen Reaktionsprodukte durch Trennverfahren isoliert, die einmal nach der Molekülgröße und zum anderen nach der Ladung differenzieren.

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Insulinderivat gemäß Anspruch 1.

verknüpft ist, wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome bzw. Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht, eine hohe zuckersenkende Wirkung aufweisen.

Weiterhin wurde gefunden, daß man vernetzte Insuline, in welchen die a-Aminogruppe von Glycin^A1 mit der ε-Aminogruppe von Lysin⁸²⁹ durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formell verknüpft ist, wobei X die oben angegebene Bedeutung besitzt, erhält, wenn man Insulin mit aktivierten Derivaten von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

Y—C—X—C—Y

(Π)

60

Es ist bereits bekanntgeworden, daß sich Insulin ittels monofunktioneller Reagenzien chemisch modi- :ieren läßt, daß sich auf diese Weise dargestellte erivate auch in einheitlicher Form gewinnen lassen id daß derartige Insulinderivate veränderte biogische Eigenschaften besitzen (s. zum Beispiel wobei X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Y für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht, in polaren organischen Lösungsmitteln oder in Mischung organischer Lösungsmittel mit Wasser, in Gegenwart von Protonenakzeptoren unter Verdünnungsbedingungen umsetzt und die erhaltenen Reaktionsprodukte durch Trennverfahren isoliert, die einmal nach der Molekülgröße und zum anderen nach der Ladung differenzieren, überraschenderweise werden bei der erfindungs-

Ll

gemäßen Vernetzungsreaktion allein intramolekular vernetzte Insulinderivate gebildet, in denen die Aminogruppen von Glycin*¹ und Lysin⁸²⁹ verknüpft sind. So konnte auf den temporären Schutz der Phenylalanin ^B1-Aminogruppe verzichtet werden, obwohl 5 nach dem Stand der Technik erwartet werden mußte, daß diese Aminogruppe in hohem Ausmaß substituiert würde (D. G. Lindsay und S. Shall, Biochem. J., 221, 737 [1971]; D. Levy und F. H. Carpenter, Biochemistry, 6, 3559 [1967]). ιό Ebenso unerwartet ist, daß Nebenreaktionen an Tyrosin- und Serin-OH-Gruppen (H. Zahn und F. Schade, Angew. Chem., 75, 377 [1963]) nicht auftraten.

Es ist ferner sehr überraschend, daß die erfindungsgemäßen Insulinderivate eine höhere blutzuckersenkende Wirkung als die meisten morofunktionell substituierten, bekannten Insulinderivate besitzen und eine wesentlich höhere blutzuckersenkende Wirkung als die bisher bekanntgewordenen bifunktionell vernetzten Insuline aufweisen.

Besonders günstig ist der unerwartete Befund, daß die erfindungsgemäßen Insulinderivate aus zinksalzhaltigen Lösungen kristallisiert werden können. So ergibt sich die Möglichkeit einer Applikation in Form von Kristallsuspensionen, die bei Insulin bekanntlich im Hinblick auf eine protrahierte Wirkung angewandt wird.

Die erfindungsgemäßen Stoffe stellen somit eine Bereicherung der Pharmazie dar.

Verwendet man Rinderinsulin und Adipinsäurebis-p-nitrophenylester als Ausgangsstoffe, so kann der Reaktionsablauf durch das folgende vereinfachte Formelschema wiedergegeben werden:

H₂N-GIy --Cys—Cys --Cys--Cys—Asu A-Kette

	S I	S	ς	NH2
H2N-Phe 1	I Cys	Cys	I Cys -Lys—Ala B-Kette 29 30
+ O2N-	f~~V-0—C-(CH,	U-C-O-Z-V-NO2
	0	Il 0
-2O2N-	^-OH O C
	O ^	21 Cys—Asn
HN:c^Gly-	■■Cys—C3	S
	<	Il "~~" ^
		-\
	I ^s Cys	0 S ^NH
H2N-Phe
	Il -2 O	Q
^s Lys—Ala

In den Formeln I und II steht X vorzugsweise für —(CH;,)„—, wobei η eine ganze Zahl sowie Null bedeuten kann. Y steht vorzugsweise für gegebenenfalls substituiertes Phenoxy.

Die erfindungsgemäß verwendbaren bifunktionellen Verbindungen sind bereits bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden (H. Zahn und F. Schade, Chem. Ber., 96, 1747 [1963]; J. Schnell und H. Zahn, Kolloid-Z., 203, 27 [1965]; H. Zahn und M. Bahra, Forschungsber. des Landes Nordrhein-Westfalen, Nr. 1897; L.Brandt, Herausg., Westdeutscher Verlag, Köln und Opladen [1967]), in der Regel aus der Dicarbonsäure, dem substituierten Phenol und Dicyclohexylcarbodiimid.

Als Beispiele seien genannt:

Derivate aliphatischer Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

YOC- (CH₂),,-COY

in denen die Carboxylgruppe durch den Rest Y aktiviert ist, wie Adipinsäure-bis-p-nitrophenylestei, Pimelinsäure - bis - N - hydroxysuccinimidester, Korksäure - bis - 2,4,5 - trichlorphenylester, Sebacinsäurebis-pentachlorphenylester, sowie Aminosäuren, die zwei Carboxylgruppen in aktivierter Form besitzen und in denen die Aminogruppe(n) geschützt ist, wie N,N' - Bis - tert. - butyloxycarbonyl - cystin - bis - 2,4,5 - trichlorphenylester, N - Benzyloxycarbonyl - glutaminsäure-a,y-bis-p-nitrophenylester.

Als Insuline können beispielsweise verwandt werden: Rinderinsulin, Schweineinsulin, Schafinsulin, VValinsulin, Fischinsuline.

Als Verdünnungsmittel können alle polaren organischen Lösungsmittel verwendet werden, in denen sich Insulin löst, sowie Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser. Als Beispiele seien Dimethylsulfoxyd und Dimethylformamid genannt.

Als Protonakzeptoren können alle bei der Peptidsynthese üblichen basischen Verbindungen verwendet werden, z. B. organische Basen wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin (die letztere vorzugsweise

beim Arbeiten mit optisch aktiver Carbonsäure zur Vermeidung von Racemisierung), beim Arbeiten in Gegenwart von Wasser auch Alkalihydroxyde, Hydrogencarbonate oder Carbonate, wie Natriumhydrogencarbonat oder Natriumcarbonat.

Im allgemeinen arbeitet man bei Temperaturen zwischen 0 und 40⁰C, vorzugsweise bei 18 bis 25° C.

Die Reaktionen werden üblicherweise bei Normaldruck durchgeführt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man auf 1 Mol Kristallinsulin oder amorphes Insulin 1 bis 2 Mol, vorzugsweise 1,2 bis 1,3 Mol, des aktivierten Dicarbonsäurederivates ein, und zwar so, daß in die verdünnte Lösung des Insulins die Lösung des aktivierten Derivates langsam eingetropft wird, üblicherweise während 1 bis 5 Stunden. Sodann läßt man die Reaktionsmischung noch mehrere Stunden, gegebenenfalls unter Rühren, stehen. Günstig, jedoch nicht notwendig, ist Licht- und Sauerstoffausschluß, d. h. Arbeiten im Dunkeln und unter Schutzgas (z. B. Stickstoff) zur Vermeidung von Nebenreaktionen (z. B. von oxydativen Schädigungen des Insulins).

Die Aufarbeitung erfolgt entweder durch Ausfällen der Insulinderivate durch Zugabe von mit dem Lösungsmittel mischbaren Lösungsmitteln, welche die Eigenschaft besitzen, die Insulinderivate auszufällen, beispielsweise Methanol und Äther. Man kann auch die Reaktionslösung im Dialyseschlauch gegen Wasser dialysieren und so die Insulinderivate abtrennen. Zum Abbruch der Reaktion kann vor Beginn der Dialyse angesäuert werden, z. B. mit Essigsäure. Als günstig hat sich auch eine Dialyse gegen verdünnte Ammoniumbicarbonatlösung erwiesen, wobei restliche aktivierte Gruppen der Dicarbonsäure aminolysiert werden.

Nach der Dialyse wird entweder direkt lyophilisiert, oder das Insulinderivat wird durch Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt ausgefällt.

Das Präparat wird sodann entweder feucht oder nach Trocknung mittels eines Verfahrens fraktioniert, das Moleküle nach dem Molekulargewicht trennt, vorzugsweise durch Gelchromatographie unter Bedingungen, bei denen Insulin und die Derivate nicht aggregieren. Zum Beispiel wird hierbei Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure verwendet. Das nach Dialyse und Gefriertrocknung erhaltene Präparat (Monomerfraktion 3, vgl. Beispiele) wird weiter nach Verfahren fraktioniert, die Moleküle nach der Ladung auftrennen. Hierzu können Ionenaustauschchromatographie oder elektrophoretische Verfahren dienen. Vorzugsweise wird im sauren Medium eine Ionenaustauschchromatographie angewandt, z. B. an SE-Sephadex A25 bei pH 3,0 in Essigsäure/7 M Harnstoff mit einem NaCl-Gradienten.

Das nach Dialyse, Gefriertrocknung und (eventuell erforderlichem) Entsalzen mittels Gelfiltration, ζ. Β. an Sephadex G 25, oder durch isoelektrisches Umfallen erhaltene Produkt kann, falls erforderlich, durch Ionenaustauschchromatographie in schwach alkalischer Lösung, z. B. an DEAE-Sephadex A 25 bei pH 8,4, nachgereinigt werden.
Als neue Wirkstoffe seien im einzelnen genannt:

_N=.A\_NtB29_o_xai_yi_insulin (Rind),

N^lA\N'^B29-Succinylinsulin (Rind),
N^lA1,N^lB29-Glutarylinsulin(Rind),
N"^M,N^tB29-Adipoylinsulin (Rind, Schaf),
N^aA1,N^tB29-Pimeloylinsulin(Rind),
N^aA1,N^tB29-Suberoylinsulin(Rind),

N^aA1,N^tB29-Azelaoylinsulin (Rind),

N^aA1,N^lB29-Sebacoylinsulin (Rind, Schwein),
N" ^M ,N^EB29-Undecandioylinsulin (Rind),
N"^A1,N^lB29-Dodecandioylinsulin (Rind),
_N.Ai/N^£B29-Tridecandioylinsulin (Rind),

N^aA1,N^tB29-(N,N'-Bis-tert.-butyloxycarbonyl)-

L-cystinylinsulin (Rind),
N" ^M ,N" ^B29-L-Cystinylinsulin (Rind),
N^aA1,N^tB29-N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-

insulin (Rind),
N^aA1,N^cB29-L-Glutamylinsulin (Rind).

Chemischer Strukturbeweis für die kovalent
vernetzten Insulinderivate

a) Insulin und alle Derivate, in denen Aminogruppen monofunktionell substituiert sind, geben bei der Spaltung der Disulfidbindungen, z. B. durch oxydative Sulphitolyse (L. B a i 1 e y und R. D. C ο 1 e. J. Biol. Chemistry, 234, 1733, [1959]), die getrennten

A- und B-Ketten als S-Sulfonate. Vereinfachtes Schema:

Sulphitolyse
AB(SS)₃ — A(SSO₃-J₄ + B(SSOf)₂

Insulin Α-Kette B-Kette

Bei einem mittels einer bifunktionellen Brücke zwischen Glycin·⁴¹ und Phenylalanin⁸¹ oder Lysin⁸²⁹ knüpften Insulinderivat darf nur ein Kettenderivat nach der Spaltung auftreten:

^AB(SS)

Sulphitolyse [-A(SSO₃ ► OC

vernetztes Insulin

OC- B(SSOf)₂

vernetztes Kettenderivat

Alle Präparate (Beispiele 1 bis 4, 6 bis 9) wurden 65 gaben erwartungsgemäß zwei Banden, da auch di(

einer Sulphitolyse unterworfen, die Elektrophorese neu eingeführte Brücke gespalten wird,

zeigte nur eine Bande (s. Fig. 1, Nr. 2). Nur die mit b) Der Nachweis, daß sich die Brücke ausschließ

Cystin vernetzten Derivate (Beispiele 11 und 12) lieh zwischen Glycin^ und Lysin⁸²⁹ und nicht zwi

sehen Glycin^A1 und Phenylalanin¹¹¹ befindet, gelang durch enzymatischen Abbau der vernetzten Kettenderivate mittels Trypsin und wird durch Endgruppenbestimmung bestätigt.

Adipoyl - A - ketten - tetra - S - sulfonat - B - ketten - bis-S-sulfonat wurde mit Trypsin nach S. S. Wang und F. H. Carpenter, Biochemistry, 6, 215 (1967), gespalten. Die Spaltprodukte wurden nach der Gefriertrocknung durch Papierelektrophorese bei pH 2 (2,4 M Ameisensäure/7 M Harnstoff) aufgetrennt (s. Fig. 1, Nr. 3).

Es wurden nur die zwei in der folgenden Tabelle angegebenen Spaltpeptide gefunden. Alle anderen vernetzten Insuline (Beispiele 1 bis 4 und 6 bis 9) gaben bei der elektrophoretischen Analyse und Endgruppenbestimmung gleiche Resultate.

Die nun folgende Tabelle zeigt die Aminosäurezusammensetzung des aus Adipoylinsulin durch oxydative Sulphitolyse erhaltenen Derivates Ν^',Ν*⁸²⁹-Adipoyl - A - ketten - tetra - S - sulfonat - B - ketten - bis-S-sulfonat (A—Ad — B) und der daraus gewonnenen tryptischen Spaltpeptide N^aA1,N^cB29-Adipoyl-A-ketten - tetra - S - sulfonat - B (23 bis 30) [Bezeichnung: A— Ad — B (23 bis 30)] und B(I bis 22)-bis-S-sulfonat [Bezeichnung: B (1 bis 22)].

Aminosäureanalyse nach Moore und Stein. Hydrolysendauer: 48 Stunden, bei 110⁰C. Alle Werte sind unkorrigiert und bezogen auf Glycin.

Aminosäure	A — \d	— B A-Ad-	B B
		(23 bis 30)	(I bis 22!
LYS	1.08	0.97	0
HIS	2,05	0	+
ARG	1.04	0	1,16
ASP	3.43	1.95	0.81
THR	1.13	1.07	1.69
SER	2.80	1.73	1.28
GLU	6,80	3.72	1.34
PRO	1.48	+	0
GLY	4,00	2,00	2.00
ALA	3.28	2.00	0,90
Halbcystin	4,72	3.61	-r
VAL	5.06	1,70	4,05
ILE	0.70	0	0
LEU	6,33	1.91	3,70
TYR	4,10	2,68	0,71
PHE	3,14	2.03	1,50
Das Zeichen +	bedeutet	vorhanden, jedoch	nicht quantitativ
bestimmt.

B (23 bis 30) = Aminosäuresequenz 23 bis 30 der B-Kette.
B(I bis 22) = Aminosäuresequenz 1 bis 22 der B-Kette.

Beschreibung der Fig. 1 bis 4 der Patentanmeldung

Die F i g. 1 zeigt vier Papierelektropherogramme bei pH 2 (Puffed 2,4 M HCOOH 7 M Harnstoff) von:

1. Α-Kette (links) und B-Kette (rechts) in der S-Sulfonatform,

2. N^aA\N^tB29-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-

B-ketten-bis-S-sulfonat,

3. den hieraus durch Trypsinabbau erhaltenen Spaltpeptiden und

4. den aus Insulin-B-Ketten-S-sulfonat mit Trypsin erhaltenen Spaltpeptiden. B(I bis 22) (links) und B (23 bis 29) (rechts).

Angefärbt wurde hierbei mit diazotierter Sulfanilsäure. Die Pfeilmarkierung soll die Startlinie der Elektrophoresen markieren.

Die F i g. 2 zeigt das Elutionsdiagramm der Gelchromatographie von etwa 600 mg rohem Azelaoylinsulin (Beispiel 8) an einer Säule (Dimensionen: 5 χ 150 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure. Durchlaufgeschwindigkeit 100 ml'Stunde, Fraktionen zu 12 ml.

Abszisse: Fraktionsnummer.
Ordinate: Extinktion bei 254 nm.
Fraktion 1 enthält oligomere, Fraktion 2 hauptsächlich dimere, Fraktion 3 monomere Insulinderivate. Die Elutionsdiagramme der Gelchromatographie der anderen bifunktionell vernetzten Insulinderivate zeigen einen ähnlichen Verlauf.

F i g. 3 zeigt das Elutionsdiagramm der lonen-

austauschchromatographie von 320 mg rohem Suberoylinsulin (Beispiel 7. Fraktion 3) an einer Säule (Dimensionen 1.5 χ 45 cm) mit SE-Sephadex bei pH 3,0. Linearer Natriumchloridgradient, Puffer siehe Angaben bei Beispiel 1. Durchlaufgeschwindigkeit 30 bis 35 ml/Stunde, Fraktionen zu 6,8 ml, Extinktionsmessung bei 254 nm.

Abszisse: Fraktionsnummer.
Ordinate: NaCl-Konzentration in Mol/l.
Fraktion mit dem Maximum bei Fraktionsnummer 60: Gesuchtes Insulinderivat mit Brücke zwisehen Glycin^Al und Lysin⁸²⁹. Die Elutionsdiagramme der lonenaustauschchromatographie der anderen bifunktionell vernetzten Insulinderivate zeigen einen ähnlichen Verlauf.

F i g. 4 zeigt das UV-Spektrum von amorphem

Insulin ( ), Konzentration = 0.767 mg/ml,

und Glutarylinsulin ( ). Konzentration

= 0.636 mg/ml, in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8,2.

Ordinate: Extinktion.
Abszisse: Wellenlänge in nm (Nanometer).

Die neuen Wirkstoffe weisen eine blutglucose-

senkende Wirkung auf. Sie eignen sich deshalb zur Behandlung von Diabetikern im allgemeinen und besonders solchen, die infolge Antikörperbildung gegen Rinder- und/oder Schweineinsulin hohe Dosen herkömmlicher Insulinpräparate benötigen, deren Bedarf aber erfahrungsgemäß nach Umstellung auf ein neues Präparat, gegen das keine Antikörper gebildet werden, durch niedrigere Dosen zufriedenstellend gedeckt ist.

Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen und Suspensionen, besonders Kristallsuspensionen.

Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise

angewendet werden, insbesondere zur parenteralen Injektion.

Versuchsanordnung zur Untersuchung des Insulingehaltes von Insulinderivaten

Insulin senkt die Blutglucose von Ratten. Diese Wirkung ist in einem bestimmten Bereich dosisabhängig. Durch vergleichende Berechnung der Blut-

609 518/49;

glucosesenkung bei Ratten nach subcutaner Injektion von Präparaten mit unbekannter Insulinwirksamkeit und der Blutglucosesenkung nach subcutaner Injektion von Insulin mit bekanntem WirkstofTgehalt wird die blutglucosewirksame Insulinaktivität der Insulinderivate ermittelt. Einzelheiten s. H. Zahn, E. Drechsel und W. Puls: Hoppe Seylers Z., Physiol. Chem., 349, 385 bis 389 (1968).

In der nun folgenden Tabelle wird die blutglucosewirksame Insulinaktivität einiger erfindungsgemäßer Verbindungen in Prozent vom Insulinstandard (25,4 IE'mg) angegeben:

Wirkstoff

Blutglucosewirksame Insulinaktivität 1 mg in Prozent vom Insulinstandard (25.4 lE/mg)

N^lA1,N^tB29-Oxalylinsulin (Rind)
N^lA\N^cB29-Glutarylinsulin (Rind)
_n*ai,N^£B29-Adipoylinsulin (Rind)
N*^A\N^£B29-Pimeloylinsulin (Rind)

N^lAI.N^£B29-Azelaoylinsulin(Rind)
N^jA1,N^cB29-Sebacoylinsulin(Rind)

52

32

41

35

100

100

61

Beispiel 1
N^aA\N^lB29-Oxalylinsulin (Rind) ^

Eine Lösung von 640 mg (100 μΜοΙ) kristallinem Rinderinsulin und 150 μΐ Triäthylamin in 75 ml Dimethylsulfoxid wurde unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer Lösung von 39,8 mg (120 μΜοΙ) Oxalsäure-bis-p-nitrophenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 4 Stunden versetzt. Die Reaktionslösung stand noch 60 Stunden bei Raumtemperatur und wurde dann zunächst 2 Stunden gegen fließendes Wasser und anschließend zwei-Bial jeweils 1 Stunde gegen 1 1 0,05 M Ammoniumkicarboiiatlösung dialysiert. Die Lösung wurde mit »erdünnter HCl auf pH 4,9 angesäuert, das ausgefallene Protein abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Das feuchte Produkt wurde in 3 ml Eisessig und 17 ml Wasser gelöst und an einer Säule (5 χ 150 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure chromatographiert. Das Eluat wurde in J Fraktionen (vgl. F i g. 2) viermal gegen je 11 dest. Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

Auswaagen

Fraktion 1 70 mg

Fraktion 2 216 mg

Fraktion 3 315 mg

(49,3% der
Theorie)

310 mg der Fraktion 3 wurden in 3 ml 1,5 M Essigsäure/7 M Hamstoff/0,05 M NaCl (pH 3,0) gelöst •nd auf eine Säule (1,5 χ 45 cm) mit SE-Sephadex aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war.

Die Elution erfolgte mittels eines linearen Gradienten aus 250 ml Startpuffer und 250 ml Zulaufpuffer, der die gleiche Zusammensetzung wie dei Startpuffer besaß, jedoch 0,2 M an NaCl war. Das Eluat unter dem Maximum (schraffierter Teil, vgl F i g. 3) wurde dreimal je 1 Stunde gegen 1 1 dest Wasser dialysiert und lyophilisiert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Säule (3 χ 60 cm) mit Sephadex G-25 in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung von restlichem Salz und Harnstoff befreit und das Eluat lyophilisiert.

Ausbeute: 98,2 mg (15% der Theorie).

^f278 = 5490 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8,2) (vgl. F i g. 4).

Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.

R;„_s (elektrophoretische Beweglichkeit, bezogen aul Insulin) = 0,74.

Freie Aminogruppen (Dansylchloridmcthode nach W. R. Gray, Methods in Enzymology, Bd. 11. 139. [1967]): Phenylalanin Oxalylinsulin kristallisiert aus zmkionenhaltigem Citratpuffer (J. Sch I ich tkrull, Acta Chem. Scand. 10, 1455 [1956]) in Form von kleinen Prismen.

Beispiel 2
N^lA1,N^lBM-Succinylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden innerhalb von 3 Stunden mit 43,2 mg (120 μΜοΙ) Bernsteinsäurebis-p-nitrophenylester unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Aufarbeitung und Gelchromatographie erfolgten ebenfalls wie im Beispiel 1 beschrieben.

Auswaagen

Fraktion 1 90 rng

Fraktion 2 105 mg

Fraktion 3 411 me

(64,2% der Theorie)

410 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert und aufgearbeitet. Die Hauptfraktion (schraffiert, vgl. ^ ig- 3) gab nach der Chromatographie an Sephadex G-25 139 mg (21,7% der Theorie) Succinylinsulin.

'278 = 5540 (in 0,05 M Ammonium bicarbonat-Iosung, pH 8,2).

Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.
K/„ = 0,77.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.
Knstallform: Sphärische Partikeln.

Beispiel 3
N»ai,N^£B29-Glutarylinsulin (Rind)

/i^f°r^{8 krist Rinde}rinsulin wurden mit 44,8mg UiüuMol) Glutarsäure-bis-p-nitrophenylester unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingunaen umgesetzt. Aufarbeitung und Gelchromatographie erfolgten ebenfalls wie im Beispiel 1 beschrieben.

. Auswaagen

Fraktion 1.... _{54 mg}

lotion! Υ.'.'.'....:. 195mg

Fraktion 3 330mg

(51,6% der
Theorie)

320 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 besenneben, an SE-Sephadex chromatographiert und

aulgearbeitet. Nach dem Entsalzen durch Gelfiltration an Sephadex G-25, gefolgt von isoelektrischem Umfallen bei pH 4,8, wurden aus der Hauptfraktion (vgl. Fig. 2) 110,3mg (17,3% der Theorie) Glutarylinsulin erhalten.

I₂Is = 5400 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung).

Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.

R_lns = 0,74.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin. ίο

Kristallform: Verfilzte kleine Nadeln.

Beispiel 4

N^aAJ,N^cB29-Adipoylinsulin (Rind) "⁵

a) 1,27 g (200 μΜοΙ) krist. Rinderinsulin wurden in 140 ml Dimethylsulfoxid in Gegenwart von 0,3 ml Triäthylamin unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer Lösung von 93,2 mg (240 μΜοΙ) 2ο Adipinsäure - bis - ρ - nitrophenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid versetzt. Nach 60stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung wie bei Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet. Nach der Gelchromatographie an Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure wurden erhalten:

Fraktion 1 304 mg

Fraktion 2 335 mg

Fraktion 3 587 mg

(46.2% der Theorie)

580 mg der Fraktion 3 wurden in zwei gleichen Anteilen an SE-Sephadex chromatographiert, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Hauptfraktionen (vgl. F i g. 3) wurden nach der Gefriertrocknung vereinigt und durch Gelfiltration (s. Beispiel 1) entsalzt.

Ausbeute: 294 mg (23% der Theorie) Adipoylinsulin.

(■■₂76 = 5650 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung. pH 8,2).

Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.

R,„_s = 0,73.

Freie Aminogruppe: Phenylalanin.

Kristallform: Kleine Nadeln sowie sphärische Partikeln.

b) Zu einer Lösung von 120 mg (18,7 μΜοΙ) krist. Rinderinsulin in 15 ml Dimethylsulfoxid und 30 al Triäthylamin wurden innerhalb von 2 Stunden 7.8 mg (20 μΜοΙ) Adipinsäure - bis - ρ - nitrophenylester in 2,5 ml Dimethylsulfoxid unter Rühren getropft. Anschließend wurden weitere 7,8 mg Ester in 2,5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von einer Stunde zugetropft. Die Reaktionslösung wurde sofort mit Methanol/Äther versetzt, das ausgefallene Insulinderivat mit Methanol/Äther (1:9) gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet. Dann wurde in einem Gemisch aus 1 ml Eisessig und 9 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (3 χ 200 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure aufgetragen und chromatographiert. Die Eluate (vgl. Fig. 1) wurden dialysiert und lyophilisiert.

Auswaagen

Fraktion 1 29 mg

Fraktion 2 14 mg

Fraktion 3 55 mg

(45,8% der
Theorie)

Beispiel 5
N^lA1,N^fB29-Adipoylinsulin (Schaf)

Zu einer Lösung von 320 mg krist. Schafinsulin (50 μΜοΙ) in 35 ml Dimethylsulfoxid und 75 μΐ Triäthylamin wurde unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von 23,3 mg (60 μΜοΙ) Adipinsäure-bisp-nitrophenylester in 4 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 4 Stunden getropft. Die Reaktionsmischung stand noch 48 Stunden bei Raumtemperatur und wurde dann wie im Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde an Sephadex (Säule: 3 χ 200 cm) wie im Beispiel 1 chromatographiert.

Auswaagen

Fraktion 1 88 mg

Fraktion 2 74 mg

Fraktion 3 94 mg

(29,4% der
Theorie)

Die Fraktion 3 enthielt nach der quantitativen Papierelektrophorese 59% N*^A!,N^£B29-Adipoylinsulin.

Beispiel 6
N^2A1.N^tB29-Pirneloylinsulin(Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 48,2 mg (120 aMol) Pimelinsäure-bis-p-nitrophenylester unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Nach 44 Stunden wurde die Reaktionsmischung aufgearbeitet und das Rohprodukt chromatographiert.

Auswaagen

Fraktion 1 194 mg

Fraktion 2 111 mg

Fraktion 3 288 mg

(45% der
Theorie)

280 mg der Fraktion 3 wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert. Das aus der Hauptfraktion (vgl. Abb. 3) isolierte Produkt wurde an Sephadex G-25 entsalzt.

Ausbeute: 132 mg (20.6% der Theorie).

,₂₇₈ = 5970 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8,2).

Elektrophoretische Reinheit: 95%.

R_1n, = 0,73.

Freie Aminogruppe: Phenylalanin.

Kristallform: Verfilzte Nadeln.

Beispiel 7
N^lA\N^eB29-Suberoylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 49,9 mg (120 μΜοΙ) Korksäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt und nach 48 Stunden aufgearbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben. Nach der Gelfiltration wurden erhalten:

Fraktion 1 137 mg

Fraktion 2 122 mg

Fraktion 3 331 mg

(51,7% der
Theorie)

320 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert. Die

Hauptfraktion is. Fig. 3) wurde an Sephadex G-25 entsalzt, anschließend bei pH 4,8 isoelektrisch umgefällt und erneut lyophilisiert.

Ausbeute: 138,8 mg (21,6% der Theorie).

F₂₇₈ = 5110 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8,2).

Elektrophoretische Reinheit (pH 2): 98%.

R₁₁* = 0,74.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.

Kristallform: Kleine Nadeln.

IO

20

Beispiel 8
N"^,N^tB29-Azelaoylinsulin (Rind)

640 mg krist Rinderinsulin wurden mit 51,6 mg (120 μΜοΙ) Azelainsäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben. Nach der Gelfiltration (s. Fig. 2) wurden erhalten:

Fraktion 1 166 mg

Fraktion 2 121 mg

Fraktion 3 311 mg

(48% der
Theorie)

300 mg der Fraktion 3 wurden an SE-Sephadex Chromatographien, wie bei Beispiel 1 beschrieben. Die Aufarbeitung der Hauptfraktion (vgl. Fig. 3) gab nach dem Entsalzen 134,3 mg Azelaoylinsulin (21% der Theorie).

^f278 = 6060 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung).

Elektrophoretische Reinheit (pH 2): 94%.

R,„, = 0,77.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.

Kristallform: Kleine Nadeln.

Beispiel 9
N"^A1,N'^B29-Sebacoylinsulin(Rind)

40

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 53,3 mg (120μΜο1) Sebacinsäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben. Abweichend erfolgte die Aufarbeitung so, daß das Reaktionsprodukt nach der Dialyse durch Gefriertrocknung isoliert wurde. Das Rohprodukt wurde in 4 ml Eisessig und 16 ml Wasser gelöst und wie im Beispiel 1 chromatographiert.

Beispiel 10 N^lA\N^£B29-Sebacoylinsulin (Schwein)

640 mg krist. Schweineinsulin wurden mit 53,3 mg (12OaMoI) Sebacinsäure-bis-p-nitrophenylester um" sesetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Nach 20stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde aufgearbeitet.

Auswaagen nach der Gelfiltration

Fraktion 1 190 mg

Fraktion 2 139 mg

Fraktion 3 280 mg

(43.7% der Theorie)

Fraktion 3 enthielt nach der quantitativen elektrophoretischen Analyse 70% Sebacoylinsulin.

Beispiel 11

^{c B29}-: Bis-N.N '-tert.-butyloxycarbon\ 1 )-cystinylinsulin (Rind)

a) Zu einer Lösung von 640 mg krist. Rinderinsulin in 75 ml Dimethylsulfoxid und 150 μΐ Triäthylamin wurde unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von 95,8 mg (120μΜο1) N,N'-Bis-tert.-butyloxycarbonyl-cystin-2,4,5-trichlorphenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 5 Stunden unter Rühren getropft. Nach 22stündigem Stehen wurde die Reaktionsmischung, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde an Sephadex G-50 in 10%iger Essigsäure chromatographiert.

Auswaagen

Fraktion al 191 mg

Fraktion a2 132 mg

Fraktion a3 261 mg

(40,8% der Theorie)

b) Die Reaktion wurde unter gleichen Bedingungen wie im Beispiel 11 a) geführt, jedoch unter Verwendung von 110 al N-Methylmorpholin als Base.

Auswaagen

Fraktion b 1 206 mg

Fraktion b2 159 mg

Fraktion b 3 272 mg

(42,5% der Theorie)

Auswaagen

Fraktion 1 175 mg

Fraktion 2 143 mg

Fraktion 3 278 mg

(43% der
Theorie)

270 mg der Fraktion 3 wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert, das Hauptprodukt (vgl. Fig. 3) wurde an Sephadex G-25 entsalzt.

Ausbeute: 121,2 mg (19% der Theorie).

f₂₇₈ = 5500.

Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.

R.ns = 0,78.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.
Kristallform: Kleine Nadeln.

250 mg der Fraktion a 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex aufgetrennt. Die Hauptfraktion wurde durch Chromatographie an Sephadex G-25 entsalzt.

Ausbeute: 103,6 mg (16,5% der Theorie).

^f278 ⁼ 5400 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonallösung, pH 8,2).

Papierelektrophorese (bei pH 2): Einheitlich. R_lns = 0,77.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.

Auf gleiche Weise wurden aus 260 mg der Fraktion h3 91,8 mg (14,3%. der Theorie) (Bis-butyloxycarbonyl)-cystinyl-insulin erhalten. _f,-_s = 5900.

Papierelektrophorese (bei pH 2): Einheitlich.

R,„ = 0,70.

Freie Aminogruppe: Phenylalanin.

Beispiel 12

N^lA1.N^tBM-CystinyI-insulinlRind)

40 mg N^3A1.N^£B29-(Bis-butyloxycarbonyl)-cystinylinsulin (Beispiel 11) wurden 15 Stunden im Vakuum über P₂O₅ und KOH getrocknet. Dann wurde im Zentrifugenröhrchen mit 0,3 ml Trifluoressigsäure versetzt und die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Das Protein wurde anschließend mit 10 ml absolutem Äther ausgefällt, der Rückstand abzentrifugiert und mehrfach mit Äther gewaschen.

Ausbeute nach Trocknen im Vakuum über P,O₅ und KOH: 42 mg (etwa 96% der Theorie).

'2->8 = 5560 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonatlösung).

Elektrophoretische Reinheit (bei pH 2): Einheitlich.

R_1n = 1.0.

B e i s ρ i e 1 13

Darstellung von N^3AI,N^tB29-(N-Benzyloxycarbonyl)-glutamyl-insulin (Rind)

Zu einer Lösung von 640 mg krist. Rinderinsulin in 75 ml Dimethylsulfoxid und ΙΙΟμΙ N-Methylmorpholiri wurde innerhalb von 5 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von 62,7 mg (120 μ,ΜοΙ) N - Benzyloxycarbonyl - glutaminsäure- <i.;·-bis-p-nitrophenylester getropft. Nach 22stündigem Stehen wurde wie im Beispiel 1 aufgearbeitet und anschließend chromatographiert.

Auswaagen

Fraktion 1 106 mg

Fraktion 2 129 mg

Fraktion 3 257 mg

(40,2% der Theorie)

beiden Pufferlösungen betrugen jedoch jeweils 700 ml. Die Aufarbeitung der Hauptfraktion (vgl. F i g. 3) gab nach dem Entsalzen 139 mg Undecandioylinsulin (22.5% der Theorie).
Papierelektrophorese bei pH 2: Einheitlich.

:,-_s - 5390 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8.2).

R₁^ = 0.74.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.
Kristallform: Sphärische Partikeln.

Beispiel 15
_N=.Ai _N£ ^B29-Dodecandioylinsulin (Rind)

640 mg krisl. Rinderinsulin wurden mit 56.7 mg (120 μΜοΙ) Dodecandisäure - bis - ρ - nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Reaktionslösung wurde jedoch 18 Stunden nach Zugabe des Esters aufgearbeitet. Nach der Gelfiltration wurden erhalten:

Fraktion 1 140 mg

Fraktion 2 157 mg

Fraktion 3 276mg

(43,1% der Theorie)

250 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert. Nach dem Entsalzen durch Chromatographie an Sephadex G-25 wurden erhalten: 105 mg (16,4% der Theorie).

Elektrophoretische Reinheit (pH 2): 95%.

R_1n. = 0,76.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.

45

Beispiel 14
N^aA1,N^cB29-Undecandioylinsulin(Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 55,0 mg (120 μΜοΙ) Undecandisäure - bis - ρ - nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Reaktionslösung wurde jedoch bereits 18 Stunden nach Zugabe des Esters aufgearbeitet. Nach der Gelfiltration (s. F i g. 2) wurden erhalten:

Fraktion 1 144 mg

Fraktion 2 117 mg

Fraktion 3 311 mg

(48.6% der Theorie)

300 mg der Fraktion 3 wurden an einer Säule (2.7 χ 40cm) mit SP-Scphadex chromatographiert. wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Volumina der 260 mg der Fraktion 3 wurden an einer Säule (2,7 χ 40 cm) mit SP-Sephadex chromatographiert, wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Puffervolumina betrugen jedoch jeweils 700 ml. Die Aufarbeitung der Hauptfraktion (vgl. Fig. 3) gab nach dem Entsalzen 108 mg (17.9% der Theorie) Dcdecandioylinsulin.

,₂₇₈ = 5870 (in 0,05 M Ammoniumbicarbonailösung, pH 8,2).

Papierelektrophorese (bei pH 2): Einheitlich.

R_lns = 0.73.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.

Kristallform: Sphärische Partikeln.

Beispiel 16
Ν^πΛ1. N^cBM-Tridecandioylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 58,4 mg (120 μΜοΙ) Tridecandisäurc-bis-ρ-nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Reaktionslösung wurde jedoch 18 Stunden nach Zugabe des Esters aufgearbeitet. Nach der Gelfiltration wurden erhalten:

Fraktion 1 143 mg

Fraktion 2 154 mg

Fraktion 3 297 mg

(46.4%)

290 mg der Fraktion 3 wurden an einer Säule (2,7 χ 40cm) mit SP-Sephadex chromatographiert. wie bei Beispiel 1 beschrieben, die Puffervolumina betrugen jedoch jeweils 700 ml. Die Aufarbeitung der Hauptfraktion (vgl. Fig. 3) gab nach dem Entsalzen 109 mg (17,4% der Theorie) Tridecandioylinsulin.

,_27b = 5880 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung. pH 8.2).

Papicrclektrophorese (bei pH 2): Einheitlich.
R_tns = 0,75.

Freie Aminogruppen: Phenylalanin.
Kristallform: Sphärische Partikeln.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

ΑΠ9 S1R/.19S

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Bifunktioneil vernetzte Insulinderivate, in welchen die a-Aminogruppe von Glycin ^M der Α-Kette mit der f-Aminogruppe von Lysin⁸²⁹ der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

— C—X —C— (1)