DE2209835A1 - Insulinderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel - Google Patents

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKUSEN-BayerweÄ _p _ ^y

Zcntralbercich

latente, Marken und Lizenzen.

Ia (Pirn) Er/Mx

Insulinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel

Die vorliegende Erfindung "betrifft neue, über Aminogruppen vernetzte, monomere Insulinderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Antidiabetika.

Es ist bereits bekannt geworden, daß sich Insulin mittels monofunktioneller Reagenzien chemisch modifizieren läßt, daß sich auf diese Weise dargestellte Derivate auch in einheitlicher Form gewinnen lassen und daß derartige Insulinderivate veränderte biologische Eigenschaften besitzen (siehe z.B. D. levy und F. H. Carpenter, Biochemistry J5, 3559 (1967); D. G. Lindsay und S. Shall, Biochem. J. 121 _t 737 (1971); B. Africa und P. H. Carpenter, Biochemistry £, 1962 (1970)).

Über eine therapeutische Verwendung dieser Umsetzungsprodukte von Insulin mit monofunktionellen Reagenzien ist bisher Jedoch noch nichts bekannt geworden.

Bei der Umsetzung von Insulin mit bifunktionellen Reagenzien konnten bisher nur heterogene Mischungen und keine einheit-

Le A 14 113

309836/1166

lichen Reaktionsprodukte erhalten werden (siehe z.B. DDR Patent 10 002; H. Zahn und J. Meienhofer, Makromol. ' Chem. £6, 153 (1958). Hierbei reagierten die Reagenzien immer mit verschiedenen funktioneilen Gruppen des Insulinmoleküls und neben monomeren Derivaten entstanden auch höhermolekulare Produkte mit unbestimmtem Polymerisationsgrad (siehe z. B. DDR Patent 10 002).

Die beiden bisher bekannten einheitlichen Insulinderivate mit einer intramolekularen m-Phenylendithiocarbainoylbrücke erwiesen sich als biologisch inaktiv (D. Brandenburg, H. G. Gattner, M. Weinert, L. Herbertz, H. Zahn und A. Wollmer, Diabetes, Proc. 7th Congress Int. Diabetes Fed. Buenos Aires, 1970. Excerpta Medica Int. Congr. Series 231 , 363 (1971)).

Es wurde gefunden, daß die neuen, bifunktionell vernetzten

Insulinderivate, in welchen die Qt-Aminogruppe von Glycin der Α-Kette mit der £-Aminogruppe von Lysin der B-Kette des Insulinmoleküls durch eine Dioarbonsäürebrücke der Formel

-C-X-C- (I)

Il Il

0 0
verknüpft ist,

wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1-15 c-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome bzw. Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht,

Ie A H 113 " -2-

309836/1166

eine hohe zuckersenkende Wirkung aufweisen.

Weiterhin wurde gefunden, daß man vernetzte Insuline, in welchen die <*.-Aminogruppe von Glycin mit der £-Amino-

B29
gruppe von Lysin durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel I verknüpft ist, wobei X die oben angegebene Bedeutung beeitzt, erhält, wenn man Insulin mit aktivierten Derivaten von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

Y-C-X-C-Y (II)

O 0

wobei X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Y für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht,

in polaren organischen Lösungsmitteln oder in Mischung organischer Lösungsmittel mit Wasser, in Gegenwart von Protonenakzeptoren unter Verdünnungsbedingungen umsetzt und die* erhaltenen Reaktionsprodukte durch Trennverfahren isoliert, die einmal nach der Molekülgröße und zum anderen nach der Ladung differenzieren.

Überraschenderweise werden bei der erfindungsgemäßen Vernetzungsreaktion allein intramolekular vernetzte Insulin-

A1 derivate gebildet, in denen die Aminogruppen von Glycin

329
und Lysin ^J verknüpft sind. So konnte auf den temporären

B1
Schutz der Phenylalanin -Aminogruppe verzichtet werden, obwohl nach dem Stand der Technik erwartet werden mußte, daß diese Aminogruppe in hohem Ausmaß substituiert würde (D. G. Lindsay und S. Shall, Biochem. J. 1_21_, 737 (1971); D. Levy und F. H. Carpenter, Biochemistry £, 3559 (1967). Ebenso unerwartet ist, daß Nebenreaktionen an Tyrosin- und Serin-OH-Gruppen (H. Zahn und F. Schade, Angew. Chem. 7.5» 377 (1963)) nicht auftraten.

Le A 14 113 -3-

309836/1 166

Es ist ferner sehr überraschend, daß die erfindungsgemäßen Insulinderivate eine höhere blutzuckersenkende Wirkung als die meisten monofunktionell substituierten, bekannten Insu^ linderivate besitzen und eine wesentlich höhere blutzuckersenkende Wirkung als die bisher bekannt gewordenen bifunktionell vernetzten Insuline aufweisen.

Besonders günstig ist der unerwartete Befund, daß die erfindungsgemäßen Insulinderivate aus zinksalzhaltigen Lösungen kristallisiert werden können. So ergibt sich die Möglichkeit einer Applikation in Form von Kristallsuspensionen, die bei Insulin bekanntlich im Hinblick auf eine protrahierte Wirkung angewandt wird.

Die erfindungsgemäßen Stoffe stellen somit eine Bereicherung der Pharmazie dar.

Verwendet man Rinderinsulin und Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester als Ausgangsstoffe, so kann der Reaktionsablauf durch das folgende vereinfachte Pormelschema wiedergegeben werden:

111 21

H₉N-GIy Cys-Cys Cys Cys-Asn A-Ke tte

* I I

S S '

I I

S S NH₉

ι ι ι ²

H₉N- Phe Cys Cys Lys-Ala B-Kette

^ά 1 29 30

+ O₉N-/ \\-0-C-( CH₉) -C-O-/~\-NO

2 O₂N-/

Le A U 113 -4-

309836/1166

11 I 21

τ Cys-Cys Cys Cys-Asn

ς ° s

H₉N-Phe Cys Cys Lys-Ala

. 1 30

In den Formeln I und II steht X vorzugsweise für -g_n wobei η eine ganze Zahl sowie Null "bedeuten kann. Y steht vorzugsweise für gegebenenfalls substituiertes Phenoxy.

Die erfindungsgemäß verwendbaren bifunktionellen Verbindungen sind bereits bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden (H. Zahn und F. Schade, Chem. Ber. 96, 1747 (1963); J. Schnell und H. Zahn, Kolloid-Z. 203, 27 (1965), H. Zahn und M. Bahra, Forschungsber. des Landes Nordrhein-Westfalen Nr. 1897; L. Brandt, Herausg., Westdeutscher Verlag, Köln und Opladen (1967)), in der Regel aus der Dicarbonsäure, dem substituierten Phenol und Dicyclohexylcarbodiimid.

Als Beispiele seien genannt:

Derivate aliphatischer Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

YOC - (CH₂)_n - COY,

in denen die Carboxylgruppe durch den Rest Y aktiviert ist, wie Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester, Pimelinsäure-bis-

Ie A H 113 -5-

309836/1166

N-hydroxysuccinimidester, Korksäure-bis-2,4,5-triohlorphenylester, Sebacinsäure-bis-pentachlorphenylester, sowie Aminosäuren, die zwei Carboxylgruppen in aktivierter Form besitzen und in denen die Aminogruppe(n) geschützt ist, wie N,N'-Bis-tert.-butyloxycarbonyl-cystin-bis-2,4,5-trichlorphenylester, N-Benzyloxycarbonyl-glutaminsäure-^, ^bis-p-nitrophenylester.

Als Insuline können beispielsweise verwandt werden* Rinderinsulin, Schweineinsulin, Schafinsulin, Walinsulin, Fischinsuline ,

Als Verdünnungsmittel können alle polaren organischen Lösungsmittel verwendet werden, in denen sich Insulin löst, sowie Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser. Als Beispiele seien Dirnethylsulfoxyd und Dimethylformamid genannt .

Als Protonacceptoren können alle bei der Peptideynthese üblichen basischen Verbindungen verwendet werden, zum Beispiel organische Basen wie Triethylamin oder N-Methylmorpholin (die letztere vorzugsweise beim Arbeiten mit optisch aktiven Carbonsäure zur Vermeidung von Racemisierung) , beim Arbeiten in Gegenwart von Wasser auch Alkalihydroxyde, Hydrogencarbonate oder Carbonate, wie Natrium- * hydrogencarbonat oder Natriumcarbonat.

Im allgemeinen arbeitet man bei Temperaturen zwischen O und 40 °, vorzugsweise bei 18 bis 25 °·

Die Reaktionen werden üblicherweise bei Normaldruck durchgeführt .

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrene setzt man auf 1 Mol Kristallinsulin oder amorphes Insulin 1 bis

Le A H 113 ' · -6-

309836/1166

Mol, vorzugsweise 1,2 bis 1,3 Mol, des aktivierte; "bonsäurederivates ein, und zwar so, daß in die ve! Lö^w-ig des Insulins die Lösung des aktivierten Derivates , langsam eingetropft wird, üblicherweise während 1 bis 5 Stunden. Sodann läßt man die Reaktionsmischung noch mehrere Stunden, gegebenenfalls unter Rühren, stehen. Günstig, jedoch nicht notwendig, ist Licht- und Sauerstoffausschluß, d.h. Arbeiten im Dunkeln und unter Schutzgas (z.B. Stickstoff) zur Vermeidung von Nebenreaktionen (z.B. von oxydativen Schädigungen des Insulins).

Die Aufarbeitung erfolgt entweder durch Ausfällen der Insulinderivate durch Zugabe von mit dem Lösungsmittel mischbaren Lösungsmitteln, welche die Eigenschaft besitzen, die Insulinderivate auszufällen, beispielsweise Methanol und Äther. Man kann auch die Reaktionslösung im Dialyseschlauch gegen Wasser dialysieren und so die Insulinderivate abtrennen. Zum Abbruch der Reaktion kann vor Beginn der Dialyse angesäuert werden, zum Beispiel mit Essigsäure. Als günstig hat sich auch eine Dialyse gegen verdünnte Ammoniumbicarbonatlösung erwiesen, wobei restliche aktivierte Gruppen der Dicarbonsäure aminolysiert werden.

!fach der Dialyse wird entweder direkt lyophilisiert oder das Insulinderivat wird durch Einstellung des pH-Wertee auf den isoelektrischen Punkt ausgefällt.

Das Präparat wird sodann entweder feucht oder nach Trocknung mittels eines Verfahrens fraktioniert, das Moleküle nach dem Molekulargewicht trennt, vorzugsweise durch Gelchromatographie unter Bedingungen, bei denen Insulin und die Derivate nicht aggregieren. Zum Beispiel wird hierbei Sephadex G-50 fine in 10-proz. Essigsäure verwendet· Das nach Dialyse und Gefriertrocknung erhaltene Präparat (Monomerfraktion 3, vgl. Beispiele) wird weiter nach

Le A H 113 ' ' -7-

309836/1166

Verfahren fraktioniert, die Moleküle nach der Ladung auftrennen. Hierzu können Ionenaustauechchromatographie oder elektrophoretisch Verfahren dienen. Vorzugsweise wird¹ im sauren Medium eine Ionenaustauschchromatographie angewandt, zum Beispiel an SE-Sephadex A 25 bei pH 3·0 in Essigsäure/? M Harnstoff mit einem NaCl-Gradienten. i

Das nach Dialyse, Gefriertrocknung und (eventuell erforderlichem) Entsalzen mittels Gelfiltration, zum Beispiel an :! Sephadex G 25, oder durch isoelektrisches Umfallen erhaltene Produkt kann, falls erforderlich, durch Ionenaustauechchromatographie in schwach alkalischer Lösung, zum Beispiel an DEAE-Sephadex A 25 bei pH 8.4 nachgereinigt werden.

Als neue Wirkstoffe seien im einzelnen genannt:

, IT^eB29-Oxalylinsulin (Rind)

-Succinylinsulin (Rind) ~

-Glutarylinsulin (Rind)
-Adipoylinsulin (Rind, Schaf) -Pimeloylinsulin (Rind)
-Suberoylinsulin (Rind)
¹ -Azelaoylinsulin (Rind)

-Sebacoylinsulin (Rind, Schwein) -Undecandioylinsulin (Rind) -Dodecandioylinsulin (Rind) -Tridecandioylinsulin (Rind) -(ip¹-Bis-tert.-butyloxycarbonylJ-L-cystinylinsulin

(Rind)

-L-Cystinylinsulin (Rind) -N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamylinsulin (Rind) -L-Glutamylinsulin (Rind)

Le A H 113 -8-

309836/1166

Chemischer Strukturbeweis für die kovalent vernetzten Insulinderivate '

a) Insulin und alle Derivate, in denen Aminogruppen monofunktionell substituiert sind, geben bei der Spaltung der Disulfidbindungen, zum Beispiel durch oxydative SuI-phitolyse (L. Bailey und R. D. Cole, J. Biol. Chemistry 234, 1733, (1959)), die getrennten A- und B-Ketten als S-SuIfonate. Vereinfachtes Schema:

Sulphitoly8e _v AB(SS)₃ >

Insulin Α-Kette B-Kette

Bei einem mittels einer bifunktionellen Brücke zwischen Glycin und Phenylalanin⁵ oder Lysin ^ verknüpften Insulinderivat darf nur ein Kettenderivat nach der Spaltung auftreten:

Sulphitolyse

pA(SSO₅~)₄

OC

vernetztes Insulin vernetztes Kettenderi

vat

Alle Präparate (Beispiele 1 bis 4} 6 bis 9) wurden einer . Sulphitolyse unterworfen, die Elektrophorese zeigte nur eine Bande (siehe 3?ig.1, Nr. 2). Bur die mit Cystin vernetzten Derivate (Beispiele 11 und 12) gaben erwartungsgemäß zwei Banden, da auch die neu eingeführte Brücke

Le A 14 113 _r .-9-

309836/1166

gespalten wird. . " ·

b) Der Nachweis, daß sich die Brücke ausschließlich swisohen

αϊ B29 A1

Glycin und Lysin ^ und nicht zwischen Glycin und

B1

Phenylalanin befindet, gelang durch enzymatiechen Abbau der vernetzten Kettenderivate mittels Trypsin und wird durch Endgruppenbestimmung bestätigt.

Adipoyl-A-ketten-tetra-S-aulfonat-B-ketten-bis-S-aulfonat wurde mit Trypsin nach S. S. Wang und P. H. Carpenter, Biochemistry _6, 213 (1967) gespalten. Die Spaltprodukte wurden nach der Gefriertrocknung durch Papierelektrophorese bei pH 2 (2.4 M Ameisensäure/7 M Harnstoff) aufgetrennt (siehe Fig. 1, Nr. 3).

Es wurden nur die zwei in der folgenden Tabelle angegebenen Spaltpeptide gefunden. Alle anderen vernetzten Insuline (Beispiele 1 bis 4 und 6 bis 9) gaben bei der elektrophoretischen Analyse und EndgruppenbeStimmung gleiche Resultate.

Die nun folgende Tabelle zeigt die Aminosäurezusammensetzung des aus Adipoylinsulin durch oxydative Sulphitolyse erhaltenen Derivates N⁰^¹, N^£B29-Adipoyl-A-lcettentetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat (A - Ad - B) und der daraus gewonnenen tryptischen Spaltpeptide N*^A1, N^^B29-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B(23-30) Bezeichnung: A-Ad- B(23-30)7 ^* B(1-22)-bis-S-sulfonat B^ezei^cnnunS^: B(1-22)_7·

Aminosäureanalyse nach Moore und Stein, Hydrolysendauer: 48 Stunden, bei 110 ⁰C. Alle Werte eind unkorrigiert und bezogen auf Glycin. _;

Ie A 14 113 . . -10-

309836/1166

22Q9835

Aminosäure	A-Ad-B	A-Ad-B (23-30)	B (1-22) ■
* IYS	1,08	0,97	O
HIS	2,05	O	+
arg	1,04	O	1,16
ASP	3,43	1,95	0,81
THR	1,13	1,07	1,69
SER	2,80	1,73	1,28
GLU	6,80	3,72	1,34
PRO	* 1,48	+	O
GLY	4,00	2,00	2,00
ALA	3,28	2,00	0,90
Harbcystin	4,72	3,61	+
VAL	5,06	1,70	4,05
ILE	0,70	O	O
LEU	6,33	1,91	3,70
TYR	4,10	2,68	0,71
PHE	3,14	2,03	1,50

Das Zeichen + "bedeutet vorhanden, jjedoch nicht quantitativ "bestimmt.

B(23-30) = Aminosäuresequenz 23-30 der B-Kette B(1-22) = Aminosäuresequenz 1-22 der B-Kette

Le A 14 113

-11-

309836/1166

Beschreibung der Figuren Hr. 1 bis 4 der Patentanmeldung

Die Figur 1 zeigt vier Papierelektropherogramme bei pH 2 (Puffer: 2.4 M HCOOH/7 M Harnstoff) yon: i

1. Α-Kette (links) und B-Kette (rechts) in der S-Sulfonatform

2. N*^A1, N^£B29-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-kettenbis-S-sulfonat

3. den hieraus durch Trypsinabbau erhaltenen Spaltpeptiden und

4. den aus Insulin-B-Ketten-S-sulfonat mit Trypsin erhaltenen Spaltpeptiden. B (1-22) (links) und B (23-29) (rechte).

Angefärbt wurde hierbei mit diazotierter SuIfanilsäure. Die Pfeilmarkierung soll die Startlinie der Elektrophoresen markieren.

Die Figur 2 zeigt das Elutionsdiagramm der Gelchromatographie von ca. 600 mg rohem Azelaoylinsulin (Beispiel 8) an einer Säule (Dimensionen: 5 σ 150 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10 #iger Essigsäure. Durchlaufgeschwindigkeit 100 ml / Stunde, Fraktionen zu 12 ml.

Abszisse: Fraktionsnummer

Ordinate: Extinktion bei 254 nm

Fraktion 1 enthält oligomere, Fraktion 2 hauptsächlich dimere, Fraktion 3 monomere Insulinderivate. Die Elutionediagramme der Gelchromatographie der anderen bifunktionell vernetzten Insulinderivate zeigen einen ähnlichen Verlauf.

Le A 14 113 ~¹²~

309836/1 166

Figur 3 zeigt das Blutionsdiagramm der Ionenaustauschchroraatographie von 320 mg rohem Suberoy!insulin (Beispiel 7, Fraktion 3) an einer Säule (Dimensionen 1,5 x 45 om) mit SE-Sephadex "bei pH 3,0. Linearer Fatriumchloridgradient, Puffer siehe Angaben bei Beispiel 1. Durchlaufgeschwindigkeit 30-35 ml / Stunde, Fraktionen zu 6.8 ml«; Extinktionsmessung bei 254- mn.
Abszisse: Fraktionsnummer
Ordinate: ITaC1-Konzentration in Mol/l

Fraktion mit dem Maximum bei Fraktionsnummer 60: Gesuchtes Insulinderivat mit Brücke zwischen Glycin und Lysin . Die Elutionsdiagramme der Ionenaustauschchromatographie der anderen bifunktionell vernetzten Insulinderivate zeigen einen ähnlichen Verlauf.

Figur 4 zeigt das üV-Spektrum von amorphem Insulin (----),

Konzentration = 0.767 mg/ml, und Glutarylinsulin (— )„

Konzentration = 0.636 mg/ml, in 0.05 M Ammoniumbicarbonat« lösung, pH 8.2.

Ordinate: Extinktion

Abszisse: Wellenlänge in mn (Nanometer)

Die neuen Wirkstoffe weisen eine blutglucosesenkende Wirkung auf. Sie eignen sich deshalb zur Behandlung von Diabetikern im allgemeinen und besonders solchen, die infolge Antikörperbildung gegen Rinder- und/oder Schweineinsulin hohe Dosen herkömmlicher Insulinpräparate benötigen, deren Bedarf aber erfahrungsgemäß nach Umstellung auf ein neues Präparat, gegen das keine Antikörper gebildet werden, durch niedrigere Dosen zufriedenstellend gedeckt ist.

Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen und Suspensionen, besonders Kristallsuspensionen.

Le A 14 113 -13-

309836/1166

Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere zur parenteralen Injektion.

Versuchsanordnung zur Untersuchung dea Ineulingenaltee von Insulinderivaten

Insulin senkt die Blutglucose von Ratten. Diese Wirkung ist in einem bestimmten Bereich dosisabhängig. Durch vergleichende Berechnung der Blutglucosesenkung bei Ratten naoh subcutaner Injektion von Präparaten mit unbekannter Insulin wirksamkeit und der Blutglucosesenkung nach subcutaner Injek tion von Insulin mit bekanntem Wirkstoffgehalt, wird die

blutglucosewirksame Insulinaktivität der Insulinderivate er-

mittelt. Einzelheiten s. H. Zahn , E. Dreohsel und W. Puls ι Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 349, 385 bis 389 (1968).

In der nun folgenden Tabelle wird die blutglucosewirksame

Insulinaktivität einiger erfindungsgemäßer Verbindungen in._ J

Prozent vom Insulinstandard (25,4 ΙΕ/mg) angegeben:

Wirkstoff	blutglucosewirksame ! Tnsulinaktivität 1 mg in i» vom Insulin standard (25,4 IE / mg
N*A1 ,N£B29-Oxalylinsulin (Rind) N*A1tN fcB29_Glutarylinsulin (Rind) NÖ<A1,N£B29-Adipoylinsulin (Rind) NaA1,N£B29-Pimeloylinsulin (Rind) N°'A1,NEB29-Suberoylinsulin (Rind) N*A1,N€B29-Azelaoylinsulin (Rind) NOtA1,NiB29-Sebacoylinsulin (Rind)	52 32 41 35 100 100 61

Ie A 14 113

-14-

309836/1166

Beispiel 1 y^£B29-0xalylin3ulin (Rind)

Eine Lösung von 64-0 mg (100 u Mol) kristallinem Rinderinsulin und 150 ill Triäthylamin in 75 ml Dimethylsulfoxid wurde unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer lösung von 39.8 mg (120 u Mol) Oxalsäure-bis-p-nitrophenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 4 Stunden versetzt. Die Reaktionslösung stand noch 60 Stunden bei Raumtemperatur und wurde dann zunächst 2 Stunden gegen fließendes Wasser und anschließend zweimal jeweils eine Stunde gegen einen Liter O.05 M Ammoniumbicarbonatlösung dialysiert. Die Lösung wurde mit verdünnter HCl auf pH 4.9 angesäuert, das ausgefallene Protein abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Das feuchte Produkt wurde in 3 ml Eisessig und 17 ml Wasser gelöst und an einer Säule (5 x cm) mit Sephadex G-50 fine in 10 $iger Essigsäure chromatographiert. Das Eluat wurde in 3 Fraktionen (vgl. Fig. 2) viermal gegen je einen Liter dest. Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

Auswaagen	• •	70	mg
Fraktion	1	216	mg
Fraktion	2	• 315	mg
Fraktion	3

(49.3 % d. Th.)

310 mg der Fraktion 3 wurden in 3 ml 1.5 M Essigsäure / 7 M Harnstoff / 0.05 M JiaCl (pH 3.0) gelöst und auf eine Säule (1.5 x 45 cm) mit SE-Sephadex aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war.

Die Elution erfolgte mittels eines linearen Gradienten aus 250 ml Startpuffer und 250 ml Zulaufpuffer, der die

Le A U 113 . -15-

309836/1166

gleiche Zusammensetzung wie der Startpuffer "besaß, jedoch 0.2 M an NaCl war. Das Eluat unter dem Maximum (schraffierter Teil, vgl. Fig. 3) wurde dreimal je eine Stunde gegen einen Liter destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, Der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Säule (3 χ 60 cm) mit Sephadex G-25 in 0.05 M Ammoniuinbicarbonatlösung von restlichem Salz und Harnstoff befreit und das Eluat lyophilisiert.
Ausbeute; 98.2 mg (15 $ d. Th.)

^278 ⁼ 5490 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8.2)

(vgl. Pig. 4). ·

Papierelektrophorese bei pH 2: einheitlich Rj_n (elektrophoretische Beweglichkeit, bezogen auf Insulin) = 0.74

Freie Aminogruppen /(Dansylchloridmethode nach W. R. Gray, Methods in Enzymology Band V\_, 1391 (1967)/: Phenylalanin Oxalylinsulin kristallisiert aus Zinkionen-haltigem Citratpuffer /J. Schlichtkrull, Acta Chem. Scand. _U)» 1455 (1956^7 in Form von kleinen Prismen.

Beispiel 2 N^aA1, N^£B29-Succinylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden innerhalb von 3 Stunden mit 43-2 mg (120 u Mol) Bernsteinsäure-bis-p-nitrophenylester unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Aufarbeitung und Gelchromatographie erfolgten ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. ₅

Auswaagen:	90	mg	3	(64	.2	*	d.	Th
Fraktion 1	105	mg			-1	6-
Fraktion 2	411	mg		098	3	6/	1 1	66
Fraktion 3
Le A 14 113

410 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert und aufgearbeitet. Die Hauptfraktion (schraffiert, vgl. Pig. 3) gab nach der Chromatographie an Sephadex G-25 139. mg (21.7 ⁰Jo d. Th.) Succinylinsulin.

Ep₇₈ = 5540 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8.2) Papierelelctrophorese bei pH 2; einheitlich ^Ei_n3 - °·⁷⁷

Freie Aminogruppen: Phenylalanin
Kristallform: Sphärische Partikel

Beispiel 3 _N ^£B29__{Glutarylin3ulin} (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 44.8 mg (120 u Mol) Glutarsäure-bis-p-nitrophenylester unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Aufarbeitung und Gelchromatographie erfolgten ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben.

Auswaagen:

Fraktion 1 54 mg

Fraktion 2 . 195 mg

Fraktion 3 330 mg (51.6 fo d. Th.)

320 mg- der Fraktion 3 wurden₅ wie bei Beispiel 1 beschrieben₅ an SE-Sephadex chromatographiert und aufgearbeitet₀ Each Entsalzen durch Gelfiltration an Sephadex &-2^_D gefolgt von isoelektrischen Umfallen bei pE 4«8 wur&esi &m© öer-Hauptfraktion (vgl. Pig, 2) 110,3 mg (1?_o? §1 do fho) Glutarylinsulin erhall·an.

Le A 14 113

3 U is ί ;; "J-

= 5400 (in 0.05 K Ammoniumbicarbonatlösung) Papierelektrophorese "bei pH 2: einheitlich

^Rlns - °·⁷⁴

Freie Aminogruppen: Phenylalanin

Kristallform: Verfilzte kleine Nadeln

Beispiel 4 N^¹, N^£B29-Adipoylinsulin (Rind)

a) 1.27 g (200 u Mol) krist. Rinderinsulin wurden in 140 ml Dirnethylsulfoxid in Gegenwart von 0.3 ml Triäthylamin unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer Lösung von 93.2 mg (240 u Mol) Ädipinsäure-bis-p-nitrophenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid versetzt. Nach 60-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung wie bei Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet. Nach der Gelchroma tographie an Sephadex G-50 fine in 10 #iger Essigsäure wurden erhalten:

Fraktion	1	304	mg
Fraktion	2	335	mg
Fraktion	3	587	mg

(46.2 # d. Th.)

580 mg der Fraktion 3 wurden in zwei gleichen Anteilen an SE-Sephadex chromatographiert, wie im Beispiel 1 beschrieben, Die Hauptfraktionen (vgl. Fig. 3) wurden nach der Gefrier trocknung vereinigt und durch Gelfiltration (siehe Beispiel 1) entsalzt.
Ausbeute: 294 mg (23 # d. Th.) Adipoylinsulin

£₂₇g = 5650 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 9.2) Papierelektrophorese bei pH 2: einheitlich

Le A 14 113 ~¹⁸~

309836/1166

Freie Aminogruppe: Phenylalanin

Kristallform: Kleine Nadeln sowie sphärische Partikel

b) Zu einer Lösung von 120 mg (18.7u Mti) krist. Rindsrinsulin in 15 ml Dimethylsulfoxid und 30 p.1 Triäthylemin wurden innerhalb von 2 Stunden 7.8 mg (20 γ. Hol) Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester in 2.5 ml Dimethylaiilfoxid unter Rühren getropft. Anschließend wurden weitere 7.8 mg Ester in 2.5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 1 Stunde zugetropft. Die Reaktionslösung wurde sofort mit Methanol/ Äther versetzt, das ausgefallene Insulinderivat mit Methanol/ Äther (1:9) gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet. Dann wurde in einem Gemisch aus 1 ml Eisessig und 9 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (3 x 200 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10 $iger Essigsäure aufgetragen und chromatographiert. Die Eluate (vgl. Pig. 1) wurden dialysiert und lyophilisiert.

Auswaagen:

Fraktion 1 29 mg

Fraktion 2 14 mg

Fraktion 3 55 mg (45.8 <fo d. Th.)

Beispiel 5 N^£B29-Adipoylinsulin (Schaf)

Zu einer Lösung von 320 mg krist. Schafinsulin ( 50 μ Mol) in 35 ml Dimethylsulfoxid und 75 Ul füriäthylamin wurde unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von 23·3 sg (60 u Mol) Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester in 4 al Dimethylsulfoxid innerhalb von 4 Stunden getropft. Die Eeaktionsmischung

Le A 14 113 -19-

309836/1166

stand noch 48 Stunden bei Raumtemperatur und wurde dann wie in Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde an Sephadex (Säule: 3 x 200 cm) wie in Beispiel 1 chromatographiert.

Auswaagen	• •	88	mg
Fraktion	1	74	mg
Fraktion	2	94	mg
Fraktion	3

(29.4 1o d. Th.)

Die Fraktion 3 enthielt nach der quantitativen Papierelektrophorese 59 fo N⁰^¹, N^£B29-Adipoylinsulin.

Beispiel 6 N*^A1, N^6B29-Pimeloylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 48.2 mg (120 u Mol) Pimelinsäure-bie-p-nitrophenylester unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Nach 44 Stunden wurde die Reaktionsmischung aufgearbeitet und das Rohprodukt chromatographiert.

Auswaagen	:	. 194	mg
Fraktion	1	111	mg
Fraktion	2	288	mg
Fraktion	3

(45 $> d. Th.)

280 mg der Fraktion 3 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert. Das aus der Hauptfraktion (vgl. Abb. 3) isolierte Produkt wurde an Sephadex G-25

entsalzt.

Ausbeute: 132 mg (20.6 fo d. Th.)

£ = 5970 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8.2)

Le A 14 113 ' -20-

309836/1166

84

Elektrophoretisch^ Reinheit: 95

Freie Aminogruppe: Phenylalanin Kristallform: Verfilzte Nadeln

B e"i s ρ i e 1 N^£B29-Suberoylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 49·9 mg (120 u Mol) Korksäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt und nach Stunden aufgearbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben. Uach der Gelfiltration wurden erhalten:

Fraktion 1 137 mg Fraktion 2 122 mg Fraktion 3 331 mg (51.7 <f° d. Th.)

320 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben,, an SE-Sephadex chromatographiert. Die Hauptfraktion (siehe Fig. 3) wurde an Sephadex G-25 entsalzt, anschließend bei pH 4.8 isoelektrisch umgefällt und erneut lyophilisiert. Ausbeute: 138.8 mg (21.6 <fo d. Th.)

E₂-JQ = 5110 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung", pE 8.2) Elektrophoretische Reinheit (pE 2)s 98 $

Freie Aminogruppen: Phenylalanin 'Kristallform: Kleine Nadeln

Le A 14 113

309836/1

Beispiel· 8 Ν*^Α1, N^gB29-Azelaoylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 51.6 mg (120 u Mol) Azelainsäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt, wie "bei Beispiel 1 beschrieben. Nach der Gelfiltration (siehe Pig. 2) wurden erhalten:

Fraktion 1 166 mg
Fraktion 2 121 mg
Fraktion 3 311 mg (48 $> d. Th.)

300 mg der Fraktion 3 wurden an SE-Sephadex chromatographier*> wie bei Beispiel 1 beschrieben. Die Aufarbeitung der Hauptfraktion (vgl. Fig. 3) gab nach dem Entsalzen 134.3 mg Azelaoylinsulin (21 $> d. Th.).

ε _₈ = 6060 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlöeung) Elektrophoretische Reinheit (pH 2): 94 i»

«Ins ■ °·⁷⁷

Freie Aminogruppen: Phenylalanin

Kristallform: Kleine Nadeln

Beispiel 9 N^feB29-Sebacoylinsulin (Rind)

640 mg krist. Rinderinsulin wurden mit 53.3 mg (120 u Mol) Sebacinsäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt, wie bei Beispiel 1 beschrieben„ Abweichend erfolgte die Aufarbeitung so, daß das Reaktionsprodukt nach der Dialyse durch Gefriertrocknung isoliert wurde. Das Rohprodukt wurde in 4 ml Eisessig und 16 ml Wasser gelöst und wie in Beispiel 1 ohromatographiert.

Le A 14 113 . , -22-

30S836/1166

Auswaagen:

Fraktion 1 175 mg

Fraktion 2 143 mg

Fraktion 3 278 mg (43 $> d. Th-)'

270 mg der Fraktion 3 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex ohromatographiert, das Hauptprodukt (vgl.

Fig. 3) wurde an Sephadex G-25 entsalzt.

Ausbeute: 121.2 mg (19 f° d. Th.) E₂₇₈ = 5500

Papierelektrophorese bei pH 2: einheitlich ^EIns = °·⁷⁸

Freie.Aminogruppenr Phenylalanin Kristallform: Kleine Nadeln

Beispiel y^£B29~Sebacoylin3ulin (Schwein)

640 mg krist. Schweineinsulin wurden mit 53·3 mg (120 u Mol) Sebacinsäure-bis-p-nitrophenylester umgesetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 20-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde aufgearbeitet.

Auswaagen nach -der Gelfiltration:

Fraktion 1 190 mg Fraktion 2 139 mg Fraktion 3 280 mg (43.7 # ά. Th.)

Fraktion 3 enthielt nach der quantitatiren ilektroplioretischen Analyse 70 i» Sebacoylinsulin. *

Le A 14 113 . -23-

309838/1166

Beispiel

insulin (Rind)

a) Zu einer Lösung von 640 mg krist. Rinderinsulin in 75 ml Dinethylsulfoxid und 150 ul Triäthylamin wurde unter Rühren bei Raumtemperatur eine lösung von 95.8 mg (120 u Mol) N,N^l-Bis-tert.-butyloxycarbonyl-cystin-2,4,5-trichlorphenylester in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 5 Stunden unter Rühren getropft. Nach 22-stündigem Stehen wurde die Reaktionsmischung,, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde an Sephadex G-50 in 10 #iger Essigsäure chromatographiert.

Auswaagen:

Fraktion a 1 191 mg

Fraktion a 2 132 mg

Fraktion a 3 261 mg (40.8 # d. Th.)

b) Die Reaktion wurde unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 11a) geführt, jedoch unter Verwendung von 110 Ul N-Methylmorpholin als Base.

Auswaagen:

Fraktion b 1 . 206 mg

Fraktion b 2 159 mg Fraktion b 3 272 mg (42.5 1° d. Th.)

250 mg der Fraktion a 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-sephadex aufgetrennt. Die Hauptfraktion wurde durch Chomatographie an Sephadex G-25 entsalzt. Ausbeute: 103.6 mg (16.5 i° d. Th.) E₂ = 5400 (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung, pH 8.2) Papierelektrophorese (bei pH 2): einheitlich

Le A 14 113 -24- 'i '

309836/1166

Freie Aminogruppen: Phenylalanin

Auf gleiche Weise wurden aus 260 mg der Fraktion b 3 91»8 mg (14.3 io d. Th.) (Bis-butyloxycarbonylJ-cystinyl-insulin erhalten.

S₂₇₈ = 5900

Papierelektrophorese(bei pH 2): einheitlich E_Ina = 0.70

Freie Aminogruppe: Phenylalanin

Beispiel 12 N^£B29-Cystinyl·-insulin (Rind)

40 mg N*^A1, N^EB29-(Bis-butyloxycarbonyl)-cystinyl-insulin (Beispiel 11) wurden 15 Stunden im Vakuum über P9O5 u* getrocknet. Dann wurde im Zentrifugenröhrchen mit 0.3 ml Trifluoressigsäure versetzt und die Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Das Protein wurde anschließend mit 10 ml absolutem Äther ausgefällt, der Rückstand abzentrifugiert und mehrfach mit Äther gewaschen.

Ausbeute nach Trocknen im Vakuum über Po°5 ¹^ ^K^H: ^

(ca. 96 $> d. Th.)

£₂„₈ = 556O (in 0.05 M Ammoniumbicarbonatlösung) Elektrophoretische Reinheit (bei pH 2): einheitlich ^Elns=¹·⁰

Ie A 14 113 -25-

309836/1166

220983F

Beispiel 13 ; ,

Darstellung von W₁ N -(N-Benzyloxyoarbonyl)-.glutamyl- inaulin (Rind) -

Zu einer Lösung von 640 mg krist. Rinderinaulin in 75 ml Dimethylsuloxid und 110 ul N-Methylmorpholin wurde innerhalb von 5 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von 62.7 mg (120 u Mol) N-Benzyloxycarbonyl-glutaminsäure-dt» , f-bis-p-nitrophenylester getropft. Nach 22-stündigem Stehen wurde wie in Beispiel 1 aufgearbeitet und anschließend chroma to graphiert.

Auswaagen	• ■ ·	106	mg
Fraktion	1	129	mg
Fraktion	2	257	mg
Pralction	3

(40.2 # d. Th.) ,.

250 mg der Fraktion 3 wurden, wie bei Beispiel 1 beschrieben, an SE-Sephadex chromatographiert. Nach dem Entsalzen duroh Chromatographie an Sephadex G-25 wurden erhalten: 105 mg (16.4 % d. Th.)
Elektrophoretische Reinheit (pH 2): 95 jC

R_Tt,_q = 0.76 . '

Ins

Preie Aminogruppen: Phenylalanin

Le A 14 113 -26- '

309836/1166

OR/Öffy|AL INSPECTED

Claims (4)

1. Patentansprüche

   ifunktionell vernetzte Insulinderivate, in welchen die

   oUAminogruppe von Glycin der Α-Kette mit der £-Amino-

   B29
   gruppe von Lysin ^ der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

   -C-X-C- (I)

   ti H

   O O

   verknüpft ist,

   wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenatoff-' Bindung, eine· aliphatisch^ Kohlenwasserstoffkette mit 1-15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von bifunktionell vernetzten Insulinderivaten, in welchen die ot-Aminogruppe von Glycin der Α-Kette mit der S-Aminogruppe von Lysin ^y der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel

   ti Il

   O 0

   verknüpft ist,

   wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1-15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder

   Le A U 113 ' ■'" -27-

   309836/1166

   nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht,

   dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin mit aktivierten Derivaten von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

   Y-C-X-C-Y

   If tf

   0 0

   (II)

   wobei X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Y für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht, . *

   in polaren organischen Lösungsmitteln oder in Mischung organischer Lösungsmittel mit Wasser, in Gegenwart von Protonenakzeptoren unter Verdünnungsbedingungen umsetzt und die erhaltenen Reaktionsprodukte durch Trennverfahren isoliert, die einmal nach der Molekülgröße und zum anderen nach der Ladung differenzieren.
3. 3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Insulinderivat gemäß Anspruch 1.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von blutzuckersenkenden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulinderivate gemäß Anspruch 1 mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen vermischt.

   Manschen oder Tieren-arppTiziert, die an Diabe" s.

   gemäß Eingab· eingegangen am ..2

   Le A H

   , -28-

   309836/1166

   Leerseite