SU1423000A3

SU1423000A3 - Способ получени пептидов

Info

Publication number: SU1423000A3
Application number: SU843790663A
Authority: SU
Inventors: Болен Питер; Эрнест Бразо Поль; Стефен Эш Фредерик; Чай-Ван Линг Николас; Бьюз Веренберг Вильям; Чарльз Луис Гуйллемин Роджер
Original assignee: Дзе Салк Институт Фор Биолоджикал Стадиз (Фирма)
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1984-08-27
Publication date: 1988-09-07
Also published as: IL72717A0; KR900006560B1; AU577542B2; DK161835C; DK161835B; DE3461641D1; ES535455A0; FI843355A0; EG17263A; FI81589B; NO843381L; HUT35000A; AR248284A1; CS251085B2; GR80227B; AU3244984A; PT79094A; EP0137689B1; JPH0676437B2; EP0137689A1

Abstract

Изобретение касаетс пептидов, в частности соединений общей ф-лы H-tyR-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-ThR-AsN- -SeR-TyR-ARg-Lys- R j-Leu-Gly-GlN-Leu- -Seh-Ala-ARg-Lys-Leu-Leu-GlN-Asp-Ile- -Met-Rjg-ARg-GlN-Gly-Glu-Glu-ARg- . -AsN-GlN-Gly-GlN-Gly-Ala-R -Val-ARg- -Ley-Y, где Y - OH или NH,; R,, j Val или He; - SeR или AsN,- ,- ARg или Lys, которые обладают способностью прокотировать выделение гормона роста, что может быть использовано в ветеринарии. Цель - создание новых более доступных и менее токсичных пептидов. Их синтез ведут из замещенного группой Вое лейцина, который св зывают с метилбензгидрилами- новой смолой (МБГАС) или хлорметили- рованной смолой (из расче-га 1 ммоль аминокислоты на 1 г смолы) в среде хлористого метилена и/или диметил- формамида. Затем удал ют Вос-группу и к полученному Leu-полимеру присоедин ют аминокислоты в необходимой последовательности. Получают пептидную смолу общей ф-лы X,-TyR(X2,)-Ala- -Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-ThR(Xj-AsN-SeR (X5-)-TyR(X2)-ARg(X5)-Lys(,X)-R 5-Leu- -Gly-GlN-Leu-SeR(X4)-Ala-ARg(Xy)- -Lys(Xb)-Leu-Leu-GlN-Asp(X,)-Ile-Met- -Rj(Xd)-ARg(X5)-GlN-Glu-GlN-Gly(X3)- -ARg(X5)-AsN-GlN-Glu(X3)-GlN-Gly- -Ala-R4, (Xy) или Xg - Val-ARgXXs)- Leu-X , где .R ,j , Rje R4, CM. ше, X, - Бос, Хг - 2,6-дихлорбензил, Х,- бензиловый эфир, бензил, тозил, Xg- хлорбензилоксикарбонил; -ОСНд-хлорметилированна смола или NH-МБГАС. В этой смоле отщепл ют защитные группы и полимерный носитель С помощью в хлористом метилене с последующей обработкой HF в при сутствии анизола и/или метилзтилсуль- фида при (-20)-0&deg;С. Новые пептиды в сравнении с природным пептидом РФГРТ(1-44)Ш обеспечивают 70%-ную активность при малой токсичности, причем указанный способ позвол ет получать пептиды, вьщел ющие гормоны роста состава, характерного дл опре- деленного вида животных. СО см

Description

Изобретение относитс к способу получени пептидов - новых биологи- активных соединений, которые могут найти применение в ветеринарии I,

Цель изобретени - повышение доступности соединений пептидной природы , малотоксичных и обладающих свойством стимулировать высвобождение гормона роста гипофизом.

Пример 1. Синтез свиного

Г|Ф (1-44) ОН формулы: Н-гТир-Ала-Асп-Ала-Иле-Фе-Тгр-Асн- -фер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Гли-Глн- - ей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп - ле-Мет-Сер-Арг-Глн-Глу-Гли-Гли- -4рг-Асн-Глн-Глу-Глн-Гли-Ала-Арг-Вал -Дрг-Лей-ОН провод т ступенчато, ис- пбльзу синтезатор пептидов Бекман 990 на хлорметилированной смоле, выпускаемой фирмой Lab.Systems. lac, содержащий 0,9 мэкв С1/г. Осуществ- присоединение БОК-Лей к смоле, пг|и этом замещаетс приблизительно 1моль Лей на 1 г смолы. Все раст в0рители, которые при этом используютс , тщательно дегазируют путем барботировани инертным газом, пред- почтите/гьно гелием, чтобы быть уверенным в отсутствии кислорода, который может приводить к нежелательному ок-ислению серы в Мет-остатке.

После сн ти защиты и нейтрали- за. ции пептидную цепь стро т шаг за шагом на смоле. Св зывание точно провод т в соответствии со схемой, при- Ееденной в таблице.

Дл реакции св зывани 1 ммоль Вос--защищенной аминокислоты в хлористом метилене используетс на 1 г смолы плюс 1 экв 0,5 М дициклогексил карбодегиьшда (ДЦКИ) в хлористом метилене или 30%-ный ДМФ в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Apr св зан, используют смесь 10%-ного к хлористого метилена. Бензил (Бэл) используют в качестве защитной группы гидроксильной боковой цепи Сер и Тгр. 2-хлорбензилоксикар- бошш (2C1-Z) используют в качестве защитной группы боковой цепи Лиз, .Тозил (Tos) используют дл защиты гуанидино-группы Apr и карбоксильна группа Глу или Асп защищена, как беи . зиловый эфир. Фенольна гидроксиль- ка группа Тир защищена 2,6-дихлор- Яензилом. В конце синтеза получают пептидную смолу следующего состава:

o

5

0

3

0

5

U

Х4-Тир(Х2)-Ала-Асп(Х,)-Л.а-Иле- -Фе-Тгр(Х4)-Асн-Сер(Х5)-Тир(Х)-Арг- (Xg)-Лиз(Х)-Вал-Лей-Гли-Глн-Лей- -Сер(X у)-Ала-Арг(Х)-Лиз(X 7)-Лпй- -Лей-Глн-Асп(Х,)-Иле-Мет-Сер(Х5)-Арг- (X 5-) -Гл н- Глн-Гли-.Глу (X, ) -Apr (Х е) - -Асн-Гли-Глу(Х,)-Глн-Гли-Ала-Арг(Хй)- -Вал-Арг(Хб)-Лей-Х5,

где X, Х„

- Вок

25б-дихлорбензил;

Х - бензиловый эфир;

Х4 - Бэл;

Xj - Toe;

XT, -. 2C1-Z;

Xg - -ОгСН,,-бензолполистирол смолистый носитель.

После окончани -остаток Тир СЕЯЗЫ- вают со смолой, Вос-группу удал ют 45%-ной трифторуксусной кислотой в хлористом метилене (ТФУ в ). Дл расщеплени и сн ти защиты с оставшейс защищенной системы пептид- смола, пептид обрабатывают 1,5 йп анизола, 0,25 мп метилзтилсульфида и 10 мл фтористого водорода (HF) на 1 г пептид-смола при -20 С за полчаса и при О С за полчаса. После удалени HF при высоком вакууме остаток смола-пептид промывают попеременно сухим диэтиловым эфиром и хлороформом , и пептид затем экстрагируют дегазированной 2 н. водной уксусной кислотой. При лиофилизации уксуснокислого экстракта получают белый пушистый материал.

Расщепленный, лишенный защиты, пептид затем раствор ют в уксусной кислоте и подвергают мелкозернистой гель-фильтрации, использу фильтр Сефадекс G-50.

Затем пептид дополнительно очищают с помощью СМ-32 карбоксиметилцел- люлозной катионообменной хроматографии (1j8 X 18 CMs - 50 мл) 5 ис- сюльзу вогнутый градиентJ вызываемый введением по капл м 1 л 0,4 М НН40Ац5 рН 6,5 в смешивающую колбу, содержащую 400 мл 0,01 М , рН 4,5, Окончательную очистку провод т,, использу распределительную хроматографию на Сефадексе G-50 с мелкозернис-- тым носителем (Pharmacia) с н-БуОН: ;Э10Н:пиридин:0,2% н. (4:1:7) растворительной системой. Хромато- графические фракции тщательно контролируют тонкослойной хроматографией (т.с.к) и только те фракции, которые

оказывались существенно чистыми, отбирают .

Пептид свиной ГРФ (1-44) (, в 1%-ной уксусной кислоте) - 64,2 i 1, выход 395,2 мг (из 6 г смолы получено 9,5 г пептидной смолы и 395,2 мг пептида).

Синтез повтор ют, использу МБГА смолу, чтобы получить тот же пептид, имекиций амидированный С-край.

Пептид свиной ГРФ (1-44)ОН: ( в 1%-ной уксусной кислоте) - 66,, выход 704,4 мг (из 6 г смолы получено 9,80 г пептидной смолы).

П р и м е р 2. Синтез бычьего ГРФ (1-44) формулы Н-Тир-Ала-Асп-Ала-Иле- Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей- Гли-Глн-Лей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей- Гли-Асп-Иле-Мет-Ас н-Арг-Глн-Глн-Гли- Глу-Арг-Асн-Глн-Глу-Глн-Гли-Ала-Лиз- Вал-Арг-Лей-ЫН,. провод т постадийно с применением пептидного синтезатора Бекмана 990 и 6 г смолы МБГА. Реакцию сочетании Вос-Лей с молекулой этой смолы провод т в течение 2 ч в хлористом метилене с использованием трехкратного избытка Вос-Лей и ОС в качестве активирующего агента, в результате чего происходит замещение приблизительно 0,2-0,6 ммоль Лей на каждый 1 г смолы, св занной амид- ной св зью с аминогруппами смолы МБГА. Все используекые растворители тщательно удал ют барботированием инертным газом, предпочтительнее гелием , с целью обеспечить отсутствие кислорода, который мог бы вызвать нежелательное окисление серы в Мет-ос- татке.

После удалени защитных групп и нейтрализации на молекуле смолы шаг за шагом стро т пептидную цепь. Операции сочетани , удалени защитных групп и нейтрализации провод т как описано в примере 1.

Дл реакции сочетани используют по 1 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене на каждьш 1 г смолы плюс по 1 экв 0,5-М DCC1 в хлористом метилене или 30% ДМФ в хлористом метилене, продолжительность реакции 2 ч. В реакции сочетани аргинина используют смесь 10% ДМФ с хлористым метиленом. В качестве группы, защищающей боковую гид- роксильную группу цепи в молекулах серина и треонина, используют бензин. п боковой цепи лиз ша в качестве

- м .

10

20

25

X, X , - Х4 -

X. X , 423000

защитной группы используют 2-х-мор- бензилоксикарбонил. Тозил используют в качестве защитной группы гуанидиновой группы аргинина, а карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот защищают в виде BZl-эфИуа. Фенольную гидроксиль- нvю группу тирозина защищают 2,6-ди- хлорбензилом. По завершении синтеза пол чают продукт следующего с оста . а:

X,-Тир(Хг)-Ала-Асп(X,)-Ала-Иле- Фен-Тре(Х4)-Амн-Сер(Ху)-Тир (Х,)- Apr(Хб)-Лиз(XT)-Вал-Лей-Гли-Глн-Лей- 15 Сер(Х5-)-Ала-Арг(Х)-Лиз(Х7)-Лей-Лей- Глн-Асп (Хэ ) -Иле-Мет-Асп-Асн-Арг (Х,) - Глн-Глн-Гли-Глу(Х,)-Арг(Хб)-Асн-Глн- Глу(Х,)-Глн-Гли-Ала-Лиз(Х)-Вал-Арг- (Х)-Лей-Н-МБГА-полистирольный полимерный субстрат, где X i - Вос

2,6-дихлорбензил;

бензиловый эфир/

BZ1;

BZl;

Tos;

2C1-Z.

После конечного сочетани остатка тирозина с молекулой смолы Нос-группу удал ют с использованием 45%-ного ТГФ в хлористом метилене с получением 19,4 г системы пептид-смола. С целью отщеплени и удалени блокирующих групп от защищенной системы пептид- смола 10 г этой последней обрабатывают 10 МП анизола 2,5 мп метилэтил- сульфида и 90 мл фтористого водорода при температаре -20°С в течение получаса и при температуре О С в течение также получаса. После удалени фтористого водорода в глубоком вакууме смоло-пептидный остаток промывают попеременно сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют дегазированным водным 2 н. раствором уксусной кислоты. В результате лиофилизации уксуснокис- лотного экстракта получают белый рыхлый мат ериал.

Далее отщепленный и освобожденный от защитных групп пептид раствор ют в 30%-ной уксусной кислоте и подвергают фильтрованию с использованием тонкодисперсного гел Сефадекс С-50.

Затем пептид подвергают дальнейшей очистке катионообменной хроматографией с использованием карбоксиметил- целлкшозы СМ-32 (1,8 х 18 см; объем сло 50 мп) с применением вогнутого

30

35

40

45

50

55

градиента.который создают прикапы- BfiHiieM 1 л 0,4 М раствора ацетата а.мони с величиной рН, равной 6,5, в Смесительную колбу, в которой со- д4ржитс 400 мл 0,01М раствора азота аммони при величине рН,-равной 4,5. Кс|нечную очистку провод т с применением распределительной хроматографи- чёской обработки на тонкодисперсной пс|дложке Сефадекс С-50 (Pharmacia) с :помощью растворйтельной смеси н-бу- та)нола с этанолом, пиридином и О, 2% н. ук|сусной кислотой в соотношении 4:1: :1j:7. Хроматографические фракции тщательно провер ют тонкослойным жидкостным хроматографическим анали- 3OJM, объедин только те фракции, ко- тфые характеризуютс существенной ст1епенью чистоты.

Выход бычьего ГРФ (1-44) NH, 2dl мг (из 3 г смолы), Ы (, в уксусной кислоте) -64,0нн1.

г Использу , хлорметилированную смо- л, получают бычий ГРФ (1-44) ОН с вьЬсодом 128 мг (из 1 г смолы ), Cot-lj, (CJ™1, B уксусной кислоте -64,0+1.

П р и м е р 3. Синтез овечьего ГРФ (1-44) ЫН„ формулы:

3;

Н-Тир-Ала-Асп-Ала-11пе-Фе-Тр-Асн-Сер- Тир-Лрг-Лиз-Иле-Лей-Гли-Гли-Лей-Сер- Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-Мет- Асп-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-Арг-Асн-Глн - Глу-Глн-Гли-Ала-Ли з-Вал-Арг-Лей-Ш провод т ступенчато, использу синтезатор марки Бекман 990 и МБГА смолу , как указывалось в примере 2. В .конце синтеза получают пептидную смолу следующего состава: Q

X,-Тир(XJ)-Ала-Асп(X,)-Ала-Иле-Фе- Тгр(Х4)-Асн-Сер(Х5)-Тир(Х)-Арг(Хб)- Лиз(XY)-Иле-Лей-Гли-Глн-Лей-Сер(Хр)- Ала-Арг (Хб) -Лиз (Х) -Лей-Лей-Глн-Асп

системы пептид-смола провод т как указывалось в примере 2. Расшепленньй и лишенный защиты пептид раствор ют g в 30%-ной уксусной кислоте, подвергают мелкозернистой гель-фильтрации с помощью Сефадекс G-50, катионообмен- ной хроматографии и в заключение распределительной хроматографии, как

10 указывалось в примере 1.

Выход овечьего ГРФ (1-44) NHj 197 мг (исход из 3 г смолы), Ы- (, в 1%-ной уксусной кислоте) -62,.

15 Синтез повтор ют, использу хлорметилированную смолу, чтобы получить такой же пептид, имеющий свободный кислотный С-край, следу процеду°рр. описанной в примере 1.

20 Выход овечьего ГРФ (1-44) ОН 186 мг (исход из 1 г смолы) . (С 1, в 1%-ной уксусной кислоте) -64,.

Проведены биологические испыта26 НИН синтезированных пептидов,

Определена эффективность этих пептидов при освобождении гормона роста в анализах in vitro. Опыты проводились с гипофизарной клеткой. Исполь30 зуемые культуры включают клетки гипофиза крысы, удаленного предварительно за 4 или 5 дней. Инкубацию с веществом, подлежащим испытанию, провод т в течение 3-4 ч и аликвоты культуральной среды удал ют обрабатывают таким образом, чтобы измерить содержание в иммунореактивном ГР с помощью хорошо разрешимого радиоим- г-гуноанализа. Результаты этих сравнительных испытаний показьшают, что в эквимолйрных отношени х пептид:

I свиной ГРФ (1-44) NHo, где

. Вал; Rjg Cepj R4, Apr, имеет внутреннюю биологическую активность

(Хз)-Иле-Мет-Асн-Арг(Х,)-Глн-Глн-Гли- природного пептида РФГРГ (1-44) NH2.

Глу(Х,)-Арг(Хе)-Асн-Глн-Глу(Х,,)-Глн- Гли /ша-Лиз(Х7)-Вал-Арг(Х,)-Лей-Х 8 где X, - Бок ,

Х - 2,6-дихлорбензил,

Х - сложный бензиловый эфир,

Х - Бэл;

Xj, - Бэл 5

Х - Тос$

Х - 2C1-Z,

Х„ - NH-MBfA смолистый носитель

о

После завершени синтеза остаток j np соедин ют со смолой, Бок-группу /дал ют 45% ТФУ в .-Расщепление .i сн тие защиты оставшейс защищенной

II бычьей ГРФ (1-44) R,

NH

г

где

R,- Бал; R2B Асн; R4i - Лиз, и NH.

III

овечьего ГРФ (1-44) NH, где R,j- Иле; Rjg- Леи; R41 Лиз, имеют активность составл ющую 70% от активности природного пеп - да РФГРГ (1-44) NH.

Способы относ тс к малотоксичным веществам.

Испытани пептидов в кислой форме показали, что они обладают близкой биологической активностью.

Проведенные опыты in vivo подтвердили , что пептиды, полученные в услови х описываемого способа, могут

I свиной ГРФ (1-44) NHo, где

природного пептида РФГРГ (1-44) NH2.

II бычьей ГРФ (1-44) R,

NH

г

где

R,- Бал; R2B Асн; R4i - Лиз, и NH.

III

7 1

быть отнесены к категории малоток- сичных соединеннй.

Предлагаемый способ позвол ет получать новые биологически активные соединени - близкие аналоги по структуре и действию к природным соединени м, но более доступные. Синтез таких соединений позвол ет получать пептиды .с последовательностью аминокислот фактора, высвобождающего гормон роста, состава, характерного дл определенных видов животных.

Таким образом, осуществление пред- лагаемого способа делает доступным синтетические варианты природных гормонов , что позвол ет вводить в организм разных животных соответствующие их виду синтетические гормоны дл достижени конкретньк целей.

Claims

Формула изобретени

Способ получени пептидов общей формулы I

H-TyR-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-ThR-AsN- SeR-TyR-ARg-Lys-R,,-Leu-Cly-GlN-Leu- SeR-Ala-ARg-Lys-Leu-Leu-GlN-Asp-Ile- Met-R,e-ARg-GlN-Gly-Glu-Glu-ARg-AsN- GlN-Gly-GlN-Gly-Ala-R -Val-ARg-Ley-Y

где Y - ОН или NHj-, R,, - Val или lie , 16 SeR или AsN; R4, - ARg или Lys,

5 0

5

0

5

) i8

о т л I ч a ю щ и и с тем, что |ВВид т во в:5П 1модействие I ммоль BOC-LOU с 1 г МКГА или хлорметилиро- вашюй смолы в хлор1- стом метилене, HJII диметилформамиде, или их смеси, удал ют Бос- защиту и к полученному Leii-полимеру присоедин ют оставщиес аминокислоты в последовательности, отвечающей общей формуле I, полученное соединение общей формулы II X,-TyR(X)-Ala-Asp-(Xj)-Ala-Ile-Phe- ThR(X4)-AsN-SeR(X5)-TyR(X)-ARg(X5)- Lys(X4)-R,,-Leu-Gly-GlN-Leu-SeR(X4)- Ala-ARg(X )-Lys(Xg)-Leu-Leu-GlN-Asp (X,)-ile-Met-Rae(X4)-ARg(X)-GlN-GlN- Giy-Glu(X3)-ARg(X5.)-AsN-GlN-Glu(X,)- GlN-Gly-Ala R4,(X5 или X) - Val-ARg (X,) - Leu-X, где X, - Бос;

X - 2,6-дихлорбензил,

X - бензиловьш эфир;

Хд - бензил,

Х - тозил;

Xfi - хлорбензилоксикарбонил,

Ху - хлорметилированна

смола, ННМБГА

деблокируют и отщепл ют полимер-носитель с использованием трифторуксусной кислоты в хлористом метилене с последующей обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии анизола, метилэтилсульфида или их смеси при О - 20 С.

Приоритет по признакам:

29.08.83 при R,,j- Val; SeR; R, - ARg.

12.10.83при R,, - Val; AsN; R4, - Lys.

02.03.84при R,,- lie; - R ,2g- AsN; R4, - Lys.

+ 5%-ный 1,2-этандитиол в CHjClj

(1 раз)0,5

50%-на трифторуксусна кислота +

+ 5% 1,2-этандитиол в

(1 раз)20

CHjCl промьшка (3 раза)0,5

CH.jOH промывка (2 раза)0,5

AsN; R4, - Lys.

- R ,2g- AsN; R4, - Lys.