CS251085B2

CS251085B2 - Method of peptides production liberating growth hormone

Info

Publication number: CS251085B2
Application number: CS846453A
Authority: CS
Inventors: Peter Bohlen; Paul E Brazeau; Frederick S Esch; Nicholas Chain-Kwan Ling; William B Wehrenberg; Roger Ch L Guillemin
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1984-08-27
Publication date: 1987-06-11
Also published as: IL72717A0; IE57730B1; FI843355L; NO843381L; DE3461641D1; DK161835B; SU1423000A3; IE842199L; FI81589B; PT79094B; NO167867B; FI843355A0; IL72717A; HU190973B; GR80227B; DK413084A; DK161835C; AU577542B2; YU45907B; EP0137689B1

Description

Vynález se týká způsobu výroby peptidů, které mají vliv na funkci hypofýzy u savců. Běží zejména o peptidy, které podporují uvolňování růstového hormonu hypofýzou a které jsou zvláště vhodné pro použití u některých živočišných druhů.

V roce 1982 byl izolován z nádoru Langerhansových ostrůvků hypothalamlcký faktor, uvolňující růstový hormon z hypofýzi. Tato látka byla čištěna a charakterizována a syntetizována. Při biologických zkouškách bylo prokázáno, že sloučenina uvolňuje růstový hormon (GP!) z hypofýzy. Tento· peptid má následující sled:

H—T^ir—A^ia—Asp—A^—Ile—Phe—T^ir— —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Val—Leu— —Gly—Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Ser—Asn— —Glu—Glu—Arg—Gly—Ala—Arg—Ala— —Arg—Leu—NH2.

Lidský hypothalmický faktor, zvolňující růstový hormon z hypofýzy (hGRFJ má, jak bylo nyní prokázáno, stejnou strukturu [Bohlen a další, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 114, 3, str. 930 až 936 (1983]].

Nyní byly izolovány peptidy o 44 zbytcích z čištěných extraktů hypothalmů vepřů, hovězího dobytka, koz nebo ovcí a tyto látky byly také charakterizovány. Bylo prokázáno, že každá z nich se od druhých podobných látek liší v několika zbytcích aminokyselin, všechny sloučeniny se liší stejným způsobem také od hGRF.

V případě, že se GRF vepře vyjádří jako hGRF, má tento peptid (pGRF) jako jeho analog · následující složení: jde o analog [Arg34, Gin³⁸, Val⁴²]:

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr-Arg—Lys—Val—Leu— —Gly—Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys·— —Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn— —Gln—Glu—Gln—Gly—Ala—Arg—Val— —Arg—Leu—NH2.

Tato látka bude dále uváděna jako pGRF čili somatocrinin vepře. Tento peptid je možno· užít k podpoře růstu u teplokrevných živočichů, zejména selat nebo i u studenokrevných živočichů pro zemědělské účely.

Pokud jde o analogickou látku u skotu, je příslušný peptid (bGRF] možno popsat jako následující analog hGRF:

[Ans2⁸, Arg^3,4, Gin³⁸, Lys4i, Val⁴2]-hGRF (1-44J-NH2 a je možno· jej vyjádřit vzorcem —H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe— —Thr—Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Val— —Leu—Gly—Gln—Leu—Ser—Ala—Arg— —Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met— —Asn—Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg— , —Asn—Gln—Glu—Gln—Gly—Ala—Lys— —Val—Arg—Leu—NH2.

Dále bude tato· látka nazývána bGRF, čili somatocrinin skotu. Kozí GRF má tentýž vzorec a je možno · jej užít k podpoře růstu teplokrevných živočichů, zejména skotu a studenokrevných živočichů v zemědělství. Je možno jej užít rovněž ke zvýšení produkce mléka u krav· a koz ke získání mléka pro výrobu speciálních sýrů.

Vyjádřeno jako analog hGRF je možno znázornit ovčí GRF [oGRFJ takto:

[Ilei3, Asn28, Arg34, Gln3⁸, Lys4i, VaP²]-hGRF-(l-44)-NH2, celý vzorec je tedy:

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Ile—Leu— —Gly—Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Asn— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn— —Gln—Glu—Gln—Gly—Ala—Lys—Val— —Arg—Leu—NH2.

Dále bude tato látka uváděna jako ovčí somatocrinin (oGRFJ. Tento peptid je možno užít k podpoře růstu u teplokrevných živočichů, zejména ovcí nebo k podpoře růstu studenokrevných živočichů v zemědělství. Je také možno jej užít ke zvýšení produkce mléka u ovcí za účelem získání vyššího množství mléka pro výrobu speciálních sýrů.

Veterinární prostředky, sloužící uvedeným účelům budou obsahovat buď pGRF, bGRF nebo oGRF nebo· analogy těchto látek nebo jejich biologicky aktivní fragmenty nebo také jejich netoxické soli, dispergované v· pevném nebo, kapalném, z farmaceutického nebo· veterinárního hlediska, přijatelném nosiči. Tyto prostředky je možno užít v klinickém lékařství, jak lidském, tak veterinárním pro krátkodobé i dlouhodobé podávání pro diagnostické i léčebné účely. Mimoto je možno je užít ke zrychlení růstu svalové hmoty a/nebo· produkce mléka u selat, skotu, koz, ovcí nebo jiných živočichů.

Názvosloví, které se užívá při charakterizaci peptidů bylo· shrnuto v publikaci Schroder <a Lubke, „The Peptides“, Academie Press (1965), kde ve shodě s běžnými zvyklostmi se aminokyselina na N-terminálním zakončení nachází na levé straně a karboxylové skupina na C-terminálním zakončení se nachází na pravé straně molekuly peptidů. V případě, že zbytek aminokyseliny má isoterní formu, pokládá se za tuto formu vždy zbytek L-aminokyseliny, není-li výslovně uvedeno jinak.

Předmětem vynálezu je způsob výroby

6 peptidů, uvolňujících růstový hormon z hypofýzy, obecného vzorce I

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr — —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Ri3—Leu— —Gly—Gla—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—R2S— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn— —Gin-· G.’:-Gin-—Gly-All^i—R1-^hil—Aru—Leu—Y kde

R13 znamená Val nebo Ile,

Rž8 znamená Ser nebo Asn, R41 znamená Arg nebo Lys a

Y znamená hydroxylovou skupinu nebo aminoskupinu, · vyznačující se tím, že se

a) vytvoří sloučenina s alespoň j-ednou ochrannou skupinou, kterou je možno vyjádřit obecným vzorcem II

Xi—Tyr[X²) — Ala—Asp(X³) — Ala—Ile— —Phe—Thr (χ4) — Asn—Ser (X⁵) —Tyr (X²) — —Arg(X⁶ ] —Lys (X⁷ )—R13—Leu—Gly—Gln— —Leu—Ser (X5) — Ala—Arg (X⁶)—Lys{ X7) — —Leu—Leu—Gln—Asp (X³ )—Ile—Met— —R28(X5)—Arg(X⁶)—Gln--Gln—Gly— —Glu(X³)~Arg(X®)—Asn—Gln—Glu(X6) — —Asn—Gln—Glu(X³)—Gln—Gly—Ala— —R4i(X^e) nebo· (X7J— Val—Arg(X^tí) — leu— —X8 kde

Xi znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na α-aminoskupině, s výhodou Boc,

X‘2 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu fenolové hydroxylové skupiny Tyr, s výhodou 2,6-dichlorbenzylovou skupinu,

X³ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na karboxylové skupině Asp nebo Glu, s výhodou Bzl,

X4 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro alkoholovou hydroxylovou skupinu Thr, s výhodou Bzl,

X⁵ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro alkoholovou hydroxylovou skupinu Ser, s výhodou Bzl,

X⁶ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro guanidoskupinu .Arg, s výhodou. Tos,

R⁷ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu aminoskupiny postranního řetězce Lys, s výhodou 2-chlorbenzyloxykarbonylovou skupinu,

X8 znamená —O—CH2—pryskyřice nebo —NH—pryskyřice, tak, že se naváže postupně každá aminokyselina vždy v poměru 1 mmol chráněné aminokyseliny na 1 g pryskyřice ve vhodném rozpouštědle, s výhodou methylenchloridu nebo dimethylformamidu nebo ve směsi těchto rozpouštědel, načež se bj odštěpí ochranná skupina a výsledná látka se odštěpí od pryskyřice působením kyseliny triflueroctové ve vhodném rozpouštědle, s výhodou methylendichloridu s následným působením fluorovodíku a tanisolu nebo methylethylsulfidu nebo směsi těchto látek pří nízké teplotě, s výhodou 0 až —20 stupňů Celsia, načež se výsledná látka rozpustí ve vhodném rozpouštědle, s výhodou v kyselině octové a popřípadě se čistí.

Způsob výroby peptidů na pevné fázi je uveden v učebnici „Solid-Phase, Peptide Synthesis“, Steward and Young, Freeman and Company, san Francisco, 1969, způsob je uveden také v US patentovém spisu číslo 4 105 603 z 8. srpna 1978.

Při běžných způsobech vazby je obvyklé chránit labilní postranní řetězce různých aminoskupin vhodnými ochrannými skupinami k zábraně chemické reakce v tomto místě až do odstranění příslušné ochranné skupiny. Obvyklá je také ochrana a-aminoskupiny na aminokyselině nebo jejím fragmentu při reakci karboxylové skupiny, ochranná skupina se pak selektivně odstraní k umožnění následující reakce v tomto místě. Je také obvyklé získat v jednom ze stupňů syntézy meziprodukt, který obsahuje již všechny zbytky aminokyselin v požadované poloze s ochrannými skupinami, které jsou navázány na zbytky svrchu uvedených typů.

Do oboru vynálezu spadají meziprodukty, které je možno vyjádřit následujícím obecným vzorcem:

X1—Tyr (X² {—Ala—Asp (X3 J — Ala—Ile— —Phe—Thr (X4J—Asn—Ser (X5J —Tyr (X²J — —Arg (X⁶) —Lys (X7 j —R13—Leu—Gly—Gln— —Leu—Ser (X5)—Ala—Arg (X⁶)—Lys(X7) — —Leu—Leu—Gln—Asp{X³)—Ile—Met—· —R28(X5)—Arg(X* )—Gln— Gin—Gly— —Glu ( X³)—Arg (X® )—Asn—Gln—Glu (X³ )— —Gln—Gly—Ala—Rdi(X⁶ nebo X7)—Val— —ArgJX^J—Leu—X⁸ kde

X1 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na α-aminoskupině. Touto ochrannou skupinou může být jakákoliv z běžně užívaných ochranných skupin při postupné syntéze peptidů, a to zejména

1) ochranné skupiny acylového typu, například formyl, trifluoracetyl, ftalyl, toluensulfonyl (Tos), benzensulfonyl, nitrofenylsulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitrofenoxyacetyl, chloracetyl, acetyl a gamma-chlorbutyryl,

2) aromatické ochranné skupiny typu uretanu, například benzyloxykarbonyl (Z), popřípadě substituovaný, například p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykiarbo251085 nyl, p-brombenzyloxykarbonyl, p-methoxybenzyloxykarbonyl,

3) ochranné skupiny typu alifatického uretanu, například terc.butyloxykarbonyl (BOC), diisopropylmethyoxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl, ethoxykarbonyl, allyloxykarbonyl,

4) ochranné skupiny typu cykloalkylurethanu, například cyklopentyloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl a cyklohexyloxykarbonyl,

5) ochranné skupiny typu thiourethanu, například fenylthiokarbonyl,

6) ochranné skupiny alkylového· typu, například trifenylmethyl (trityl) nebo benzyl,

7) trialkylsilanové skupiny, například trimethylsilan.

Výhodnou ochrannou skupinou na a-arnl·· noskupině je BOC.

X² znamená ochrannou skupinu pro fenolovou hydroxylovou skupinu Tyr, která se volí ze skupiny tetrahydropyranyl, terc.butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ a 2,6-dichlorbenzyl. X² může také znamenat atom vodíku, což znamená, že nebylo užito žádné ochranné skupiny na hydroxylové skupině.

χ3 znamená atom vodíku nebo· ochrannou skupinu, tvořící ester s karbonylovou skupinou Asp nebo Glu, jde o skupinu Bzl, 2,6-dichlorbenzyl, methyl nebo ethyl.

χ4 a X⁵ znamenají ochranné skupiny pro hydroxylovou skupinu Thr a Ser a běží například o acetyl, benzoyl, Terč, butyl, trityl, tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-dichIorbenzyl a CBZ. Výhodnou ochrannou skupinou v tomto případě je Bzl. χ4 a/nebo χ5 mohou také znamenat atom vodíku, což znamená, že nebylo· užito žádné ochranné skupiny pro hydroxylovou skupinu.

χ5 znamená ochrannou skupinu pro guanidinovou skupinu Arg. Jde například o nitroskupinu, Tos, CBZ, adamantylkarbonyl a BOC, nebo o· atom vodíku.

χ7 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na postranním řetězci aminoskupiny Lys. Jde například o 2-chlorbenzyloxykarbonyl, (2-C1-Z), Tos, CBZ, terč, amyloxykarbonyl nebo o BOC.

Volba ochranné skupiny na postranním řetězci není kritická, musí pouze jít o skupinu, která není odstraňována v průběhu odštěpení ochranné skupiny na a-aminoskupině, což také znamená, že obě ochranné skupiny nemohou být totožné.

Jako ochrannou skupinu na amidoskupině postranního řetězce Gin a/nebo- Asn je v některých případech také možno použít xanthylové skupiny (Xan).

X⁸ znamená hydroxyskupinu, skupinu

OCH3, zbytek esteru, amidu, hydrazidu, —OCH2— pryskyřici jako podložku nebo —NH—pryskyřici jako podložku, přičemž jako další ochranné skupiny padají v úvahu i ostatní skupiny s výjimkou hydroxylové skupiny a amidoskupiny.

V obecném vzorci meziproduktu znamená alespoň jeden ze symbolů X¹, Xz, X3, X⁴, X5, X⁶, X7 a X8 ochrannou skupinu.

Při volbě ochranné skupiny pro· postranní řetězec při syntéze polypeptidů je nutno zachovat následující pravidla:

a) ochranná skupina má být stálá k reakčnímu činidlu a za reakčních podmínek, zvolených pro odstranění ochranné skupiny na α-aminoskupině v kterémkoliv stupni syntézy,

b) ochranná skupina si má uchovat své ochranné vlastnosti a nemá být odštěpena při syntéze peptidu a

c) ochrannou skupinou postranního řetězce má být možno odstranit po· získání požadovaného sledu aminokyselin za reakčních podmínek, které nenaruší peptidový řetězec.

Peptidy je možno s výhodou získat syntézou na pevné fázi, tak jak byla popsána v publikaci Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, str. 2 149 [ 1963), i když je možno užít také jiných svrchu uvedených postupů. Syntéza na pevné fázi začíná na C-terminálním zakončení peptidu navázáním chráněné «-aminokyseliny na vhodnou pryskyřici. Výchozí materiál tohoto typu je možno připravit tak, že se naváže Leu s chráněnou a-aminoskupinou na chlormethylovanou pryskyřici nebo hydroxymethylovanou pryskyřici nebo amidovou vazbou na pryskyřici BHA nebo MBHA. Výroba hydroxymethylované pryskyřice je popsána v publikaci Bodansky a další, Chem. Ind. (Londýn) 38, 1 597 až 1598 (1966). Chlormethylované pryskyřice se běžně dodávají (Bio Rad Laboratories, Richmond, Californi-a a Lab. Systems, lne.). Výroba těchto pryskyřic je popsána v publikaci Stewart a další, „Solid Phase Peptide Synthesis“, Freeman and Co., San Francisco 1969, Kapitola 1, strana 1 až 6. Pryskyřice BHA a MBHA se běžně dodávají ia jsou používány pouze v těch případech, kdy má být požadovaný polypeptid syntetizován jako a-karboxamid na C-terminálním zakončení.

Leu s ochrannou skupinou BOC se váže na chlormethylovanou pryskyřici způsobem, popsaným v publikaci Monahan a Gilon, Biopolymer 12, strana 2 513 až 2 519, 1973 v případě, že je například požadována syntéza peptidu o 44 aminokyselinách s volnou karboxylovou skupinou na C--erminálním konci molekuly. Po vazbě BOC-Leu se ochranná skupina na α-aminoskupině odstraní například použitím kyseliny trifluoroctové (TFA) v methylenchloridu, samotné kyseliny trifluoroctové nebo kyseliny ’ chlorovodíkové v dioxanu. Odstranění ochranných skupin je možno provést při teplotě v. rozmezí 0 °C a teplotou místnosti. Je také možno použít dal251085 ších způsobů a podmínek pro specifické odštěpení ochranných skupin na a-aminoskupině, jak bylo· popsáno v publikaci Schroder a Lubke „The Peptides“, 1, str. 72 až 75 (Academie Press 196f5).

Po odstranění ochranné skupiny na a-aminoskupině Leu je možno· postupně navázat zbývající aminoskupinu s chráněnou a-aminoskupinou a s chráněným postranním řetězcem navzájem před jejich přidáním k pevné fázi. Volba vhodného činidla je snadná a provede ji každý odborník. Zvláště vhodným činidlem pro toto použití je N,N‘-dicyklohexylkarbodiimid (DCCIj.

Aktivační činidla, použitelná pro tento· účel jsou v oboru dobře známa. Jde například o činidla z následujících skupin:

lj Karbodiimidy, například N,N‘-diisopropylkarbodiimid, N,N‘-dicyklohexylkarbodiimid (DCCIJ,

2) kyanamidy, například N,N‘-dibenzylkyanamid,

3) keteniminy,

4) isoxazolinové soli, například N-ethyl-5-fenylisoxazolium-3‘-sulfonát,

5) monocyklické heterocyklické amidy aromatické povahy s obsahem dusíku a jeden až tří atomů dusíku v kruhu, například imidazolidy, pyrazolidy a 1,2,4-triazolidy. Specifickými heterocyklickými amidy vhodnými pro· toto použití jsou N,N‘-karbonyldiimidazol, N,N‘-karbonyl-di-l,2,4-triazol,

6) alkoxylovaný acetylén, například ethoxyacetylén,

7) reakční činidLa, která vytvářejí směsné anhydridy s karboxylovou skupinou aminokyseliny, například ethylchlormravenčan nebo isobutylchlormravenčan a

8) reakční činidla, která tvoří aktivní estery s karboxylovou skupinou aminokyseliny, například dusíkaté heterocykly s hydroxylovou skupinou na jednom dusíkovém atomu kruhu, například jde o N-hydroxyftalimid, N-hydroxysukcinimid a 1-hydroxybenzotriazol (HOBT).

Další použitelná aktivační činidla a jejich použití při výrobě peptidů postupnou vazbou jsou popsána v publikaci Schrodera a Lubkeho, tak jak byla svrchu uvedena, Kapitola III a v· publikaci Kapoor J., Phar. Sci. 59, strana 1 až 27 (1970).

Každá chráněná aminokyselina je přiváděna do reaktoru pro vazbu peptidu na pevné fázi ve dvojnásobném nebo vyšším přebytku a vazba se provádí v· prostředí dimethylformamidu (DMF) a methylendichloridu v poměru 1: 1 v samotném dimethylformamidu nebo methylendichloridu. V případě, že dojde k neúplné vazbě se vazba opakuje před odstraněním ochranné skupiny na a-amlnoskupině a před vazbou následující aminokyseliny. Úspěch vazby v každém stupni je možno sledovat ninhydrinovou reakcí, tak jak byla popsána v publikaci E. Kaiser a další, Anal. Biochem. 34, 595 (1970).

Po navázání požadovaného sledu aminokyselin se meziprodukt odstraní z pryskyřice, která byla použita jako pevná podložka reakčním činidlem, například kapalným fluorovodíkem, čímž nejen dojde k odštěpení peptidu z pryskyřice, nýbrž také dochází k odštěpení všech zbývajících ochranných skupin na postranních řetězcích (skupiny χ2, χ3, χ4, χ5, χϋ, χ7 д za získání výsledného peptidu.

Je také možno postupovat tak, že se výsledný peptid odstraní z pryskyřice jako z podložky alkoholýzou a po této reakci se takto· získaný C-terminální alkylester převede hydrolýzou na kyselinu, jakékoliv ochranné skupiny na postranních řetězcích je pak možno odstranit svrchu uvedenými známými postupy nebo dalšími postupy, které jsou rovněž známy, například katalytickou redukcí například při použití paládia nebo· síranu barnatého. V případě, že se k odštěpení užije fluorovodíku, užije se v reakční směsi současně také anisol a methylethylsulfiů k vazbě vedlejších zplodin.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které objasňují syntézu GRF na pevné fázi.

Příklad 1

Syntéza volného pGRF(l-44) vzorce

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—I.le—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr—Lys—Val—Leu—Gly— —Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu— —Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg— —Gln—Gl-n—Gly—Glu—Arg—Asn—Gln— —Glu—Gln—Gly—Ala—Arg—Val—Arg— —Leu—OH se provádí postupně při použití zařízení pro syntézu peptidů z aminokyselin (Beckman 990 Peptide Synthesizer) na chlormethylové pryskyřici běžně dodávané z Lab Systems, lne., s obsahem 0,9 Meq Cl/g. Navázání BOC-Leu na pryskyřici se provádí tak, že se postupuje podle publikace Monahan a další, Biopolymers, sv. 12 (1973), str. 2 513 až 2 519, výsledkem je substituce přibližně 0,22 mmol Leu na 1 g pryskyřice. Všechna použitá rozpouštědla se pečlivě zbaví plynů průchodem inertního plynu, s výhodou hélia, aby byla zajištěna přítomnost kyslíku, který by mohl způsobit nežádoucí oxidaci síry ve zbytku aminokyseliny Met.

Po odstranění ochranných skupin a neutralizaci se postupně buduje na pryskyřici peptidový řetězec. Odstraňování ochranných skupin, neutralizace a přidání každé další aminokyseliny se zásadně provádí způsobem podle Guillemina a dalších, US patentový spis č. 3 904 594. Vazba se specificky provádí podle následujícího schématu A:

A reakční činidlo· a postupy doba míšení v min.

dvojnásobné promytí methylen- 0,5 dichloridem lkrát promytí 50% kyselinou 0,5 trifluoroctovou (TFA) + 5%

1,2-ethandithiolem v methylendichloridu lkrát promytí 50% kyselinou 20,0 trifluoroctovou (TFA} + 5%

1,2-ethandithiolem v methylendichloridu trojnásobné promytí methylen- 0,5 dichloridem dvojnásobné promytí methano- 0,5 lem dvojnásobná neutralizace 10% 0,5 triethylaminem (Et3N) v methylendichloridu dvojnásobné promytí methano 0,5 lem dvojnásobná neutralizace 10% 0,5 triethylaminem (Et3N) v methylendichloridu dvojnásobné promytí metha- 0,5 nolem dvojnásobné promytí methylen- 0,5 dichloridem _w přívod aminokyseliny *Boc 120 (1 mmol/g pryskyřice) + ekvivalentní množství dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v methylendichloridu jedenkrát promytí methylen- 0.5 dichloridem dvojnásobné promytí 50% 0,5 dimethylformamidem v methylendichloridu jedenkrát promytí 10% trie- 0,5 thylaminem (EtsN) v methylendichloridu dvojnásobné promytí metha- 0,5 nolem dvojnásobné promytí methylen- 0,5 dichloridem nanesení 25% anhydridu ky- 20,0 seliny octové v methylendichloridu v množství 2 ml/g pryskyřice ?'5 1 Ο δ 5 stupeň reakční činidlo a postupy doba míšení v min.

dvojnásobné promytí methy- 0,5 lendichloridem dvojnásobné promytí metha- 0,5 nolem *Přl vazbě Asn a Gin se v tomto stupni užije zotriazolu (HOBt)

K vazbě se užije 1 mmol BOC-chráněné aminokyseliny v methylenchloridu na 1 g pryskyřice a současně 1 ekvivalent 0,5M DGCI v methylenchloridu nebo 30·% DMF v methylenchloridu na 2 hodiny. V případě vazby Arg se užije směs 10% dimethylformamidu a methylenchloridu. Pro postranní řetězec laminokyseliny Ser a Rhr s hydroxylovou skupinou se užije ochranná skupina Bzl. /2-Chlorbenzyloxykarbonyl (2C1-Z) se užije jako ochranná skupina pro postranní řetězec Lys. Tos se užije k ochraně guanidinové skupiny Arg a Glu nebo Asp s karboxylovou skupinou se chrání jako Bzl-ester. Fenolová hydroxylová skupina aminokyseliny Tyr se chrání zavedením 2,6-dichlorbenzylové skupiny. Na konci této syntézy se získá následující sloučenina:

X!—Tyr (X²) —Ala—Asp (χ3 )—Ala—Ile— —Phe—Thr (X⁴ ] — Asn—Ser (X⁵ )—Tyr (χ2 ] — —Arg (X⁶ ] —Lys (X⁷} —Val—Leu—Gly—Gln— —Leu—Ser (X⁵) —Ala—Arg (X^й)—Lys (X7) — —Leu—Leu—Gln—Asp (X3 )—lle—Met— —Ser (X5 ) —Arg(XB J—Gin—Gln—Gly— —Glu (X3 ) — Arg (X^й ) —Asn—Gln—Glu (X³ ) — —Gln—Gly—Ala—Arg(XB)—Val—Arg (X^й) — —Leu—X⁸ kde

X1 znamená BOC,

X2 znamená 2,6-dichlorbenzyl,

X3 znamená benzylester,

X⁴ znamená Bzl,

X⁵ znamená Bzl,

X« znamená Tos,

X⁷ znamená 2C1-Z a

X⁸ znamená —O—CH2—benzenpolystyrénovou pryskyřici jako podložku.

Po vazbě koncového zbytku Tyr se skupina BOC odstraní působením 45% TFA v methylendichloridu. K odštěpení ochranných skupin, zbývajících na peptidovém řetězci, se na tento řetězec působí směsí 1,5 ml anisolu, 0,25 ml methylethylsulfidu a 10 ml fluorovodíku (HFj na 1 g peptidu, vázaného na pryskyřici při teplotě —20 °C 1/2 hodiny a pak ještě 1/2 hodiny při teplotě 0 °C. Po odstranění fluorovodíku ve vysokém vakuu se zbytek pryskyřice s peptidem střídavě promývá bezvodým diethyletherem a chloroformem a peptid se pak extrahuje 2N vodným roztokem kyseliny octové, zbaveným plynu. Po lyofilizací extraktu se tímto způsobem získá pěnovitý bílý materiál,

1,136 molárníhO' přebytku 1-hydroxybenOdštěpený peptid, zbavený ochranných skupin, se pak rozpustí v 30% kyselině octové a podrobí filtraci na. gelu Sephadex G-50.

Pak se peptid dále čistí na karboxymethylcelulóze CM-32 (Whatman) a provádí se tedy kationtoměničová chromatografie při použití sloupce o rozměrech 1,8 '< 18 cm při objemu kationtoměniče 50 ml při použití gradientu, který vznikne tak, že se do mísící láhve uloží 1 litr 0,4M MHdOAc o pH 6,5, láhev již obsahuje 400 ml 0,01M MH-íOAc o· pH 4,5. Konečné čištění se provádí dělicí chromatografií při použití prostředku Sephadex G-50 (Pharmacia) při použití směsi n-butanolu, ethanolu, pyridinu a 0,2N HOAc v poměru 4:1:1:7. Podrobnosti, týkající se čištění, jsou uvedeny v publikaci Lin.g a další, Biochem.. Biophys. Res. Commun. 95, 945 (1980). Chromatografické frakce se pečlivě sledují chromatografií na tenké vrstvě a spojují se pouze ty frakce, které jsou v podstatě čisté.

Syntéza se opakuje při použití pryskyřice MBHA, čímž se získá tentýž peptid s amidovaným C-tenninálmm zakončením, obvykle se postupuje způsobem, popsaným v US patentovém spisu č. 4 292 313 k navázání Leu na pryskyřici MBHA.

Příklad 2

Aby bylo možno stanovit účinnost peptidu při uvolňování růstového hormonu, byly provedeny pokusy in vitro při použití syntetického hGRF(l-44)-NH2 a současně při použití pGRF(l-44)-NH2 a GRF referenční standard se známým účinkem na uvolnění růstového hormonu z buněk hypofýzy. GRF referenční standard je popsán a definován v publikaci Brazeau a další, Endocrinology, sv. 110, A538 (1982), běží o to množství preparátu krysího hypothalamu, které vyvolá 1/2 maximální odpovědi, pokud jde o uvolnění růstového hormonu v biologickém pokusu s monovrstvou hypofyzálních buněk. Užívají se kultury, které obsahují buňky krysích hypofýz, které byly odebrány před 4 až 5 dny. Pro srovnání se užívají kultury s definovaným standardlním prostředím a kultury, které by měly mít optimální podmínky pro sekreci růstového hormonu ve srovnávacím pokusu, který se provádí způsobem . podle publikace Brazeau a další. Regulátory Peptides, 1, 255, 1981. Inkubace zkoumané látky se provádí po dobu 3 až 4 hodin, odebírají se podíly živného prostředí a měří se jejich obsah imunoreaktivního GH (ir GH) radioimunologickým způsobem, který je zásadně znám.

Výsledky tohoto srovnání ukázaly, že při použití ekvimolárního poměru má pGRF(l-44J-NH2 plnou biologickou účinnost syntetického peptidu hGRF a přibližně stejnou intenzitu účinku.

Příklad 3

Syntéza bGRF( 1-44] amidu, který je možno vyjádřit vzorcem

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Val—Leu— —Gly—Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Asn—Arg— —Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn—Gln— —Glu—Glu—Gln—Gly—Ala—Lys—Val— —Arg—Leu—NHž se provádí postupně při použití zařízení pro výrobu peptldů z . aminokyselin (Beckman 990 Peptide Synthesizer] a pryskyřice MBHA. Vazba BOC—Leu na pryskyřici se provádí způsobem, uvedeným v US patentovém spisu číslo 4 292 313 a má za výsledek substituci přibližně 0,2 až 0,6 mmol Leu na 1 g pryskyřice v závislostí na substituci použité pryskyřice MBHA. Všechna použitá rozpouštědla se pečlivě zbaví plynů průchodem inertního plynu, s výhodou hélia, aby byla zajištěna nepřítomnost kyslíku, který by mohl nežádoucím způsobem oxidovat síru aminokyseliny Met.

Po odstranění ochranných skupin a neutralizaci se na pryskyřici postupně buduje peptidový řetězec. Odstranění ochranných skupin, neutralizace a vazba každé další aminokyseliny se obecně provádí podle Guillemina a dalších v US patentu č. 3 904 594. Zvláště se postup provádí podle schématu A z příkladu 1.

Vazba se provádí způsobem, podle příkladu 1, získá se sloučenina obecného vzorce:

X1—Tyr (X² )—Ala—Asp (X³ ] —Ala—Ile— —Phe—Thr (X⁴)—Asn—Ser (X⁵)—Tyr (X²)— —Arg (X^u)—Lys (X⁷) —Val—Leu—Gly—Gln— —Leu—Ser (X⁵)—Ala—Arg— (X^B )—Lys (X⁷) — —Leu—Leu—Gln—Asp(X³]—ne—Met— —Asn—Arg (X⁶ ]—Gln—Gln—Gly— —Glu [ X³)—Arg (X^е)—Asn—G ln—G lu (X³ ] — —Gln—Gly—Ala—Lys (X⁷ ]—Val—Arg (X® ] — —Lju—X⁸ kde

X1 znamená BOC,

X‘2 znamená 2,6-dichlorbenzyl,

X3 znamená benzylester,

X⁴ znamená Bzl,

X⁵ znamená Bzl,

X^B znamená Tos,

X7 znamená 2C1—Z a

X⁸ znamená —NH—MBHA pryskyřici jako podložku,

Po navázání koncového zbytku Tyr na pryskyřici se odstraní skupina BOC působením 45% kyseliny trifluoroctové v methylendichloridu.

K odštěpení výsledného peptidu a odstranění zbývajících ochranných skupin se na peptld a pryskyřici působí směsí 1,5' ml anisolu, 0,25 ml methylethylsulfidu a 10 ml fluorovodíku na 1 g peptidu s pryskyřicí 1/2 hodiny při teplotě —20 °C a pak ještě 1/2 hodiny při teplotě 0 °C. Po odstranění fluorovodíku ' ve vysokém vakuu se zbývající peptid navázaný na pryskyřici střídavě promývá bezvodým diethyletherem a' chloroformem a peptid se pak extrahuje 2N vodným roztokem kyseliny octové, zbaveným plynů. Lyofilizací extraktu se získá bílý pánovitý materiál.

Odštěpený peptid, zbavený ochranných skupin, se pak rozpustí ve 30% kyselině octové a podrobí se filtraci na gelu (Sephadex G-50).

Peptid se pak dále čistí chromatografií na kationtoměniči a dělicí chromatografii obdobným způsobem jako v příkladu 1.

Postup se opakuje při použití chlormethylované pryskyřice za vzniku téhož peptidu s volným zakončením na karboxylovém terminálu způsobem podle publikace Biopolymers, 12, 2 513 až 2 519 [1973], jde zejména o vazbu Leu na chlormethylovanou pryskyřici.

Postup je možno opakovat při použití chlormethylované pryskyřice za získání téhož peptidu s volnou karboxylovou skupinou na C-terminálním zakončení způsobem podle příkladu 1.

Příklad 4

Ke stanovení peptidu, pokud jde o- jeho účinek na uvolnění růstového hormonu in vitro, byly provedeny pokusy se současným použitím syntetického hGRF [1-44 ]-NH2, postup byl provádě způsobem podle příkladu

2.

Výsledky těchto pokusů prokázaly, že při použití ekvimolárního' množství má bGRF(1-44J-NH2 plnou biologickou účinnost syntetického peptidu a přibližně tutéž velikost účinku. V opakovaných dávkách bylo možno prokázat pro bGRF stejný účinek jako pro. hGRF (1-44 ]-NH2 při specifickém účinku rovném přibližně 70 % hGRF (1-44 J-NH2 při mezích spolehlivosti 54 až 93 %.

Příklad 5

Syntéza oGRF( 1-44)amidu, který je možno vyjádřit vzorcem:

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Ile—Leu— —Gly—GIn—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Leu—Gin—Asn—Ile—Met—Asn— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn— —Gln—Glu—Gln—Gly—Ala—Lys—Val— —Arg—Leu—NH2 se provádí postupně při použití zařízení pro syntézu peptidů z aminokyselin (Beckman 990 Peptide Synthesizer) a pryskyřice MBHA, stejně jako v příkladu 3. Tímto způsobem se získá výsledný produkt, který je možno vyjádřit vzorcem:

X¹—Туг (X² ]—Ala—Asp (X³ J —Ala—Ile-—Phe —Thr (X⁴) — Asn—Ser (X⁵ ] —Туг (X²) — —Arg(X⁶)—Lys—(X⁷) — lle—Leu—Gly— —Gln—Leu—Ser(X⁵)—Ala—Arg(X^BJ — —Lys(X⁷)—Leu—Leu—Gln—Asp(X³) — —Ile—Met—Asn—Arg(X⁶)—Gln—Gln— —Gly— Glu(X³) —Arg(X^bj— Asn—Gin— — Glu(X³)—Gin—Gly—Ala—Lys(X⁷) — —Val—Arg (X⁶) —Leu—X⁸ kde

X¹ znamená BOC,

X² znamená 2,6-dichlorbenzyl,

X³ znamená benzylester,

X⁴ znamená Bzl,

X⁵ znamená Bzl,

X⁶ znamená Tos,

X⁷ znamená 2C1-Z a

X⁸ znamená —NH—MBHA pryskyřici jako podložku.

Po navázání koncového zbytku Туг na pryskyřici se odstraní skupina BOC působením 45% kyseliny trifluoroctové v methylendichloridu. Odštěpení peptidů z pryskyřice a odstranění ochranných skupin se pak provádí stejně jako v příkladu 3. Odštěpený peptid bez ochranných skupin se rozpustí ve 30% kyselině octové, podrobí se filtraci na gelu Sephadex G-50, chromatografií na kationtoměniči a dělicí chromatografií způsobem, popsaným v příkladu 1.

Postup se opakuje při použití chlormethylované pryskyřice, čímž se způsobem, popsaným v příkladu 1, získá tentýž peptid s volnou karboxylovou skupinou na C-torminálním zakončení.

Příklad 6

Ke stanovení účinku peptidů na uvolňování růstového hormonu in vitro byly prováděny pokusy při použití syntetického hGRF(l-44)-NH2 současným srovnáním s ekvimolární koncentrací syntetického oGRF(l-44)-NH2 z příkladu 5 stejně jako v příkladu 2.

Výsledky tohoto· srovnání ukázaly, že v ekvimolárním poměru má oGRF f 1-44) plnou biologickou účinnost syntetického peptidů a přibližně stejnou intenzitu účinku. Při opakovaných dávkách bylo rovněž možno· prokázat, že oGRF má přibližně stejný účinek, jako hGRF(l-44)-NH2 a specifickou účinnost jako hGRF(l-44)-NH2 a specifickou účinnost, rovnou přibližně 70 % účinku hGRF(l-44)-NH2.

Očekává se, že chronické podávání syntetických peptidů pGRF, bGRF a oGRF hospodářským zvířatům, zejména selatům, Skotu, kozám a ovcím a také dalším teplokrevným živočichům podnítí anabolické reakce a tudíž zvýší tělesnou hmotnost, zvláště svalovou hmotu. Při použití ve veterinárním lékářství je použití jednotlivých typů GRF, specifických pro určitý druh, například oGRF pro· ovce, bGRF pro skot nebo kozy ideální, protože podaná molekula není antígenní, protože je přirozená druhu, jemuž je podána. Podávání by také mělo zvýšit produkci mléka u samic. V případě použití u ryb a dalších studenokrevných živočichů by rovněž mělo dojít к urychlení růstu. U zvířat je přípustná čistota pouhých 5 %, spolu s veterinárně přijatelným pevným nebo kapalným nosičem, takže není zapotřebí nákladného čištění.

Syntetický GRF nebo jeho netoxické soli v kombinaci s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska, je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky a podávat savcům včetně lidí nitrožilně, podkožně, nitrosvalově, intranasálně nebo per orálně. Tímto způsobem je možno podporovat uvolňování růstového hormonu tam, kde ie to žádoucí. Požadovaná dávka se bude měnit podle stavu, o který běží a podle předpokládaného trvání celé léčby.

Peptidy tohoto typu je možno podávat ve formě netoxických solí, přijatelných z farmaceutického hlediska, například ve formě adičních solí s kyselinami nebo ve formě kovových komplexů, například se zinkem, železem apod., tyto komplexy jsou považovány pro tento účel také za soli. Ze solí jde zejména o hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, fosfáty, maleáty, acetáty, citráty, benzoáty, sukcináty, maláty, askorbáty, tartráty apod. V případě, že účinná látka má být podávána ve formě tablet, může tableta obsahovat pojivo, například tragakanth, kukuřičný škrob nebo želatinu, dále činidlo, napomáhající rozpadu, například alginovou kyselinu, a kluzné látky, například stearan hořečnatý. V případě, že je požadováno podávání v kapalné formě, je možno užít sladidla a/nebo chuťové látky, nitrožilní podání se uskutečňuje v isotonickém roztoku chloridu sodného, ve fosfátovém pufru apod.

Peptidy, vyrobené způsobem podle vynálezu, mají být podávány pod dohledem lékaře, farmaceutické prostředky budou tyto peptidy obvykle obsahovat ve spojení s běžným nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska. Dávka se obvykle bude pohybovat v rozmezí 20 až 2 000 nanogramů peptidu na 1 kg tělesné hmotnosti.

Přestože vynález byl popsán na jednotlivých zvláště výhodných provedeních, která představují v současné době nejvýhodnější způsob, je samozřejmé, že odborník může provést různé modifikace, aniž by se přitom odchýlil od základní myšlenky způsobu podle vynálezu. Je například možno provést modifikace v řetězci, který obsahuje 44 zbyt251085 ků, zejména je možno některé zbytky vynechat, a to· zejména v blízkosti karboxylové skupiny, tak jak je to známo z předchozích pokusů, které byly prováděny s · použitím hGRF, takže je možno získat fragmenty o 34 až 43 zbytcích, například pGRF(l-34), bGRF(1-35), oGRF(l-37), nebo dokonce ještě kratší fragmenty, například oGRF(l-32), bGRF(1-29) a oGRF(l-27), přičemž tyto fragmenty mohou mít na C-terminálním zakončení skupinu NH2 nebo OH a mohou ' si zachovat biologickou účinnost peptidů. Tyto kratší fragmenty rovněž spadají do oboru vynálezu. Bylo by také možno přidat další zbytky na kterémkoliv zakončení nebo na obou zakončeních a/nebo by mohly být přírodní zbytky nahrazeny zbytky, které se obvykle pokládají za ekvivalentní za vzniku analogů, které by si zachovaly alespoň podstatnou část účinnosti původního polypeptidu. Všechny tyto látky jsou zahrnuty do oboru vynálezu.

Claims

1. Způsob výroby peptidů, uvolňujících růstový hormon z hypofýzy, obecného vzorce I

H—Tyr—Ala—Asp—Ala—Ile—Phe—Thr— —Asn—Ser—Tyr—Arg—Lys—Ri3—Leu— —Gly—Gin—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys— —Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—R28— —Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—Arg—Asn— —Gln—Glu—Gln—Gly—Ala—R41—Val— —Arg—Leu—Y kde

R13 znamená Val nebo Ile,

R28 znamená Ser nebo Asn, Rát znamená Arg nebo· Lys a

Y znamená hydroxylovou skupinu nebo aminoskupinu, vyznačující se tím, že se

a) vytvoří sloučenina s alespoň jednou ochrannou skupinou, kterou je možno vyjádřit obecným vzorcem II

Xi—Tyr (Χ²)—Ala—Asp (X3 )—Ala—Ile— —Phe—Thr (X⁴) —Asn—Ser (X⁵) —Tyr (X²)— —Arg (X⁶) —Lys (X⁷) —R13—Leu—Gly—Gln— —Leu—Ser (X5)—Ala—Arg (X⁶) —Lys (X7) — —Leu—Leu—Gln—Asp(X³) —Ile—Met— —R28 (X5) — Arg (X⁶)—Gln—Gln—Gly—Glu— — (X³)—Arg (X^b)—Asn—Gln—Glu (X³) — —Gln—Gly—Ala—R44(X^tí nebo X7)—Val— —Arg(X6)—Leu—X⁸ kde

X¹ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na α-aminoskupině, s výhodou Boc,

X² znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu fenolové hydroxylové skupiny Tyr, s výhodou 2,6-dichlorbenzylovou skupinu,

X3 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na karboxylové skupině Asp nebo

Glu, s výhodou Bzl,

VYNÁLEZU

X⁴ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro alkoholovou hydroxylovou skupinu Thr, s výhodou Bzl,

X⁶ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro· guanidoskupinu Arg, s výhodou Tos,

X⁷ znamená atom vodíku nebo· ochrannou skupinu aminoskupiny postranního řetězce ' Lys, s výhodou 2-chlorbenzyloxykarbonylovou skupinu,

X⁸ znamená —O—CH2-pryskyřice nebo —NH-pryskyřice, tak, že se naváže postupně každá aminokyselina vždy v po-měru 1 mmol chráněné aminokyseliny na 1 g pryskyřice ve vhodném rozpouštědle, s výhodou methylenchloridu nebo dimethylformamidu nebo ve směsi těchto· rozpouštědel, načež se

b) odštěpí ochranná skupina a výsledná látka se odštěpí od pryskyřice působením kyseliny trifluoroctové ve vhodném rozpouštědle, s výhodou methylendichloridu s následným působením fluorovodíku a anisolu nebo methylethylsulfidu nebo směsi těchto látek při nízké teplotě, s výhodou 0 až —20 stupňů Celsia, načež se výsledná látka rozpustí ve vhodném rozpouštědle, s výhodou v kyselině octové a popřípadě se čistí.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije sloučeniny obecného vzorce II, v němž R13 znamená Val, R28 znamená Ser a R41 znamená Arg.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije sloučeniny obecného· vzorce II, v němž R13 znamená Val, R28 znamená Asn a R41 znamená Lys.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije sloučeniny obecného vzorce II, v němž R13 znamená Ile, R28 znamená Asn a R41 znamená Lys.

5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že Y znamená NH2.