DK161835B - Grf-analoge peptider og farmaceutisk acceptable salte deraf samt middel indeholdende disse - Google Patents

Description

DK 161835B

i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte GRF-analoge peptider, som fremmer frigørelsen af væksthormon fra hypofysekirtlen, farmaceutisk acceptable salte deraf og et middel indeholdende disse peptider.

5 I 1982 blev en hypothalam frigørelsesfaktor for hypofysært væksthormon eller somatotropin isoleret fra en human ø-cellesvulst, renset, karakteriseret og syntetiseret. Ved afprøvning viste den sig at fremme frigørelsen af væksthormon (GH) fra hypofysen. Dette peptid har sekvensen: 10 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-

Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-N^· Human hypothalam væksthormon-frigørelsesfaktor (hGRF) har nu vist sig at have samme struktur ifølge Bohlen et al., 15 Biochem. and Biophs. Res. Comm., 114, 3, side 930-936 (1983).

44-rest-polypeptider er nu blevet isoleret fra rensede ekstrakter af hypothalami fra svin, kvæg, geder og får og er blevet karakteriseret. Hver af dem viser sig at have en forskel på nogle få aminosyrerester i forhold til formlen for 20 hGRF som anført i det følgende.

I henseende til sammensætningen af hGRF kan svine-GRF (pGRF) udtrykkes som analogen [Arg , Gin-3 , Val ]-hGRF (1-44)-13^, hvilket betyder, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-25 Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-

Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-N^. Det omtales i det følgende som pGRF eller svine-somatocrinin. Dette peptid kan anvendes til fremme af væksten af varmblodede dyr, især svin, af koldblodede dyr og inden for hydroponik.

2

DK 161835 B

Med hensyn til sammensætningen af hGRF kan kvæg-GRF (bGRF) udtrykkes som analogen [Asn^®, Arg^, Gln"^, Lys^, Val^]-hGRF(l-44)-NH2/ hvilket betyder, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-5 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. Det betegnes i det følgende som bGRF eller kvæg-soma-trocrinin. Gede-GRF har den samme formel og kan anvendes til fremme af væksten af varmblodede dyr, især kvæg, af koldblo-10 dede dyr og inden for hydroponik. Det kan også anvendes til forøgelse af mælkeproduktionen hos køer og geder med henblik j på opnåelse af mælk til fremstilling af specialitetsoste.

Med hensyn til sammensætningen af hGRF kan fåre-GRF (oGRF) ,, . Γτ1 13 .. 28 34 „. 38 _ 41 udtrykkes som analogen [Ile , Asn , Arg , Gin , Lys , 4 ? 15 Val ]-hGRF(l-44)-NH2/ hvilket betyder, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LYs-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-'Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2- Det omtales i det følgende oGRF eller fåre-somatocrinin, 20 Dette peptider kan anvendes til fremme af væksten af varmblodede dyr, især får, af koldblodede dyr og inden for hydroponik.

Det kan også anvendes til forøgelse af mælkeproduktionen hos får med henblik på opnåelse af mælk til fremstilling af spe-cialitetsoste.

25 Veterinære og farmaceutiske midler ifølge opfindelsener kendetegnet ved at indeholde et peptid ifølge krav 1, disper-geret i en farmaceutisk eller veterinært acceptabel flydende eller fast bærer. Sådanne midler kan anvendes inden for klinisk medicin, såvel human som veterinær, til akut eller kro-30 nisk administration til diagnostiske eller terapeutiske formål. Endvidere kan de anvendes til acceleration af væksten af 3

DK 161835 B

muskelmasse og/eller mælkeproduktion hos svin, kvæg, geder, får eller andre dyr.

Den til definition af peptiderne benyttede nomenklatur er den af Schroder & Lubke anførte i "The Peptides", Academic 5 Press (1965), hvori aminogruppen i overensstemmelse med konventionel angivelse forekommer ved N-terminalen, og carboxyl-gruppen forekommer til højre ved C-terminalen. Når aminosyre-resten har isomere former, er det L-formen af aminosyren, der angives, med mindre andet udtrykkelig er anført.

10 Ifølge opfindelsen angives syntetiske GRF-peptider med følgende formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R-^-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-I^g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R^-Val-Arg-Leu-Y, hvor Y er OH eller NH2, og hvori R^ or Val eller 15 Ile, R28 er Ser eller Asn, R^ er Arg eller Lys, eller et ikke-tok'sisk salt deraf.

Peptiderne kan syntetiseres ved hjælp af enhver egnet metode, såsom udelukkende ved hjælp af fastfaseteknik, ved hjælp af delvis fastfaseteknik, ved hjælp af fragmentkondensation, 20 ved hjælp af klassiske opløsningskoblinger eller ved anvendelse af for nylig udviklet DNA-rekombinationsteknik. F.eks. er metoden til udelukkende fastfasesyntese anført i lærebogen "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, og den er eksemplificeret i USA 25 patentskrift nr. 4.105.603. Fragmentkondensationsmetoden til syntese af eksemplificeret i USA patentskrift nr. 3.972.859. Andre til rådighed stående synteser er eksemplificeret i USA patentskrift nr. 3.842.067 og i USA patentskrift nr. 3.862.925. Fremstilling af de syntetiske peptider under anvendelse af 30 DNA-rekombinationsteknik vil sandsynligvis blive benyttet

DK 161835 B

4 til opfyldelse af kommercielle krav i stor målestok. .

i

Syntese ved anvendelse af DNA-rekombinationsteknik skal til opfindelsens formål forstås som omfattende passende anvendelse af et strukturelt gen, der koder for en form for GRF.

5 Det syntetiske GRF kan opnås ved transformation af en mikroorganisme under anvendelse af en ekspressionsvektor indbefattende en aktivator og operator sammen med et sådant strukturelt gen og ved at bringe en sådan transformeret mikroorganisme til at manifestere GRF. Et dyr (ikke menneske) kan også 10 anvendes til produktion af GRF ved hjælp af gen-dyrkning under anvendelse af et sådant strukturelt gen samt den generelle metode, der er anført i USA patentskrift nr. 4.276.282, eller ved anvendelse af mikroinjektion af fostre som beskrevet i WO83/01783 og WO82/04443. Det syntetiske GRF kan også 15 fremstilles direkte i dyret, for hvilket accelereret vækst er tiltænkt, ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i de to WO-publikationer.

Fælles for synteser af koblingstypen er beskyttelsen af de forskellige aminosyremolekyldeles labile sidekædegrupper med 20 passende beskyttelsesgrupper, der vil hindre en kemisk reaktion i at finde sted på det pågældende sted, indtil gruppen til sidst fjernes. Fælles er sædvanligvis også beskyttelsen af en α-aminogruppe eller en aminosyre eller et fragment, medens denne del reagerer med carboxylgruppen, efterfulgt 25 af den selektive fjernelse af a-aminobeskyttelsesgruppen, for at efterfølgende reaktion kan findes sted på dette sted. Følgelig er det fælles som trin i syntesen, at en mellemproduktforbindelse dannes, hvilken mellemproduktforbindelse omfatter hver af aminosyreresterne placeret i dens ønskede ræk-30 kefølge i peptidkæden med sidekædebeskyttelsesgrupper knyttet til de behørige rester. 1 betragtning kommer også mellemprodukter med formlen:

DK 161835 B

5 X1-Tyr (X2)-Ala-Asp(X2)-Ala-Ile-Phe-Thr(X3)-Asn-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X^ ) -Lys(X7 ) -R^-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X^) -Ala-Arg(X^)-Lys (X7)-Leu-Leu-Gin-Asp(X2)-Ile-Met-R2Q(X4)-Arg(X5)-Gln-Gln-

Gly-Glu(X2 )-Arg(X^)-Asn-Gln-Glu( X2 ) -Gln-Gly-Ala-R.(X^ eller 7 6 8 1 ^ 5 X )-Val-Arg(X )-Leu-x , hvori X er enten hydrogen eller en α-aminobeskyttelsesgruppe. α-aminobeskyttelsesgrupperne, som X^ betegner, at de, der vides at være anvendelige inden for den trinvise syntese af polypeptider. Til de klasser af α-aminobeskyttel sesgrupper, der dækkes af X^, hører (1) belt) skyttelsesgrupper af acyltypen, såsom formyl, trifluoracetyl, phthalyl, toluensulfonyl(Tos), benzensulfonyl, nitrophenyl-sulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitrophenoxyacetyl, chloracetyl, acetyl og γ-chlorbutyryl, (2) beskyttelsesgrupper af aromatisk urethantype, såsom benzyloxycarbonyl(Z) og substitueret 15 Z, såsom p-chlorbenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-brombenzyloxycarbonyl og p-methoxybenzyloxycarbonyl, (3) beskyttelsesgrupper af alifatisk urethantype, såsom t-bu-tyloxycarbonyl (BOC), diisopropylmethyloxycarbonyl, isopropyl-oxycarbonyl, ethoxycarbonyl og allyloxycarbonyl, (4) beskyt-20 telsesgrupper af-cykloalkyl-urethantype, såsom cyklopentyloxy-carbonyl, adamantyloxycarbonyl og cyklohexyloxycarbonyl, (5) beskyttelsesgrupper af thiourethantype, såsom phenylthio-carbonyl, (6) beskyttelsesgrupper af alkyltype, såsom tri-phenylmethyl (trityl) og benzyl, og (7) trialkylsilangrup-25 per, såsom trimethylsilan. Den foretrukne ot-aminobeskyttelses-gruppe er BOC.

2 X er en beskyttelsesgruppe for Tyr's phenoliske hydroxyl-gruppe og er valgt blandt tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ og 2,6-dichlorbenzyl. Den foretrukne 2 30 beskyttelsesgruppe er 2,6-dichlorbenzyl. X kan være hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen beskyttelsesgruppe på hydroxylgruppen.

2 3 X er hydrogen eller en esterdannende beskyttelsesgruppe for 4

Asp's eller Glu's carboxylgruppe og er valgt blandt Bzl, 2,6- 5 dichlorbenzyl, methyl og ethyl.

DK 161835 B ; 6 4 5 X og X er beskyttelsesgrupper for Thr's og Ser's hydroxyl- gruppe og er valgt blandt acetyl, benzoyl, tert-butyl, tri- tyl, tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-dichlorbenzyl og CBZ. Den 4 , 5 foretrukne beskyttelsesgruppe er Bzl. X og/eller X kan være 5 hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen beskyttelsesgruppe på hydroxylgruppen.

g X er en beskyttelsesgruppe for Arg's guanidinogruppe og er valgt blandt nitro-, Tos, CBZ, adamantyloxycarbonyl og BOC,.

g eller også er X hydrogen.

7 i 10 X er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for Lys's side- j kædeaminosubstituent. Eksempler på passende sidekæde-amino- beskyttelsesgrupper er 2-chlorbenzyloxycarbonyl (2-C1-Z),

Tos, CBZ, t-amyloxycarbonyl og BOC.

Valget af en sidekæde-aminobeskyttelsesgruppe er ikke af af-15 gørende betydning, med mindre den skal være en, der ikke fjernes under afbeskyttelsen af α-aminogrupperne under syntesen, a-aminobeskyttelsesgruppen og sidekæde-aminobeskyttelsesgruppen kan derfor ikke være den samme.

Eventuelt kan Gin's og/eller Asn's sidekæde-aminogruppe beskyt-20 tes på passende måde, såsom med xanthyl (Xan).

g X er valgt blandt OH, OCH^, estere, amider, hydrazider, -O-C^-harpiksbærer og -NH-harpiksbærer, idet grupperne bortset fra OH og amider bredt betragtes som beskyttelsesgrupper.

I formlen for mellemproduktet er mindst én af grupperne x\ 25 X^, X^, X^, X^, X^, X^ og X^ en beskyttelsesgruppe.

Ved udvælgelse af en bestemt sidekæde-beskyttelsesgruppe til anvendelse ved syntesen af peptiderne følges følgende regler: (a) Beskyttelsesgruppen skal være stabil overfor reagenset og under de reaktionsbetingelser, der vælges til fjernelse 7

DK 161835 B

af a-aminobeskyttelsesgruppen på hvert trin i syntesen, (b) beskyttelsesgruppen skal bevare sine beskyttelsesegenskaber og ikke blive fraspaltet under koblingsbetingelser, og (c) sidekæde-beskyttelsesgruppen skal kunne fjernes efter 5 afslutning af syntesen omfattende den ønskede aminosyrese- kvens og under reaktionsbetingelser, der ikke vil ændre peptidkæden.

Peptiderne fremstilles fortrinsvis under anvendelse af fast-fasesyntese, såsom den af Merrifield beskrevne i J. Am. Chem. 10 Soc., 85, side 2149 (1963), selvom andre dermed ækvivalente kemiske synteser, som kendes på området, også kan anvendes som nævnt i det foregående. Fastfasesyntese påbegyndes fra peptidets C-terminalende ved kobling af en beskyttet a-amino-syre til en egnet harpiks. Et sådant udgangsmateriale kan 15 fremstilles ved, at α-amino-beskyttet Leu ved hjælp af en esterbinding knyttes til en chlormethyleret harpiks eller en hydroxymethylharpiks eller ved hjælp af en amidbinding knyttes til en BHA-harpiks eller en MBHA-harpiks. Fremstillingen af hydroxymethylharpiksen er beskrevet af Bodansky 20 et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-1598 (1966). Chlormethy-lerede harpikser fås kommercielt fra Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien og fra Lab. Systems, Inc. Fremstillingen af en sådan harpiks er beskrevet af Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 25 1969), kapitel 1, side 1-6. BHA- og MBHA-harpiksbærere fås kommercielt og benyttes generelt kun, når det ønskede poly-peptid, som syntetiseres, har et α-carboxamid ved C-termi-nalen.

Leu, der er beskyttet med BOC, kobles til den chlormethylerede 30 harpiks i overensstemmelse med proceduren ifølge Monahan og Giion, Biopolymer 12, side 2513-2519, 1973, når det eksempelvis er ønskeligt at syntetisere 44-aminosyrepeptidet med fri carboxyterminal. Efter koblingen af BOC-Leu fjernes a-aminobeskyttelsesgruppen, såsom ved anvendelse af trifluor- 8

DK 161835B

eddikesyre(TFA) i methylenchlorid, TFA alene eller HCl i di-oxan. Afbeskyttelsen udføres ved en temperatur på mellem ca. 0°C og stuetemperatur. Andre standardspaltningsreagenser og betingelser til fjernelse af specifikke a-aminobeskyttelses-5 grupper kan anvendes som beskrevet af Schroder & Lubke i "The Peptides", 1 side 72-75 (Academic Press 1965).

Efter fjernelse af Leu's cc-aminobeskyttelsesgruppe kobles de resterende α-amino- og sidekæde-beskyttede aminosyrer trinvis i den ønskede orden til opnåelse af den ovenfor define-10 rede mellemproduktforbindelse, eller også kan nogle af dem som et alternativ til tilføjelse af hver aminosyre separat i syntesen blive koblet til hinanden forud for tilsætning til fastfasereaktoren. Udvælgelsen af et passende koblingsreagens ligger inden for fagmandens viden. Særlig egnet som 15 koblingsreagens er Ν,Ν'-dicyklohexylcarbodiimid (DCCI).

De aktiverende reagenser, der anvendes ved fastfasesyntesen af peptiderne, er velkendte på peptidområdet. Eksempler på egnede aktiverende reagenser er (1) carbodiimider, såsom N,N'-diisopropylcarbodiimid og N,N'-dicyklohexylcarbodiimid(DICC), 20 (2) cyanamider, såsom N,N1-dibenzylcyanamid, (3) ketiminer, (4) isoxazoliumsalte, såsom N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat, (5) monocykliske nitrogenholdige heterocykliske amider af aromatisk karakter indeholdende 1-4 nitrogenatomer i ringen, såsom imidazolider, pyrazolider og 1,2,4-triazo-25 lider. Specifikke heterocykliske amider, der kan anvendes, indbefatter Ν,Ν'-carbonyldiimidazol, N,N1-carbonyl-di-1,2,4-triazol, (6) alkoxyleret acetylen, såsom ethoxyacetylen, (7) reagenser, der danner et blandet anhydrid med carboxyl-molekyldelen af aminosyren, såsom ethylchlorformiat og iso-' 30 butylchlorformiat og (8) reagenser, der danner en aktiv ester med aminosyrens carboxylmolekyldel, såsom nitrogenholdige heterocykliske forbindelser med en hydroxygruppe på ét ring-nitrogenatom, f.eks. N-hydroxyphthalimid, N-hydroxysuccin-

DK 161835B

9 imid og 1-hydroxybenzotriazol(HOBT). Andre aktiverende reagenser og deres anvendelse til peptidkobling er beskrevet af Schroder & Lubke supra i kapitel III og af J. Kapoor, Phar. Sci., 59, side 1-27 (1970).

5 Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indføres i fastfasereaktoren i ca. et dobbelt eller større overskud, og koblingen kan udføres i et medium af dimethylformamid(DMF): CH2CI2 (1:1) eller i DMF eller alene. I tilfælde, hvor ufuldstændig kobling fandt sted, gentages koblingsproceduren 10 før fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen forud for koblingen af den næste aminosyre. Vellykketheden af koblingsreaktionen på hvert trin i syntesen måles ved hjælp af nin-hydrinreaktionen, således som beskrevet af E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970).

15 Efter at den ønskede aminosyresekvens er blevet færdiggjort, fjernes mellemproduktpeptidet fra harpiksbæreren ved behandling med et reagens, såsom flydende hydrogenfluorid, der ikke alene spalter peptidet fra harpiksen, men også fraspalter 2 3 4 5 alle resterende sidekædebeskyttelsesgrupper X , X , X , X , 6 7 8 le 20 X , X og X samt α-aminobeskyttelsesgruppen X til opnåelse af peptidet.

Som en alternativ vej kan mellemproduktpeptidet skilles fra harpiksbæreren ved hjælp af alkoholyse, hvorefter den udvundne C-terminal-alkylester omdannes til syren ved hjælp af hydro-25 lyse. Enhver af sidekædebeskyttelsesgrupperne kan derpå fraspaltes som tidligere beskrevet eller ved hjælp af andre kendte procedurer, såsom katalytisk reduktion (f.eks. Pd på BaS04). Ved anvendelse af hydrogenfluorid til spaltning indføres ani-sol og methylethylsulfid i reaktionsbeholderen til skylning.

30 De følgende eksempler angiver foretrukne metoder til syntetisering af GRF ved hjælp af fastfaseteknik. Det vil selvsagt fremgå, at syntesen af et tilsvarende kortere peptidfragment udføres på samme måde ved blot at eliminere det kræve- 10

DK 161835B

de antal aminosyrer ved den ene eller den anden ende af kæden. Det menes i ^dlertid i øjeblikket, at biologisk aktive fragmenter bør indeholde den anførte sekvens ved N-terminalen.

5 Eksempel 1

Syntese af pGRF(l-44) fri syre med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg—Lys-Val-Leu-

Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Afg-G1n-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Va1-Arg-Leu-OH 10 udføres på trinvis måde ved anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator ti-l· en chlormethyleret harpiks, såsom den der fås fra Lab. Systems, Inc. og indeholder 0,9 molækvivalenter Cl/g. Kobling af BOC-Leu til harpiksen udføres ved hjælp af den generelle procedure, der er angivet af Monahan 15 et al. i Biopolymers, bind 12 (1973), side 2513-2519, og den resulterer i substitution af ca. 0,22 mmol Leu pr. g harpiks. Alle opløsningsmidler, der anvendes, afgasses omhyggeligt ved gennembobling med inert gas, fortrinsvis helium, til sikring af fravær af oxygen, der på uønsket måde kunne oxidere 20 svovlet i Met-resten.

Efter afbeskyttelse og neutralisation opbygges peptidkæden trin for trin på harpiksen. Afbeskyttelse, neutralisation og tilføjelse af hver aminosyre udføres generelt i overens-25 stemmelse med proceduren angivet i detaljer af Guillemin et al. i USA patentskrift nr. 3.904.594. Koblingerne udføres nærmere betegnet som angivet i det følgende skema A:

DK 161835 B

11

SKEMA

TRIN REAGENSER OG OPERATIONER BLANDETIDER

1 C^C^-vask (2 gange) 0,5 2 50% trifluoreddikesyre (TFA) + 5% 5 1,2-ethandithiol i CH^C^ d gang) 0,5 3 50% trifluoreddikesyre (TFA) + 5% 1,2-ethandithiol i CH2C12 d gang) 20,0 4 CH2Cl2-vask (3 gange) 0,5 5 CH^OH-vask (2 gange) 0,5 10 6 10% triethylamin (Et^N) i CH2Cl2, neutralisation (2 gange) 0,5 7 ' CH^OH-vask (2 gange) 0,5 8 10% triethylamin (Et^N) i CH2C12, neutralisation (2 gange) 0,5 15 9 CH^OH-vask (2 gange) 0,5 10 CH2Cl2~vask (2 gange) 0,5 11 1Boc-aminosyre (1 mmol/g harpiks) + ækvivalent mængde dicyklohexyl- 120 carbodiimid (DCC) i CH2C12 20 12 CH2Cl2_vask (1 gang) 0,5 13 50% dimethylformamid i CH2C12, vask (2 gange) 0,5 14 10% triethylamin (Et~N) i CH2C12, vask (1 gang) 0,5 25 15 CH^OH-vask (2 gange) 0,5 16 CH2Cl2-vask (2 gange) 0,5 17 25% eddikesyreanhydrid i CELCd (2 ml/g harpiks) 20,0 18 CH2Cl2~vask (2 gange) 0,5 30 19 CH^OH-vask (2 gange) 0,5

Til kobling af Asn og Gin medtages et 1,136 molært overskud af 1-hydroxybenzotriazol (HQBt) i dette trin.

ί DK 161835Β 12

Til koblingsreaktionen anvendes kort fortalt 1 mmol BOC-beskyt-tet aminosyre i methylenchlorid pr. g harpiks plus 1 ækvivalent molær DCCI i methylenchlorid eller 30% DMF i methylenchlorid i 2 timer. Når Arg kobles, anvendes en blanding af 5 10% DMF og methylenchlorid. Bzl anvendes som hydroxyl-side- kædebeskyttelsesgruppen for Ser og Thr. 2-chlor-benzyloxy-carbonyl (2CL-Z) anvendes som beskyttelsesgruppen for Lyssidekæden. Tos anvendes til beskyttelse af Arg's guanidino-gruppe, og Glu- eller Asp-carboxylgruppen beskyttes som Bzl-10 esteren. Tyr's phenoliske hydroxylgruppe beskyttes med 2,6- | dichlorbenzyl. Ved syntesen afslutning opnås følgende sammensætning: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X^)-Lys(X^)-Val-Leu-Gly-gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X^)-Lys(X^)-15 Leu-Leu-Gin-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-

Arg(X^)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Arg(X^)-Val-Arg(X^)-Leu-X®, 12 3 hvori X er BOG, X er 2,6-dichlorbenzyl, X er benzylester, X4 er Bzl, XC^ er Bzl, X^ er Tos, X^ er 2C1-Z, og X^ er -0-CH2- benzen-polystyren-harpiksbærer.

20 Efter at den sidste Tyr-rest er blevet koblet til harpiksen, fjernes BOC-gruppen med 45% TFA i CH2C12· For at spalte og afbeskytte den tilbageværende beskyttede peptid-harpiks, behandles denne med 1,5 ml anisoly 0,25 ml methylethylsulfid og 10 ml hydrogenfluorid (HF) pr. g peptid-harpiks ved -20°C 25 i en halv time og ved 0°C i en halv time. Efter fjernelse af HF under højvakuum vaskes det tilbageværende harpiks-peptid skiftevis med tør diethylether og chloroform, og peptidet ekstraheres derpå med afgasset 2N vandig eddikesyre. Lyofili-sering af eddikesyreestrakten fører til et hvidt, fnugagtigt 30 materiale.

Det fraspaltede og afbeskyttede peptid opløses derpå i 30% eddikesyre og underkastes fin "Sephadex G-50" gelfiltrering.

DK 161835 B

13

Peptidet renses derpå yderligere ved hjælp af CM-32 carboxy-methylcellulose (Whatman) kationbytningskromatografi (1,8 x 18 cm, = 50 ml) under anvendelse af en konkav gradient dannet ved tildrypning af 1 liter 0,4 M NH^OAc, pH 5 6,5, til en blandekolbe indeholdende 400 ml 0,01 M NH^OAc, pH 4,5. Slutrensning udføres ved anvendelse af skillekromatografi på fin "Sephadex G-50"-bærer (Pharmacia) med et nBuOH:EtOH:pyridin:0,2% N HOAc (4:1:1:7) opløsningsmiddelsystem. Rensningsdetaljer er anført generelt af Ling et al.

10 i Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 945 (1980). De kromatografiske fraktioner måles omhyggeligt ved hjælp af TLC, og kun de fraktioner, der udviser væsentligt renhed, kombineres.

Syntesen gentages under anvendelse af en MBHA-harpiks til fremstilling af det samme peptid med en amideret C-terminal, 15 generelt ved at følge proceduren beskrevet i USA patentskrift nr. 4.292.313, med henblik på at knytte Leu til MBHA-harpiksen.

Eksempel 2

Til bestemmelse af effektiviteten af peptidet til at fremme frigørelsen af væksthormon, udføres in vitro prøver under 20 anvendelse af syntetisk HGRF-(1-44)-N^ til sammenligning sideløbende med pGRF(l-44og ved anvendelse af en GRF-referencestandard med en kendt effektivitet til fremme af frigørelsen af væksthormon fra hypofyseceller. GRF-reference-standarden er beskrevet og defineret af Brazeau et al. i Endo-25 crinology, bind 110, A538 (1982), og den er en mængde af et præparat af rotte-hypothalam oprindelse, som producerer en halv-maksimal reaktion udtrykt som GH-frigørelse ved en hypofysecel le-monolagsbioprøve. Der anvendes kulturer indeholdende celler af rottehypofysekirtler, som er fjernet ca. 4-5 dage 30 forinden. Både kulturer af et defineret standardmedium og kulturer, der anses for optimale til udsondring af væksthormon, anvendes til den sammenlignende afprøvning på den gene-

DK 161835B

14 relle måde, der er beskrevet af Brazeau et al. i Regulatory Peptides, 1, 225, 1981. Inkubation sammen med det stof, dér skal afprøves, udføres i 3-4 timer, og aliquot mængder af kulturmediet fjernes og behandles til måling af deres indhold 5 af immunoreaktivt GH(ir GH) ved hjælp af en velkarakteriseret radioimmunprøve.

Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning viser, at i ækvimolære mængder har pGRF(l-44)-NH2 den fulde iboende biolo-10 giske virkning som det syntetiske hGRF-peptid og tæt ved den samme virkningsstyrke, jvf. Biochemical and biophysical re- | search Communications, Vol. 117, nr. 3, 1983, side 772-779;

Vol. 116, nr. 1983, side 726-734; og Vol. 125, nr. 2, 1984, side 606-614.

15

Eksempel 3

Syntese af bGRF(l-44)-amid med formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thi—Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Ley-Gly-20 g 1n-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-11e-Met-Asn-Arg-61n-G1n-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator og en MBHA-harpiks. Kobling af BOC-Leu til harpiksen udføres ved hjælp af den generelle procedure, der er 25 anført i USA patentskrift nr. 4.292.313, og dette fører til substitution af ca. 0,2-0,6 mmol Leu pr. g harpiks, afhængigt af substitutionen af den benyttede MBHA-harpiks. Alle opløsningsmidler, der anvendes, afgases omhyggeligt ved gennembob-ling med en inert gas, fortrinsvis helium, til sikring af 30 fravær af oxygen, som på uønsket måde kunne oxidere svovlet i Met-resten,

Efter afbeskytte!se og neutralisation opbygges peptidkæden trin for trin på harpiksen. Afbeskyttelse, neutralisation og 35 tilføjelse af hver aminosyre udføres generelt i overensstemmelse med proceduren, der i detaljer er anført af Guillemin i USA patentskrift nr. 3,904.594. Koblingerne udføres nærmere betegnet som angivet i skema A i eksempel 1.

15

DK 161835B

Koblingsreaktionerne udføres som beskrevet i eksempel 1, og ved afslutningen af syntesen opnås følgende sammensætning: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2) -Arg(X6)-Lys (X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys (X7)-5 Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(X8)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X8)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-LYs(X7)-Val-Arg(X8)-Leu-X8, 12 3 hvori X er BOC, X er 2,6-dichlorbenzyl, X er benzylester, X4 er Bzl, X5 er Bzl, X6 er Tos, X7 er 2C1-Z, og x8 er 10 -NH-MBHA-harpiksbærer.

Efter at den sidste Tyr-rest er blevet koblet til harpiksen, fjernes BOC-gruppen med 45% TFA i CEki^C^· Med henblik på spaltning og afbeskyttelse af den tilbageblevne beskyttede peptid-harpiks, behandles denne med 1,5 ml anisol, 0,25 ml 15 methylethylsulfid og 10 ml hydrogenfluorid (HF) pr. g peptidharpiks ved -20°C i en halv time og ved 0°C i en halv time.

Efter fjernelse af HF under højvakuum vaskes det tilbageblivende harpiks-peptid skiftevis med tør diethylether og chloroform, og peptidet ekstraheres derpå med afgasset 2N vandig 20 eddikesyre. Lyofilisering af eddikesyreekstrakten fører til et hvidt, fnugagtigt materiale.

Det fraspaltede og afbeskyttede peptid opløses derpå i 30% eddikesyre og underkastes fin "Sephadex G-50"-gelfiltrering.

Peptidet renses derpå yderligere under anvendelse af kation-25 bytningskromatografi efterfulgt af skillekromatografi som angivet i eksempel 1.

Syntesen gentages under anvendelse af en chlormethyleret harpiks til fremstilling af det samme peptid med en fri syre-C-terminal, generelt idet man følger proceduren beskrevet i 30 Biopolymers, 12, 2513-2519 (1973) til at knytte Leu til den chlormethylerede harpiks.

* DK 161835B

16

Syntesen gentages under anvendelse af en chlormethyleret harpiks til fremstilling af det samme peptid med en fri syre-C-terminal under anvendelse af proceduren ifølge eksempel 1.

5 Eksempel 4

Til bestemmelse af effektiviteten af peptidet til at fremme frigørelsen af væksthormon udføres in vitro prøver under anvendelse af syntetisk hGRf(l-44)-NH2 til sammenligning side om side med ækvimolære koncentrationer af BGRF( 1-44 i-NEL^r 10 således som angivet ovenfor i eksempel 2.

Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning viser, at i ækvimolære mængder har bGRF( 1-44den fulde iboende biologiske virkning som det syntetiske peptid og tæt ved den samme virkningsstyrke. Ved flerdosefaktorudformede forsøg 15 viser bGRF sig at have den samme iboende aktivitet som hGRF-(l-44)-NH2 og en specifik aktivitet, der er lig med ca. 70% af aktiviteten af hGRF(1-44J-NI^ med konfidensgrænser på 54-93%.

Eksempel 5 20 Syntese af oGRF(1-44)-amid med formlen: Η-Tyr-Ala-As p-Ala-11e-Phe-Thr-As n-Ser-Tyr-Arg-Ly s-11e-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-G1n-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Ly s-Val-Arg-Leu-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 25 990 peptidsyntetisator og en MBHA-harpiks, således som angi vet i eksempel 3. Ved syntesens afslutning opnås følgende sammensætning: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X8)-Lys(X^)-Ile-Leu-Gly-gln-Leu-Ser(X3)-Ala-30 Arg(X8)-Lys(X^)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(X8)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X^)-Asn-gln-glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Lys(X^)-Val-Arg (X6)-Leu-X8, 17

DK 161835 B

12 3 hvori X er BOC, X er 2,6-dichlorbenzyl, X er benzylester, X4 er Bzl, X5 er Bzl, X6 er Tos, X^ er 2C1-Z, og X^ er -NH-MBHA- harpiksbærer.

Efter at den sidste Tyr-rest er blevet koblet til harpiksen, 5 fjernes BOC-gruppen med 45% TFA i CH2C12. Spaltning og afbe-skyttelse af den tilbageblivende beskyttede peptid-harpiks udføres som anført i eksempel 3. Det fraspaltede og afbeskyt-tede peptid opløses i 30% eddikesyre, underkastes fin "Sepha-cex G-50"-gelfiltrering, kationbytningskromatografi og til 10 sidst skillekromatografi som angivet i eksempel 1.

Syntesen gentages under anvendelse af en chlormethyleret harpiks til fremstilling af det samme peptid med en fri syre-C-terminal ved at følge proceduren beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 6 15 Til bestemmelse af peptidets effektivitet til at fremme frigørelsen af væksthormon udføres in vitro prøver under anvendelse af syntetisk hGRF(1-44)-NH2 ved sammenligning jævnsides med sekvimolære koncentrationer af det syntetiske oGRF-(l-44)-NH2 ifølge eksempel 5 som anført ovenfor i eksempel 2.

20 Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning viser, at i ækvimolære mængder har oGRF-(l-44) det syntetiske peptids fulde iboende biologiske virkning og tæt ved den samme virkningsstyrke. Ved flerdosefaktorudformede forsøg viser oGRF sig at have ca. den samme iboende aktivitet som hGRF(1-44)-25 NH2 og en specifik aktivitet, der er lig med ca. 70% af aktiviteten af hGRF(1-44)-NH2.

Kronisk administration af syntetiske pGRF-, bGRF- og oGRF-peptider til dyr i landbruget, især svin, kvæg, geder og får, eller andre varmblodede dyr forventes at fremme anabo1isme 18

DK 161835 B

og således forøge legemsvægten i henseende til muskelmasse. Anvendelsen inden for veterinærmedicin af arter af GRF, dvs. oGRF til får og bGRF til kvæg eller geder, er den ideelle situation, eftersom det injicerede eller på anden måde ad-5 ministrerede molekyle ikke vil være antigenisk, idet det er af samme art som det behandlede dyr. Det skulle også forøge mælkeproduktionen hos hundyr af arterne. Anvendelse inden for hydroponik til opdræt at fisk og andre koldblodede havdyr til acceleration af vækst kan også være vigtig. Administra-10 tion til dyr i en renhed så lav som ca. 5% kan være acceptabel og vil generelt blive udført under anvendelse af en kombination af peptidet og en veterinært acceptabel fast eller flydende bærer til dannelse af det, der til opfindelsens formål bredt betegnes som et farmaceutisk middel.

15 Syntetisk GRF eller de ikke-toksiske salte deraf i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer til dannelse af et farmaceutisk middel kan administreres til pattedyr, inklusive mennesker enten intravenøst, subcutant, intramuskulært, intranasalt eller oralt. Administrationen kan anvendes af 20 en læge til stimulation af frigørelsen af væksthormon, hvor den behandlede vært kræver en sådan terapeutisk behandling.

Den krævede dosis vil varieres med den pågældende, tilstand, der behandles, med alvorligheden af tilstanden og med varigheden af den ønskede behandling.

25 Sådanne peptider administreres ofte i form af farmaceutisk acceptable, ikke-toksiske salte, såsom syreadditionssalte eller metalkomplekser, f.eks. med zink, jern eller lignende (der betragtes som salte til opfindelsens formål). Eksempler på sådanne syreadditionssalte er hydrochlorid, hydrobromid, 30 sulfat, phosphat, maleat, acetat, citrat, benzoat, succinat, malat, ascorbat, tartrat og lignende. Hvis den aktive bestanddele skal administreres i tabletform, kan tabletten indeholde et bindemiddel, såsom tragacanth, majsstivelse eller gela-

Claims (10)

1. Syntetisk peptid, kendetegnet ved, at det har sekvensen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-R28~Arg-Gln- Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R4i“Val-Arg-Leu-Y, 30 hvor Y er OH eller NH2, og hvori R13 er Val eller Ile, R28 er Ser eller Asn, og R41 er Arg eller Lys, eller et ikke-toksisk salt deraf.

2. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R28 35 er Asn, og at R41 er Lys.

3. Peptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R^3 er Ile. DK 1618 3 5 B

4. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R28 er Ser, og at R41 er Arg.

5. Peptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R13 5 er val.

6. Syntetisk peptid med formlen ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at c-terminalen er amideret.

7. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-G1n-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-G1u-Gln-G1y-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2. 15

8. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-G1n-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln- i

20 G1 n-Gly-Glu-Arg-Asn-Gl·n-G 1 u-Gl n-6ly-Al a-Lys-Val - Arg-Leu-NH2 ·

9. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-25 Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-G1n-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2·

10. Middel til acceleration af væksten af varmblodede dyr (ikke mennesker), kendetegnet ved, at det omfatter 30 et peptid ifølge krav 1 og en veterinært acceptabel fast eller flydende bærer derfor. 35