DE2209836B2

DE2209836B2 - Neue insulinderivate sowie verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende arzneimittel

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Publication number: DE2209836B2
Application number: DE19722209836
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dipl.-Chem. Dr. 5101 Schmithof; Puls Walter Dr. 5600 Wuppertal Brandenburg
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-01
Filing date: 1972-03-01
Publication date: 1976-03-18
Also published as: IL41614A; JPS4897890A; DK145854C; US3847893A; IL41614A0; BE795998A; FR2181779A1; FR2181779B1; CH579917A5; GB1374562A; AT324589B; NL7302899A; DK145854B; SE420087B; DE2209836A1

Description

Es ist bereits bekanntgeworden, daß man die |nsulin-A-Kette mit der lnsulin-B-Kette vereinigen kann und dabei zum Teil Insulin erhält. Bei allen bisher bekannten Verfahren werden die getrennten Ketten vereinigt. Die Ausbeuten an Insulin sind in ilen Fällen sehr niedrig, weil theoretisch eine sehr große Zahl von Disulfiden entstehen kann, die A- und B-Ketten in unterschiedlichen Molverhältnissen entfalten. Hauptsächlich entstehen Kombinationsprodukte aus polymeren B-Ketten- und oligomeren A-Kettendisulfiden. Durch die Kombination von reduzierter B-Kette mit einem l,5fachen Überschuß _tn reduzierter Α-Kette läßt sich die Ausbeute an Insulin steigern (Y.-c. Du, R.-q. Jiang und C.-i. Tso u, Scicntia Sinica, 14, 229 [1965]), jedoch selbst bei der Verwendung eines fünffach molaren Überschusses an Α-Kette konnten nur 26% Insulin isoliert werden, wenn natürliche Ketten eingesetzt wurden (P.G. Katsoyannis, A.C. Trakatellis, S. Johnson, C. Zalut und G. Schwartz, Bio-Chemistry, 6, 2642 [1967]). Bei synthetischen Ketten lagen die Ausbeuten noch tiefer.

Als Hauptnachteil der bisherigen Verfahren sind niedrige Ausbeuten anzusehen, die auch durch ein wirtschaftlich nicht vertretbares Verwenden überschüssiger Α-Kette nicht entscheidend gesteigert werden können.

Es ist weiterhin bekanntgeworden, daß bei der Oxydation von reduziertem Proinsulin in vitro (D. F. Steiner und J. L. Clark. Proc, Nat. Acad., Sei., USA, 60, 622, [1968]) Proinsulin in einer Ausbeute von 50 bis 80% zurückgebildet wird. Proinsulin ist der einkettige Vorläufer des Insulins in der Biosynthese.

Hohe Kombinationsausbeuten an synthetischem Insulin sind im Prinzip über synthetisches Proinsulin erreichbar, dieser Weg weist jedoch die folgenden Nachteile auf:

1. Bis heute ist noch kein synthetisches Proinsulin bekannt.

2. Es bedeutet einen sehr hohen experimentellen Aufwand, eine Sequenz von 30 bis 33 Aminosäuren zusätzlich zu synthetisieren, um diese als Brücke zwischen dem Aminoende der A-Kette und dem Carboxylende der B-Kette zur Erhöhung der Kombinationsausbeute zu verwenden.

3. Proinsulin ist biologisch kaum aktiv, es muß in weiteren Reaktionsschritten enzymatisch zu Insulin gespalten werden. Ein spezifisches Spaltenzym ist noch nicht bekannt.

Es wurde gefunden, daß man vernetzte Insuline der vereinfachten Formel

HN^GIy C>—Cys — Cys

NH

in welchen die a-Aminogruppe von Glycin^A1 der Α-Kette mit der i-Aminogruppe von Lysin⁸²⁹ der B-Kette durch eine Dicarbonsäurebrücke der Formel darstellt, mit einem Überschuß eines aktivierten Derivates von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

-c—x—c—

Il Il

O O

(H)

45

verknüpft ist, wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatisch Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit Wasserstoffatomen und hydrophilen Gruppen abgesättigt sind, steht, erhält, wenn Derivate der Insulin-A-Kette der Formel (vereinfachte Darstellung)

21

Λ I^ L·,

(IV)

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Z für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht, in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Protonenakzeptoren so umsetzt, daß ein am Glycin^A1 monofunklionell substituiertes, aktiviertes A-Ketten-Derivat entsteht, dieses mit einem Derivat der Insulin-B-Kette der Formel (vereinfachte Darstellung)

H,N—Phe

Cys Cys

NH,

Lys

29

H₂N-GIy--Cys —Cys--Cys--Cys—Asn (III) in welcher Y eine abspaltbare Schwefelschutzgruppe worin Y die oben angegebene Bedeutung besitzt, ir polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwan von Proioncnakzeptoien reagieren läßt, vom so er-

ialtenen vernetzten Kettenderivat der Formel

HN

	Y S	Y S	Y S	--C- \|\| O	Y S	— Asn	i — Ala
CiIy	S Cys	"Cys	i Cys		Cys	I Lys
H₂N-	■—-—. Phe	~-—~-_ -Cys-	O	~-—-. ■ Cys. I
		I S Y		S Y

worin X und Y die oben angegebene Bedeutung haben, die Schwefelschulzgruppen Y entfernt und die Disulfidbindungen im wäßrigen Medium bei alkalischem pH unter Verdünnungsbedingungen oxydativ schließt.

Bei diesem Verfahren werden die im natürlichen Insulin vorkommenden Disulfidbindungen bevorzugt gebildet. Das Insulinderivat der Formel 1 wird vorzugsweise durch ein Verfahren, das Stoffe nach dem Molekulargewicht trennt, isoliert. Die lnsulinderivatc der Formel I weisen eine hohe zuckersenkende Wirkung auf.

Es ist als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß gemäß der erfindungsgemäßen Umsetzung die lnsulin-A-Kette mit der Insulin-B-Kette gezielt und in hoher Ausbeute ohne temporären Schutz der Aminogruppe des Phenylalanine¹" zwischen den Aminogruppen von Glycin^A1 und Lysin⁸²" verknüpft werden kann, weil man im Hinblick auf den Stand der Technik erwarten mußte, daß auch eine Substitution am Phenylalanin in beträchtlichem Ausmaß eintreten würde (D. Levy und F. H. C a r ρ e η t e r, Biochemistry, 6, 3559 [1967], D.G. Lindsay und S. Shall, Biochem. J., 121. 737 [1971]). Ebenso unerwartet ist, daß Nebenreaktionen an den OH-Gruppen der Tyrosin- und Serinreste (H. Zahn und F. Schade, Angew. Chem., 75. 377 [1963]) nicht auftraten.

Besonders überraschend ist ferner, daß bei der Oxydation eine spezifische Bildung der Disulfidbindungen zwischen den Halbcystinresten A 6 und Al 1. A*7 und B7 sowie A20 und B19 erfolgt und sich Insulinderivate der Formel 1 in hoher Ausbeute gewinnen lassen. Der Fachmann konnte zwar annehmen, daß sich unter Verdünnungsbedingungen die Bildung von polymeren Disulfiden zurückdrängen läßt, im Hinblick auf die zahlreichen statistischen Kombinalionsmöglichkeilen mußte jedoch erwartet werden, daß die monomeren Produkte aus einem Gemisch zahlreicher Isomerer bestehen und nur einen kleinen Teil des gewünschten Insulinderivates der Formel I enthalten würden.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen auf. So gelingt einmal die gezielte Verknüpfung von A- und B-Ketten in hoher Ausbeute ohne Nebenreaktionen und ohne Schulz der Phenylalanin-aminogruppe. Nicht umgesetzte B-Kette wird in hoher Ausbeute zurückgewonnen. Entscheidend ist, daß die Bildung der lnsulin-Disulfidbindungen in wesentlich höherer Ausbeute als bisher erreicht werden kann.

Von besonderer Bedeutung ist. daß die Brücke zwischen den Aminogruppen nicht in einer weiteren Reakttonsstufe abgespalten zu werden braucht unc daß es nicht erforderlich ist, Insulin selbst aus deir Reaktionsprodukt zu gewinnen, da sich die vernetzte! Insuline als biologisch aktiv erwiesen.

Verwendet man Rinderinsulin-A-Kette in dei Tetra-S-sulfonatform. Rinderinsulin-B-Kelte in de Bis-S-sulfonatform und Adipinsäure-bis-p-nitrophe nylester als Brückenreagenz, so kann der Reaktions ablauf durch das folgende (vereinfachte) Formel schema wiedergegeben werden:

O₇N

O—C—(CH₂L-C-O-C O

NH₇

Y S

Y S

OH

1 I I I I

+ H₂N- GIy Cys—Cys Cys Cys —Asn

[A(SYU]

O,N-

O — C—(CH₂J₄- -C —NH-GIy Cys — Cys Cys Cys — Asi

γ υ

S S

Y Y Y

SSS
ι I

HN- GIy Cys — Cys-- Cys

NH,

,N--PIk Cys Cys Lys -Ala LB(SY)₂]

Y
S

Cvs — Asn

—O,N-

-OH

■c-

"(CH₂

(Vl)

H₂N- Phc	-Cys- I	H
	I S	S
	Y
H	H
S	S

Cvs	Lys — Ala
f S Y
H S I
I Cys-	— Asn

1 I i

HN- GIy Cys— Cys ■- Cys

(VlI)

H₂N-PhC

Cys

In der Formel III steht A(S-YU rurd«_R.nde_. insulin-A-Kette in der Tetra-S-sulfonatform (Y-bU I in der die Aminogruppc und alle anderen ™kuonc"tn Gruppen in freier Form (ungeschützt) ^«ten Außefdcr Rinderinsulin-A-Kette könne,«ebensogut die A-Kctten mit der Sequenz anderer Insul nc Anwendung finden, z. B. von Human, Schal . Schweine, Wal- oder Fischmsulin.

D., Ketten können entweder in bekannte. We se aus natürlichem Insulin gewonnen werden, vorzu s weise durch oxydative Sulphitolysc: (J L B - · ^c> und R D Cole J. Diol. Chem.. 234. 1733 [1959J). oScr mine!; bekannter Methoden der ^g'hcn,«

aufgebaut werden (z.B. H. Ζ«"«:%ηΑ und B. Gut te, Z. Naturforsch.. 21b. 763 Γ WW Y kann außer SOf auch andere. abspaHbarc Schwefelschutzgr_liPPcn bedeuten,w,es,emde^P pm chemie üblich sind. z.B. SCH₂CH., (LJ. wc ι t Hoppc-Scylcrs Z. physiol. Chcm.. 3M\ 1421 (I969J)

Cys Lys —AIa

A 30

Oic Aminogruppc muß frei sein, alle anderen funktio ncllcn Gruppen können mit den in der Pcptidchemii üblichen Schutzgruppen substituiert sein.

Entsprechend slelll B(S—Y)₂ die Rindcrinsulin B-Kette vorzugsweise in der Bis-S-sulfonatform da (hier ist Y = SOf). in der die ι-Aminogruppc an Lysin⁸²'¹ in freier Form vorliegt und auch alle anderei funktioneilen Gruppen ungeschützt sind.

Ebenso können B-Ketten mit der Sequenz andere Insuline Anwendung finden, z. B. von Human-, Schaf Schweine-, Wal- oder Fischinsulin.

Die Ketten können entweder in bekannter Weis aus natürlichem Insulin gewonnen werden, verzug« weise durch oxydative Sulphitolysc. oder mittel bekannter Methoden der Pcplidchcmic aufgcbai 6_S werden (zum Beispiel H.Zahn und G. Sch m i d t Tetrahedron Letters 5095 [1967]).

Y kann außer SO; auch andere, abspaltbar Schwcfclschiitzgnippcn bedeuten, wie sie in der Peptic

609 512/4

ίο

chemie üblich sind, z.B. SCH₂CH, (U. Weber, Hoppe-Seylers Z. physiol. Cheni., 350, 142] [1969]). Die i-Aminogruppc am Lysin"²'' muß frei vorliegen, alle anderen funktionellen Gruppen können mit den in der Pcptidchemie üblichen Schutzgruppen versehen sein.

Die eilindungsgemäß verwendbaren bifunktionellcn Verbindungen sind bereits bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden (H. Zahn und F. Schade, Chem. Ber., 96, 1747 [1963], J. Schnell und H.Zahn, Kolloid-Z., 203, 27 [1965], H. Zahn und M. Bahra, Forschungsber.des Landes Nordrhein-Westfalen Nr. 1897, L. Brandt, Herausg., Westdeutscher Verlag, Köln und Opladen, 1967), in der Regel aus der Dicaibonsiiure, dem substituierten Phenol und Dicyclohexylcarbodiimid. Als Beispiele seien genannt". Aliphatischc Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel ZOC—(CH₂),,—COZ, in denen die Carboxylgruppe durch den Rest Z aktiviert ist, Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester, Pimelinsäure-bis-N-hydroxysuccinimidester, Korksäure bis-2,4,5-trichlorphenylester, Azelainsäure-bis-pentachlorphenylester.

Als Verdünnungsmittel bei der Darstellung der Kettenderivate können alle polaren organischen Lösungsmittel verwendet werden, in denen sich die Insulinketten und ihre Derivate lösen. Als Beispiele seien Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid genannt.

Die mercaptolytische Abspaltung der Schwefel-Schutzgruppen sowie die Bildung der Disulfidbindungen erfolgt im wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten Medium.

Als Protonenakzeptoren können alle bei der Peptidsynthese üblichen basischen Verbindungen verwendet werden, z. B. Triethylamin oder N-Methylmorpholin. Bei der Schulzgruppenabspaltung und Bildung der Disulfidbindungen im wäßrigen Medium können beispielsweise Ammoniumhydroxid oder Alkalihydroxide, wie Natriumhydroxid, Hydrogencarbonate, wie Ammoniumhydrogencarbonat, oder Carbonate, wie Natriuncarbonat, verwendet werden. Ferner Puffersubstanzen, wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder Glycin, sowie organische Basen, wie Methylamin.

Als Reduktionsmittel dienen beispielsweise Mercaptane wie //-Mercaptoäthanol oder Thioglycolsäure. es kann auch elektrolytisch reduziert werden.

Als Denaturierungsmittel dient beispielsweise Harnstoff, als Oxydationsmittel für SH-Gruppen z. B. Luftsauerstoff.

Bei der Darstellung der Kettenderivate arbeitet man im allgemeinen bei Temperaturen zwischen 0 und 40⁰C, bei der Reduktion zwischen 0 und 100° C, bei der Bildung der Disulfidbindungen durch Oxydation zwischen 0 und 30⁰C.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man das Kettenderivat der alleemeinen Formel (s. Formel VI, S. 7)

60

A(S-Y)₄-C-X-C-B(S-Y)₂

Dimethylsulfoxid, unter kräftigem Rühren eine Lösung von I mMol Insulin-A-Kette mit reversibel geschützten SH-Gruppen, z. B. A-Kettcn-lctra-S-sulfonat. und vorzugsweise 5 bis 10 mMol Säurebinder, /B. 1 riäthylamin, im organischen Lösungsmittel tropft. Vorzugsweise wird das gleiche Lösungsmittel verwendet, in diesem Falle Dimethylsulfoxid. Unter diesen Bedingungen reagiert das Dicarbonsäurederivat monofunktionell mit der Aminogruppe der A-Kclte zu einem aktivierten Derivat, das durch Ausfällen mit beispielsweise Methanol/Äther (1 : 10), vorzugsweise 15 bis 30 Minuten nach Beendigung der Zugabe des Dicarbonsäurederivales isoliert wird. Nach gründlichem Waschen mit z. B. Methanol/Äther wird das aktivierte A-Kettenderivat im organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylsulfoxid, gelöst, wobei die Konzentration vorzugsweise 10 bis 20 μΜοΙ/ml beträgt und zu einer gerührten Lösung von 1 bis 5. vorzugsweise 1.2 bis 1,3,Äquivalenten Insulin-B-Kctte. z.B. B-Ketten-bis-S-sulfonat und 5 bis 15, vorzugsweise etwa 7 mMol/Base pro mMol B-Kette, bei einer Konzentration von vorzugsweise 5 bis 10 uMol B-Kette/ml langsam zugetropfl, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten.

Nach einer weiteren Reaktionszeit von vorzugsweise 15 bis 20 Stunden unter Rühren wird das Reaktionsprodukt durch ein nach dem Molekulargewicht oder der Ladung trennendes Verfahren isoliert, erforderlichenfalls durch eine Kombination von beiden. Beispielsweise wird an Sephadex G-50 fine* in 0,05 Ammoniumbicarbonatlösung chromatographierl. Die Abspaltung der Schwefelschutzgruppen Y, z. B. der S-Sulfonatgruppen, sowie die Oxydation der SH-Gruppen wird in Anlehnung an die von While (F. H. White, Methods in Enzymology, Bd. 11. 481 [1967]) für Ribonuclease angegebenen Verfahren durchgeführt. Eine Lösung des Kettenderivates. die zwischen 2 und 5 μΜοΙ/ml enthält, wird mit einem Überschuß eines Reduktionsmittels (40 bis 2(Xl Mol des Reduktionsmittels pro Mol substituierte Schwefclgruppe), vorzugsweise eines Mercaptans wie Mercaptoäthanol in Gegenwart eines Denaturierungsmittels wie Harnstoff, bei pH-Werten zwischen 7 und 9. vorzugsweise bei pH 8,5 und einer Temperatur zwischen 0 und 40⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur zwischen 3 und 10 Stunden umgesetzt. Dann isoliert man das reduzierte Kettenderivat durch Ausfällen, vorzugsweise durch Zugabe eines mil Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wo bei zugleich zur Vermeidung einer Oxydation dei SH-Gruppen bei saurem pH-Wert gearbeitet wire (beispielsweise nach F. H. White, J. Biol. Chem. 236, 1353 0961], mittels Aceton/HCl) oder durcl Gelfiltration im sauren Medium.

Die Bildung der erfindungsgemäßen Insulinderivat« erfolgt durch Oxydation der reduzierten Ketten derivate unter Verdünnungsbedingungen (zwischei 0,01 und 0,05, vorzugsweise 0,02 _μΜο1 Kettenderiva pro ml) vorzugsweise im alkalischen Medium (zwischei pH 7,5 und 10,8, insbesondere bei pH 8,5 bis 9,0 und bei Temperaturen zwischen 0 und 30⁰C, Vorzugs weise zwischen 18 und 25⁰C. Die Isolierung de Insulinderivate erfolgt durch Gefriertrocknung un< Trennung

_c .· ™ _x- . ^^{iner Trennu}ng nach Molekulargewicht, z. B. ai

her, indem man zu einer Losung von 5 bis 20 mMol 65 Sephadex G-50 fine® in 10%iger Essigsäure

der aktivierten Dicarbonsäure, deren Konzentration Die neuen Wirkstoffe weisen eine blutglucose

vorzugsweise zwischen 0,05 und 0.2 Mol/l betragt, senkende Wirkung auf. Sie eignen sich deshalb zu

im vorzugsweise organischen Lösungsmittel, z.B. Behandlung von Diabetikern im allgemeinen um

besonders solchen, die infolge Antikörperbildung gegen Rinder- und/oder Schweineinsulin hohe Dosen herkömmlicher lnsulinpräparale benötigen, deren Bedarf aber erfahrungsgemäß nach Umstellung auf ein neues Präparat, gegen das keine Antikörper gebildet werden, durch niedrigere Dosen zufriedenstellend gedeckt ist.

Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen und Suspensionen, besonders Kristallsuspensionen.

Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere zur parenteralen Injektion.

Versuchsanordnung zur Untersuchung
des Insulingehaltes von Insulinderivaten

Insulin senkt die Blutglucose von Ratten. Diese Wirkung ist in einem bestimmten Bereich dosisabhängig. Durch vergleichende Berechnung der Blutglucosesenkung bei Ratten nach subeutaner Injektion von Präparaten mit unbekannter Insulinwirksamkeit und der Blutglucosesenkung nach ^.ibcutaner Injektion von Insulin mit bekanntem Wirkstoffgehalt, wird die blulglucosewirksame Insulinaktivität der Insulinderivate ermittelt. Einzelheiten siehe H. Zahn, E. Drechsel und W. Puls: Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem., 349, 385 bis 389 (1968).

Wirkstoff

Blulglucosewirksame
Insulinaktivität/1 mg
in % vom Insulinsiandard (25.4 lE/mg)

N^aA1,N^cB2M-AdipoylinsuIin 41

Beispiel 1

N^lA1,N^£B29-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat

3°

35

40

Zu einer Lösung von 38,8 mg (100 μΜοΙ) Adipinsäure-bis-p-nitrophenylester in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 28 mg (etwa 10 μΜοΙ) Rinderinsulin-A-Kette in der Tetra-S-sulfonatform in 1,5 ml Dimethylsulfoxid und 7 μΐ Triäthylamin innerhalb von 15 Minuten bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionsmischung wurde noch 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das A-Kettenderivat durch Zugabe von Äther, der 10% Methanol enthielt, gefällt, abzentrifugiert und mehrfach mit Äther gewaschen. Der Rückstand wurde in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Rinderinsulin-B-Kette (etwa 27 uMol) in der Bis-S-sulfonatform und 25 μΐ Triäthylamin in 4 ml Dimethylsulfoxid getropft.

Die Reaktionsmischung wurde noch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann 1 Stunde gegen fließendes Wasser und zweimal je 1 Stunde gegen 1 1 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung (pH 8,2) dialysiert. Sodann wurde die Lösung auf eine Säule (3 χ 200 cm) mit Sephadex G-50 fine im gleichen Lösungsmittel äquilibriert, aufgetragen und Chromatographien (Fig. 1).

Nach der Gefriertrocknung wurden erhalten:

Fraktion 1 (schraffiert):

29.3 mg (44% der Theorie) Ν^αΛ\ N^tB2l)-Adipoyl-A-kelten-leli"a-S-sulfonat-B-!:etlen-bis-S-sulionat.

Fraktion 2:
65 mg B-Ketten-bis-sulfonat.

Analyse der Fraktion I:

Papierelektrophoresc bei pH 2: Reinheit 90%.

R_A (relative Beweglichkeit der Bande, bezogen auf A-Ketten-letra-S-sulfonat) = 0,4.

UV-Sp-?kt™>in. Extinktion bei 276 nm:/j?«, ⁼ 5600. Fig. 1 zeigt das Elutionsdiagramm der Gclchromatographie des Rohproduktes aus der Synthese im Beispiel 1 an Sephadex G-50 line (Säulendimensionen 3 χ 200 cm) in 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung vom pH 8,2.

Durchlaufgcschwindigkcit: 90 ml/Stunde.
Abszisse: Elutionsvolumcn in Milliliter.
Ordinate: Extinktion bei 254 nm (Nanometer).

1. Maximum (schraffiert):
N^aA1,N^£B29-Adipoyl-A-keUen-telra-S-sulfonat-B-ketlen-bis-S-sulfonat.

2. Maximum:

Nicht umgesetztes B-Ketien-bis-S-sulfonat.

Beispiel 2

N^lAI .N^£B2t)-Azelaoyl-A-kcUen-tclra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat

Zu einer Lösung von 107.5 mg (250 μΜοΙ) Azelainsäure-bis-p-nitrophen\ tester in 3 ml Dimethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 70 mg (26 iiMol) Α-Kette in der S-sulfonalform und 20 μΐ Triäthylamin in 4 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 20 Minuten getropft. Nach weiterem Rühren für 20 Minuten wurde das Kettenderivat mit Methanol/ Äther (1 : 10) ausgefällt, abzentrifugiert, gründlich mit Methanol/Äther gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.

Das Kettenderivat wurde in 1,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung getropft, die 115 mg (32 μΜοΙ) B-Kette in der S-sulfonatform und 30 μΐ Triäthylamin in 5 ml Dimelhylsulfoxid enthielt. Die Mischung wurde noch 3¹I₂ Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann 1 Stunde gegen fließendes Wasser und 2mal je 1 Stunde gegen 1 1 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung dialysiert. Anschließend wurde die Lösung (25 ml) auf eine Säule (3 χ 200 cm) mit Sephadex G-50 aufgetragen und. wie bei Beispiel 1 beschrieben, Chromatographien.

Ausbeuten:

Fraktion 1:

64 mg (39,2% der Theorie) N"^A1.N^cB29-Azelaoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat.

Fraktion 2:

54 mg B-Ketten-bis-S-sulfonat.

Analyse der Fraktion 1:

UV-Spektrum. Extinktion bei 276 nm:
r₂₇₆ = 5340; R_A = 0,5.
Elektrophoretische Reinheit: 95%.

Beispiel 3

N'^¹,N^lB29-Suberoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat

Zu einer Lösung von 208 mg (500 uMol) Korksäurebis-p-niirophenyiester in 6 mi Dimethyisuifoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 135 mg (50 μΜοΙ) A-Ketten-tetra-S-sulfonat (aus Rinderinsulin) und 40 μΐ Triäthylamin in 7 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 20 Minuten bei Raumtemperatur ge- ίο tropft. Die Reaktionsmischung wurde noch 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in 3,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 230 mg (62 μΜοΙ) B-Ketten-bis-S-sulfonat in 10 ml Dimethylsulfoxid und 60 μΐ Triäthylamin bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionslösung wurde noch 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie bei Beispiel I beschrieben, dialysiert und Chromatographien. Nach der Gefriertrocknung wurden erhalten:

Fraktion I:

153,4 mg (48% der Theorie) N^lA1.N^tB2l)-Sube-

royl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-

S-suIfonat.
Fraktion 2:

64 mg B-Ketten-bis-S-sulfonat.

Analyse der Fraktion 1:

UV-Spektrum, Extinktion bei 276 nm:
,_27(i = 5450; R_A = 0,43.
Elektrophoretische Reinheit: >95%.

Beispiel 4
N^aA1,N^tB29-Adipoylinsulin

60 mg (etwa 8,5 μΜοΙ) des vernetzten KettenderivatesN "^A1,N^f ^-Adipoyl-A-ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat (s. Beispiel 1) wurden in 3 ml 8 M Harnstofflösung gelöst, die Lösung wurde mit Methylamin auf pH 8,6 eingestellt. Dann wurde 10 Minuten lang Stickstoff durchgeleitet, mit 200 μΐ (3,1 mMol) /y-Mercaptoäthanol versetzt und nochmals 10 Minuten lang Stickstoff durchgeleitet. Nach dreieinhalbstündiger Reduktionszeit wurde die Lösung auf etwa 0⁰C gekühlt und das Prolein mit einem Gemisch aus kaltem Aceton und 1-NHCL (im Verhältnis 39:1) gefällt, abzentrifugiert, zweimal mit kaltem Äther gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet.

Das reduzierte Kettenderivat wurde in 2 ml 1 -N Ammoniak gelöst und die Lösung mit 600 ml Ammoniumbicarbonatlösung verdünnt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8,5 bis 8,6 blieb die Lösung zur Oxydation bei Raumtemperatur an der Luft stehen. Nach 5 Tagen wurde lyophilisierl.

Auswaage: 141 mg, Proteingehalt (spektroskopisch bestimmt: etwa 36%).

135 mg wurden in 2 ml Eisessig und 8 ml Wasser gelöst, der unlösliche Anteil (16,7 mg nach dem Trocknen) wurde abzentrifugiert. Der überstand wurde auf eine Säule (3 χ 200 cm) mil Sephadex G-50 (ine aufgetragen, die mit 10%iger Essigsäure äquilibriert war, und im gleichen Lösungsmittel Chromatographien. Das Eluat unter dem Maximum (s. F i g. 2) wurde dreimal gegen je 1 Liter Jest. Wasser dialvsien und anschließend lyophilisierl.

Ausbeute:

31,6 mg (57,5% der Theorie bei einem Protein-

ι 1. nno/ \

genau vun ?\t /uy.

Analyse des Adipoylinsulins:

UV-Spektrum, Extinktion bei 278 nm:
_f278 = 5540.

Celluloseacetatelektrophorese bei pH 2: eine schärft Bande mit gleicher Beweglichkeit wie authentischem Adipoylinsulin, R_1n, (Beweglichkeit, bezogen auf Insulin) = 0,74.

Das Präparat kristallisiert aus zinksalzhaltigem Citratpuffer nach Schlichtkrull (Acta Chen: Scand., 10, 1455, 1956) in der gleichen kugeliger Kristallform wie eine Parallelprobe aus authentischer. Adipoylinsulin.

F i g. 2 zeigt das Elutionsdiagramm der GeJchromatographie des Oxydationsproduktes aus Beispiel *! an einer Säule mit Sephadex G-50 (ine (Dimensionen 3 χ 200 cm/ in i0%iger Essigsäure. Durchfiußgeschwindig! eil 35 ml/Stunde.

Abszisse: Elutionsvolumen in Millimeter.

Ordinate: Extinktion bei 254 nm (Nanometer).

Die Fraktion mit dem Maximum bei 685 mi (schraffiert) enthält das N*^A1,N^c29-Adipoy!insulin.

Der zur Ordinate parallele Pfeil soll die Lage des Adsorptionsmaximums im Falle des nativen Rinderinsulins (bei 700 ml) markieren.

Beispiel 5

N'^AI ,N^rB29-Oxalyl-A-ketlcn-tetra-S-sulfonut-B-ketlen-bis-S-sulfonat

Zu einer Lösung von 86 mg (260 μΜοΙ) Oxalsäure bis-p-nitrophenylesterin 5 ml Dimethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 70 mg (etwa 26 μΜοΙ) A-Ketten-tetra-S-sulfonat (aus Schweineinsulin) und 36 μΐ (260 μΜοΙ) Triäthylamin in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 20 Minuten bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionsmischung wurde noch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in 2,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und innerhalb von 30 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 187 mg (etwa 52 ·λΜο1) B-Kctten-bis-S-sulfonat in 8 ml Dimethylsulfoxid und 87 μΐ (620 uMol) Triäthylamin bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionslösung wurde noch i 7 Stunden

5S bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie bei Beispiel 1 beschrieben, dialysiert und chromatographiert. Nach der Gefriertrocknung wurden erhalten:

Fraktion 1:
88 mg (54% der Theorie) N"^A1,N^tB2"-Oxalyl-A-

ketten-tetra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat.
Fraktion 2:

95 mg B-Ketten-bis-S-sulfonat.

Analyse der Fraktion 1:

UV-Spektrum, Extinktion bei 276 nm:
<_21h = 5380: R_A =0,46.
Eleklrophoretische Reinheit: 90%.

35

Beispiel 6

N^jAI,N^EB29-Tridecandioyl-A-keUen-tetra-S-sulfonat-B-kC'en-bis-S-sulfonat

Zu einer Lösung von 1 K) mg (250 uMoli Tridecandisäure-bis-N-hydroxv-succinimidester in 5 ml Dimethylsulfoxid wurde unter kräftigem Rühren eine Lösung von 135 mg (etwa 50 μΜοΙ) A-Ketten-tetra-S-sulfonat (aus Schweineinsulin) und 56 μΐ Triäthylamin (400 μΜοΙ) in 5 ml Dimethylsulfoxid innerhalb von 30 Minuten bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionsmischung wurde noch 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in 4 ml DimethylsuliV.xid gelöst und innerhalb von 60 Minuten unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 290 mg (etwa 80 uMol) B-Ketten-bis-S-sulfonal in 10 ml Dimethylsulfoxid und 112μ1 (80OuMoI) Triäthylamin bei Raumtemperatur getropft. Die Reaktionslösung wurde noch 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann, wie bei Beispiel I beschrieben, dialysiert und Chromatographien. Nach der Gefriertrocknung wurden erhallen:

Fraktion 1:

196 mg (61% der Theorie) N^aA1,N^tB29-Tridecan-

dioyl-Ä-ketten-tetra-S-sulfonat-B-keiten-bis-S-

sulfonat.
Fraktion 2:

104 mg B-Ketten-bis-S-sulfonat.

Analyse der Fraktion 1:

UV-Spektrum, Extinktion bei 276 mn:
f₂₇„ = 5280; R_A = 0,43.
Elektrophoretische Reinheit: etwa 95%.

Beispiel 7

N*^A1,N^£B29-Oxalylinsulin

60 mg (etwa 8,5 μΜοΙ) des vernetzten Keltenderivates N*^A1 .N^cB29 - Oxalyl -A- ketten - tctra - S - sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat (s. Beispiel 5) wurden in 3 ml entlüftetei 8 M Harnstofflösung gelöst, die 300 μΐ (4,25 mMol) /i-Mercaptoäthanol enthielt und mit Methylamin auf pH 8,6 eingestellt war. Der pH-Wert wurde mit Methylamin auf 8,6 nachgestellt, dann wurde 10 Minuten lang Stickstoff durch die Lösung geleitet und im verschlossenen Gefäß 4 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

Das reduzierte Kettenderivat wurde, wie bei Beispiel 4 beschrieben, durch Ausfällen isoliert und in etwa 3 ml 1-N Ammoniak gelöst. Diese Lösung wurde schnell mit 850 ml 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung verdünnt, sodann wurde ein pH von 8.5 mit Ammoniak eingestellt. Die Lösung blieb im offenen Kunststoff-Becherglas bei Raumtemperatur stehen, bis der Thiolgehall auf I % des Anfangswertes abgesunken war. Nach 110 Stunden wurde mil Eisessig auf einen pH-Wert von etwa 5 angesäuert und lyophilisiert.

Der Rückstand wurde wie bei Beispiel 4 gelöst und an Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure Chromatographien.

Das Elutionsdiagramm zeigte nur ein Maximum (F.lutii>ns\olumen 770 ml). Die Gefriertrocknung des Eluaies ergab 39 mg (71 % der Theorie) Oxalylinsulin.

Analyse des Oxalylinsulins:
' UV-Spektrum. Extinktion bei 27fc run:

,,^ = 5940.

Celluloseacetatelektrophorese bei pH 2:
eine scharfe Bande, R,„_s (Beweglichkeit, bezogen auf Insulin) = 0,77, identisch mit authentischem Oxalylinsulin.

Das Präparat kristallisiert aus zinksalzhaltigem Citratpuffer prismenförmig.

Beispiel 8
N^aA1,N^cB29-Suberoylinsulin

60 mg (etwa 8,3 μΜοΙ) des vernetzten Kettenderivates N^aA\N^£B29 - Suberoyl - A - ketten - tetra - S-sulfonat - B - ketten - bis - S - sulfonat (s. Beispiel 3) wurden mit 300 ul /.-Mercaptoäthanol (4,25 mMol) 4 Stunden reduziert, wie bei Beispiel 7 beschrieben. Das reduzierte Kettenderivat wurde wie im Beispiel 4 isoliert und getrocknet.

Das reduzierte Kettenderivat wurde in 3 ml 1-N Ammoniak gelöst, und die Lösung schnell mit 550 ml einer 0.05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung. die mit Ammoniak auf pH 9.5 eingestellt war, verdünnt. Sodann blieb die Lösung im offenen Kunststoff-Becherglas 50 Stunden bei Raumtemperatur an der Luft stehen. Nach dieser Zeit wurde mit Eisessig auf pH 5 angesäuert und lyophilisiert.

Der Rückstand wurde in 3 ml Eisessig und 15 ml Wasser gelöst und an einer Säule (3 χ 200 cm) mit Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsäure Chromatographien, wie bei Beispiel 4 beschrieben. Das Elutionsdiagramm (vgl. F i g. 2) zeigte nur ein Maximum (Elutionsvolumen etwa 700 ml). Die Gefriertrocknung des Eluates (vgl. Beispiel 4) ergab 41 mg (76% der Theorie bei einem Proteingehalt von 90%).

Analyse des Suberoylinsulins:

UV-Spektrum. Extinktion bei 278 mn:

_f278 = 5700.

Celluloseacetatelektrophorese bei pH 2:

eine scharfe Bande, R_lns (Beweglichkeit, bezogen auf Insulin) = 0.75.

Das Präparat kristallisiert aus zinksalzhaltigem Citratpuffer (vgl. Beispiel 4) nadeiförmig.

Beispiel 9
N^jA'.N^cB2"-Azelaoylinsulin

60 mg (etwa 8,3 μΜοΙ) des vernetzten Kettenderivates N^jA1.N^tB2t'-Azelaoyl-A-keUen-telra-S-sulfonat-B-ketten-bis-S-sulfonat (s. Beispiel 2) wurden wie bei Beispiel 7 mit 300 μΐ (4,25 mMol) /i'-Mercaptoäthanol reduziert. Die Isolierung des reduzierten Derivates erfolgte wie bei Beispiel 4 beschrieben.

Das reduzierte Keltenderivat wurde in 3 ml 1-N Ammoniak gelöst, und diese Lösung schnell mit 600 ml einer 0.05 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung verdünnt. Durch Zugabe von Ammoniak wurde ein pH von 9 eingestellt. Die Lösung blieb im offenen Kunstsloff-Bechcrglas 120 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Der pH-Werl wurde in Abständen von 12 bis 15 Stunden geprüft und. falls erforderlich, korrigiert. Nach Beendigung der Oxi-

dation wurde mit Eisessig auf pH 5 angesäuert und ^Das ^^^„ίΑωβΗΜ Liiert und^ in

lyophiHsiert. . . . ...

Der Rückstand wurde wie bei Beispiel 4 gelost
und an Sephadex G-50 fine in 10%iger Essigsaure
Chromatographien. Die Gefriertrocknung des Huals > m«.·,„.-.----^-

unter dem M-i-^uUo^olumen etwa 750 ml) De ^b^ ^ ^ ergab 41,5 mg (76% der lheone).

c ■ - iniOlüCliail oui -'» ,»n

Analyse des Azelaoylinsulins: _war. Nach 100 Stunden wurde gegen

UV-Spektrum, Extinktion bei 278 nm: _{|0 säure} dialysiert und anschaltend ivc f ₇₇₈ = 5820. , Rückstand wurde in 2 ml

Celluloseacetatelektrophorese bei pH f. _{e]öst undi w}i_e bei Beispiel u_rnmilto..raDhiert i

eine scharfe Bande, R_1n (Beweglichkeit, bezogen ^._{50 fine in ]0}o_/oiger Essigsaure ^romatofcraphjert

auf Insulin) = 0,77. Das Eluat unter dem Maximum <^E]"^"^°™

Kristallform: sehr kleine Nadeln. ,_{5 76}0 ml wurde lyophiHsiert und ergab 38 mg (70/o der

Theorie) Tridecandioylinsulin. s

Beispiel 10 . .. ί

Analvse des Tridecandioylinsulins. j

_N.A_l5N£B2,._Tridecandloyhnsul,n UvSjSrum, Extinktion bei 276 nm: j

60 mg (etwa 8,3 _μΜοΙ) des vernetzten Ketten- 20 ^,,^teacetatelektrophores bei pH 2:

derivates N-*\N·«'-Tridecandioyl-A-ketten-««- ^,SSSSSSe JR^ (Beweglichkeit, bezogen

S-sulfonats-B-ketten-bis-S-sulfonat wurden mit 400 μΐ e je scharte bande. ,„

(5,7 mMol) ₍.-Mercaptoä,hanol 4 Stunden reduz.ert, äS^Äcnfönnig.

wie bei Beispiel 7 beschrieben. ^Nl

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von bifunktionell vernetzten Insulinderivaten der Formel

HN- GIy Cys — Cys Cys

H₁N-Phe -Cys

in welchen die a-Aminogruppe von Glycin*¹ der Α-Kette mit der f-Aminogruppe von Lysin⁸²⁹ der B-Kette durch eine Dicarbonsäu rebrücke der Formel

—C—X—C— (11)

verknüpft ist, wobei X für eine direkte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 15 C-Atomen, in der gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen ersetzt sind, und deren weitere Valenzen entweder nur mit Wasserstoffatomen oder mit WasserstofT-atomen und hydrophilen Gruppen abgesätligt sind, steht, dadurch gekennzeichnet, daß man Derivate der Insulin-A-Kette der Formel

Y
S

Y
S

ι I I I I 2i

H₂N—Gly — Cys —Cys — Cys — Cys—Asn

(HI)
in welcher Y eine abspaltbare Schwefelschutz-

-χ-Cys—Asn

"NH

Cys -—Lys —-

29

gruppe darstellt, mit einem Überschuß eines aktivierten Derivates von Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel

Z—C—X—C—Z

(IV)

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt und Z für einen die Carbonsäuregruppe aktivierenden Rest steht, in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Protonenakzeptoren zu einem an Glycin^A1 monofunktionell substituierten aktivierten A-Kettenderivat umsetzt und dieses mit einem Derivat der Insulin-B-Kette der Formel

Y
S

NH,

H₂N- Phe -- Cys - Cys Lys --

(V)

worin Y die oben angegebene Bedeutung besitzt, in polaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Protonenakzeptoren reagieren läßt, vom so erhaltenen vernetzten Kettenderivat der Formel

HN — GIy ■ Cys — Cys Cys

H₂N- Phe C

Y
S

Cys—Asn

NH

(Vl)

worin X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, die Schwefelschutzgruppen Y entfernt und die Disulfidbindungen im wäßrig alkalischen Medium unter Verdünnungsbedingungen oxydativ schließt und die erhaltenen bifunktionell vernetzten Insulinderivate durch ein Verfahren, das Stoffe nach dem Molekulargewicht trennt, isoliert.
2. Bifunktionell vernetzte Insulinderivate gemäß Formel 1 im Anspruch 1.
3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem bifunktionell vernetzten !nsulinderivat gemäß Formel 1 im Anspruch 1.