CH661746A5 - Verfahren zur herstellung von humaninsulin oder von threonin b30-estern von humaninsulin, oder von einem salz oder einem metallkomplex derselben, sowie diese ester. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben, oder zur Herstellung von ThreoninB30-Estern von Humaninsulin als Verbindungen der Formel II

(Thr(R2)-OR1)B30-h-In (II)

worin R1 eine Carboxyl-Schutzgruppe und R2 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeuten, oder von einem Salz oder einem Metallkomplex derselben, gemäss dem Oberbegriff des entsprechenden, nebengeordneten Patentansprüchen 1 und 2. Ferner betrifft die Erfindung die nach dem Verfahren hergestellten Threonin830-Ester von Humaninsulin.

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin bekannt. Beispiele solcher Verfahren sind unter anderem die Extraktion aus Humanpancreas, die Synthese aus entsprechenden Aminosäuren, gentechnische Verfahren und die Konversion von Schweineinsulin in Humaninsulin. Einige der Verfahren zur Konversion von Schweineinsulin in Humaninsulin verlaufen via Schweine-des-octapep-tid-(B23-B30)-Insulin und andere verlaufen via des(AlaB30)-Insulin.

Bei der Behandlung von Diabetes mellitus werden im allgemeinen Insulinpräparate auf der Basis von Schweine- oder Rinderinsulin eingesetzt. Rinder-, Schweine- und Humaninsulin zeigen kleinere Differenzen hinsichtlich ihres Aminosäureaufbaus. Die Differenz zwischen Human- und Schweineinsulin ist auf eine einzige Aminosäure begrenzt: Die B30-Aminosäure von Humaninsulin ist Threonin, währenddem die gleiche Aminosäure bei Schweineinsulin Alanin ist.

Ein Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin aus

5

10

15

20

25

30

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50

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3

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des(AlaB30)-Insulin wird in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 80 101 966 beschrieben (siehe dazu auch Nature 280 [1979], Seite 412). Gemäss der genannten Patentanmeldung wird die Amidierung bevorzugterweise in einem Medium ausgeführt, das 0 bis 65, speziell bevorzugterweise 40 bis 60% eines organischen Lösungsmittels enthält. Weiter liegt die bevorzugte Reaktionstemperatur zwischen 20 und 40 °C, wobei in allen Beispielen eine Temperatur von

37 °C eingehalten wird. Die Ausbeute der Verkupplung war, gemäss den drei Beispielen, 75, 80 und ungefähr 50%. Die genannte Ausbeute wurde übrigens mittels Hochdruckflüssigchromatographie bestimmt. Gemäss der angegebenen Veröffentlichung in Nature betrug die Ausbeute 73%.

Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von Humaninsulin aus des(AlaB30)-Insulin ist beschrieben in «Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium», Aachen, BRD, 1979. Gemäss dieser Veröffentlichung wurde die Amidierung in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60% organisches Lösungsmittel enthält. Die Reaktionstemperatur lag bei

38 °C. Die Ausbeute, welche wiederum mittels HPLC bestimmt wurden, lag bei 67%.

Noch ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin aus des(AlaB30)-Insulin ist beschrieben in «Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsingor, Dänemark, 1980».

Gemäss dieser Veröffentlichung wurde das Verfahren in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60% organisches Lösungsmittel enthielt. Wahrscheinlich lag die Reaktionstemperatur bei 37 °C. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten betrug die Ausbeute 85%. Nach 22 Stunden betrug der entsprechende Wert jedoch nur noch 70%.

Einer der Gründe für die niederen Ausbeuten der bekannten Verfahren liegt im Verlust von Insulin wegen unerwünschten Nebenreaktionen, beispielsweise der Bildung von DOI-ThrR2-OR'. In dieser Formel steht DOI für Schweine-des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin und R1 und R2 für die obengenannten Substituenten.

Das Ziel der hier beschriebenen Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, mittels dem die Ausbeute an Reaktionsprodukten extrem gesteigert werden konnte, bevorzugterweise auf über 90%.

Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, dass eine solche Ausbeute dann erreichbar ist, wenn die Wasserkonzentration in der Reaktionsmischung viel tiefer liegt als diejenige der bekannten Verfahren. Ebenso werden die gesuchten hohen Ausbeuten erreicht, wenn die Umsetzungen bei niedrigeren Temperaturen als diejenigen der bekannten Prozesse, ausgeführt werden.

Das Verfahren gemäss dieser Erfindung ist gekennzeichnet durch die in den nebengeordneten Patentansprüchen 1 und 2 angegebene Kombination von Verfahrensschritten.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann so ausgeführt werden, dass des(AlaB30)-Insulin, ein L-Threoninderivat der Formel (I) und Trypsin zusammen in einer Mischung aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst werden, gegebenenfalls in Anwesenheit einer Säure.

Die organischen Lösungsmittel, welche im erfindungsge-mässen Verfahren eingesetzt werden können, sind polare Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind. Es sind zugleich bevorzugterweise jene Lösungsmittel, welche Insulinverbindungen und Threoninester in hoher Konzentration zu lösen vermögen. Beispiele solcher geeigneter organischer Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, wie N,N-Dime-thylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Aceton, Tetrahydrofuran, Formamid und Acetonitril und protische Lösungsmittel wie Äthanol, Methanol, 2-Propanol und

1,2-Äthandiol. Die Natur des Lösungsmittels beeinflusst das System als Ganzes und ein Zusammenhang zwischen einem bestimmten Lösungsmittel und einem hohen Amidierungs-grad kann nicht auf ein anderes Lösungsmittel übertragen 5 werden. Die besten Ausbeuten wurden erhalten mit aproti-schen Lösungsmitteln und solche Lösungsmittel sind daher die bevorzugten bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Je nach verwendetem organischen Lösungsmittel, nach m gewählter Reaktionstemperatur und ob Säure anwesend ist oder nicht, sollte der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-0'«, bevorzugterweise zwischen 15 und 25 Vol.-% betragen.

Ein Vorteil des verringerten Wassergehaltes in der Reakti-h onsmischung ist die Verhütung von Nebenreaktionen. Auch durch Erhöhen des Säuregehaltes in der Reaktionsmischung wird der gleiche Effekt erreicht. Die Erhöhung an Ausbeute korreliert positiv mit einem niederen Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung. Um die Denaturierung des Enzyms in 2» der Reaktionsmischung wegen den niedrigen Wassergehalt zu verhüten, sollte die Reaktionstemperatur um einiges tiefer liegen als die Reaktionstemperatur von bekannten Verfahren in der Peptidsynthese mit Trypsin. d.h. tiefer als ungefähr 37 ~ C liegen.

- ' Der Trypsintyp ist nicht kritisch für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens. Trypsin ist ein gut charakterisiertes Enzym, welches in hoher Reinheit kommerziell erhältlich ist, und zwar vor allem aus Rinder- oder Schweinepräparaten. Es kann aber auch Trypsin von mikrobieller Her->n kunft eingesetzt werden. Zudem ist auch die Form des Tryp-sins für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens nicht kritisch, d.h. das Enzym kann kristallin (lösliche Form), immobilisiert oder sogar als Derivat (solange die Trypsinakti-vität beibehalten wird) vorliegen. Der Ausdruck «Trypsin» ^ wird hier verwendet, um die Trypsine aller Herkünfte und in allen Formen zu umfassen, welche die Amidierungsaktivität beibehalten. Der Ausdruck umfasst also auch Proteasen mit trypsinähnlicher Spezifizität, beispielsweise Achromabacter lyticus protease; siehe dazu Agric. Biol. Chem. 42, Seite 1443. ■,n Als Beispiele für aktive Trypsinderivate können die folgenden genannt werden: acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, Glutaraldehyd-behandeltes Trypsin und immobilisierte Trypsinderivate. Falls ein immobilisiertes Trypsin verwendet wird, wird es im Reaktionsmedium suspendiert.

Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und/oder Basen wie Pyridin, TRIS, N-Methylmorpholin und N-Äthylmorpholin können dem Reaktionsmedium zugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zu schaffen. Organi-sehe Säuren werden dabei bevorzugt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne solche Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10 Äquivalente pro Äquivalent L-Threoninderivat der Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an Säure ■' zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-derivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen, können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben werde.

Das Verfahren kann bei Temperaturen im Bereich zwi-n'' sehen ungefähr 37 °C und dem Gefrierpunkt der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden normalerweise bei ungefähr 37 " C durchgeführt, um so eine ungenügend hohe Umsatzgeschwindigkeit zu erreichen. Um jedoch die Inaktivierung von Trypsin zu h' vermeiden, ist es von Vorteil, das erfindungsgemässe Verfahren bei Temperaturen unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. Praktisch werden Reaktionstemperaturen von oberhalb ungefähr 0 °C bevorzugt.

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4

Die Reaktionszeit liegt normalerweise zwischen einigen Stunden und einigen Tagen, je nach Reaktionstemperatur und je nach der Menge zugesetzten Trypsins. Auch andere Reaktionsparameter können auf die Reaktionsdauer einen Einfluss haben.

Zu einem grossen Ausmass wird die Wirkung von Trypsin durch die gegenseitige Beeinflussung von Wasser und Lösungsmittel kontrolliert. Die gleiche Wirkung hängt aber auch vom Säure/Base-Verhältnis und von der Reaktionstemperatur ab. Diese Reaktionsbedingungen werden so gewählt, dass die Amidierungswirkung begünstigt wird und unerwünschte Nebenreaktionen, die ebenfalls durch das Trypsin katalysiert werden, unterdrückt werden. Die Verringerung des Wassergehaltes in der Reaktionsmischung zeigt die beiden zuletzt genannten positiven Wirkungen, führt aber auch zu einer Erhöhung der Geschwindigkeit, welche zur irreversiblen Denaturierung von Trypsin führt. Der zuletztgenannten Einwirkung kann jedoch zumindest teilweise dadurch entgegengewirkt werden, dass die Reaktionstemperatur erniedrigt wird. Durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur wird zwar auch die Amidierungsgeschwindigkeit kleiner, aber dieser Nachteil wird einfach durch Verlängerung der Reaktionsdauer wiedergutgemacht.

Das Gewichtsverhältnis zwischen eingesetztem Trypsin und des(AlaB30)-Insulin in der Reaktionsmischung liegt normalerweise ungefähr oberhalb 1:200, speziell bevorzugterweise oberhalb etwa 1:50 und unterhalb etwa 1:1.

Die ThreoninB30-Derivate von Humaninsulin, welche aus der genannten Amidierung resultieren, können durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt werden:

(Thr(R2)-OR')B30-h-In (II).

Darin steht h-In für den Human-des(ThrB30)-Insulinrest und R1 und R2 sind gleich definiert wie vorne in der Beschreibung.

Einsetzbare L-Threoninderivate der Formel (I) sind solche, in denen R1 eine Carboxylrest-Schutzgruppe ist, die vom ThreoninB30-Ester des Humaninsulin (Verbindung der Formel II) entfernt werden kann, ohne dass dabei die Insulinmolekel irreversibel und wesentlich geändert werden. Beispiele solcher Carboxylrest-Schutzgruppen sind folgende: Niederal-kyl wie Methyl, Äthyl und tert-Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl und 2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphe-nylmethyl sowie Gruppen der allgemeinen Formel CH2CH2SO2R3, mit R3 Niederalkyl wie Methyl, Äthyl, Propyl und n-Butyl. Geeignete Hydroxylrest-Schutzgruppen R2 sind solche, welche vom ThreoninB30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) so abgespalten werden können, dass dabei keine irreversible und wesentliche Änderung in der Insulinmolekel auftritt. Ein Beispiel einer solchen Gruppe R2 ist tert-Butyl.

Weitere Schutzgruppen, die eingesetzt werden können, sind solche aus «Wünsch: Methoden der Organischen Chemie» (Houben-Weyl), Band XV/1, herausgegeben von Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.

Ein Verfahren für die Herstellung von des(AlaB30)-Insulin ist auch in «Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiol. Chemie 359» (1978), Seite 799, ff. beschrieben.

Einige der L-Threoninderivate der Formel (I) sind bekannte Verbindungen; die anderen L-Threoninderivate können mittels _ialoger Verfahren erhalten werden.

Die L-Threoninderivate der Formel (I) können entweder als freie Basen vorliegen oder, zusammen mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren, als Salze davon. Bevorzugt sind dabei die Acetate, die Propionate, die Buty-rate und die Hydrohalogenide, beispielsweise die Hydrochlo-ride.

Bevorzugt werden die Reaktionsteilnehmer, d.h. das des(AlaB30)-Insulin und die L-Threoninderivate der Formel (I) in hohen Konzentrationen eingesetzt. Das Molverhältnis zwischen dem L-Threoninderivat der Formel (I) und dem 5 des(AlaB30)-Insulin liegt bevorzugterweise etwa oberhalb 5:1.

Die Konzentration des L-Threoninderivats der Formel (I) in der Reaktionsmischung sollte bevorzugterweise höher als 0,1 molar sein.

Von den ThreoninB30-Derivaten von Humaninsulin (Ver-10 bindungen der Formel II) kann das Humaninsulin mittels Entfernen der Schutzgruppen R1 und allfällig vorhandener Schutzgruppen R2 erhalten werden, und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden. Falls R1 Methyl, Äthyl oder eine der Gruppen -CH2CH2S02R3 mit R3 gemäss obiger Defi-15 nition ist, kann die genannte Schutzgruppe in schwach basischen Bedingungen in einem wässrigen Medium entfernt werden. Bevorzugterweise wird dabei bei einem pH-Wert zwischen 8 bis 12, speziell bei etwa 9,5 gearbeitet. Als Basen können eingesetzt werden: Ammoniak, Triäthylamin, Bicarbo-20 nat/Carbonat-Puffer oder Hydroxide von Alkalimetallen wie Natriumhydroxid. Falls R1 tert-Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann die genannte Schutzgruppe mittels Acidolyse entfernt werden, und zwar bevorzugterweise mit « Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann Wasser enthalten oder auch nicht; sie kann aber auch mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt sein wie beispielsweise Dichlormethan. Wenn R2 tert-Butyl ist, kann diese Schutzgruppe ebenfalls mittels der oben beschriebenen Acidolyse w entfernt werden.

Bevorzugte ThreoninB30-Derivate von Humaninsulin der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in denen R2 Wasserstoff ist. Diese Verbindungen werden hergestellt aus L-Threoninderivate der Formel (I), in denen R2 schon Was-serstoff ist.

Als Beispiele für Komplexe oder Salze von des(AlaB30)-Insulin kann das Zinksalz oder der Zinkkomplex davon angegeben werden.

Wenn die Reaktionsbedingungen gemäss dem oben 1,1 Gesagten ausgewählt werden, und wenn auch die Angaben der folgenden Beispiele dabei berücksichtigt werden, ist es möglich, eine Ausbeute von ThreoninB30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) zu erhalten, welche über 90%, ja sogar über 95% liegt.

45 Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von Humaninsulin, ausgehend von einem ThreoninB30-Derivat von Humaninsulin, ist die folgende:

1. Falls irgendwelche Rest-Trypsinaktivitäten nach der Amidierung vorliegen, ist es von Vorteil, wenn diese entfernt werden. Dies kann beispielsweise so geschehen, dass die Zustandsbedingungen derart verändert werden, dass Trypsin inaktiviert wird. Praktisch bedeutet das, dass man zum Beispiel in einem sauren Medium, und zwar unterhalb dem pH-Wert 3, arbeitet. Trypsin kann aber auch mittels Abtrennme-thoden entfernt werden, die gemäss dem Molekulargewicht agieren, beispielsweise mittels Gelfiltration an «Sephadex-G50»-Gel oder an «Bio-Gel P-30»-Gel in Essigsäure; siehe wiederum Nature 280, loc, cit.

2. Unreinheiten wie nicht umgesetztes des(AlaB30)-Insulin h" können mittels Anionen- und/oder Kationen-Austausch-

Chromatographie entfernt werde.

3. Anschliessend wird das ThreoninB30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) deblockiert und das Humaninsulin isoliert, beispielsweise mittels Kristallisierung,

h ' und zwar gemäss Methoden, die an und für sich bekannt sind.

Das so erhaltene Humaninsulin ist schon von einer annehmbaren pharmazeutischen Reinheit; es kann aber gemäss bekannter Methoden weiter gereinigt werden.

5

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Abkürzungen in dieser Beschreibung sind im Sinne der IUPAC-IUB Rules, Commission on Biochemical Nomenclature, 2nd Edition, Maryland 1975, eingesetzt und sollen auch entsprechend verstanden werden.

Jeder neue Gesichtspunkt in dieser Beschreibung sowie auch Kombinierungen solcher Gesichtspunkte werden als wesentlich betrachtet.

Das erfindungsgemässe Verfahren für die Herstellung von Humaninsulinderivaten und Humaninsulin wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Diese Beispiele sind nicht als Limitierung des Erfindungsgedankens zu betrachten, sondern zeigen nur einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel 1

10 mg Schweine-des(AlaB30)-Insulin wurden in 100 ul einer 10-M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 p.1 dieser Lösung wurden gegeben: 100 jxl einer 2-M-Thre-OMe (Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-Dimethylacetamid, 60 jxl N,N-Dime-thylacetamid, 15 |il Wasser und 10 ul einer Lösung von Trypsin (8% Gew./Vol.) in einer 0,05-M-Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Anschliessend wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt, mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert und dann in vacuo getrocknet. Die Ausbeute an Thr-OMeB30-h-In wurde mittels HPLC bestimmt.

Das Produkt wurde anschliessend in 2 ml einer 1-M-Es-sigsäurelösung gelöst. 100 (j.1 dieser Lösung wurden auf eine Kolonne von 4 x 200 mm gegeben, die mit «Nucleosil 5 C18» beschickt war. Das Material. wurde einer Umkehrphase-HPLC unterworfen, wobei als Eluent eine 0,2-M-Ammo-niumsulphat-Pufferlösung verwendet wurde, die auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt war. Die gleiche Lösung enthielt 26,8 Vol-% Acetonitril. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min wurde nach 18 Minuten des(AlaB30)-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten, (Thr-OMe)B30-h-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d.h. das (Thr-OMe)B23-des-hep-tapeptid-(B24-B30)-Insulin wurde nach 7 Minuten eluiert. 5 Die qualitative und quantitative Bestimmung der Proteine wurde ausgeführt aufgrund der Extinktion der verschiedenen Lösungen bei 280 nm. Die Analyse ergab die folgende Verteilung der Verbindungen:

(Thr-OMe)B30-h-In 97,1%

io des(AlaB30)-Insulin 2,5%

(Thr-OMe)B23-des-heptapeptid (B24-B30)-Insulin 0,4%

Beispiele 2 bis 16

Die Beispiele 2 bis 16, deren Parameter und Resultate in 15 den folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden analog dem Beispiel 1 ausgeführt. Die Reaktionsparameter, die gegenüber dem Beispiel 1 verschieden sind, sind in der genannten Tabelle aufgeführt. In allen Beispielen wurden 10 |il einer 8%igen Trypsinlösung in Wasser, 100 ul eines so organischen Lösungsmittels mit dem Threoninderivat der Formel (I) und 50 jxl Essigsäure mit 20% des(AlaB30)-Insulin zugegeben. Die Molarität des Threoninderivates der Formel (I) im genannten organischen Lösungsmittel und in der Essigsäurelösung ist ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. Die 25 Reaktionsdauer betrüg 24 Stunden. In Tabelle 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid, DMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethyl-sulfDMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethyl-M sulfoxid, NMP ist N-Methylpyrrolidon und THF ist Tetrah-ydrofuran. In demjenigen Fall, in dem (Thr-OBu')B30-h-In synthetisiert wurde, (Beispiel 15) wurde eluiert unter Verwendung einer Gradientenlösung in Acetonitril, und zwar von 26,8 bis 40 Vol.-%.

Tabelle 1

Beisp. Organ. Molarität an Molarität Zusätzliche

Nr. Lösungs- Threonin- an mittel dérivât HOAC [M] [M]

Zugabe von organ. Lösungsmittel m

H,0 [Iii]

Tem- Aus- R' p. beute [°C] [%]

R2

Ungefährer Wassergehalt in der Reaktionsmischung

2

DMAA

2

10

60

15

12

97

Me

H

20

3

DMAA

2

10

60

15

25

97

Me

H

20

4

DMAA

2

10

75

0

4

93

Me

H

13

5

DMF

2

10

60

15

4

97

Me

H

20

6

DMF

2

10

60

15

12

97

Me

H

20

7

DMF

2

10

60

15

25

97

Me

H

20

8

DMSO

2

10

60

15

4

97

Me

H

20

9

DMSO

2

10

60

15

12

94

Me

H

20

10

NMP

2

10

60

15

4

96

Me

H

20

11

NMP

2

10

60

15

12

97

Me

H

20

12

DMAA

2

4

60

15

12

88

Me

H

27

13

DMAA

2

4

75

0

12

94

Me

H

21

14

DMF

2

4

60

15

-22

90

Me

H

27

15

DMAA

2

10

60

15

12

97

Bu'

H

20

16

DMAA

2

10

60

15

12

91

Bu'

Bu'

20

Beispiele 17 bis 34

Diese Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 16 ausgeführt mit der Ausnahme, dass die Reaktionsdauer nur 4 Stunden betrug. In allen diesen Beispielen wurden jedoch praktisch die gleichen Ausbeuten erreicht wie diejenigen der

Beispiele 1 bis 16. Daraus folgt, dass das erfindungsgemässe b5 Verfahren unter anderem sich von den bekannten Verfahren dadurch unterscheidet, dass die Zeitabhängigkeit der Ausbeute ausgeschaltet wird.

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6

Beispiel 35

250 mg kristallines (Thr-OMe)B30-h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1-N-Natriumhy-droxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0 in Lösung gebracht. Der pH-Wert wurde 24 Stunden lang konstant auf 10,0 gehalten; die Temperatur betrug 25 °C. Das dabei gebildete Humaninsulin kristallisierte nach Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natriumacetattrihydrat und 2,4 mg Zink-

acetatdihydrat und einer anschliessenden Zugabe von 1 N Salzsäurelösung, um einen pH-Wert von 5,52 zu erhalten, aus. Nach Lagerung des Produktes während 24 Stunden bei 4 °C wurden die rhombohedralen Kristalle mittels Zentrifugierung 5 abgetrennt, mit 3 ml Wasser gewaschen, durch Zentrifugierung isoliert und in vacuo getrocknet. Die Ausbeute betrug 220 mg Humaninsulin.

G

Claims (14)

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1:50 und 1:1 liegt.

1. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben, mittels Umsetzung von Schweine-des(AlaB30)-Insulin oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben mit einem L-Threonin-Ester der Formel I

Thr(R2)-OR' (I)

worin R1 eine Carboxyl-Schutzgruppe und R2 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeuten, oder mit einem Salz desselben, in einer Mischung aus Wasser, einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Trypsin, dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 VoI.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb 37 °C liegt, wonach das resultierende Derivat deblockiert wird.

2. Verfahren zur Herstellung von ThreoninB30-Estern von Humaninsulin als Verbindungen der Formel II

(ThrCRVORO^-h-In (II)

worin R1 eine Carboxyl-Schutzgruppe und R2 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeuten, oder von einem Salz oder einem Metallkomplex derselben, mittels Umsetzung von Schweine-des(AlaB30)-Insulin oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben mit einem L-Threonin-Ester der Formel I

Thr(R2)-OR' (I)

worin R1 und R2 wie oben definiert sind, oder mit einem Salz desselben, in einer Mischung aus Wasser, einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Trypsin, dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb 37 °C liegt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des L-Threonin-Esters in der Reaktionsmischung mehr als 0,1 molar ist, die Reaktionstemperatur oberhalb des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung liegt und die Reaktionsmischung bis zu 10 Äquivalente von einer Säure pro Äquivalent von L-Threonin-Ester enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur zwischen 0 °C und der Raumtemperatur liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 15 und 25 Vol.-% liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die von Methanol, Äthanol, 2-Pro-panol, 1-2-Äthandiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Formamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Acetoni-tril oder Dimethylsulfoxid gebildet ist, und insbesondere Formamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Acetoni-tril oder Dimethylsulfoxid ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Gegenwart einer Säure durchgeführt wird, die eine organische Säure und vorzugsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent von

L-Threonin-Ester beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und Schweine-des(AlaB3ö)-Insulin in der Reaktionsmischung zwischen 1:200 und 1:1 und insbesondere zwischen

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass R1 niederes Alkyl, substituiertes Benzyl, substituiertes Diphenylmethyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -CH2-CH2-S02-R3, worin R3 niederes Alkyl ist, bedeutet, und insbesondere Methyl, Äthyl, tert-Butyl, p-Methoxybenzyl, 2,4,6,-Trimethylbenzyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -CH2-CH2-S02-R3, worin R3 Methyl, Äthyl, Propyl oder n-Butyl ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen abgespalten werden, um die Form des Humaninsulins herzustellen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Base, insbesondere bei einem pH-Wert zwischen 8 und 12, abgespalten werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen durch Acidolyse, insbesondere mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden.

14. ThreoninB30-Ester von Humaninsulin als Verbindung der Formel II

(Thr(R2)-OR')B30-h-In (II)

worin R1 eine Carboxyl-Schutzgruppe und R2 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeuten, oder Salze oder Metallkomplexe derselben, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2.