FI79142C - Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. - Google Patents

Description

1 79142

Menetelmä meuliinijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään ihmisen insuliinin valmi s tamiseksi.

Ennestään tunnetaan erilaisia menetelmiä ihmisen insuliinin valmistamiseksi. Esimerkkejä tällaisista prosesseista ovat mm. uuttaminen ihmisen haimarauhasista, synteesi perustana olevista aminohapoista, geenimanipulaatio ja sian insuliinin muuntaminen ihmisen insuliiniksi, Eräät menetelmät sian insuliinin muuntamiseksi ihmisen insuliiniksi suoritetaan sian B30 des-oktapeptιdι-<B23-B-30)-insu1iinin ja eräät des(Ala >-insuliinin kautta.

B30 Tämä keksintö kohdistuu tarkemmin sanottuna sian des<Ala )- insuliinin muuntamiseen ihmisen insuliiniksi ihmisen insulii-B30 nin treoniini -johdannaisen kautta.

Sokeritaudin hoidossa on tavallisesti käytetty sian tai härän insuliinia sisältäviä insuliinivalmisteιta. Härän, sian ja ihmisen insuliinin aminohappokoostumuksessa on vähäisiä eroja, jolloin ero ihmisen ja sian insuliinin välillä rajoittuu yhteen ainoaan aminohappoon, sillä B30-aminohappo ihmisen insuliinissa on treoniini kun se taas sian insuliinissa on ala-niini .

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 80 101 966 on selostettu erästä menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi des-B30 (Ala )-insu1iinista, katso myös Nature 280 (1979), 412.

Mainitun patenttihakemuksen mukaan suoritetaan amidointi edullisesti väliaineessa, joka sisältää 0-65 %, edullisesti 40-60 % orgaanista liuotinta. Reaktiolämpötila on lisäksi o o edullisesti 20-40 C, jolloin 37 C:n lämpötilaa on käytetty kaikissa esimerkeissä. Kytkennän saanto määritettiin 3 esimerkin mukaan HPLC:llä (high pressure liquid chromatography) 2 79142 75, 80 ja noin 50 %:kaι, Julkaisun Nature mukaan oli saanto noin 73 %.

Erästä menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi des-B30 (Ala )-insullinista on vielä selostettu julkaisussa Pro ceedings of the 2nd International Insulin Symposium, Aachen, Saksan liittotasavalta, 1979. Tämän julkaisun mukaan suoritettiin amidointi seoksessa, joka sisälsi noin 60 % orgaanis- o ta liuotinta ja reaktio suoritettiin 38 C:ssa. Kytkennän saanto määritettiin HPLC:llä 67 %:ksi.

Erästä toista menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi B30 des-(Ala )-msulιinistä on lisäksi selostettu julkaisussa Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsin-g«5r , Tanska, 1980. Mainitun julkaisun mukaan suoritettiin prosessi seoksessa, joka sisälsi suurin piirtein 60 % orgaanista liuotinta. Reaktiolämpötila oli kaikella todennäköisyy-o della 37 C. 30 min reaktioajan jälkeen oli saanto 85 %, mutta saanto aleni 70 %:iin 22 tunnin jälkeen.

Eräs syy alempaan saantoon tunnetuilla menetelmillä on ineu- liinitappio ei-toivuttujen sivureaktioiden johdosta, esim.

D0I-Thr(R )-OR :n muodostumisen johdosta, jossa DOI tarkoit- 1 2 taa sian des-oktapeptldi-<B23-B30)-ineu1iinia, ja R ja R tarkoittavat samaa kuin jäljempänä.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena oli aikaansaada menetelmä, jossa reaktiotuotteen saanto oli erittäin korkea, edullisesti korkeampi kuin 90 %.

Yllättäen on osoittautunut, että tällainen saanto voidaan saavuttaa käyttämällä paljon alempaa vesipitoisuutta reaktio-seoksessa kuin ennestään tunnetuissa menetelmissä, ja että lisäksi on edullista suorittaa prosessi huomattavasti alemmassa reaktiolämpötilassa kuin jo tunnetuissa menetelmissä.

Il 3 79142

Yllä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnus- B3 0

omaista, että des(Ala )-insuliini tai sen suola tai kompleksi saatetaan reagoimaan L-treoniinijohdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava I

Thr(R2)-OR1 I

1 2 jossa R tarkoittaa karboksyylisuojaryhmää, ja R tarkoittaa vetyä tai hydroksyylisuojaryhmää, tai tämän suolan kanssa veden, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja trypsiinin seoksessa, jossa veden määrä reaktioseoksessa on 30-10 %. Suositeltava reaktiolämpötila on noin 0°C:n ja huoneen lämpötilan välillä, so. noin 25-20°C.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa B3 0 liuottamalla des(Ala )-insuliini, kaavan I L-treoniini-johdannainen ja trypsiini veden ja vähintään yhden veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen seokseen, mahdollisesti hapon läsnäollessa.

Ne orgaaniset liuottimet, jotka soveltuvat käytettäväksi tässä keksinnössä, ovat polaarisia liuottimia, jotka ovat veteen sekoittuvia ja edullisesti sellaisia, että ne kykenevät sisältämään korkeita insuliiniyhdisteiden ja treo-niiniesterin pitoisuuksia. Esimerkkejä tällaisista sopivista orgaanisista liuottimista ovat aproottiset liuottimet, kuten esimerkiksi Ν,Ν-dimetyyliformamidi, N,Ν-dimetyyliaset-amidi, N-metyylipyrrolidoni, heksametyylifosforitriamidi, dimetyylisulfoksidi, dioksaani, asetoni, tetrahydrofuraani, formamidi ja asetonitriili, ja proottiset liuottimet, kuten esimerkiksi etanoli, metanoli, 2-propanoli ja 1,2-etaanidioli. Liuotin vaikuttaa koko järjestelmään sellaisenaan ja ne olosuhteet, jotka soveltuvat yhdelle liuotinjär-jestelmälle korkeine amidointisaantoineen, eivät välttämättä sovellu toiselle liuottimelle. Parhaimmat saantotulokset on saatu aproottisilla liuottimilla ja aproottiset liuottimet ovat kaikkein edullisimmat esillä olevaa keksintöä suoritettaessa.

4 79142

Riippuen siitä mitä veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta käytetään, valitusta reaktiolämpötilasta ja hapon läsnäolosta reaktioseoksessa, tulee veden pitoisuuden reak-tioseoksessa olla pienempi kuin noin 30 % (tilavuus/tilavuus) , edullisesti pieneni kuin noin 25 % (tilavuus/tila-vuus) ja suurempi kuin noin 10 % (tilavuus/tilavuus), edullisesti suurempi kuin noin 15 % (tilavuus/tilavuus).

Eräs etu, kun pienennetään veden määrää reaktioseoksessa, on että sivutuotteiden muodostuminen tällöin vähenee.

Samoin lisäämällä hapon määrää reaktioseoksessa, on mahdollista vähentää sivutuotteiden muodostumista. Saannon kohoaminen on positiivisessa suhteessa alhaisen vesipitoisuuden kanssa reaktioseoksessa. Entsyymin denaturoinnin estämiseksi reaktioseoksessa, jossa on alhainen vesipitoisuus, tulee reaktiolämpötilan edullisesti olla huomattavasti alhaisempi kuin ne reaktiolämpötilat, joita tavallisesti käytetään trypsiinillä suoritetuissa peptidisvnteeseissä, nimittäin pienempi kuin noin 37°C.

Esillä olevan keksinnön soveltamisen kannalta ei ole olennaista, minkä tyyppistä trypsiiniä käytetään. Trvpsiini on hyvin karakterisoitu entsyymi, jota on kaupallisesti saatavana hyvin puhtaana, erityisesti häristä ja sioista. Lisäksi voidaan käyttää mikrobiologista tietä saatua trypsiiniä. Esillä olevan keksinnön sovellutuksen kannalta ei myöskään trypsiinin muoto, esimerkiksi kiteinen trypsiini (liukenematon muoto), immobilisoitu trypsiini tai edes trypsiini-johdannaiset (niin kauan kuin trypsiiniaktiviteetti säilyy) ole olennainen. Sanonta trypsiini käsittää tässä käytettynä kaikista lähteistä peräisin olevia trvpsiinejä ja kaikkia trypsiinimuotoja, joissa amidoiva aktiviteetti on säilynyt, mukaanluettuna proteaasit joilla on trypsiinintapainen spesifisyys, esimerkiksi Achromobacter lyticus-proteaasi, vertaa Agric. Biol. Chem. 4^2, 1443 .

5 79142

Esimerkkeinä aktiivisista trypsiinijohdannaisista voidaan mainita asetyloitu trypsiini, sukkinyloitu trypsiini, glutaarialdehydillä käsitelty trypsiini ja immobilisoidut trypsiinijohdannaiset.

Mikäli käytetään immobiloisoitua trypsiiniä, suspendoi-daan tämä väliaineeseen.

Sopivan puskurijärjestelmän aikaansaamiseksi voidaan lisätä orgaanisia tai epäorgaanisia happoja kuten suolahappoa, muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihappoa tai voihappoa ja/tai emäksiä kuten pyridiiniä, TRIS, N-metyy-limorfoliinia ja N-etyylimorfoliinia. Orgaanisia happoja suositaan. Reaktio voidaan kuitenkin suorittaa ilman tällaisia lisäyksiä. Lisätty happomäärä on tavallisesti pienempi kuin noin 10 ekvivalenttia kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti. Hapon määrä on edullisesti 0,5-5 ekvivalenttia kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti. Voidaan lisätä ioneja,jotka stabiloivat trypsiinin, kuten kalsiumioneja.

Menetelmä voidaan suorittaa lämpötilassa, joka on 37°C:n ja reaktioseoksen jäätymispisteen välillä. Riittävän reaktionopeuden aikaansaamiseksi suoritetaan entsymaattiset reaktiot trypsiinillä tavallisesti 37°C:ssa. Trypsiinin in-aktivoitumisen välttämiseksi on kuitenkin edullista suorittaa esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan alapuolella. Käytännössä suositaan reaktiolämpötiloja, jotka ovat yli noin 0°C.

Reaktiolämpötilasta, trypsiinin lisätystä määrästä ja muista reaktio-olosuhteista riippuen, on reaktioaika tavallise-ti muutaman tunnin ja muutaman päivän välillä.

Veden ja liuottimen välinen suhde, hapon ja emäksen välinen suhde ja reaktioaika säätelevät suuressa määrin trypsiinin 6 79142 vaikutusta sen amidointivaikutuksen edistämiseksi ja tryp-siinin katalysoimien sivureaktioiden vaimentamiseksi. Vähentämällä veden pitoisuutta reaktioseoksessa saavutetaan kumpikin, mutta tällöin lisätään myös sitä nopeutta, jolla trypsiini denaturoituu irreversiibelisti. Trypsiinin denaturoitumista voidaan - ainakin osittain - ehkäistä alentamalla reaktiolämpötilaa. Reaktiolämpötilan alentaminen alentaa myös amidointinopeutta, mutta tämän alenemista voidaan korvata pidentämällä reaktioaikaa.

B 3 0

Trypsiinin ja des(Ala )-insuliinin painosuhde reaktio-seoksessa on tavallisesti yli noin 1:200, edullisesti yli noin 1:50 ja alle noin 1:1.

Amidoinnin tuloksena olevat ihmisen insuliinin treoniini-B 3 0

-johdannaiset, voidaan esittää yleisellä kaavalla II

(Thr(R2)-OR1)B30-h-In II

B 3 0 jossa h-In tarkoittaa ihmisen des(Thr )-insuliiniosaa, 1 2 jossa R ja R tarkoittavat samaa kuin yllä.

Käyttökelpoisia kaavan I L-treoniinijohdannaisia ovat sellaiset, joissa R1 on karboksyvlisuojaryhmä, joka voidaan B3 0 poistaa ihmisen insuliinin treoniini -esteristä (kaava II) olosuhteissa, jotka eivät aikaansaa olennaista palautumatonta muutosta insuliinimolekvylissä. Esimerkkeinä tällaisista karboksyylisuojaryhmistä mainittakoon alempi al-kyyli, esimerkiksi metyyli, etyyli ja tert-butyyli, subs-tituoitu bentsyvli, kuten p-metoksibentsyvli ja 2,4,6-tri- metyylibentsyyli ja difenyylimetyyli, ja ryhmät, joilla on 3 3 yleinen kaava -Ci^CHjSC^R , jossa R tarkoittaa alempaa alkyyliä, kuten metyyliä, etyyliä, propyyliä ja n-butyvliä.

2

Sopivia hydroksyylisuojaryhmiä R ovat sellaiset, jotka B 3 0 voidaan poistaa ihmisen insuliinin treoniini -johdannaisista (kaava II) olosuhteissa, jotka eivät aikaansaa olen- 11 7 79142 naista palautumatonta muutosta insuliinin molekyylissä.

2

Esimerkkeinä tällaisista ryhmistä (R ) voidaan mainita tert-butyyli.

Alemmat alkyyliryhmät sisältävät vähemmän kuin 7 hiiliatomia, edullisesti alle 5 hiiliatomia.

Wunsch on julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg

Thieme Verlag Stuttgart, 1974, selostanut muita tavanomaisesti käytettyjä suojaryhmiä.

Hoppe-Seyler on julkaisussa Z. Physiol. Chem. 359, (1978), B 3 0 799 selostanut menetelmää des(Ala )-insuliinin valmistamiseksi .

Eräät kaavan I L-treoniinijohdannaiset ovat tunnettuja yhdisteitä ja muita L-treoniinijohdannaisia voidaan valmis-. . taa analogisesti tunnettujen yhdisteiden valmistuksen kans- ' s a.

Kaavan I L-treoniinijohdannaiset voivat olla näiden vapai-ta emäksiä tai sopivia orgaanisia tai epäorgaanisia suoloja, edullisesti asetaatteja, propionaatteja, butyraatteja tai vetyhalideja, kuten vetyklorideja.

B3 q

On toivottavaa käyttää reagensseja, so. des(Ala )-insuliinia ja L-treoniinijohdannaisia, joilla on kaava I, suurina pitoisuuksina. Kaavan I L-treoniinijohdannaisen ja B3 0 des(Ala )-insuliinin moolisuhde on edullisesti yli noin 5:1.

On toivottavaa, että kaavan I L-treoniinijohdannaisten pitoisuus reaktioseoksessa ylittää 0,1 moolia.

T. . , . . . . . .B3 0

Ihmisen insuliini saadaan ihmisen insuliinin creonuni 8 79142 johdannaisista (kaava II) poistamalla suojaryhmä I< ja 2 mahdollinen suojaryhmä R sinänsä tunnetuilla menetelmillä tai analogisesti sinänsä tunnettujen menetelmien kanssa. Siinä tapauksessa että R1 on metyyli, etyyli tai ryhmä 3.3 -C^CF^SC^R , ]ossa R tarkoittaa samaa kuin yllä, voidaan mainittu suojaryhmä poistaa lievissä emäksisissä olosuhteissa vesipitoisessa väliaineessa, edullisesti pH-arvossa, joka on välillä noin 8 ja noin 12, esimerkiksi noin 9,5. Emäksenä voidaan käyttää ammoniakkia, trietyyli-amiinia, dikarbonaatti/karbonaattipuskuria tai alkalimetal-lihydroksideja kuten natriumhvdroksidia. Siinä tapauksessa että R^ on tert-butyyli, substituoitu bentsyyli kuten p-metoksibentsyyli tai 2,4,6-trimetyylibentsvyli tai di-fenyylimetyvli, voidaan mainittu ryhmä poistaa happohydro-lyysillä, edullisesti trifluorietikkahapolla. Trifluori-etikkahappo voi olla vedetön tai sisältää hieman vettä, tai se voi olla laimennettu orgaanisella liuottimena ku- 2 ten dikloorimetaanilla. Siinä tapauksessa, entä R on tert-butyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa happohydro-lyysillä, kuten yllä.

B 3 0

Edullisia kaavan II ihmisen insuliinin treeniini -joh- 2 .....

dannaisia ovat yhdisteet, joissa R on vety, ja näitä voidaan valmistaa kaavan I L-treoniinijohdannaisista, joissa _ 2 R on vety.

B3 0

Esimerkkinä des(Ala )-insuliinin kompleksista tai suolasta voidaan mainita sinkkikompleksi tai sinkkisuola.

Jos reaktio-olosuhteet valitaan yllä mainitun selityksen mukaisesti ja jos alla olevissa esimerkeissä annetut reaktio-olosuhteet otetaan huomioon, on mahdollista saada ihmisen insuliinin treoniini^^-johdannaisten (kaava II) saanto, joka on suurempi kuin 90 % tai vieläkin suurempi kuin 95 %.

Il 9 79142

Eräs edullinen menetelmä ihmisen insuliinin valmistami-

B 3 O

seksi ihmisen insuliinin treoniini -johdannaista on seuraava: 1) Jos trypsiiniaktiviteettia on jäljellä amidoinnin jälkeen, poistetaan tämä edullisesti, esimerkiksi olosuhteissa, joissa trypsiini on inaktiivinen, esimerkiksi hap-pamessa väliaineessa pH-arvossa alle 3. Trypsiini voidaan poistaa molekyylipainon perusteella suoritetulla erotuksella, esimerkiksi geelisuodattamalla "Sephadei® G-50"-geelillä tai "Bio-ge ]^}?-30 "-geelillä etikkahapos sa , katso edellä mainittu Nature 280.

B 3 0 2) Epäpuhtaudet kuten reagoituina ton des (Ala )-insuliini voidaan poistaa anioni- ja/tai kationinvaihtokromatogra- fiällä.

3) Tämän jälkeen lohkaistaan ihmisen insuliinin treonii- B3 0 ni -johdannainen (kaava II) ja ihmisen insuliini erotetaan, esimerkiksi kiteytetään sinänsä tunnetulla tavalla.

Tällä tavoin voidaan aikaansaada ihmisen insuliinia, jolla on hyväksyttävä farmaseuttinen puhtaus ja ihmisen insuliini voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen.

Käytetyt lyhenteet ovat yhtäpitäviä niiden sääntöjen kanssa, jotka IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature on hyväksynyt (1974) , katso Collected Tentative Rules IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.

Ihmisen insuliinijohdannaiSten ja ihmisen insuliinin valmistusmenetelmiä selostetaan alla olevissa esimerkeissä.

Esimerkit kuvaavat muutamia edullisia suoritusmuotoja esillä olevan keksinnön mukaisesta menetelmästä.

10 79 1 42

Esimerkki 1

B3 O

10 mg sian des(Ala )-insuliinia liuotettiin 100 yul:aan 10 M etikkahappoa- 50 ^ul:aan tätä liuosta lisättiin 100 ^,ul 2 M Thr-OMe (Me tarkoittaa metyyliä) N,N-dimetyyliaset-amidissa, 60 ,ul Ν,Ν-dimetyyliasetamidia, 15 ^ul vettä ja 10 ^ul trypsiinin liuosta (8 % paino/tilavuus) 0,05 M kalsiumkloridissa. Inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa 24 h saos-tettiin tuote 8 ml:lla asetonia, erotettiin sentrifugoi- malla, pestiin 8 ml:11a asetonia, erotettiin sentrifugoi- B 3 0 maila ja kuivattiin tyhjössä. (Thr-OMe) -h-In-saanto määritettiin HPLCillä.

Tuote liuotettiin 2 mlraan 1 M etikkahappoa ja 100 ,ul liuosta lisättiin 4 x 200 mm:n "Nucleosil®5 C^g-kolonnil- le" vastavirta-HPLC:tä varten käyttäen 0,2 M anmoniumsul- faattipuskuria säädettynä pH-arvolle 3,5 ja jossa oli 26,8 % (tilavuus/tilavuus) asetoninitriiliä eluenttina.

B3 0

Virtausnopeudella 1 ml/min eluoitui des(Ala )-insuliini B 3 0 18 min jälkeen ja (Thr-OMe) -h-In 24 min jälkeen. Reak- B23 tion sivutuotteet, nimittäin (Thr-OMe) -des-heptapepti-di-(B24-B30)-insuliini eluoitui 7 minuutin jälkeen. Proteiinien havaitseminen ja määrä määritettiin ekstinktiolla arvossa 280 nm. Analyysillä saatiin seuraava yhdisteiden jakautuminen:

pOO

(Thr-OMe) -h-In: 97,1 % B 3 0 des(Ala )-insuliini: 2,5 % (Thr-OMe) B^-des-heptapeptidi (B24-B30)-insuliini : 0,4 %

Esimerkit 2-16

Alla olevat esimerkit 2-16 taulukossa 1 suoritettiin analogisesti esimerkin 1 kanssa, jolloin reaktioparametria muutettiin, kuten taulukossa on esitetty. Kaikissa esimerkeissä lisättiin kuitenkin 10 ^,ul 8 S:sta trypsiiniä vesi-liuoksessa, 100 ^,ul orgaanista liuotinta, joka sisälsi kaavan I treoniinijohdannaista sekä 50 ,ul etikkahappoa, jossa oli 20 % des(Ala )-insuliinia. Kaavan I treoniini- u 79142 johdannaisen moolisuus orgaanisessa liuottimessa ja etikka-hapon moolisuus ilmenevät taulukosta 1. Reaktioaika oli 24 h. Taulukossa 1 on käytetty seuraavia lyhenteitä: HOAc on etikkahappo, DMAA on Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, DMF on Ν,Ν-dimetyyliformamidi, DMSO on dimetyylisulfoksidi, NMP on N-metyylipyrrolidoni ja THF on tetrahydro-furaani.

Syntetisoitaessa (Thr-OBut)B30-h-In, vertaa esimerkki 15, suoritettiin eluointi käyttäen gradienttia asetonitrii-lissä, joka oli 26,8 % - 40 % (tilavuus/tilavuus).

i2 7 9 1 42

•H

:rd C tn :nj 3> ιτ5 :r£3 c tn S to tn

H -H (U

λ; o tn

3 4J M

r-H Ή O

3 -8" 9) dP ΟΟΓΟΟΟΟΟΟΟΟΓ'^ΗΓ'ΟΟ 4-1 tn O w Γ4Γ4γΗΓ\ΙΓΜΓΜΓ4ΓΝΓν1ΓΜ(-ΜΓΝ|ΓΝ(ΝΓΜ 4-1 (U -h

01 > 4-J

w c I

ib 01 Q)

J C M

tN "C

Cc- ffiCCKKSCffiKEKEnKEdKK C

CQ

4-1 4-1 , (ΐ)Φα)Φ(υ<ιιω(ΐ)(υαια)ΦΦ^3 x sssssssassassm m o 4-1

c r^r^nr^r^r-r-^vxjr^GO^or^rH

to ca° tnoitjit^t^t^tjitjitjic^cotj'cr'^tj' to

CO

8* C t^im'i-^J’fNLriM'On^rCNCNCNtNCNCN

.§ ,—j C\J r—I (N i—I I—I I—I i—t (N r—I r—I

'J -P 1 I-1 O ^ LO LO O LO LO LO LO LO t-O LO LO LO LT) Lfl 33 i—I i—i I—t i—I i—I r—i i—I i—I i—I i—I i—I i—I r-4

At

C

Tl CC

% SS

^ S -u m

OOLDOOOOOOOOLnOOO

tjb 5 "tn Cl -H -H

0 »ή'—*

e I

• · -H

0 rH C/3 ^QCSoooooooooo-^^^roo

e ^ 1-1 *—t >—t l—I i-1 I—I i—I i-1 I—I i-1 I-1 I—I

1 tn 1 C e •h jd _ P h 'o e tn

C-CCU-HStAirMCMrMrNjCNjrNjrMrsitNCNOMCNCsirNJ O O in H (D -i—i -H Q

>4 -A C 8

P e e E I -S

£ £ -g <c < < oo <c < < < σι e 3 rfCChfefctntn&.ft^^hfi^ M -H -h sssssssssssssss

OCrH QQQQQQQQZSQQQQQ

*2 fi e* .¾ (Nn^in^hcoo^OHrNjro^iniö

(/) «Η ·~I I—I i-H ·—I I—I I—I I—I

W M

i3 791 42

Esimerkit 17 - 34 Nämä esimerkit suoritettiin analogisesti esimerkkien 1-16 kanssa sillä poikkeuksella, että reaktioaika oli 4 h. Kussakin esimerkissä oli saanto sama kuin esimerkeissä 1 - 16 .

Esimerkkien 1 - 16 ja esimerkkien 17 -34 vertailusta ilmenee,että saatiin sama saanto ja että tämä mm. erottaa uuden menetelmän ennestään tunnetuista menetelmistä, joita on selostettu julkaisussa Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, katso yllä. Tämän seurauksena on riippuvuus ajasta eliminoitu.

Esimerkki 35 B3 0 250 mg kiteistä (Thr-OMe) -h-In suspendoitiin 25 mlraan vettä ja liuotettiin lisäämällä 1 N natriumhydroksidi-liuosta pH-arvoon 10,0. pH-arvo pidettiin vakiona arvossa 10,0 24 h 25°C:ssa. Muodostunut ihmisen insuliini kiteytettiin lisäämällä 2 g natriumkloridia, 350 mg natriumase-taattitrihydraattia ja 2,5 mg sinkkiasetaattidihydraattia, minkä jälkeen lisättiin 1 N suolahappoa, jotta saatiin pH-arvoksi 5,52. 24 tunnin seisomisen jälkeen 4°C:ssa erotettiin romboedriset kiteet sentrifugoimalla, pestiin 3 ml :11a vettä, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin tyhjössä. Saanto: 220 mg ihmisen insuliinia.

Claims (10)

1. Menetelmä ihmisen insuliinin tai ihmisen insuliinin B30 treoniini -johdannaisten tai näiden suolojen tai komplek- B30 sien valmietamisekeι saattamalla sian des<Ala )-insuliini tai sen suola tai kompleksi reagoimaan L-treoniinijohdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava I 2 1 Thr(R )-OR I 1. jossa R tarkoittaa karboksyylisuojaryhmää ja R tarkoittaa vetyä tai hydroksyylisuojaryhmää, tai sen suolan kanssa veden, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja trypsiinin seoksessa, tunnettu siitä, että reaktloseoksen vesipitoisuus on 30-10 % (tilavuus/ti1avuus), reaktio lämpötila on pienempi o kuin 37 C ja että happoa on läsnä, minkä jälkeen saadun johdannaisen suojaryhma lohkaistaan ihmisen insuliinin muodoeta-miseks i .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I L-treoniinijohdannaisen pitoisuus reak-tioseoksessa on yli 0,1 moolia, reaktiolämpötila on reaktio-seoksen jäätymispisteen yläpuolella ja reaktioseoksessa on korkeintaan 10 ekvivalenttia happoa kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti.

3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiolämpötila on huoneen läm- o pötilan alapuolella ja yli 0 C.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktioseoksen vesipitoisuus on alle 25 % ja yli 15 % (tilavuus/tilavuus).

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veteen sekoittuva orgaaninen liuotin on asetoni, tetrahydrofuraani, N,N-dimetyy1iformamidi, li ΐ5 79142 N, N-dimetyyliaeetamidi, N-metyy1ipyrro 1idoni, asetonitrii1ι tai DMSO.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo on etikkahappo,

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapon määrä reaktioseoksessa on O, 5-5 ekvivalenttia kaavan I L-treonnnijohdannaisen ekviva-1entt ia koht i.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- B30 telmä, tunnettu siitä, että trypsiinin ja des<Ala )-insu-liinin painosuhde reaktioseoksessa on yli 1:200, edullisesti yli 1:50 ja alle 1:1.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- telmä, tunnettu siitä, että R on metyyli tai tert-butyy-li .

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lohkaisu suoritetaan vesipitoisessa väliaineessa emäksen läsnäollessa, edullisesti pH-arvossa 8-12, tai happo-hydrolyysillä.