KR100543980B1 - 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산유도체와 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu) 또는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl)와 아미노산을 반응시켜 2-(4-니트로페닐)설포닐(또는 사이오)에톡시카르보닐-아미노산(Nsc-아미노산)을 합성한 후에 Nsc-아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)를 산에 민감하면서도 안정성이 낮은 트리틸(Trt) 유도체 또는 디-t-부틸-디카르보네이트((Boc)2O)와 반응시켜 제조한 신규 아미노산 유도체로, 보호기로 도입된 트리틸(Trt) 계열기 또는 t-부티록시카르보닐기(t-Boc)가 온화한 탈보호 조건 하에서도 짧은 시간에 제거되므로 고체상 펩티드 합성법에 사용되어서는 우수한 순도와 수율로 다양한 종류의 펩티드를 합성하게 되는 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체와 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 발명의 상세한 설명에서 정의한 바와 같다.
2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐기, 아미노산, 펩티드, 고체상 합성
Description
본 발명은 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu), 또는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl)와 아미노산을 반응시켜 2-(4-니트로페닐)설포닐(또는 사이오)에톡시카르보닐-아미노산(Nsc-아미노산)을 합성한 후에 Nsc-아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)를 산에 민감하면서도 안정성이 낮은 트리틸(Trt) 유도체 또는 디-t-부틸-디카르보네이트((Boc)2O)와 반응시켜 제조한 신규 아미노산 유도체로, 보호기로 도입된 트리틸(Trt) 계열기 또는 t-부티록시카르보닐기(t-Boc)가 온화한 탈보호 조건 하에서도 짧은 시간에 제거되므로 고체상 펩티드 합성법에 사용되어서는 우수한 순도와 수율로 다양한 종류의 펩티드를 합성하게 되 는 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체와 이의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1는 수소원자, -OR 또는 -NHR을 나타내고; R2은 수소원자, 치환 또는 비치환된 C1∼C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 
를 나타내며, 이때 치환기는 -OR, -NHR 또는 -NHC(=NH)NHR을 나타내고; R은 트리틸기, 할로트리틸기, C1∼C6의 알킬 치환된 트리틸기, 또는 t-부티록시카르보닐기를 나타낸다.
근년에 펩티드 및 보호된 펩티드 분절법의 고체상 합성법에서 극도로 산에 민감한 다양한 종류의 트리틸(trt) 계열의 수지와 더불어 여기에 사용된 아미노산의 보호를 위해 플루오레닐메톡시카르보닐기(Fmoc)/t-부틸기(-tBu), 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐기(Nsc)/t-부틸기(-tBu)를 이용한 합성법이 사용되어지고 있다. 상기한 아미노산의 보호기로서 t-부틸기는 탈보호(deprotection) 과정에서 고농도의 트리플루오르아세트산(TFA)을 장시간 사용하여야 하며, 이러한 탈보호 과정에서는 TFA 산 촉매에 의한 부반응이 발생하곤 한다. 예컨대, 트립토판과 메티오닌이 포함된 펩티드의 탈보호 반응에서는 t-부틸 양이온이 트립토판 및 메티오닌의 측쇄에 의한 친전자 작용에 의해 다수의 부산물이 생성되게 된다. 이에 탈보호 과정에서의 부반응을 최소화하기 위한 보다 다양한 조건의 탈보호 방법이 개발되어 있으나 그리 만족할 만한 수준은 아니다.
이에 사용된 측쇄기의 산 안정성을 낮추어 탈보호 과정에서의 부반응을 최소화시키는 것이 중요하다. 그 결과, 희석된 트리플루오르아세트산(TFA)을 사용하여 보다 온화한 조건에서 탈보호할 수 있는 트리틸(trt) 계열기가 개발된 바도 있다. 탈보호 과정에서 생성되는 트리틸(trt) 계열의 양이온은 매우 부피가 커서 공격적이지 못하며, 또한 약한 친전자로서 작용하므로 부반응을 최소화할 수 있다.
종래에도 이미 몇 종류의 Fmoc/trt-아미노산 유도체가 개발되어 몇몇 펩티드 합성에 사용되어서는 우수한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[K. Barlos et al., J. Peptide Res.
51, p.194 (1998)]. 그러나, Fmoc/trt-아미노산 유도체가 고체상 펩티드 합성에 우수한 효과를 나타냄에도 불구하고, 일부 Fmoc이 가지는 소수성(hydrophobicity)에 따른 낮은 용해도에 의해 난구조 펩티드 합성에서 낮은 축합 수율을 나타내었다.
이에 반하여, 본 발명이 합성하는 신규 아미노산 유도체의 주골격을 구성하게 되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐(Nsc)은 니트로기와 설포닐기의 구조적 특성에 기인하여 아미노산의 용해도 증가와 펩티드 사슬 사이의 소수성 상호 작용(hydrophobic interaction)을 억제하는 역할을 한다. 또한 자동화 시스템 하에서 Fmoc에 비해 Nsc의 안정성[Yeon-Sun Lee et al., proceeding of the 16th APS, 1999]이 탁월하여 긴 사슬의 펩티드 합성반응에 매우 유리한 이점을 가지고 있다.
상기한 바와 같은 사실에 입각하여, 본 발명자들은 다기능성 아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기 또는 아민기를 산에 민감하면서도 안정성이 낮은 트리틸(Trt) 계열기 또는 t-부티록시카르보닐기(t-Boc)로 보호하고, 아미노산의 N-알파 위치에는 염기 불안정성인 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐(Nsc)기를 도입하며, 그리고 아미노산의 C-말단에는 유리 카르복시산(free COOH)이 위치하도록 하는 새로운 구조의 아미노산 유도체를 합성함으로써 본 발명은 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 주쇄를 구성하는 Nsc의 구조적 안정성에 의하여 고체상 합성법에 의한 긴 사슬의 펩티드 합성이 가능하면서도, 고체상 펩티드 합성과정에서의 탈보호 반응이 용이하여 보다 우수한 순도와 수율로 다양한 구조의 펩티드를 합성할 수 있는 신규 아미노산 유도체와 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체를 그 특징으로 한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1는 수소원자, -OR 또는 -NHR을 나타내고; R2은 수소원자, 치환 또는 비치환된 C1∼C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 
를 나타내며, 이때 치환기는 -OR, -NHR 또는 -NHC(=NH)NHR을 나타내고; R은 트리틸기, 할로트리틸기, C1∼C6의 알킬 치환된 트리틸기, 또는 t-부티록시카르보닐기를 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 펩티드 사슬간의 소수특성을 억제하고 아미노산의 용해도를 증가시키는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐기(Nsc)가 아미노산의 N-알파 위치에 결합되어 있는 구조적 안정성에 기인하여 고체상 합성법에 의한 긴 사슬의 펩티드 합성이 가능함은 물론이고, 곁사슬로 존재하는 하이드록시기 또는 아민기가 트리틸(Trt) 계열기 또는 t-부티록시카르보닐기(t-Boc)로 보호되어 있어 온화한 조건의 탈보호 반응에 의해서도 쉽게 제거되므로 다양한 구조를 가지는 펩티드를 보다 우수한 순도와 수율로 합성할 수 있게 하는 새로운 아미노산 유도체에 관한 것 이다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체의 제조방법을 포함하는 바, 제조방법은 다음 반응식 1과 2로 나타낼 수 있다.
첫 번째 제조방법은 다음 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 다음 화학식 2a로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu)와 다음 화학식 3a로 표시되는 아미노산 단분자를 반응시켜 다음 화학식 4a로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐-아미노산(Nsc-아미노산)을 합성하는 과정과, 그리고 상기에서 제조한 화학식 4a로 표시되는 Nsc-아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)에 보호기(R)를 도입하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 합성하는 과정이 포함된다.
상기 반응식 1에서, R1 및 R2은 각각 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R'는 수 소원자, 하이드록시기 또는 아미노기를 나타내고; R"은 수소원자, C1∼C6의 알코올기, C1∼C6의 알킬아민기, C1∼C6의 알킬구아니딘기, 하이드록시페닐기, 아미노페닐기, 구아니디노페닐기 또는 
를 나타낸다.
상기 화학식 2a로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu)와 상기 화학식 3a로 표시되는 아미노산 단분자는 알칼리금속 또는 알칼리 토금속염의 염기와 통상적으로 사용되는 유기용매 존재하에서 실온 또는 용매 환류온도 조건으로 대략 1 ∼ 3시간정도 반응시킨다. 바람직하기로는, 염기로서 탄산칼륨 수용액을 사용하고, 용매로서 아세토니트릴을 사용하는 것이며, 이러한 조건하에서 반응은 실온에서 2시간 정도만에 완료된다.
그런 다음, 상기 반응 결과로 얻어진 상기 화학식 4a로 표시되는 Nsc-아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기 또는 아민기에 보호기(R)를 도입한다. 본 발명에서는 하이드록시기 또는 아민기의 보호기로서 트리틸(Trt) 계열기의 도입을 위해서는 트리틸 알코올, 트리틸 할라이드, 할로트리틸 할라이드, 알킬트리틸 할라이드를 사용한다. 그리고, t-부티록시카르보닐기(t-Boc)의 도입을 위해서는 디-t-부틸-디카르보네이트((Boc)2O)를 사용한다. 상기한 보호기 도입반응은 아세토니트릴 등의 유기용매하에서 디메틸아미노피리딘(DMAP)와 디-t-부틸-디카르보네이트((Boc)2O)를 첨가하여 실온 또는 용매환류 온도에서 1 ∼ 3시간정도 수행한다.
두 번째 제조방법은 다음 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 다음 화학식 2b로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐 클로라이드("Ntc-Cl")와 다음 화학식 3b로 표시되는 아미노산 알킬 에스테르 단분자를 반응시켜 다음 화학식 4b로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐-아미노산 에스테르("Ntc-아미노산 에스테르")를 합성하는 과정과, 상기에서 제조한 화학식 4b로 표시되는 Ntc-아미노산 에스테르의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)에 보호기(R)를 도입한 후에 에스테르 가수분해하여 다음 화학식 5로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐-아미노산("Ntc-아미노산")을 제조하는 과정과, 그리고 상기에서 제조한 화학식 5로 표시되는 Ntc-아미노산을 설포닐화 반응하여 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 과정이 포함된다.
상기 반응식 2에서, R1, R2, R' 및 R"는 각각 상기 반응식 1에서 정의한 바와 같다.
상기 반응식 2에 따른 제조방법은 기본적으로 상기 반응식 1의 방법을 따르며, 에스테르화 반응, 가수분해 반응, 설폰화 반응은 공지 방법에 준하여 수행한다. 예컨대, 에스테르화 반응은 메탄올 용매하에서 사이오닐 클로라이드 (SOCl2)의 적가로 실온에서 3일 반응 또는 환류온도 조건하에서 5-6 시간 반응을 수행한다. 가수분해 반응은 테트라하이드로퓨란 (THF), 물 또는 메탄올 용매하에서 10% 수산화나트륨 (NaOH)의 적가로 실온에서 2시간 반응 수행한다. 설폰화 반응은 메탄올 또는 아세톤 용매와 얼음물하에서 0.3M Na2MoO4와 과산화수소의 적가 후 40℃에서 2-3시간 반응 수행한다.
상기한 바와 같은 제조방법 결과로 합성한 상기 화학식 1로 표시되는 2-(4- 니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체는 고체상 합성법에 의한 다양한 구조의 펩티드를 합성하는데 유용하다.
일반적으로, 곁사슬에 보호기가 없는 트립토판과 곁사슬에 설포닐기를 보호기로 사용하는 아르기닌이 포함된 고체상 펩티드 합성과정에서는 많은 부반응이 발생한다. 이는 산 촉매하의 보호기 제거과정 중에 생성되는 카르보니움(carbonium ion) 이온이 트립토판의 인돌(indole) 링 구조와의 알킬화에 의해 기인된 것이며 또한 심각한 설포닐화가 발생한다. 그러나, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 유도체를 사용하여 고체상 합성법을 수행하게 되면 상기에서 언급한 부반응을 최소화하는 효과를 얻을 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: N-Nsc-O-트리틸-L-세린 ("Nsc-Ser(trt)-OH")의 합성
(1) Nsc-Ser-OH의 합성
세린 1.0 당량(150 mmol)을 0.75M 탄산칼륨 수용액 300 mL와 300 mL의 아세토니트릴에 녹였다. 여기에 얼음물 하에서 1.1 당량의 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu)을 조금씩 적가하고 난 후 실온에서 2시간동안 교반하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴을 감압 증류 하에서 제거하고 과량의 Nsc-Osu를 제거하기 위해 디에틸에테르로 수용액층을 두 번 세척하였다. 수용액층에 에틸아세테이트를 넣고, 얼음물 하에서 3M 염산 수용액으로 pH 3이 되도 록 산성화하였다. 분리된 에틸아세테이트층을 충분히 물로 세척한 후 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일형태로 감압 증류한 후 디에틸에테르로 재결정하여 Nsc-Ser-OH 고체를 얻었다(수율: 61%, 순도; 98% 이상).
m.p: 144∼145℃. TLC: Rf 0.65(아세토니트릴/아세트산/물=80/2/20 부피비). HPLC: Rt 5.561(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(2) Nsc-Ser(trt)-OH의 합성
각각 2.0 당량의 트리페닐메틸알코올(Trt-OH)과 아세트산 무수물(Ac2O)을 빙아세트산에 넣어 60 ℃에서 완전히 녹였다. 여기에 상기에서 합성한 1.0 당량의 Nsc-Ser-OH 고체를 첨가하고 30분간 교반한 후 약 30 ℃로 냉각시켰다. 이 용액에 0.01 당량의 진한 황산을 첨가하고 실온에서 약 30분간 교반한 후 다시 60 ℃에서 약 2시간동안 교반 반응하였다. 반응 후 얼음물 하의 차가운 물 1 L에 반응 생성물을 천천히 적가하여 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 얼음물 하에서 약 2시간정도 교반한 후 여과하고 물과 디이소프로필에테르로 충분히 세척한 후 건조하여 Nsc-Ser(trt)-OH 고체를 얻었다(총수율: 75%, 순도: 98% 이상).
m.p: 112∼113℃. TLC: Rf 0.58(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비). HPLC: Rt 30.768(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
실시예 2: N-Nsc-O-트리틸-L-트레오닌 ("Nsc-Thr(trt)-OH")의 합성
(방법 1)
(1) Trt-Thr-OH·DEA의 합성
트레오닌 1.0 당량(100 mmol)을 40 mL의 물, 3.0 당량의 디에틸아민(DEA) 및 120 mL의 이소프로필알코올에 녹이고, 여기에 1.3 당량의 트리페닐메틸 클로라이드(Trt-Cl)을 천천히 적가하였다. 반응이 완결된 후 물을 첨가하여 트리페닐메탄올 및 트리페닐메틸다이에틸아민을 필터 여과하고 얻어진 여액을 아세트산으로 산성화하여 침전을 얻었다. 재결정하기 위해 에탄올에 녹여 감압 증류하고 이를 디에틸에테르에 녹인 후 디에틸아민(DEA)으로 처리하여 고체를 생성시켰다(Trt-Thr-OH·DEA).
m.p: 154∼155℃. TLC: Rf 0.41(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
(2) H-Thr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 Trt-Thr-OH·DEA 고체 1.0 당량(50 mmol)을 350 mL의 디클로로메탄에 녹이고, 4.0 당량의 트리에틸아민(TEA) 및 0.1 당량의 디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하고 2.1 당량의 trt-Cl을 얼음물 하에서 조금씩 적가 교반하였다. 반응 종결 후 물을 첨가하고 유기층을 충분히 물로 세척하고, 황산나트륨 으로 건조 여과하였다. 여과액을 감압 증류하여 오일 형태의 생성물을 만들었다. 상기에서 합성한 오일 생성물을 선택적인 탈 트리틸화(detritylation)를 위해 빙아세트산/트리플루오로에탄올(TFE)/디클로로메탄(1/2/7 부피비)의 혼합용액을 얼음물 하에서 약 한시간 정도 반응시켜 탈 트리틸화하였다. 이후 감압 증류하여 오일형태의 생성물을 만든 후 디에틸에테르/석유에테르(1/1 부피비)로 재결정하였다(H-Thr(trt)-OH).
m.p: 193∼194℃. TLC: Rf 0.19(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비). HPLC: Rt 16.779(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(3) Nsc-Thr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 H-Thr(trt)-OH 고체 1.0 당량(10 mmol)을 0.75M 탄산칼륨 수용액 20 mL와 아세토니트릴 100 mL에 녹였다. 여기에 얼음물 하에서 1.1 당량의 Nsc-Osu을 조금씩 적가하고 난 후 실온에서 2시간동안 교반 반응하였다. 반응종료 후 아세토니트릴을 감압 증류 하에서 제거하고 과량의 Nsc-Osu를 제거하기 위해 디에틸에테르로 수용액층을 두 번 세척하였다. 수용액층에 에틸아세테이트를 넣고, 얼음물 하에서 0.1M 시트르산으로 매우 조심스럽게 산성화하였다. 분리된 에틸아세테이트층을 충분히 물로 세척 후 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일 형태로 감압 증류한 후 소량의 에틸아세테이트와 디에틸에테르로 재 결정하여 Nsc-Thr(trt)-OH를 얻었다.
m.p: 103∼104℃. TLC: Rf 0.58(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비). HPLC: Rt 30.768(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(방법 2)
(1) HCl·H-Thr-OMe의 합성
1.0 당량(200 mmol)의 트레오닌을 150 mL의 메탄올에 넣고 여기에 얼음물 하에서 1.4 당량의 티오닐 클로라이드(SOCl2)를 조심스럽게 조금씩 적가한 후 실온에서 3일동안 교반 반응하였다. 반응 후 메탄올을 감압 증류하고 여기에 디에틸에테르를 첨가하여 충분히 세척 여과 건조하였다(HCl·H-Thr-OMe). 오일형태로 다음 반응을 진행하였다.
TLC: Rf 0.45(아세토니트릴/아세트산/물=80/2/20 부피비)
(2) Ntc-Thr-OMe의 합성
상기에서 합성한 HCl·H-Thr-OMe 고체 1.0 당량(475 mmol)을 아세토니트릴 500 mL에 녹이고, 여기에 2.0 당량의 트리에틸아민을 첨가한 후 얼음물 하에서 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl) 1.0 당량을 조금씩 적가 한 후 2시간 정도 교반 반응하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴을 감압 증류하여 오일화하고 여기에 물과 에틸아세테이트를 첨가하여 완전히 용해시켰다. 얼음물 하에서 3M 염산 수용액으로 산성화하고, 추출된 유기층을 충분히 물과 소금물로 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일 형태로 감압 증류한 후 소량의 에틸아세테이트와 n-헥산으로 재결정하였다(Ntc-Thr-OMe).
m.p: 111∼113℃
TLC: Rf 0.48(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
HPLC: Rt 18.986(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(3) Ntc-Thr(trt)-OMe의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Thr-OMe 고체 1.0 당량(100 mmol)을 300 mL의 디클로로메탄에 녹이고, 4.0 당량의 트리에틸아민 및 0.1 당량의 디메틸아미노피리딘을 첨가하고 2.1 당량의 trt-Cl을 얼음물 하에서 조금씩 적가 교반하였다. 반응 종결 후 얼음물 하에서 매우 조심스럽게 0.5M 염산 수용액으로 중성화하고 감압 증류한 후 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 유기층을 충분히 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 여과액을 감압 증류하여 오일 형태의 생성물을 얻었다(Ntc-Thr(trt)-OMe).
TLC: Rf 0.90(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
(4) Ntc-Thr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Thr(trt)-OMe 오일 1.0 당량(41 mmol)을 메탄올/테트라하이드로퓨란/물(1/3/1 부피비)의 혼합용액에 완전히 녹이고, 얼음물 하에서 10% 수산화나트륨 수용액을 조금씩 적가한 후 상온에서 반응하였다. 반응 종료 후 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 유기층을 충분한 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 이어서 유기층을 감압 증류하고 디에틸에테르로 재결정하였다(Ntc-Thr(trt)-OH).
m.p: 125∼127℃
TLC: Rf 0.62(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
(5) Nsc-Thr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Thr(trt)-OH 고체 1.0 당량(40 mmol)을 아세톤 200 mL, 0.3M Na2MoO4 20 mL에 녹이고 얼음물 하에서 과산화수소 25 mL를 조금씩 적가 교반하였다. 약 3시간 정도 반응 후 감압 증류하고 물과 에틸아세테이트를 첨가하였다. 유기층을 물과 소금물로 충분히 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과한 후 감압 증류하고 소량의 에틸아세테이트에 녹이고 디에틸에테르로 재결정하여 Nsc-Thr(trt)-OH(순도: 98% 이상)를 얻었다.
m.p: 103∼104 ℃
TLC: Rf 0.58(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비
HPLC: Rt 30.768(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
실시예 3: N-Nsc-O-트리틸-L-티로신 ("Nsc-Tyr(trt)-OH")의 합성
(1) HCl·H-Tyr-OMe의 합성
1.0 당량(500 mmol)의 티로신을 400 mL의 메탄올에 넣고 여기에 얼음물 하에서 1.4 당량(55 mL)의 티오닐 클로라이드(SOCl2)를 조심스럽게 조금씩 적가한 후 실온에서 3일동안 교반하였다. 반응 후 메탄올을 감압 증류하고 여기에 디에틸에테르를 첨가하여 충분히 세척하고 여과 건조하였다(HCl·H-Tyr-OMe).
m.p: 193∼194 ℃
TLC: Rf 0.51(에틸아세테이트/피리딘/아세트산/물=42/14/6.6/4 부피비)
HPLC: Rt 9.57(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(2) Ntc-Tyr-OMe의 합성
상기에서 합성한 HCl·H-Tyr-OMe 고체 1.0 당량(500 mmol)을 2M 탄산칼륨 수용액 300 mL와 물 300 mL, 100 mL의 아세토니트릴에 녹이고, 얼음물 하에서 2-(4-니트로페닐)티오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl) 1.0 당량을 조금씩 적가한 후 3시간 정도 반응하였다(pH 8 유지). 반응 종료 후 아세토니트릴을 감압 증류 오일화하고 여기에 물과 에틸아세테이트를 첨가하여 완전히 용해시켰다. 얼음물 하에서 3M 염산 수용액으로 산성화하고 추출된 유기층을 충분히 물과 소금물로 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일형태로 감압 증류 후 소량의 에틸아세테이트와 n-헥산으로 재결정하였다(Ntc-Tyr-OMe).
m.p: 97∼98 ℃
TLC: Rf 0.38(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
HPLC: Rt 23.840(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(3) Ntc-Tyr(trt)-OMe의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Tyr-OMe 고체 1.0 당량(50 mmol)을 100 mL의 아세토니트릴에 녹이고, 2.5 당량의 트리에틸아민 및 0.1 당량의 디메틸아미노피리딘을 첨가하고 1.0 당량의 trt-Cl을 얼음물 하에서 조금씩 적가 교반하였다. 반응 종결 후 감압 증류한 후 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 얼음물 하에서 매우 조심스럽게 0.25M 시트르산으로 산성화(pH ∼4)하고 유기층을 충분히 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 여과액을 감압 증류하여 오일형태의 생성물을 얻었다(Ntc-Tyr(trt)-OMe).
TLC: Rf 0.71(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
HPLC: Rt 30.768(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(4) Ntc-Tyr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Tyr(trt)-OMe 오일 1.0 당량(50 mmol)을 150 mL의 메탄올과 100 mL의 테트라하이드로퓨란 혼합물에 완전히 녹이고, 얼음물 하에서 3M 수산화나트륨 수용액 50 mL를 조금씩 적가한 후 상온에서 가수분해 반응하였다. 반응 종료 후 얼음물 하에서 0.5M 시트르산을 조금씩 조심스럽게 적가하면서 중성화하였다. 감압 증류한 후, 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 유기층을 5% 탄산수소나트륨과 충분한 물로 세척한 후에 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 이어 유기층을 감압 증류하고 디에틸에테르로 재결정하였다(Ntc-Tyr(trt)-OH).
m.p: 125∼127 ℃
TLC: Rf 0.75(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
(5) Nsc-Tyr(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Tyr(trt)-OH 고체 1.0 당량을 80 mL의 아세톤 및 0.3M Na2MoO4에 녹이고 얼음물 하에서 과산화수소를 조금씩 적가 교반하였다. 약 3시간 정도 반응 후 감압 증류하고 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 얼음물 하에서 조심스럽게 0.1M 시트르산로 산성화(pH ∼4) 하였다. 유기층을 물과 소금물로 충 분히 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과한 후 감압 증류하고 소량의 에틸아세테이트에 녹이고 디에틸에테르로 재결정하여 Ntc-Tyr(trt)-OH를 얻었다.
m.p: 168∼170 ℃
TLC: Rf 0.70(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 30.768(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
실시예 4: N-Nsc-O-2-클로로트리틸-L-티로신 ("Nsc-Tyr(2-Cltrt)-OH")의 합성
상기 실시예 3의 합성방법으로 수행하되, 다만 (3)에서 트리틸 클로라이드(trt-Cl)를 사용하는 대신에 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Cltrt-Cl)를 사용하여 Ntc-Tyr(2-Cltrt)-OH를 합성하였다.
실시예 5: N-Nsc-N-트리틸-L-리신 (Nsc-Lys(trt)-OH)의 합성
(1) H-Lys(trt)-OH의 합성
리신 염산염 1.0 당량(25 mmol)을 50 mL의 디클로로메탄에 녹이고, 여기에 1.5 당량의 클로로트리메틸실란(TMS-Cl)을 적가하고 30분간 가열 환류시켰다. 이 혼합물을 실온에서 식힌 후 트리에틸아민 5.0 당량과 2.0 당량의 트리틸 클로라이드(trt-Cl) 를 첨가하고 약 15시간 정도 교반 반응하였다. 반응 종료 후 물을 첨가하고 유기층을 충분히 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과한 후 감압 증류하여 오일형태의 생성물을 얻었다. 상기에서 합성한 오일 잔류물을 선택적으로 탈 트리틸화(detritylation) 시키기 위해 1% 트리플루오르아세트산(TFA)가 함유된 DCM 용액으로 0 ℃에서 30분간 교반한 후 22 ℃에서 1시간 교반 반응시켰다. 그리고 이 혼합 용액에 1.2 당량의 트리에틸아민을 첨가 교반하고 감압 증류하였다. 얻어진 오일 잔류물에 디에틸에테르와 5% 시트르산 수용액을 넣어 분리 세척하였다. 분리된 유기층을 한번 더 5% 시트르산로 세척하고, 수용액층을 디에틸에테르로 세척한 후 4N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 조절하였다. 이때 생성된 고체를 여과하고 물과 디에틸에테르로 세척 건조하였다(수율: 64%, H-Lys(trt)-OH).
(2) Nsc-Lys(trt)-OH의 합성
상기에서 합성한 H-Lys(trt)-OH 고체 1.0 당량을 0.75M 탄산칼륨 수용액과 아세토니트릴에 녹였다. 여기에 얼음물 하에서 1.1 당량의 Nsc-Osu을 조금씩 적가하고 난 후 실온에서 2시간동안 교반 반응하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴을 감압 증류 하에서 제거하고 과량의 Nsc-Osu를 제거하기 위해 디에틸에테르로 수용액층을 두 번 세척하였다. 수용액층에 에틸아세테이트를 넣고, 얼음물 하에서 0.1M 시트르산으로 매우 조심스럽게 산성화(pH 6) 하였다. 분리된 에틸아세테이트층을 충분히 물로 세척한 후 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일 형태로 감압 증류한 후, 뜨거운 디에틸에테르로 녹여 실온에서 방치하여 결정화하였다(수율: 65%).
실시예 6: N-Nsc-N-4-메틸트리틸-L-리신 ("Nsc-Lys(Mtt)-OH")의 합성
상기 실시예 5의 합성방법으로 수행하되, 다만 (1)에서 트리틸 클로라이드(trt-Cl)를 사용하는 대신에 4-메틸트리틸 클로라이드(4-Mtt-Cl)를 사용하여 Nsc-Lys(Mtt)-OH를 합성하였다.
실시예 7: N-Nsc-NG-트리틸-L-아르기닌 ("Nsc-Arg(trt)-OH")의 합성
(1) Ntc-Arg-OH의 합성
1.0 당량(400 mmol)의 아르기닌을 0.5M 탄산칼륨 수용액과 200 mL의 1,4-디옥산에 녹이고 얼음물 하에서 1,4-디옥산에 녹인 2-(4-니트로페닐)티오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl) 1.0 당량을 약 1시간동안 조금씩 적가하였다. 적가한 후 pH 8이 되는지 확인하고 30분간 교반 반응하였다. 아세트산으로 pH 5∼6으로 조절 후, 물을 첨가하고 실온에서 1시간동안 교반한 후 생성된 침전물을 여과하였다. 여과물을 물과 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르로 충분히 세척한 후 건조하였다(Ntc-Arg-OH).
m.p: 133∼135 ℃
TLC: Rf 0.13(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 12.569(20-80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(2) Ntc-Arg(trt)1,2-OH 혼합물의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Arg-OH 고체 1.0 당량(25 mmol)을 150 mL의 아세톤 및 4M 수산화나트륨 수용액에 완전히 녹이고 얼음물 하에서 아세톤에 녹인 2.0 당량의 trt-Cl을 1시간동안 천천히 적가하였다. 그리고 이 용액을 실온에서 1시간 교반 반응한 후 3M HCl 수용액으로 중성화하여 반응을 중지하고 감압 증류하였다. 이 오일 잔류물을 에틸아세테이트에 완전히 녹이고 0.5M HCl 수용액으로 유기층을 세척하고 다시 물과 소금물로 충분히 세척 후 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 여과 후 감압 증류하며, 이때 고체가 생성되며 에틸아세테이트가 소량 남았을 때 디에틸에테르를 넣어 충분히 고체를 생성시키고 여과 건조하였다. 얻어진 생성물은 혼합물로 다음 반응에 이용하였다. 생성된 고체는 모노-트리틸/디-트리틸가 7/3의 비율로 생성되었다(Ntc-Arg(trt)1,2-OH).
Ntc-Arg(trt)1-OH :
TLC: Rf 0.28(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 25.519(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
Ntc-Arg(trt)2-OH :
TLC: Rf 0.40(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 34.371(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(3) Nsc-Arg(trt)1-OH 및 Nsc-Arg(trt)2-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Arg(trt)1,2-OH 혼합물 1.0 당량(5 mmol)을 20 mL의 아세톤 및 0.3M Na2MoO4 2 mL에 녹이고 얼음물 하에서 과산화수소 2 mL를 조금씩 적가 교반하였다. 약 3시간 정도 반응 후 감압 증류하고 물과 에틸아세테이트를 첨가하고 얼음물 하에서 조심스럽게 0.5M 염산 수용액으로 산성화(pH ∼4) 하였다. 유기층을 물과 소금물로 충분히 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과한 후 감압 증류하고 소량의 에틸아세테이트에 녹이고 디에틸에테르로 재결정하였다. 생성된 혼합 고체는 클로로포름과 메탄올의 전개용매 하에서 컬럼 크로마토그래피법(column chromatography)으로 정제하였다.
Ntc-Arg(trt)1-OH :
m.p: 204∼206 ℃
TLC: Rf 0.15(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 22.5(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
Ntc-Arg(trt)2-OH :
m.p: 150∼152 ℃
TLC: Rf 0.30(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
HPLC: Rt 31.8(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
실시예 8: N-Nsc-N-in-t-Boc-L-트립토판 ("Nsc-Trp(Boc)-OH")의 합성
(1) HCl·H-Trp-OMe의 합성
1.0 당량(200 mmol)의 트립토판을 150 mL의 메탄올에 넣고 여기에 얼음물 하에서 1.4 당량의 티오닐 클로라이드(SOCl2)를 조심스럽게 조금씩 적가한 후 실온에서 3일 교반하였다. 반응 후 메탄올을 감압 증류하고 여기에 디에틸에테르를 첨가하여 충분히 세척 여과 건조하였다(HCl·H-Trp-OMe).
m.p: 228∼230 ℃
TLC: Rf 0.90(에틸아세테이트/피리딘/아세트산/물=42/14/6.6/4 부피비)
HPLC: Rt 5.398(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
(2) Ntc-Trp-OMe의 합성
상기에서 합성한 HCl·H-Trp-OMe 고체 1.0 당량(50 mmol)을 250 mL의 아세토니트릴에 녹이고, 여기에 2.0 당량의 트리에틸아민(또는 디이소프로필에틸아민)을 첨가한 후 얼음물 하에서 2-(4-니트로페닐)티오에톡시카르보닐 클로라이드(Ntc-Cl) 1.0 당량을 조금씩 적가 후 2시간 정도 교반 반응하였다. 반응 종료 후 아세토니트릴을 감압 증류 오일화하고, 여기에 물과 에틸아세테이트를 첨가하여 완전히 용해시켰다. 얼음물 하에서 1M 염산 수용액으로 유기층을 세척하고 다시 1M 탄산수소나트륨 수용액으로 세척한 뒤 마지막으로 충분한 물과 소금물로 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 유기층을 오일 형태로 감압 증류한 후 소량의 디에틸에테르와 석유에테르로 재결정하였다(Ntc-Trp-OMe).
m.p: 88∼89℃
TLC: Rf 0.83(클로로포름/메탄올/아세트산=90/10/3 부피비)
(3) Ntc-Trp(Boc)-OMe의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Trp-OMe 고체 1.0 당량(50 mmol)을 150 mL의 아세토니트릴에 녹이고, 0.1 당량의 디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하고 1.1 당량의 디-t-부틸-디카르보네이트((Boc)2O)를 얼음물 하에서 조금씩 적가 교반한 후 실온에서 1시간동안 교반 반응하였다. 반응 종결 후 감압 증류하고 얻어진 오일 잔류물을 에틸아세테이트에 완전히 녹였다. 이 유기층을 2M 시트르산으로 세척하고 충분히 물과 소금물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 여과액을 감압 증류하여 오일 형태의 생성물을 얻었다(Ntc-Trp(Boc)-OMe).
TLC: Rf 0.89(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
(4) Ntc-Trp(Boc)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Trp(Boc)-OMe 오일 1.0 당량(47.5 mmol)을 200 mL의 메 탄올에 완전히 녹이고, 얼음물 하에서 10% 수산화나트륨 수용액 50 mL을 조금씩 적가한 후 상온에서 1시간 동안 가수분해 반응하였다. 반응 종료 후 감압 증류하고, 물과 에틸아세테이트를 첨가하여 유기층을 0.25M 시트르산과 충분한 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조 여과하였다. 이어 유기층을 감압 증류하고 에틸아세테이트와 디에틸에테르로 냉장 하에서 재결정하였다(순도: 98%, Ntc-Trp(Boc)-OH).
TLC: Rf 0.51(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
(5) Nsc-Trp(Boc)-OH의 합성
상기에서 합성한 Ntc-Trp(Boc)-OH 고체 1.0 당량(68 mmol)을 300 mL의 아세톤과 0.3 Na2MoO4에 녹이고 얼음물 하에서 과산화수소를 조금씩 적가 교반하였다. 45 ℃에서 약 3시간 정도 반응 후 감압 증류하고 물과 에틸아세테이트를 첨가하였다. 유기층을 물과 소금물로 충분히 세척하고 황산나트륨으로 건조 여과한 후 감압 증류하고 소량의 에틸아세테이트에 녹이고 에틸아세테이트와 n-헥산으로 재결정하였다(수율: 79%, 순도: 98% 이상).
m.p: 173∼175 ℃
TLC: Rf 0.30(클로로포름/메탄올/아세트산=95/5/3 부피비)
HPLC: Rt 22.156(20∼80% 0.1% TFA in AcCN for 40min, XTerraTMRP18, 5㎛, 4.6×25mm)
실험예 1: 펩티드 합성
상기 실시예에서 합성한 Nsc-아미노산을 이용하여 아래와 같은 펩티드 합성[K. Barlos et.al., J. Peptide Res. 51, 194, 1998]에 응용하였다. 다음의 펩티드들은 고체상 펩티드 합성법에 의해 합성되었으며, 사용한 수지는 2-클로로트리틸 레진이며, 합성된 펩티드는 HPLC와 Maldi-Tof mass를 이용하여 분석하였다.
다음의 펩티드 1, 2번 합성 시, 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl chloride resin(Bead TechTM): 1% DVB crosslinked: 100∼200 mesh; 0.6∼1.5 mmol/g)에 첫번째 아미노산인 Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ser(trt)-OH를 각각 결합시키고, 1% 1,8-디아자바이싸이클로[5.4.0]운뎃-7-엔(DBU)에 20% 피페리딘이 포함된 디메틸포름아미드(DMF) 용액으로 Nsc를 탈보호 처리하였다. 이때 레진 g당 결합된 아미노산의 용량은 0.60 mmol과 0.65 mmol이며 100 mg씩 합성에 사용되었다.
또한 3번 펩티드 역시 위의 방법에 의거하여 레진 g당 결합된 Nsc-Tyr(tBu)-OH와 Nsc-Tyr(trt)-OH의 용량은 각각 0.70 mmol과 0.6 mmol 이었으며 100 mg씩 합성에 사용되었다.
이 후 축합에 사용되어지는 Nsc-아미노산과 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (Bop), N-하이드록시벤조트리아졸 (HOB)는 4 배수를 사용하였고, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)는 8 배수 사용하였다. 축합 반응 시 디메틸포름아미드 (DMF) 용매 하에서 1시간 실온에서 반응하고 디메틸포름아미드 (DMF)로 세척하였다. 또한 각 아미노산 축합하였고, Nsc 탈보호는 1% 1,8-디아자바이싸이클로[5.4.0]운뎃-7-엔 (DBU)에 20% 피페리딘이 포함된 디메틸포름아미드(DMF) 용액으로 5분, 1분, 1분씩 반응하고 세척하였다.
목적하는 펩티드를 합성한 후 마지막으로 다음 표 1과 같은 다양한 조건 하에서 tBu와 trt 보호기를 제거한 결과, Nsc/tBu-아미노산을 사용했을 경우에 비해 새로이 합성한 Nsc/trt-아미노산을 사용했을 시 보다 향상된 순도를 보였다. 즉, Nsc/trt-아미노산 사용 시 Met, Trp, Tyr이 포함된 서열의 펩티드 합성 시 부반응을 상당히 억제하고 축합 수율도 향상되는 것을 볼 수 있었다. 이를 통해 새로 합성한 Nsc/trt-아미노산의 유용성을 확인할 수 있었다.
1.
Nsc-Ser-Met-Ser-Met-Ser-OH
1-a. Nsc/tBu-아미노산 사용
1-b. Nsc/trt-아미노산 사용
2.
Nsc-Ser-Trp-Ser-Trp-Ser-OH
2-a. Nsc/tBu-아미노산 사용
2-b. Nsc/trt-아미노산 사용
3.
H-Thr-Thr-Trp-Thr-Ser-Met-Ser-Trp-Tyr-OH
3-a. Nsc/tBu-아미노산 사용
3-b. Nsc/trt-아미노산 사용
| 펩티드 | 탈보호 조건(%) | 시간 (분) | 펩티드 | 순도 (%) |
| 1-a | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 90 | Nsc-Ser-Met-Ser-Met-Ser-OH (Nsc/tBu 이용) | 56 |
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 35 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 67 | ||
| 1-b | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 90 | Nsc-Ser-Met-Ser-Met-Ser-OH (Nsc/trt 이용) | 95 |
| TFA/CH2Cl2= 5/95 | 15 | 93 | ||
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 83 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 81 | ||
| 2-a | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 90 | Nsc-Ser-Trp-Ser-Trp-Ser-OH (Nsc/tBu 이용) | 70 |
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 35 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 48 | ||
| 2-b | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 90 | Nsc-Ser-Trp-Ser-Trp-Ser-OH (Nsc/trt 이용) | 87 |
| TFA/CH2Cl2= 5/95 | 15 | 93 | ||
| CH2Cl2/TFA/TIS =94/1/5 | 30 | 93 | ||
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 56 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 65 | ||
| 3-a | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 120 | H-Thr-Thr-Trp-Thr-Ser-Met-Ser-Trp-Tyr-OH (Nsc/tBu 이용) | 25 |
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 22 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 60 | ||
| 3-b | TFA/CH2Cl2= 50/50 | 15 | H-Thr-Thr-Trp-Thr-Ser-Met-Ser-Trp-Tyr-OH (Nsc/trt 이용) | 81 |
| TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5 | 120 | 69 | ||
| TFA/H2O/EDT/TIS = 94.5/2.5/2.5/2.5/1 | 120 | 66 | ||
| TFA/CH2Cl2= 5/95 | 15 | 95 | ||
| CH2Cl2/TFA/TIS = 94/1/5 | 30 | 83 |
상기 표 1에 의하면, 고체상 합성법에 의한 다양한 구조의 펩티드를 합성함에 있어 공지의 Nsc/tBu-아미노산을 사용하는 것보다는 본 발명에 따른 신규 아미노산 유도체 즉, Nsc/trt-아미노산을 사용하였을 때 반응 시간을 현저히 줄일 수 있었고 그리고 목적하는 펩티드의 순도를 크게 향상시키는 결과를 얻고 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 분절 펩티드의 합성
본 발명에서 합성한 Nsc/trt-아미노산을 이용하여 아래의 서열을 가진 연어 칼시토닌에 적용하였다 : CSNLS TCVLG KLSQE LHKLN TYPRT NTGSG TP
기존의 분절축합법(segment condensation)에 의한 합성 시, 1 ∼ 10번으로 정한 분절 아미노산 서열 중에서 2, 5번 위치에 Nsc-Ser(trt)-OH을 이용하여 합성을 하였을 경우, 80%의 순도를 가진 분절 펩티드를 합성할 수 있었으나, 반면 기존의 Fmoc, Nsc/tBu-아미노산을 이용한 합성법에서는 약 60 %의 순도를 보였다.
실험예 3: GRF(Growth related factor)의 합성
YADAI FTNSY RKVLG QLSAR KLLQD IMSR
상기와 같은 GRF(Growth related factor)의 합성에서의 예를 보면, 기존의 Nsc-Ser(tBu)-OH를 이용한 방법으로 합성할 경우, 합성 수율 및 순도가 매우 낮았으나 9, 18, 28번 위치에 Nsc-Ser(trt)-OH를 도입하였을 경우 매우 우수한 합성 순도 및 수율이 향상되는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 28번 위치에서는 Fmoc, Nsc-Ser/Ser(tBu)/Ser(Trt) 세개의 비교 실험을 진행하였는 데 Nsc-Ser(Trt)-OH를 사용한 결과가 가장 우수하게 나왔으며 Fmoc, Nsc-Ser-OH를 이용한 경우, 이소루이신 이후 반응이 거의 진행이 되지 않았으며, Fmoc, Nsc-ser(tBu)-OH의 경우도 심한 산화(oxidation)와 반응의 진행율이 낮아 10mer 이상 반응의 진행이 어려웠다.
실험예 4 : 펩티드 합성
본 발명에서 합성한 Nsc-Trp(Boc)-OH의 유용성을 보기 위해 아래와 같은 펩티드[B. Riniker et.al., proceeding of the APS., 950, 1990]를 합성하였다 : Nsc-Trp-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-OH
첫번째 아미노산이 결합된 Nsc-Val-PEG-PS 수지(0.18 mmol/g) 100 mg을 사용하였으며, 각 서열에 사용된 Nsc-아미노산의 경우, Arg의 보호기는 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐(pbf)이며, Trp의 경우 상기에서 합성한 t-부티록시카르보닐(t-Boc)이 보호기로 사용되었다.
축합에 사용 되어지는 Nsc-아미노산과 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(Bop), N-하이드록시벤조트리아졸(HOB)는 4배수를 사용하였고, 디이소프로필에틸아민(DIPEA)는 8 배수 사용하였다. 축합 반응 시 DMF 용매 하에서 1시간 실온에서 반응하고 DMF로 세척하였다. 또한 각 아미노산 축합 후 Nsc 탈보호는 1% 1,8-디아자바이싸이클로[5.4.0]운뎃-7-엔 (DBU)에 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액으로 5분, 1분, 1분씩 반응하고 세척하였다.
마지막 보호기 제거 시에는 트리플루오르아세트산(TFA)/1,2-에탄디티올(EDT)/물 (75/20/5)의 부피비로 2시간 반응 처리하였다. 얻어진 펩티드의 순도는 94%의 순도를 가지는 펩티드를 얻을 수 있었으나, 반면에 보호기가 없는 Nsc-Trp-OH 사용 시에는 65%의 순도를 가지는 펩티드를 얻었다. 즉, 설포닐 계열로 보호된 아르기닌 유도체와 트립토판이 포함된 서열의 펩티드 합성 시, 트립토판에 Boc으로 보호된 Nsc-Trp(Boc)-OH를 사용했을 때 일반적으로 보호기가 없는 트립토판을 사용했을 때 부반응으로 발생하는 설폰화를 최소화 할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따른 신규 아미노산 유도체의 유용성을 충분히 확인할 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체는 주쇄를 구성하는 Nsc의 구조적 안정성에 의하여 고체상 합성법에 의한 긴 사슬의 펩티드 합성이 가능하면서도, 고체상 펩티드 합성과정에서의 탈보호 반응이 용이하여 보다 우수한 순도와 수율로 다양한 구조의 펩티드를 합성할 수 있다.
Claims (6)
- 다음 화학식 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체 :[화학식 1]
상기 화학식 1에서,R1는 수소원자, -OR 또는 -NHR을 나타내고; R2은 수소원자, 치환 또는 비치환된 C1∼C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는를 나타내며, 이때 치환기는 -OR, -NHR 또는 -NHC(=NH)NHR을 나타내고; R은 보호기로서 트리틸기, 할로트리틸기, C1∼C6의 알킬 치환된 트리틸기, 또는 t-부티록시카르보닐기를 나타내고,
단, R1이 수소원자이고, R2가 OR로 치환된 C1∼C6의 알킬기 또는 페닐기이고, R가 t-부티록시카르보닐기인 화합물은 제외한다. - 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R은 트리틸기(-trt), 2-클로로트리틸기(2-Cltrt), 메틸트리틸기(-Mtt) 또는 t-부티록시카르보닐기(t-Boc)인 것임을 특징으로 하는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 -CHR1R2은 CH2O-Trt, -CH(O-Trt)CH 3, -CH2C6H4O-Trt, -CH2C6H4O-(2-Cltrt), -CH2CH2CH2CH2NH-Trt, -CH2CH2CH2 CH2NH-Mtt, -CH2CH2CH2NHC(=NH)NH-Trt, 또는 -CH2-인돌-N-t-Boc 인 것임을 특징으로 하는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체.
- 다음 화학식 2a로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 N-숙신이미드(Nsc-Osu)와 다음 화학식 3a로 표시되는 아미노산 단분자를 반응시켜 다음 화학식 4a로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐-아미노산(Nsc-아미노산)을 합성하는 과정, 그리고상기에서 제조한 화학식 4a로 표시되는 Nsc-아미노산의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)에 보호기(R)를 도입하여 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체를 합성하는 과정이 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법 :
상기에서, R1 및 R2은 각각 상기 청구항 1에서 정의한 바와 같고, R'는 수소원자, 하이드록시기 또는 아미노기를 나타내고; R"은 수소원자, C1∼C6의 알코올기, C 1∼C6의 알킬아민기, C1∼C6의 알킬구아니딘기, 하이드록시페닐기, 아미노페닐기, 구아니디노페닐기 또는를 나타낸다.
- 다음 화학식 2b로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐 클로라이드("Ntc-Cl")와 다음 화학식 3b로 표시되는 아미노산 알킬 에스테르 단분자를 반응시켜 다음 화학식 4b로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐-아미노산 에스테르("Ntc-아미노산 에스테르")를 합성하는 과정과,상기에서 제조한 화학식 4b로 표시되는 Ntc-아미노산 에스테르의 곁사슬로 위치하는 하이드록시기(-OH) 또는 아민기(-NH2)에 보호기(R)를 도입한 후에 에스테르 가수분해하여 다음 화학식 5로 표시되는 2-(4-니트로페닐)사이오에톡시카르보닐-아미노산("Ntc-아미노산")을 제조하는 과정과, 그리고상기에서 제조한 화학식 5로 표시되는 Ntc-아미노산을 설포닐화 반응하여 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체를 합성하는 과정이 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법 :
상기에서, R1, R2, R' 및 R"는 각각 상기 청구항 4에서 정의한 바와 같다. - 다음 화학식 1로 표시되는 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐 치환된 아미노산 유도체가 결합되어 있는 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 고체상 펩티드 합성법 :[화학식 1]
상기 화학식 1에서,R1는 수소원자, -OR 또는 -NHR을 나타내고; R2은 수소원자, 치환 또는 비치환된 C1∼C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는를 나타내며, 이때 치환기는 -OR, -NHR 또는 -NHC(=NH)NHR을 나타내고; R은 보호기로서 트리틸기, 할로트리틸기, C1∼C6의 알킬 치환된 트리틸기, 또는 t-부티록시카르보닐기를 나타내고,
단, R1이 수소원자이고, R2가 OR로 치환된 C1∼C6의 알킬기 또는 페닐기이고, R가 t-부티록시카르보닐기인 화합물은 제외한다.
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