JP2023007947A - 液相ペプチド製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の課題は、液相ペプチド合成用担体を用いるペプチド製造法において、アミノ酸活性エステルを液相処理により除去することを可能とする液相ペプチド製造法を提供することにある。
[1]次の工程a~dを含むことを特徴とする液相ペプチド製造方法。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
b.縮合反応後の反応液に、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
c.反応液中の前記アミノ保護基でアミノ基が保護された化合物のアミノ保護基を脱離する工程、
d.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。
[2]前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、次の一般式(1)で表されるアミノスルホン酸類及びアミノ硫酸類、
一般式(2)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類、並びに
一般式(3)で表されるアミノアルコール類から選ばれる化合物である[1]記載の液相ペプチド製造方法。
[3]前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、次の一般式(1a)で表されるアミノスルホン酸類、
一般式(2)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類、並びに
一般式(3)で表されるアミノアルコール類から選ばれる化合物である[1]記載の液相ペプチド製造方法。
[4]前記アミノ保護基が、Fmоc基、Bоc基、Cbz基及びAc基から選ばれる保護基である[1]~[3]記載の液相ペプチド製造方法。
[5]前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接又はリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である[1]~[4]のいずれかに記載の液相ペプチド製造方法。
[6]前記液相ペプチド合成用担体が、下記式(I):
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~18の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、又は式(a):
r、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
で表される化合物である[1]~[4]のいずれかに記載の液相ペプチド製造方法。
これにより、ペプチドの液相製造をワンポットで効率よく行うことが可能になった。
このような液相ペプチド合成用担体としては、例えば前記特許文献1-14に記載の化合物が挙げられる。好ましい液相ペプチド合成用担体としては、下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~18の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、又は式(a):
r、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の芳香族複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の芳香族複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
ここで、R17としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖又は分岐鎖のC1~10のアルキル基が挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示す。
当該有機基中に存在する脂肪族炭化水素基とは、直鎖、分岐状若しくは環状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、有機溶媒溶解性の点から、C5以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、C5~30の脂肪族炭化水素基がより好ましく、C8~30の脂肪族炭化水素基がさらに好ましい。当該脂肪族炭化水素基の具体例としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられるが、特にアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。さらに、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルケニル基が好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基がより好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がさらに好ましく、C8~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がよりさらに好ましい。
アルケニル基としては、ビニル基、1-プロぺニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、オレイル基などの一価の基、それらから誘導される二価の基が挙げられる。
アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基、1-プロピニル基などが挙げられる。
脂肪族炭化水素基に酸素原子を介して置換し得るシリル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基及び置換基を有していてもよいアリール基から選ばれる3個が置換したシリル基が好ましい。従って、前記脂肪族炭化水素基には、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基及び置換基を有していてもよいアリール基から選ばれる3個が置換したシリルオキシ基が置換していてもよい。ここで、置換基を有していてもよいアリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
好ましい酸素原子を介して置換するシリル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基であり、より好ましくは炭素数1~4の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基である。シリルオキシ基に置換する3個のアルキル基又はアリール基は、同一でも異なっていてもよい。なお、当該シリルオキシ基は、前記脂肪族炭化水素基に1~3個置換しているのが好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ここで、芳香族環としては、C6~18の芳香族炭化水素環、及びC4~10の芳香族複素環が挙げられる。
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
Raの芳香族環には、1~3個のハロゲン原子が置換していてもよい。
式(a)中のr、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが0~4を示す。
rは、0~4が好ましく、1~3がより好ましく、1~2がさらに好ましい。
ここで、R18としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
R15及びR16で表される酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基は、前記のR12及びR13と同じものが挙げられ、前記のR12及びR13と同じものが好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ここで、R19としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
なお、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後に、必要に応じて保護基を脱離、除去することで目的化合物を得ることができる。その場合の水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
ここでいうリンカーとは、リンカーの一方が、前記アミノ酸又はペプチドのカルボキシル基と結合し、他方が液相ペプチド合成用担体と結合する2つの反応基をもつ有機基である。好ましいリンカーは、分子量が約2000以下(好ましくは約1500以下、より好ましくは約1000以下)の有機基であって、反応基として、同じでも異なってもよく、アミノ基、カルボキシル基、及びハロメチル基からなる群より選ばれる少なくとも2つの基を分子内にもつ化合物である。リンカーとして、例えば、以下の化合物を挙げることができる。
アミノ保護基としては、Fmоc基、Bоc基、Cbz基、Ac基などが挙げられ、このうち塩基性条件で脱保護できるFmоc基がより好ましい。
なお、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後の任意の時点で、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。
水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
そのような有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、シクロヘキサン、シクロペンチルメチルエーテル(CPME)、メチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)、2-メチルTHF、4-メチルテトラヒドロピラン(4-メチルTHP)、酢酸イソプロピル、クロロホルム、ジクロロメタン、N-メチルピロリドンを挙げることができ、好ましくは、THF、DMF、シクロヘキサン、CPME,MTBE、2-メチルTHF、4-メチルTHP、酢酸イソプロピル、N-メチルピロリドンである。さらに、上記溶媒の2種以上の混合溶媒でもよい。
反応温度は、ペプチド合成において一般的に用いられる温度、例えば、-20~40℃が好ましく、より好ましくは0~30℃である。反応時間(1サイクルの時間)は、通常0.5~30時間である。
この工程は、縮合反応で副生するアミノ酸活性エステルをスカベンジする工程であり、当該スカベンジャーとしてアミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれる化合物を用いることを特徴とする。これらの化合物をスカベンジャーとして用いることにより、系内を酸性条件とすることなく、アミノ酸活性エステルを捕捉、除去できる。
一般式(2)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類;
一般式(3)で表されるアミノアルコール類が好ましい。
このうち、これらの化合物の溶解性の点から、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数6~8のアリーレン基がより好ましく、炭素数1~6の直鎖又は分岐際のアルキレン基がさらに好ましく、炭素数1~5の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基がよりさらに好ましく、炭素数1~3の直鎖アルキレン基がさらに好ましく、炭素数1又は2の直鎖アルキレン基が最も好ましい。
一般式(1)において、X1が単結合の場合はアミノスルホン酸類であり、X1が酸素原子の場合はアミノ硫酸類である。
一般式(2)において、X2が単結合の場合はアミノホスホン酸類であり、X2が酸素原子の場合はアミノリン酸類である。
工程bの別の態様は、縮合反応後の反応液に、アミノスルホン酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程である。
この工程は、縮合反応で副生するアミノ酸活性エステルをスカベンジする工程であり、当該スカベンジャーとしてアミノスルホン酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれる化合物を用いることを特徴とする。これらの化合物をスカベンジャーとして用いることにより、系内を酸性条件とすることなく、アミノ酸活性エステルが除去でき、固液分離や分液不良を解消した。
一般式(2)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類;
一般式(3)で表されるアミノアルコール類が好ましい。
このうち、これらの化合物の溶解性の点から、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数6~8のアリーレン基がより好ましく、炭素数1~6の直鎖又は分岐際のアルキレン基がさらに好ましく、炭素数1~5の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基がよりさらに好ましく、炭素数1~3の直鎖アルキレン基がさらに好ましく、炭素数1又は2の直鎖アルキレン基が最も好ましい。
一般式(1a)の化合物はアミノスルホン酸類である。
一般式(2)において、X2が単結合の場合はアミノホスホン酸類であり、X2が酸素原子の場合はアミノリン酸類である。
当該アミノ保護基の脱離工程は、アミノ保護基の種類により相違する。例えば、アミノ保護基がFmoc基の場合は反応液を塩基性条件とすればよい。アミノ保護基がBoc基の場合は反応液を酸性条件とすればよい。アミノ保護基がCbz基の場合は接触還元すればよい。アミノ保護基がAc基の場合は、強酸又は強塩基条件で脱保護すればよい。このうち、ワンポット液相合成とするには、アミノ保護基をFmoc基とするのがより好ましい。
Fmoc脱離工程は、反応液を塩基性にできればよいが、アミン化合物、例えば、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]-5-ノネン(DBN)、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]-オクタン(DABCO)、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの3級アミン類;1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミン、トリアミノエチルアミン、1-エチルピペラジン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、エチレンジアミン、ピぺリジン、ピペラジンなどの1級又は2級のアミノ基を少なくとも1つ持つ2価以上の水溶性アミン類を用いることができる。好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジン、4-アミノピペリジン、ジエチレントリアミンであり、より好ましくは、DBU、ピぺリジン、1-メチルピペラジンである。さらに好ましくはDBUである。
工程cにおいて添加するアミン化合物の当量は、系に存在するFmoc基の量に対して、1~30当量、好ましくは4~20当量、より好ましくは4~10当量である。
で表される化合物が挙げられる。
一般式(4)又は(5)中L1及びL2は、それぞれ2価の有機基を示す。当該2価の有機基としては、炭素数1~10の2価の有機基が好ましく、より好ましくは、メルカプト基を有していてもよい炭素数1~10の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数6~10のアリーレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数4~9のヘテロアリーレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、メルカプトトリメチレン基、メルカプトプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基、ナフチレン基、インドール基、ベンズイミダゾール基、キノリル基、イソキノリン基などが挙げられる。
Mは水素原子又はアルカリ金属を示す。具体的には、水素原子、ナトリウム、カリウムが挙げられる。
具体的には、メルカプトメタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸、3-メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンスルホン酸、2-メルカプトベンズイミダゾール-5-スルホン酸ナトリウム、メルカプトメタンホスホン酸ナトリウム、メルカプトエタンホスホン酸、3-メルカプトプロパンホスホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンホスホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記アミン化合物とメルカプト化合物は、同時に添加してもよく、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加してもよく、塩基を加えFmoc基を除去したのちにメルカプト化合物を加えてもよい。
Fmoc脱離工程は、-20~40℃の温度で、5分~5時間行えばよい。
工程cの反応液に水溶液を添加した後、水層と有機溶媒層を分液する。
水層には、アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドと活性エステルスカベンジャーとの縮合体と、DBF-トラッピング剤付加体が含まれる。すなわち、アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドと活性エステルスカベンジャーとの縮合体は、工程dの水溶液の添加だけで、容易に水層に抽出される。
一方、有機溶媒層には、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体が含まれる。
ここで、用いられる水溶液としては、水、又は中性付近のpHを有する水溶液が挙げられる。具体的には、水、塩化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸三ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸三カリウム水溶液等が挙げられる。
なお、液相ペプチド合成用担体として、以下に示す化合物を使用した。
・TIPS2-OH(C11)型ベンジル化合物(積水メディカル社製)(以下、B-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
・TIPS2-OH(C11)型キサンテン化合物(積水メディカル社製)(以下、X-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
また、以下の実施例では、B-STagがFmoc保護tBu保護グルタミン酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)と結合した化合物を、Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)と表記し、下記の構造を示すものとする。Fmoc-Glu(OtBu)-OHに限らず、他のアミノ酸と結合した場合も、これに準ずる表記とする。
アミノ酸活性エステルとスカベンジャーの縮合物の、水洗浄による除去率に関する検討
スカベンジャーとして、タウリン(実施例1-1)、2-AEHS(硫酸水素2-アミノエチル:2-アミノエチル硫酸)(実施例1-2)又はAEAE(2-(2-アミノエチルアミノ)エタノール)(比較例1)のいずれかを使用し、以下の検討を実施した。なお、タウリンは0.6Mの水溶液として、2-AEHSは0.25MのDMSO溶液として添加した。
CPME 7mL、DMF 3mLの混合溶液に、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.88g(1.5mmol)、COMU 0.64g(1.5mmol)、Oxyma 0.64g(4.5mmol)、DIPEA 1.55g(12.0mmol)を加え、室温で30分撹拌した。スカベンジャーを1.8mmol添加し、室温で15分攪拌した後、本液をHPLCにて分析し、アミノ酸活性エステルとスカベンジャーの縮合物の量を検証した。続いて、DBU 0.69g(4.5mmol)を加え、30分撹拌し、本液をHPLCにて分析した後に(分析(1))、1N塩酸4.5mLを加え、分液した。得られた有機層をHPLCにて分析し(分析(2))、アミノ酸活性エステルとスカベンジャーの縮合物の水層への除去率、すなわち洗浄性を検証した。結果を表1に示した。
カラム:MonoBisカラム 3.2×150mm 低圧タイプ、メソポア径11mm、ODS・エンドキャップ(株式会社京都モノテック、製品番号32150L11ODS)
移動相A:0.1%ギ酸含有5%イソプロパノール―5%イソプロピルエーテル水溶液
移動相B:0.1%ギ酸含有85%イソプロパノール―5%イソプロピルエーテル水溶液
流速:1.0mL/min
カラム温度:60℃
検出波長:215nm
グラジエント条件:5%B(0分)→5%B(1分)→100%B(11分)→100%B(16分)→5%B(17分)→5%B(20分)
除去率={(A-B)/A}×100(%)
除去率が高いほど、Fmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルとスカベンジャーの縮合物が水層に除去されやすく、有用なスカベンジャーであると言える。
X-STagに対して3.0当量のFmoc保護フェニルアラニン(Fmoc-Phe-OH)を添加し、3段階に分けてペプチド鎖を伸長する反応において、スカベンジャーを使用しなかった場合(比較例2)、スカベンジャーとしてタウリンを使用した場合(実施例2)のH―Phe―Phe-Phe-NH2の合成結果を比較した。なお、タウリンは0.6Mの水溶液として添加した。
X-STag 0.44g(0.5mmol)をCPME 7mL、DMF 3mLに溶解し、Fmoc-Phe―OH 0.58g(1.5mmol)、COMU 0.64(1.5mmol)、Oxyma 0.21g(1.5mmol)、DIPEA 0.26g(2.0mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。X-STagが生成物のFmoc-Phe-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、スカベンジャーを添加する場合は2.0mmol分を加え、室温で15分撹拌した。Fmoc-Phe-OHの活性エステルがスカベンジャーと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-プロパンスルホン酸ナトリウム0.54g(3.0mmol)(1.2mol/LとなるようDMSOに溶解)を添加し、DBU 0.88g(5.8mmol)を加え、30分撹拌した。Fmoc-Phe-NH-(X-STag)が生成物のH-Phe-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1N 塩酸3.4mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に50%リン酸水素二カリウム水溶液6.7mL、DMSO 0.18mL、DMF 0.18mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Phe-OHの活性エステルがスカベンジャーと縮合した化合物がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME 7mLを加え、H―Phe―NH―(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
各条件で得られたH―Phe―Phe―Phe-NH―(X-STag)に、トリフルオロ酢酸、水、トリイソプロピルシラン、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオールの92.5/2.5/2.5/2.5混合液を、H―Phe―Phe―Phe-NH―(X-STag)の濃度が50mMとなるよう添加し、室温で1時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、H―Phe―Phe―Phe-NH―(X-STag)の90%(v/w)のMTBEをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物を、H―Phe―Phe―Phe-NH―(X-STag)に対して68.4%(v/w)のMTBEで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H―Phe―Phe―Phe-NH2を得た。
得られたH―Phe―Phe―Phe-NH2の純度をHPLCで測定した。結果を表2に示した。HPLC分析条件は、実施例1と同一である。
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 2.40g(3.0mmol)をCPME6mL、THF9mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3.21g(7.5mmol)、WSCI・HCl 1.44g(7.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン36.8mg(0.3mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.94g(7.5mmol)、DMSO 38mLを加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.42g(8.6mmol)を添加し、DBU5.1mL(34mmol)を加え、20分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液75mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水17mL、5%炭酸ナトリウム水溶液6mL、DMF 1.2mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME27mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 2.38g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で2時間撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、20分撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物がないことを確認し、H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 2.43g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Ala-OH一水和物 1.33g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間半撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Ala-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Ala-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物がないことを確認し、H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1.67g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間撹拌した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、40分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Ala-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたタウリンと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 4.58gを得た。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.29mL、トリイソプロピルシラン0.29mL、ジチオトレイトール865mg、アニソール0.58mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルエーテル72mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をジイソプロピルエーテル10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの純度は90.5%であった。
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、Fmoc-NH-(D-STag)が生成物のNH2-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液10mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液し、NH2-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.55g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。NH2-(D-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エタノール(AEEE)62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、70分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Thr(tBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物がないことを確認し、H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.7mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、50分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物がないことを確認し、H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.58g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物がないことを確認し、H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Trp(Boc)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物がないことを確認し、H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.82g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 3.0mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物がないことを確認し、H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 24mL、IPA18mL、CPME6mL、水12mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag) 1.84gを得た。
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)1.14g(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.25mL、トリイソプロピルシラン0.25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE70mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 227mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の純度は77.2%であった。
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール150μL(2.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.74g(4.5mmol)、DMSO 4.5mLを添加し、DBU1.7mL(11.3mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液6mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液19mLを加えた後、室温まで昇温し分液した。得られた有機層に20%食塩水20mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME9mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF2mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.79g(1.4mmol)、COMU 0.57g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で1時間撹拌した。H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で1時間半撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(1.3mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、25分撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.81g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で55分撹拌した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Ala-OH・一水和物 0.47g(1.5mmol)、COMU 0.64g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール89μL(1.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。Fmoc-Ala-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.5mmol)、DMSO 2.5mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Ala-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 0.56g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で70分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、水 3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Asp(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 1.56gを得た。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸7.5mL、水0.21mL、トリイソプロピルシラン0.21mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.42mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの純度は78.4%であった。
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
Fmoc-NH-(X-STag) 1.10g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、Fmoc-NH-(X-STag)が生成物のNH2-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液4.8mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液10mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液し、NH2-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.54g(1.4mmol)、COMU 0.57g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。NH2-(X-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.11g(1.0mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で20分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたアミノメタンホスホン酸と縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、70分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Thr(tBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたアミノメタンホスホン酸と縮合した化合物がないことを確認し、H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.7mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で30分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、50分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.57g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.0mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEEEと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mL、DMF0.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Glu(OtBu)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.0mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Trp(Boc)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.83g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.0mmol)を加え、室温で40分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 3.0mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いた2-アミノエタノールと縮合した化合物がないことを確認し、H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 25mL、MeOH15mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag) 1.26gを得た。
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)1.15g(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.25mL、トリイソプロピルシラン0.25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE70mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 358mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の純度は78.1%であった。
H-Gln-Asn-Cys-Arg-OHの合成
1)H-Arg(Pbf)-O-(B-STag)の合成
B-STag 0.40g(0.5mmol)をCPME1mL、THF1.5mLに溶解し、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.81g(1.3mmol)、WSCI・HCl 0.24g(1.3mmol)、4-ジメチルアミノピリジン6.1mg(0.05mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、リン酸二水素2-アミノエチル(AEDP)0.18g(1.3mmol)、DMSO 2.5mLを加え、室温で1時間撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.37g(2.3mmol)を添加し、DBU0.84mL(5.6mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液15mL、CPME3mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水6mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Arg(Pbf)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME0.6mL加え、H-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.40g(0.7mmol)、COMU 0.28g(0.7mmol)、DIEPA 0.24mLを加え、室温で80分撹拌した。H-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、AEDP 92mg(0.7mmol)、DMSO 1.3mLを加え、室温で2時間撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.21g(1.2mmol)を添加し、DBU0.45mL(3mmol)を加え、50分撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液1.6mLを滴下したのち、5%炭酸水素カリウム水溶液7mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水8mL、DMF 0.4mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Cys(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物がないことを確認し、H-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.2mL、DMF1.1mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.40g(0.7mmol)、COMU 0.28g(0.7mmol)、DIEPA 0.24mLを加え、室温で65分撹拌した。H-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、AEDP92mg(0.7mmol)、DMSO 1.3mLを加え、室温で90分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.21g(1.2mmol)を添加し、DBU0.45mL(3mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液1.6mLを滴下したのち、5%炭酸水素カリウム水溶液7mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水8mL、DMF 0.4mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Asn(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.2mL、DMF1.1mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH0.48g(0.75mmol)、COMU 0.31g(0.73mmol)、DIEPA 0.39mLを加え、室温で80分撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、AEDP 0.10g(0.73mmol)、DMSO 1。5mLを加え、室温で45分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物を確認したのち、0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.22g(1.4mmol)を添加し、DBU0.50mL(3.4mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)に対し10%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液1.8mLを滴下した後、5%炭酸水素カリウム水溶液7mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水8mL、DMF 0.4mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc-Gln(Trt)-OHの活性エステルがスカベンジャーとして用いたAEDPと縮合した化合物がないことを確認し、H-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣として、H-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag) 1.58gを得た。
上記のH-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-O-(B-STag)1.58(0.50mmol相当)に事前に調製したトリフルオロ酢酸/水/トリイソプロピルシラン/3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール混液(90/2.5/2.5/5)10mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln―Asn-Cys-Arg-OH 275mgを得た。得られたH-Gln―Asn-Cys-Arg-OHの純度は82.6%であった。
以上のように、本発明で見いだされたアミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類は、アミノ酸活性エステルのスカベンジャーとして機能し、ペプチド伸長反応、特にワンポットで行う連続したペプチド伸長反応に有用であることが示された。
Claims (6)
- 次の工程a~dを含むことを特徴とする液相ペプチド製造方法。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、アミノ保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
b.縮合反応後の反応液に、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
c.反応液中の前記アミノ保護基でアミノ基が保護された化合物のアミノ保護基を脱離する工程、
d.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体が結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記アミノ保護基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。 - 前記アミノ保護基が、Fmоc基、Bоc基、Cbz基及びAc基から選ばれる保護基である請求項1~3のいずれか1項に記載の液相ペプチド製造方法。
- 前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接またはリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である請求項1~4のいずれか1項に記載の液相ペプチド製造方法。
- 前記液相ペプチド合成用担体が、下記式(I):
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~18の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、又は式(a):
r、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
で表される化合物である請求項1~5のいずれか1項に記載の液相ペプチド製造方法。
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