FR2511036A1 - Procede de preparation de derives d'insuline et produits obtenus - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION DE DERIVES D'INSULINE. ON PEUT SUBSTANTIELLEMENT ACCROITRE LE RENDEMENT DE LA PRODUCTION DE DERIVES DE THREONINE D'INSULINE HUMAINE LORS D'UNE AMIDATION DE LA DES(ALA)-INSULINE AVEC UN DERIVE DE L-THREONINE DANS UN MELANGE D'EAU ET D'UN SOLVANT ORGANIQUE MISCIBLE A L'EAU EN PRESENCE DE TRYPSINE, SI LA TENEUR EN EAU DANS LE MELANGE REACTIONNEL EST COMPRISE ENTRE 30 ET 10. APPLICATION A LA PREPARATION D'INSULINE HUMAINE.

Description

Procédé de préparation de dérivés d'insuline et produits obtenus. La

présente invention concerne un procédé de

préparation d' insuline humaine et les produits ainsi obtenus.

On connaît différents procédés de préparation d'insuline humaine Des exemples pour de tels procédés sont, entre autres, l'extraction de glandes pancréati- ques humaines, la synthèse à partir d'acides aminés primitifs, des procédés biotechnologiques et laconversion d'insuline porcine en insuline humaine Quelques-uns des procédés de conversion d'insuline porcine en

insuline humaine sont mis en oeuvre via lades-

octapeptide-(B 23-B 30)-insuline porcine et d'autres

procédés sont mis en oeuvre via la des(Ala)-insuline.

La présente invention concerne plus particulière-

ment la conversion dedes(Ala)-insuline porcine en insuline humaine via un dérivé thréonine B 30 de

l'insuline humaine.

Lors du traitement du diabète sucré, on a généralement utilisé des préparations d'insuline dérivant de l'insuline porcine ou bovine Les insulines bovines, porcines et humaines présentent de légères différences en ce qui concerne leur composition en acide

aminé, la différence entre l'insuline humaine et l'in-

suline porcine étant limitée à un seul acide aminé: l'acide aminé B 30 de l'insuline humaine est la thréonine,

tandis que celui de l'insuline porcine est l'alanine.

On a décrit un procédé de préparation d'insuline humaine à partir de des(Ala B 30)-insuline dans la demande de brevet européen N O 80 101 966, voir également Nature 280 ( 1979), 412 Suivant ladite demande de brevet, l'amidation est, de préférence, effectuée dans un milieu contenant O à 65 %, de préférence 40 à 60 % d'un solvant organique En outre, la température de réaction préférée est comprise entre 20 et 400 C; la température de 37 e C a été utilisée dans tous les exemples Suivant les 3 exemples, le rendement de

11036

l'association a été déterminé par CLHP (chromatographie en phase liquide à haute pression) et était de 75, de et d'environ 50 % Suivant le document Nature, le

rendement était de 73 %.

Un autre procédé de préparation d'insuline humaine à partir de des(Ala B 30)-insuline a été décrit

à l'occasion des séances du deuxième Symposium Interna-

tional de l'insuline, Aachen, République Fédérale d'Allemagne, 1979 Selon ledit document, l'amidation a été effectuée dans un milieu contenant environ 60 % d'un solvant organique et la réaction a été effectuée à 38 WC Le rendement de l'association a été déterminé

par CLHP et était de 67 %.

Un autre procédé de préparation d'insuline humaine à partir de des(Ala B 30)-insuline a été décrit à l'occasion des réunions du 16 ème Symposium Européen du peptide, Helsingbr, Danemark, 1980 Suivant ledit document, le procédé a été effectué dans un milieu

contenant environ 60 % d'un solvant organique Proba-

blement, la température de réaction était de 37 WC.

Après un temps de réaction de 30 minutes, le rendement était de 85 %; cependant, le rendement était abaissé

à 70 % après 22 heures.

Une des raisons pour les faibles rendements dans les procédés connus est la perte d'insuline due à des réactions secondaires indésirables, par exemple

2 1

la formation de DOI-Thr(R)-OR, dans lequel DOI représente la desoctapeptide-(B 23-B 30)-insuline porcine

et R 1 et R 2 sont tels que décrits ci-dessous.

L'objet de la présente invention consiste à trouver un procédé pour lequel le rendement du produit

de réaction est extrêmement élevé, de préférence supé-

rieur à 90 %.

De manière surprenante, on a trouvé qu'un tel rendement peut être obtenu en utilisant une concentration en eau beaucoup plus faible dans le mélange de réaction que pour les procédés connus et qu'il est en outre préférable d'effectuer le procédé à une température de réaction substantiellement plus basse que pour les

procédés connus.

Le procédé de la présente invention est caracté-

risé en ce qu'il comprend la réaction de la des(Ala B 30)-

insuline ou un sel ou un complexe de celle-ci avec un dérivé de Lthréonine de formule générale I Thr(R 2)-OR 1 dans laquelle R 1 représente un groupe de protection carboxylique et R 2 représente l'hydrogène ou un groupe de protectionhydroxyle ou avec un sel de ce dérivé dans un mélange d'eau, d'un solvant organique miscible à l'eau et de trypsine, dans lequel la teneur en eau est comprise entre 30 et 10 % De préférence, la température

de réaction est comprise entre environ O et la tempéra-

ture ambiante, c'est-à-dire environ 20 à 25 C.

Le procédé de la présente invention peut être effectué en dissolvant la des(Ala B 30)-insuline, un dérivé de L-thréonine de formule I et la trypsine dans un mélange d'eau et d'au moins un solvant organique miscible

à l'eau, éventuellement en présence d'un acide.

Les solvants organiques adéquats pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention sont des solvants

polaires qui sont miscibles à l'eau et, de préféren-

ce, les solvants qui sont capables de contenir de fortes concentrations de composés d'insuline et d'esters de thréonine Des exemples de tels solvants organiques adéquats sont des solvants aprotiques, tels que le N, N-diméthylformamide, le N,N-diméthylacétamide, la N-méthylpyrrolidone, l'hexaméthylphosphortriamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, l'acétone, le tétrahydrofuranne, le formamide et l'acétonitrile et des solvants protiques comme l'éthanol, le méthanol, le 2-propanol et le 1,2éthanediol La nature du solvant affecte le système dans son ensemble et une corrélation avantageuse avec un solvant produisant de hauts rendements d'amidation peut ne pas s'appliquer avec un solvant différent Les meilleurs rendements ont été obtenus avec des solvants aprotiques et ceux-ci sont les plus préférés pour la mise en oeuvre du procédé

de l'invention.

En fonction du solvant organique miscible à l'eau utilisé, de la température réactionnelle choisie et de la présence d'un acide dans le mélange réactionnel, la teneur en eau de ce dernier doit être inférieure à environ 30 % (volume/volume), de préférence inférieure à environ 25 % (v/v), et supérieure à environ 10 % (v/v),

de préférence supérieure à environ 15 % (v/v).

Un avantage qu'offre la réduction de la quantité d'eau dans le mélange réactionnel réside dans le fait que la formation de sous-produits diminue De même, en augmentant la quantité d'acide dans le mélange

réactionnel, on peut réduire la formation de sous-

produits L'accroissement du rendement est en corréla-

tion positive avec une faible teneur en eau dans le mélange réactionnel Afin d'empêcher la dénaturation de l'enzyme dans le mélange réactionnel à faible teneur en eau, la température de réaction devrait, de préférence, être substantiellement inférieure aux températures de réaction traditionnellement utilisées dans la synthèse des peptides avec de la trypsine, c'est-à-dire inférieure à environ 370 C. Le type de trypsine importe peu pour la mise en oeuvre de la présente invention La trypsine est une enzyme bien caractérisée qui est disponible dans' le commerce à un haut degré de pureté et qui est notamment d'origine bovine ou porcine De plus, on

peut utiliser la trypsine d'origine microbienne.

En outre, la forme sous laquelle se présente la trypsine, par exemple la trypsine cristalline (forme soluble), la trypsine immobilisée ou même des dérivés de la trypsine (pour autant que l'activité de la trypsine soit maintenue) importe peu pour la mise en oeuvre de là présente invention Il est entendu que l'expression "trypsine" utilisée dans la présente spécification englobe les trypsines de toutes origines, de même que toutes les formes de trypsine conservant une activité d'amidation, y compris les protéases d'une spécificité analogue à celle de la trypsine, par exemple la protéase

Achromobacter lyticus;voir "Agric Biol Chem 42, 1443 ".

Parmi les dérivés actifs de trypsine on peut mentionner par exemple les dérivés de la trypsine acétylée, de la trypsine succinylée, de la trypsine

traitée au glutaraldéhyde et de la trypsine immobilisée.

Si on utilise une trypsine immobilisée, on la

met en suspension dans le milieu.

Afin d'obtenir un système tampon approprié, on peut ajouter des acides organiques ou inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, 1 acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique et l'acide butyrique, et/ou des bases telles que la pyridine,

le TRIS, la N-méthylmorpholine et la N-éthylmorpholine.

Les acides organiques sont préférés, Cependant, la réaction peut être effectuée sans procéder à de telles additions La quantité d'acide ajoutée est habituellement inférieure à environ 10 équivalents par équivalents du dérivé de L-thréonine de formule I De préférence,

la quantité d'acide est comprise entre 0,5 et 5 équiva-

lents par équivalent de dérivé de L-thréonine de formule I On peut ajouter des ions qui stabilisent

la trypsinetels les ions de calcium.

On peut effectuer le procédé à une température se situant entre 370 C et le point de congélation du mélange réactionnel On effectue habituellement des réactions enzymatiques avec la trypsine à une température d'environ 370 C afin d'assurer une vitesse réactionnelle suffisante Toutefois, afin d'éviter l'inactivation de la trypsine, il est avantageux d'effectuer le procédé suivant la présente invention à une température inférieure à la température ambiante Dans la pratique, des températures réactionnelles supérieures à environ

0 C sont préférées.

Le temps de réaction est généralement situé entre quelques heures et quelques jours, suivant la température de réaction, la quantité de trypsine

ajoutée et les autres conditions de réaction.

L'action de la trypsine est en grande partie réglée par une interrelation de la teneur en eau et ensolvant, du rapport acide/base et de la température

de réaction de manière à favoriser son action d'amida-

tion et de supprimer des réactions secondaires indési-

rables catalysées par la trypsine La diminution de la concentration en eau dans le mélange réactionnel mène

aux deux résultats cités ci-dessus mais augmente égale-

ment le degré auquel s'effectue la dénaturation irré-

versible de la trypsine Cependant, cette dernière peut être au moins partiellement compensée par la diminution de la température de réaction La réduction de la température de réaction réduit également le degré d'amidation mais une telle réduction est compensée par

l'augmentation du temps de réaction.

Le rapport pondéral entre la trypsine et la

des(Ala 30)-insuline dans le mélange réactionnel est norma-

lement situé au-dessus d'environ 1: 200, de préférence au-dessus d'environ 1: 50, et en-dessous d'environ 1: 1 Les dérivés thréonine B 30 d'insuline humaine résultant de l'amidation peuvent être notés par la formule générale II (Thr(R 2)-OR 1)B 30-h-In

dans laquelle h-In représente le reste des(Thr)-

insuline humaine, et R 1 et R 2 ont la même significa-

tion que ci-dessus.

Des dérivés de L-thréonine de formule I utilisa-

bles sont ceux dans lesquels R 1 est un groupe de protec-

tion carboxylique qui peut être enlevé de l'ester de thréonine B 30 de l'insuline humaine (formule II) dans des conditions qui ne provoquent pas d'altérations substan-

tiellement irréversibles dans la molécule d'insuline.

A titre d'exemples de tels groupes de protections carbo-

xyliques on peut mentionner les alkyles inférieurs, par exemple le méthyle, l'éthyle et le tertiobutyle, les benzyles substitués tels que le p-méthoxybenzyle et le 2,4,6-triméthylbenzyle et le diphénylméthyle, et des groupes de formule générale -CH 2 CH 252 R, o R 3 représente un alkyle inférieur tel que le méthyle, l'éthyle, le propyle et le n-butyle Des groupes de protection hydroxyle avantageux R 2 sont ceux qui

peuvent être éliminés du dérivé thréonine B 30 de l'insu-

line humaine (formule II) dans des conditions qui ne

provoquent pas d'altérations substantiellement irréversi-

bles dans la molécule d'insuline A titre d'exemple

pour un tel groupe (R 2), on peut mentionner le tertio-

butyle. Les groupes d'alkyles inférieurs contiennent moins de 7 atomes de carbone, de préférence moins de atomes de carbone. D'autres groupes de protection couramment utilisés sont décrits par Wnsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Vol XV/1, éditeur

Eugen M ller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1974.

Un procédé de préparation d'insuline des C Ala B 30 est décrit dans HoppeSeyler's Z Physiol Chem 359

( 1978), 799 et suivantes.

Certains dérivés L-thréonine de formule I sont des composés connus et les autres dérivés de L-thréonine

peuvent être préparés de manière analogue à la prépara-

tion des composés connus.

Les dérivés de L-thréonine de formule I peuvent

être les bases libres ou des sels organiques ou inor-

ganiques adéquats de celles-ci, de préférence des

acétates, des propionates, des butyrates et des halogé-

nures d'hydrogène, tels que des chlorhydrates. Il est désirable d'utiliser les réactifs, c'est-à-dire la des(Ala 30)-insuline et les dérivés

L-thréonine de formule I en des concentrations élevées.

Le rapport molaire entre le dérivé de L-thréonine de formule I et la des(Ala B 30)-insuline est de préférence

supérieur à environ 5: 1.

Il est désirable que la concentration du dérivé de L-thréonine de formule I dans le mélange réactionnel

dépasse la concentration O, 1 molaire.

L'insuline humaine peut être obtenue à partir de dérivés de thréonine B 30 d'insuline humaine (formule II) en éliminant le groupe de protection R 1 et tous groupes de protection R par des procédés connus ou analogues aux procédés connus Dans le cas ou R 1 est méthyle, éthyle ou le groupe- CH 2 CH 2 SO 2 R 3, dans lequel R a la même signification que ci-dessus, ledit groupe de protection peut être éliminé dans des conditions légèrement basiques en milieu aqueux, de préférence

à un p H d'environ 8 à 12, par exemple d'environ 9,5.

En tant que bases, on peut utiliser l'ammoniac, le triéthylamine, des tampons bicarbonate/carbonate ou des hydroxydes de métaux alcalins tels que l'hydroxyde de sodium Dans le cas o R 1 est tertio-butyle, un benzyle sybstitué tel que le p-méthoxybenzyle ou le 2,4,6- triméthylbenzyle ou le diphénylméthyle, ledit groupe peut être éliminé par acidolyse, de -préférence

avec de l'acide trifluoracétique L'acide trifluoracé-

tique peut ne pas être aqueux ou peut contenir un peu d'eau ou il peut être dilué avec un solvant organique comme le dichlorométhane Dans le cas o R 2 est tertio-butyle, ledit groupe peut être éliminé par

acidolyse comme ci-dessus.

De préférence, les dérivés de thréonine B 30 de l'insuline humaine de formule II sont des composés

dans lesquels R 2 est un atome d'hydrogène et l'on pré-

pare ces composés à partir de dérivés de L-thréonine de formule I dans laquelle Ri est un atome d'hydrogène. A titre d'exemples pour un complexe ou un sel de des(Ala B 30)-insuline, on peut mentionner un

complexe de zinc ou un sel de zinc.

En choisissant les conditions de réaction suivant l'explication donnée cidessus, en considérant les conditions de réaction dans les exemples suivants, il est possible d'obtenir un rendement en dérivés de thréonine B 30 d'insuline humaine (formule Il) supérieur

à 90 % ou même supérieur à 95 %.

Un mode d'exécution préféré pour la préparation d'insuline humaine à partir d'un dérivé de thréonine B 3 O d'insuline humaine est le suivant: 1) Si l'une ou l'autre activité de trypsine subsiste après l'amidation, il est préférable de l'éliminer, par exemple dans des conditions dans lesquelles la trypsine est inactive, par exemple dans un milieu acide d'un p H inférieur à 3 La trypsine peut être éliminée par séparation suivant le poids moléculaire, par exemple par filtrationsur gel sur "Sephadex G-50 " ou sur "Bio-gel P 30 " dans de l'acide acétique (voir "Nature",

280 loc cit).

2) Des impuretés telles que la des(Ala B 3)-insuline qui n'a pas réagi peuvent être éliminées au moyen d'une chromatographie à échange d'anions et/ou de

cations.

3) Ensuite, le dérivé de thréonine B 30 d'insuline humaine (formule II) est débloqué et l'insuline humaine est isolée, par exemple cristallisée de façon connue

en soi.

Par ce procédé, on peut obtenir de l'insuline humaine d'une pureté pharmaceutique acceptable et on

peut éventuellement la purifier davantage.

Les abréviations utilisées sont conformes à la réglementation approuvée ( 1974) par "IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature", voir Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical

Nomenclature IUPAC-IUB, 2 ème édition, Maryland 1975.

Toutes caractéristiques nouvelles ou combinaisons

de caractéristiques décrites dans ce mémoire sont consi-

dérées comme essentielles et relèvent de l'invention.

Le procédé de préparation de dérivés d'insuline humaine et d'insuline humaine est illustré par les exemples suivants qui ne doivent cependant pas être considérés comme limitatifs Les exemples illustrent certains modes d'exécution préférés du procédé de l'invention.

Exemple 1

On a dissous 10 mg de des(Ala B 30)-insuline porcine dans 100 pl d'acide acétique 10 molaires A 50 p 1 de cette solution on a ajouté: loo ul de Thr-O Me (Me désigne méthyle) 2 molaires dans du N,N-diméthylacétamide, 601 ul de N,N-diméthylacétamide, 15 jl d'eau et 10 pl d'une solution de trypsine ( 8 % poids/volume) dans du chlorure de calcium 0,05 molaire Après incubation à 40 C pendant 24 heures, le produit a été précipité avec 8 ml d'acétone, séparé par centrifugation, lavé avec 8 ml d'acétone, séparé par centrifugation et séché sous vide Le rendement en(Thr-O Me) B 30-h-In a été

déterminé par CLHP.

Le produit a été dissous dans 2 ml d'acide acétique 1 molaire et 100 pl de la solution ont été introduits dans une colonne "Nucleosil 5 C 18 " de 4 x 200 mm pour une CLHP à renversement de phases, en utilisant un tampon de sulfate d'ammonium 0,2 molaire dont le p H est réglé à 3,5 et contenant 26,8 % (volume/ volume) d'acétonitrile comme éluant Ledérivé d'insuline il des(Ala B 30) a été élué après 18 minutes et B 30 (Thr-O Me) B 30-h-In après 24 minutes, pour un débit

de 1 ml/min Le sous-produit de la réaction, le dé-

rivé d'insuline (Thr-O Me) -des-heptapeptide-(B 24-B 30) a été élué après 7 minutes La détection et la déter- mination de la quantité de protéines étaient basées sur l'extinction à 280 nm L'analyse a donné la distribution des composés suivante: B 30 (Thr-O Me)B 30-h-In 97,1 % 1 B O Des(Ala B 30)-insuline: 2,5 %

(Thr-O Me)B 23-des-heptapeptide(B 24-B 30)-insuline 0,4:%.

Exemples 2 à 16 Les exemples suivants 2 à 16 du tableau 1 ont été effectués de manière semblable à l'exemple 1 enmodifiant les paramètres de la réaction comme montré dans ledit tableau Cependant, dans tous les exemples, on a ajouté 10 pl de trypsine à 8 % dans une solution aqueuse, 100 pl d'un solvant organique contenant un dérivé de thréonine de formule I et 50 pl d'acide acétique contenant 20 % dedes(Ala B 30)-insuline La molarité du dérivé de thréonine de formule I dans le solvant organique et de l'acide acétique apparaît dans

le tableau 1 Le temps de réaction était de 24 heures.

Dans le tableau 1, les abréviations suivantes ont été utilisées: HO Ac représente acide acétique, DMAA représente

le N;N-diméthylacétamide, DMF représente le N,N-diméthyl-

formamide, DMSO représente le diméthylsulfoxyde, NMP représente la Nméthylpyrrolidone et THF représente

le tétrahydrofuranne.

Dans le cas o (Thr-O But)B 30-h-In a été synthé-

tisé, voir exemple 15, l'élution par CLHP a été accomplie en appliquant un gradient d'acétonitrile de

26,8 % à 40 % (volume-/volume).

w Ln w o Ln o O Ln O Fi Ln

Tableau 1

molarité addition concentration du dérivé molarité supplémentaire approx estimée Exem Solvant de de de solvant rende de l'eau dans

ple organique thréonine HO Ac organique 2 ment R R le mélangeréac-

N M M pul A C % tionnel (%) 2 DMAA 2 10 60 15 12 97 Me H 20 3 DMAA 2 10 60 15 25 97 Me H 20 4 DMAA 2 10 75 O 4 93 Me H 13 DMF 2 10 60 15 4 97 Me H 20 6 DMF 2 10 60 15 12 97 Me H 20 7 DMF 2 10 60 15 25 97 Me H 20 8 DMSO 2 10 60 15 4 97 Me H 20 9 DMSO 2 10 60 15 12 94 Me H 20 NMP 2 10 60 15 4 96 Me H 20 11 NMP 2 10 60 15 12 97 Me H 20 12 DMAA 2 4 60 15 12 88 Me H 27 13 DMAA 2 4 75 O 12 94 Me H 21 14 DMF 2 4 60 15 -22 90 Me H 27 DMAA 2 10 60 15 12 97 But H 20 16 DMAA 2 10 60 15 12 91 Bu Bu 20 _ ro Un o o

251103 '5

Exemples 17 à 34 Ces exemples sont exécutés de manière analogue aux exemples 1 à 16 avec la restriction que le temps de réaction était de 4 heures Dans chacun de ces exemples le rendement était le même que celui obtenu

respectivement dans les exemples 1 à 16.

D'une comparaison des exemples 1 à 16 avec respectivement les exemples 17 à 34, il apparaît qu'on obtient les mêmes rendements et ceci distingue, en outre, le nouveau procédé décrit dans les exemples des procédés connus décrits dans le document de la réunion du 16 ème Symposium Européen sur les Peptides, cité ci-dessus Dès lors, la dépendance du temps a été éliminée.

Exemple 35

B 30

On disperse 250 mg de (Thr-O Me) -h-In cristal-

line dans 25 ml d'eau et on dissout par addition d'une

solution d'hydroxyde de sodium 1 N jusqu'à un p H de 10.

On maintient le p H à une valeur constante de 10 pendant 24 heures à 250 C On cristallise l'Linsuline humaine formée par addition de 2 g de chlorure de sodium, 350 mg d'acétate de sodium à trois molécules d'eau et de 2,5 mg d'acétate de zinc à deux molécules d'eau, puis on ajoute de l'acide chlorhydrique 1 N pour atteindre un p H de 5,52 Après conservation pendant 24 heures à 40 C, on isole les cristaux rhomboédriques par centrifugation, on les lave avec 3 ml d'eau, on les isole à nouveau par centrifugation, et on les

sèche sous vide Rendement: 220 mg d'insuline humaine.

Claims (16)

Revendications

1 Un procédé de préparation d'insuline humaine ou de dérivés de thréonine 30 d'insuline humaine ou d'un sel ou d'un complexe de ceux-ci par réaction de des(Ala B 3)-insuline porcine ou un sel ou un complexe de celle-ci-avec un dérivé de L-thréonine de formule générale I Thr(R 2) OR 1 dans laquelle R 1 représente un groupe de protection carboxylique et R 2 un atome d'hydrogène ou un groupe de protection hydroxyle, ou avec un sel de ce dérivé dans un mélange d'eau, d'un solvant organique miscible à l'eau et de trypsine, caractérisé en ce que la teneur en eau dans le milieu réactionnel est compris entre et 10 % (volume/volume) et en ce que la température de réaction est inférieure à environ 370 C en présence éventuelle d'un acide, le dérivé résultant étant ensuite, si désiré, libéré du groupe protecteur

pour former de l'insuline humaine.

2 Procédé suivant la revendication 1 caracté-

risé en ce que la concentration du dérivé de L-thréonine de formule I dans le mélange réactionnel dépasse la concentration 0,1 molaire, en ce que la température de réaction est supérieure au point de congélation du mélange réactionnel et en ce que le mélange réactionnel ne contient pas plus de 10 équivalents d'un acide par équivalent de dérivés de L- thréonine de formule I.

3 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes caractérisé en ce que la température de réaction est inférieure à la température ambiante

et supérieure à environ O WC.

4 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que la teneur en eau dans le mélange réactionnel est inférieure à 25 % (volume/volume). Procédé suivant l'une quelconques des revendi- cations précédentes caractérisé en ce que la teneur en eau dans le mélange réactionnel est supérieure à 15 % (volume/volume). 6 Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations précédentes caractérisé en ce que le rapport molaire entre le dérivé de Lthréonine de formule I

et lades(Ala B 30)-insuline estsupérieur à 5: 1.

7 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que le solvant organique miscible à l'eau est du méthanol, de l'éthanol,

du 2-propanol, du 1,2-éthanediol, de l'acétone, du dioxan-

ne, du tétrahydrofuranne, du formamide, du N,N-diméthyl-

formamide, du N,N-diméthylacétamide, de la N-méthylpyrro-

lidone, de l'hexaméthylphosphortriamide, de l'acétoni-

trile ou du diméthylsulfoxyde.

8 Procédé suivant la revendication 7 caractérisé

en ce que le solvant est du formamide, du N,N-diméthyl-

formamide, du N,N-diméthylacétamide, du N-méthylpyrroli-

done, de l'hexaméthylphosphortriamide, de l'acétonitrile

ou du diméthylsulfoxyde.

9 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que l'acide est un acide organique, de préférence l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique ou l'acide butyrique.

Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que la quantité d'acide dans le mélange réactionnel est compris entre 0,5 et 5 équivalents par équivalent de dérivés de L-thréonine de formule I.

11 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que le rapport pondéral entre la trypsine et lades(Ala B 30)-insuline dans le mélange réactionnel est supérieur à 1: 200,

de préférence supérieur à 1: 50, et inférieur à 1: 1.

12 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce qu'il est effectué

en présence d'ions calcium.

13 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce qu'il est effectué

dans un mélange tampon.

14 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que le dérivé de L-thréonine de formule I est ajouté sous forme d'acétate oupropionate, butyrate ou halogénure d'hydrogène tel

que le chlorhydrate.

Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que la température de réaction et la teneur en eau et en acide dans le mélange réactionnel sont choisies de sorte que le rendement en dérivés de thréonine B 30 d'insuline humaine dans le mélange de réaction est supérieur à 90 %, de préférence

supérieur à 95 %.

16 Procédé suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que R 1 est un

alkyle inférieur, un benzyle substitué ou un diphényl-

méthyle ou un groupe de formule générale CH 2 CH 25 Q 2 R 3

dans lequel R 3 représente un alkyle inférieur.

17 Procédé suivant la revendication 16 caracté-

risé en ce que R 1 est méthyle, éthyle, tertio-butyle, p-méthoxybenzyle, 2,4,6-triméthylbenzyle ou un groupe

3 3

de formule -CH 2 CH 2 SQ 2 R dans lequel R représente

le méthyle, l'éthyle, le propyle ou le n-butyle.

18 Procédé suivant l'une quelconque des reven-

dications précédentes caractérisé en ce que la libéra-

tion des groupes protecteurs est effectuée dans un milieu aqueux en présence d'une base, de préférence à

un p H compris entre 8 et 12.

19 Procédé suivant l'une quelconque des reven-

dications précédentes caractérisé en ce que la libéra-

tion du groupe protecteur est effectuée par acidolyse,

de préférence avec de l'acide trifluoroacétique.

Dérivés de thréonine B 30 d'insuline humaine préparés par le procédé suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 17.

21 Insuline humaine préparée par le procédé

suivant l'une quelconque des revendications l à 19.