LU83197A1 - Verfahren zur herstellung von threonin b30-estern menschlichen insulins sowie threonin b30-ester menschlichen insulins - Google Patents

Description

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Novo Industri A/S, Novo Allé, Bagsvaerd, Danemark B 30

Verfahren zur Herstellung von Threonin -Estern menschlichen B30

Insulins sowie Threonin -Ester menschlichen Insulins.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von B30 « Threonin -Estern menschlichen Insulins oder eines Salzes B30 oder Komplexes desselben, sowie Threonin -Ester menschlichen Insulins.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Umwandlung von Insulin und .insulinähnlichen Verbindungen in menschliches Insulin.

Bei der Behandlung von Diabetes Mellitus werden Insulinverbindungen, hergestellt aus Schweine- oder Rinderinsulin « 1 «« allgemein verwandt. Schweine-, Rinder- und menschliche Insuline zeigen geringfügige Unterschiede in ihrer Aminosäurezusammensetzung, wobei der Unterschied zwischen menschlichem und Schweineinsulin sich auf eine einzige Aminosäure beschränkt insofern, daß die B30 Aminosäure des menschlichen Insulins Threonin ist, während die von Schweineinsulin Alanin ist. .

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Es kann.daher immerhin eingewendet werden, daß die ideale Insulinpräparation für die Behandlung von Menschen ein Insulin mit exakt der gleichen chemischen Struktur wie der von menschlichem Insulin ist.

Für die Herstellung von menschlichem, natürlichen Insulin steht die notwendige Menge menschlicher Pancreas-Drüsen nicht zur Verfügung.

Synthetisches menschliches Insulin ist sehr teuer in kleinem Maßstab hergestellt worden, siehe Helv.Chim.Acta, _57, s. 2617, und 60, S. 27. Halbsynthetisches menschliches Insulin ist aus Schweineinsulin über zeitaufwendige Reaktionswege, wie in Hoppe-Seyler*s Zeitschrift für Physiologische Chemie, 357, 759, und Nature 280, 412 beschrieben, hergestellt worden.

Die US-PS 32 76 961 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von halbsynthetischem menschlichem Insulin. Nichtsdestoweniger ist die Ausbeute an menschlichem Insulin schlecht, da das Verfahren in Wasser durchgeführt wird, und unter Bedin- B22 B23 gungen, in denen Trypsin eine Spaltung der Arg -Gly -Bindung bewirkt, siehe Journal of Biological Chemistry, 236, S. 743.

Ein bekanntes halbsynthetisches Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin weist folgende drei Schritte auf: ' B30

Zuerst wird Schweineinsulin in Schweine-des-(Ala )-Insulin mittels Behandlung mit Carboxypeptidase A, siehe Hoppe-Seyler' s Zeitschrift von Physiologische Chemie, 359, Seite ,799,umgewandelt. Im zweiten Schritt wird Schweine-des-(AlaB30^- # i - 2 - 4 4

A

S · ' Insulin einer Trypsin-katalysiert mit Thr-OBut B 30 gekoppelt, wodurch der Thr -tert-Butylester menschlichen Insulins gebildet wird. Schließlich wird dieser Ester mit Trifluoressigsäure behandelt, um menschliches Insulin zu liefern, siehe Nature 280, Seite 412. Der erste Schritt liefert eine teilweise Abspaltung von AsnA2^, wodurch des-(AlaB3°, -A21

Asn )-Insulin geliefert wird. Dieser Abkömmling führt - nach den beiden anschließenden Reaktionen zu einer Verunrei- A21 gung von des-(Asn )-Insulin in dem hergestellten halbsynthetischen menschlichen Insulin, die .

nicht leicht mit dem bekannten Präparationsverfahren ent- A21 fernt werden kann. Des-(Asn )-Insulin besitzt niedrige biologische Aktivität (etwa 5 %), siehe American Journal of Medicine 40, Seite 750.

Die Aufgabe der Erfindung besteht also darin, ein Verfahren | zu liefern, mit welchem in industriellem Maßstab menschliches j Insulin hergestellt werden kann, wobei nicht-menschliches

Insulin in menschliches Insulin umgewandelt werden soll.

Weiterhin soll ein Verfahren geliefert werden, welches

Schweineinsulin und in diesem enthaltene bestimmte Verun- B30 reinigungen in menschliches Insulin über einen Threonin Ester des menschlichen Insulins umwandelt.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von

Threonin -Estern menschlichen Insulins gelöst, das gekenn- - zeichnet ist durch Transpeptidieren einer Insulinverbindung oder eines Salzes oder eines Komplexes derselben, welche in B30 die Insulin-Threonin -Ester umwandelbar sind, mit einem L-Threonin-Ester oder einem Salz desselben in einer Mischung von Wasser, einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel und Trypsin, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung ! weniger als 50 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur un terhalb 50°C ist, sowie durch ThreoninB^-Ester menschlichen I Insulins, bei denen die Estergruppe sich von t-Butyl und

Methyl unterscheidet.

Das Verfahren nach der Erfindung besitzt also folgende Vor- teile gegenüber dem Stand der Technik: * B30 a) Die enzymatische Hydrolyse zur Abspaltung von Ala ' beispielsweise mit Carboxypeptidase A, wird ausgelassen.

b) Die Isolation einer Zwischenverbindung, wie beispiels- B30 weise Schweine-des-(Ala )-Insulins, ist unnötig.

A21 c) Verunreinigungen mit des(Asn )-Insulin-Derivaten * werden vermieden.

» d) Proinsulin und andere insulinähnliche Verunreinigungen, die im Rohinsulin anwesend sind, werden durch das erfindungsgemäße Verfahren süber den Threonin^^-Ester des mensch- i liehen Insulins in menschliches Insulin umgewandelt, wodurch die Ausbeute erhöht wird.

e) Antigenartige insulinähnliche Verbindungen, siehe GB-PS 12 85*023, werden in menschliches Insulin umgewandelt.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele erläutert sind.

Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die an die B29 * Carbonylgruppe von Lys gebundene Aminosäure oder Peptid- kette in der Insulinverbindung mit einem Threonin-Ester ausgetauscht werden kann. Dieser Austausch wird hierin als Transpeptidierung bezeichnet.

Der hierin verwandte Terminus "Insulinverbindungen" umschließt Insuline und Insulin-ähliche Verbindungen, welche B30 die menschliche des(Thr )-Insulineinheit enthalten, wobei die B30-Aminosäure des Insulins Alanin (in Insulin von beispielsweise Schwein, Hund, Finn- und Spermwal) oder Serin ist, wie beim Kaninchen. Der Terminus "insuiinähnliche Verbindungen", wie er hierin gebraucht wird, schließt Proinsulin, das sich von irgendeiner oben genannter Spezies und Primaten ableitet, gemeinsam mit Intermediärprodukten von % der Umwandlung von Proinsulin in Insulin,ein. Als Beispiel derartiger Intermediärprodukte können gespaltenes Proinsulin, Desdipeptid-Proinsuline, Desnonapeptid-Proinsulin und Diargi-nin-Insuline genannt werden, siehe auch R. Chance "In Pro-ceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 bis 305, HerausgeberR.R. Rodrigues & J.V.-Owen, Ex- · cerpta Medica, Amsterdam.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist die Transpeptidierung einer Insulinverbindung oder eines Salzes oder eines Komplexes derselben mit einem L-Threonin-Ester oder einem Salz desselben in einer Mischung von Wasser, einem wassermischbaren organischei Lösungsmittel, und Trypsin, auf, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung weniger als etwa 50 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb etwa 50°C liegt.

Obwohl Trypsin wegen seiner· proteolytischen Eigenschaften am bekanntesten ist, haben Fachleute erkannt, daß Trypsin B 30 dazu befähigt ist, das Koppeln von des-(Ala )-Insulin und einem Threonin-tert-Butyl-Ester zu katalysieren, vide Nature 280, S. 412. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Trypsin zur Katalyse der Transpeptidierungsreaktion eingesetzt.

Die Transpeptidierung kann durch Auflösen von 1. der Insulinverbindung, 2. einem L-Threonin-Ester, und 3. Trypsin in einer Mischung von Wasser und mindestens einem wassermisch-baren organischen Lösungsmittel, wunschweise in Gegenwart einer Säure, durchgeführt werden.

Bevorzugte wassermischbare organische Lösungsmittel sind polare Lösungsmittel. Als spezifische Beispiele derartiger Lösungsmittel können Methanol, Ethanol, 2-Propanol, 1,2-E.thandiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, N,Ν-Dimethyl-formamid, Formamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid, N-Methylpvrrolidon, | Hexamethylphosphortriamid und Acetonitril genannt werden, ή.

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In Abhängigkeit davon, welches wassermischbare organische Lösungsmittels verwendet wird, von der ausgewählten Reak-tionstemperatur und davon, ob eine Säure in der Reaktions-mischung anwesend ist, sollte der Wassergehalt in der Reak-tionsmischung weniger als etwa 50 Vol.-% sein, bevorzugt weniger als etwa 40 Vol.-% und mehr als etwa 10 Vol.-% sein·

Ein Vorteil der Verminderung der Wassermenge in der Reaktionsmischung besteht darin, daß aufgrund dessen die Bildung von Nebenprodukten vermindert wird. Durch Erhöhen der Säure-Menge in der Reaktionsmischung ist es auf ähnliche Art und Weise möglich, die Nebenproduktbildung herabzusetzen. Die Erhöhung der Ausbeute ist positiv mit einem hohen Prozentsatz organischen Lösungsmittel korreliert.

Die Trypsinart ist nicht wesentlich für die Ausführung der Erfindung. Trypsin ist ein gut charakterisiertes, kommerziell in hoher Reinheit erhältliches Enzym, nämlich von Schweinen und Rindern. Weiterhin kann Trypsin mikrobiellen Ursprungs verwandt werden. Die Trypsinform, beispielsweise kristallines Trypsin (lösliche Form), immobilisiertes Trypsin oder sogar Trypsinderivate (so lange die Trypsinaktivität erhalten bleibt) ist nicht kritisch für die Durchführung der Erfindung. Der Terminus Trypsin, wie er hierin verwandt wird, soll Trypsine ’ aus allen Quellen und alle Formen von Trypsin umschließen, welche ' transpeptidierende Aktivität besitzen, eingeschlossen Proteasen mit trypsinähnlicher Spezifität, beispielsweise Acromobacter lyticus Protease, siehe Agric. Biol. Chem. 42, Seite 1443.

Als Beispiele aktiver Trypsinderivate können acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, mit Glutaraldehyd behandeltes Trypsin und immobiliserte Trypsin-Derivate genannt werden.

Wenn ein immobilisiertes Trypsin eingesetzt wird, wird es j, im Medium suspendiert.

Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Butyrsäure oder Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-hydroximethylaminomethan), N-Methyl-morpholin und N-Ethylmorpholin können dazugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zustande zu bringen. Organische Säuren verde bevorzugt eingesetzt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne derartige Zusatze durchgeführt werden. Die Menge zugesetzter Säure ist üblicherweise geringei als 10 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-Ester. Bevorzugt beträgt die Säuremenge zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-Ester. Ionen, welche Trypsin stabilisieren, wie Calciumionen, können zugegeben werden.

Das Verfahren kann .in 'einem Temperatur-Bereich von +50°C und dem Erstarrungspunkt der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden üblicherweise bei etwa 37°C durchgeführt, um eine genügende Reaktionsgeschwindigkeit zu gewährleisten. Nichtsdestoweniger ist es vorteilhaft, um Inaktivierung des Trypsins zu vermeiden, das Verfahren nach der Erfindung bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. In praxis werden Reaktionstemperaturen oberhalb etwa 0°C bevorzugt.

Die Reaktionszeit beträgt üblicherweise zwischen einigen Stunden und mehreren Tagen, abhängig von der Reaktionstemperatur, von der Menge zugegebenen Trypsins und von anderen Reaktionsbedingungen.

Das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinver-bindung in der Reaktionsmischung ist üblicherweise oberhalb von etwa 1 : 200, bevorzugt oberhalb etwa 1 : 50,und unterhalb etwa 1:1.·

Die für die Durchführung der Erfindung vorgesehenen L-Threonin Ester können durch die allgemeine Formel

- Thr(R5)-OR4 II

« beschrieben werden, wobei R4 eine Carboxylschutzgruppe und 5 R Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe, oder ein Salz derselben ist.

B30

Die Threonin -Ester menschlichen Insulins, die bei der Transpeptidierung entstehen, können durch die allgemeine Formel &

(Thr(R5)-OR4)B30-h-In, III

B30 wobei h-In die menschliche des-(Thr )-Insulineinheit 4 5 repräsentiert und R und R die gleichen Reste wie weiter oben definiert sind, beschrieben werden.

Verwendbare L-Threonin-Ester der Formel II sind solche, in denen R4 eine Carboxyl-Schutzgruppe ist, die vom ThreoninB3°-Ester des menschlichen Insulins (Formel III) unter Bedingungen, welche keine wesentliche irreversible Umwandlung im Insulinmolekül hervorrufen, abgespalten werden kann. Als Beispiele derartiger Carboxyl-Echutzgruppen können niedere Alkylgruppen, beispielsweise Methyl, Ethyl und tert-Butyl, substitutiertes Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, 2,4,6-Tri- methylbenzyl und Diphenylmethyl genannt werden, sowie Grup-. pen der allgemeinen Formel -Ci^C^SC^R6, wobei R^ einen niederen Alkylrest wie Methyl, Ethyl, Propyl und n-Butyl 5 bedeutet. Geeignete Hydroxyl-Schutzgruppen R sind solche, B30 die von dem Threonin -Ester des menschlichen Insulins (Formel III) unter Bedingungen abgespalten werden können, die keine wesentlichen irreversiblen Umwandlungen im Insulinmolekül hervorrufen. Als Beispiel einer derartigen Gruppe 5 R kann tert-Butyl genannt werden.

Niedrige Alkylgruppen enthalten weniger als 7 Kohlenstoff-atome, bevorzugt weniger als 5 Kohlenstoffatome.

Weitere Schutzgruppen, die üblicherweise eingesetzt werden,si von Wünch’ih: Methoden der organischen Chemie (Houben-

Wevl), Band XV/1, Herausaeber Euaen Müller. Geora Thieme

Einige L-Threonin-Ester (Formel II) sind bekannte Verbindungen und die restlichen L-Threonin-Ester (Formel II) können analog der Herstellung bekannter Verbindungen präpariert werden.

Die L-Threonin-Ester der Formel II können freie Basen oder Salze geeigneter organischer oder anorganischer Säuren derselben sein, bevorzugt Acetate, Propionate, Butyrate und Salze von Halogenwasserstoffen wie Hydrochloride.

Es ist wünschenswert, die Reaktanden, nämlich die Insulin-Verbindung und den L-Threonin-Ester (Formel II), in hohen Konzentrationen einzusetzen. Bevorzugt wird ein Molverhältnis oberhalb etwa 5:1 zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung eingesetzt.

Es ist wünschenswert, daß die Konzentration an L-Threonin-Ester (Formel II) in der Reaktionsmischung oberhalb von 0,1 Molar liegt.

B30 '

Menschliches Insulin kann aus Threonin -Estern von menschlichem Insulin (Formel III) durch Abspaltung der 4 5

Schutzgruppe R und irgendeiner Schutzgruppe R durch bekannte Verfahen oder per se bekannte Methoden erhalten 4 werden. Im Falle daß R Methyl, Ethyl oder eine Gruppe ' c * g -CH2CH2SO2R0 ist, wobei R wie oben beschrieben definiert ist, kann die Schutzgruppe unter leicht basischen Bedingungen im wäßrigen Medium abgespalten werden, bevozugt bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, beispielsweise bei etwa 9,5. Als Base können Ammoniak, Triethylamin oder Alkalimetallhydroxide verwandt werden, wie Natriumhydroxid.

4

Falls R tert-Butyl substituiertes Benzyl wie p-Methoxy- benzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann die besagte Gruppe durch Acidolyse entfernt werden, 1 - 9 - bevorzugt mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann wasserfrei sein oder etwas Wasser enthalten oder mit einem organischen Lösungsmittel wie Dichlormethan verdünnt 5 ; sein. Palls R tert-Butyl ist, kann die Gruppe durch Aci- dolyse, wie oben beschrieben, abgespaltent werden.

TD Opj

Bevorzugte Threonin -Ester menschlichen Insulins der 5

Formel III sind Verbindungen, in denen R Wasserstoff ist/

und: diese werden aus den L-Threonin-Estern der Formel II

5 hergestellt, in denen R Wasserstoff ist.

B30

Die Transpeptidierung^der Insulinverbindungen im Threonin Ester menschlichen Insulins kann detaillierter auf Basis folgender Formel, die den Insulinverbindungen gegeben wird, beschrieben werden: R1-(1-~j-A 21)

(1—1b- 29) -R2 , I

wobei ' ' -(1-~rA—21) i (1—Ie-—29) -

ß3Q

menschliche des(Threonin )-Insulineinheit ist, wobei A1 1

Gly mit dem als R bezeichueten Substituenten verbunden B29 2 ist und Lys mit dem Substituenten, der als R bezeichnet 2 .

ist, verbunden ist, wobei R eine Aminosäure oder eine Peptidkette bedeutet, die nicht mehr als 36 Aminosäuren enthält und R^ Wasserstoff oder eine Gruppe der allgemeinen 3

Formel R -X- repräsentiert, wobei X Arginin oder Lysin be- 3 deutet und R eine Peptidkette, welche nicht mehr als 35 2

Aminosäuren enthält, repräsentiert, oder R gemeinsam mit 3 R eine Peptidkette repräsentieren, welche nicht mehr als 35 Aminosäuren enthält, unter der Voraussetzung, daß die T"" 2 1 2

Anzahl der in R plus R gegenwärtigen Aminosäuren weniger als 37 beträgt.

„ .. , Die Transpeptidierung nach dieser Erfindung wandelt dem- entsprechend jegliche der oben genannten Insulinverbin- B 30 düngen in Threonin -Ester menschlichen Insulins (Formel III) um, welche sodann zur Bildung von menschlichem Insulin ent-v blockiert werden.

' Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die in rohem Insulin vorhandenen insulinähnlichen Verbindungen, die in einigen handelsüblichen Insulinpräparationen gegenwärtig sind und durch die Formel I gedeckt werden, durch die B30 erfindungsgemäße Transpeptidierung in Threonin -Ester mensch liehen Insulins umgewandelt werden, welche sodann zur Bildung von menschlichem Insulin entblockiert werden können. Beispiele insulinähnlicher Verbindungen der Formel I ergeben sich aus dem folgenden: 1 2 2

Schweinediarginin-Insulin (R ist Wasserstoff und R ist -Ala- . 3 2 -Arg-Arg) , Schweineproinsulin (R zusammen mit R ist -Ala-Arg- -Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly- -Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro- B29 —Gln-Lys—, wobei das terminale Alanyl mit Lys verbunden ist) 3 ‘ 2

Hundeproinsulin (R zusammen mit R ist -Ala-Arg-Arg-Asp-Val- -Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- —Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Alanyl mit Lys®^ verbunden ist), gespaltenes Schweineproinsulin 3, 2 (R "ist Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, und R ist -Ala- -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu- —Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), Desdipeptid-

Proinsulin vom Schwein (R ist Wasserstoff und R ist -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu- —Leu-Gly—Gly-Gly-Leu-Gly—Gly—Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu- —Gly—Pro—Pro—Gin), menschliches Proinsulin (R zusammen 2 mit R ist -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly--Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln--^o-heu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threonyl mit Lys verbunden ist) und Affen-3 2 proinsulin(R zusammen mit R ist -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala- -Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro- -Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu- B 29 -Gin-Lys-, wobei das terminale Threonyl mit Lys ver-' j bunden ist).

Bei all diesen durch die Formel I abgedeckten Verunreini- 3 1 gungen wird der mit R -X- bezeichnete R -Substituent mit Wasserstoff ausgetauscht.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel . der Erfindung umfaßt das Reagierenlassen von rohem Schweineinsulin, welches insulinähnliche Verbindungen enthält, oder ein Salz oder einen Komplex desselben mit einen L-Threonin-Ester (Formel II) oder einem

Salz desselben unter oben genannten Bedingungen, wonach.

4 5 die Schutzgruppe R und irgendeine Schutzgruppe R abgespalten werden. Durch dieses Verfahren wird das Schweineinsulin zusammen mit insulinähnlichen Verbindungen in demselben in menschliches Insulin umgewandelt.

Als Beispiel eines Komplexes oder eines Salzes einer Insulinverbindung (Formel I) kann ein Zinkkomplex oder ein Zinksalz genannt werden.

Wenn die Reaktionsbedingungen entsprechend der obigen Erklärungen ausgewählt werden und die in den darauffolgenden

Beispielen erzielten Resultate in Betracht gezogen werden, B30 ist es möglich, eine Ausbeute von mehr als 60 % Threonin -Ester menschlichen Insulins zu erzielen, und sogar.* eine solche, die höher als 80 % ist, und unter besonders bevorzugten Bedingungen eine von mehr als 90 %.

Ein.bevorzugtes Verfahren zur Herstellung menschlichen Insulin ist das folgende; 1. Das Ausgangsmaterial für die Transpeptidierung ist rohes - 12 - . .

• » *

Schweineinsulin, beispielsweise kristallines Insulin, das durch Verwendung eines Citratpuffers, siehe US-PS 26 26 228, hergestellt wurde.

*». tr>' i 2. 'Falls nach der'Transpeptidierung noch etwas Trypsin-Aktivität übrigbleibt, wird diese bevorzugt unter Bedingungen, unter denen Trypsin nicht aktiv ist, beispielsweise in saurem Medium mit einem pH-Wert unterhalb von 3,entfernt. Trypsin kann durch Trennverfahren nach dem Molekulargewicht, beispielsweise durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 oder Bio-gel P-30 in 1 M Essigsäure, siehe Nature 280, 412, entfernt werden.

\ 3. Andere Verunreinigungen, wie beispielsweise nicht reagiertes Schweineinsulin, können durch .

• Anionen-oder Kationenaustauschchromatographie, siehe Beispiele 1 · und 2, entfernt werden.

B30 4. Anschließend wird der Threonin -Ester des menschlichen Insulins entblockiert und das menschliche Insulin in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Kristallisation, isoliert.

Durch dieses Verfahren kann Insulin einer akzeptablen pharmazeutischen Reinheit erhalten ... und, falls gewünscht, weiterer Reinigung unterworfen werden.

*' - Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf neuartige Threonin^^

Ester menschlichen Insulins, in welchem die Estereinheit unterschiedlich von tert-Butyl und Methyl ist.

Die hier verwandten Abkürzungen entsprechen den von der IUPAC-IUB Commission in Biochemical Nomenclature, 1974, empfohlenen Regeln, siehe Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland, 1975.

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Analytische Untersuchungen;

Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schweineproinsulin --•.-^4 in menschliche Insulinester kann durch DISC PAGE Elektro- ^ phorese in 7.5 % Polyacrylamidgel in einem Puffer, bestehend aus 0,375 M Tris, 0,06 M . HCl und 8 M· Harnstoff demonstriert werden. Der pH-Wert des Puffers beträgt 8,7. Ester der ïbmel III wandern mit 75 % der Geschwindigkeit von Schweineinsulin. Schweineproinsulin wandert mit 55 % der Geschwindig-- keit von Schweineinsulin und wird durch den erfindungsgemäßen

Prozeß in das gleiche Produkt umgewandelt. Identifizierung der Umwandlungsprodukte als Verbindungen der Formel III erfolgt’aufgrund folgender Kriterien: a) Die elektrophoretische Migration der menschlichen Insulinester der Formel III, bezogen aif Schweineinsulin, entspricht dem Verlust einer negativen Ladung.

b) Die Aminosäurezusammensetzung der angefärbten Proteinbänder im Gel, - die die Verbindungen der Formel III repräsentieren, ist identisch mit derjenigen menschlichen Insulins, nämlich 3 Mol Threonin und 1 Mol Alanin pro Mol Insulin, und die Zusammensetzung des Schweineinsulins beträgt 2 Mol Threonin und 2 Mol Alanin pro Mol Insulin. Die Technik der *

Aminosäureanalyse von Proteinbändem in Polyacrylamidgelen ist in Eur. J. Biochem. 2j>, 147 beschrieben.

c) Der Beweis, daß das eingebaute Threonin als C-terminale *

Aminosäure in der B-Kette gebunden wird; wirdhdurch oxidative Sulfitolyse der Schwefelbrücken des Insulins in 6 M Guanidiniurrhydrochlorid, . gefolgt durch Abtrennen der A-und B-Ketten durch Ionenaustauschchromatographie an SP Sephadex geführt. Die Verdauung des B-Ketten-S-Sulfonats mit Carboxypeptidase A setzt lediglich die C-terminale Aminosäure frei. Diese Technik ist von Markussen in Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 7 * ""'“H . " • » * 12 - 14 July, 1978 (Herausgeber: Baba, Kaneko & Yaniahara)

Int. Congress Sériés No. 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford beschrieben. Die Analyse wird durchgeführt, nachdem die Estergruppe von den Verbindungen der Formel III abgespalten worden ist.

Diese drei Analysen zeigen eindeutig, daß Umwandlung in menschliches Insulin stattgefunden hat.

Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schweineproinsulin in menschliche Insulinester kann quantitativ durch HPCL (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) in Umkehrphase verfolgt werden. Eine 4 x 300 mm ^u Bondapak C^-Säule (Waters Ass.) wurde eingesetzt und die Elution mit einem 0,2 M Ammoniumsulpha't (mit Schwefelsäure'auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt) und 26 bis 50 Vol.-S Acetonitril aufweisenden Puffer durchgeführt. Die optimale Acetonitrilkonzentration hängt davon ab, welchen Ester der Formel III man 4

vom Schweineinsulin abzutrennen wünscht. Im Falle,daß R

5

Methyl und R. Wasserstoff ist, wird die Auftrennung in 26 Vol.-% Acetonitril erreicht. Schweineinsulin und r> (Thr-OMe) -h-In (Me ist Methyl) sind nach 4,5 bzw. 5,9 Säulenvolumen eluiert, als gut aufgetrennte. , symmetrischer Peaks. Vor dem Aufträgen auf der HPLC-Säule wurden die Proteine in der Reaktionsmischung durch Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Das Ausgefällte wurde durch Zentrifugation isoliert, vakuumgetrocknet und in 0,02 M Schwefelsäure gelöst.

Das Verfahren zur Herstellung menschlicher Insulinester und menschlichen Insulins wird durch folgende Beispiele genauer erläutert, welche keineswegs als Begrenzung angesehen werden sollen. Die Beispiele zeigen einige bevorzugte Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens.

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Beispiel 1 ψ 200 mg rohes Schweineinsulin, einmal kristallisiert, wurden in 1,8 ml 3,33 M Essigsäure gelöst. 2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe (Me ist Methyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid und 20 mg Trypsin, gelöst in 0,2 ml Wasser, wurden zugegeben. Nach 18-stündigem Stehenlassen bei 37°C wurden die Proteine durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt und das Ausgefällte durch Zentrifugieren isoliert. Der Überstand wurde verworfen. Analyse des Ausgefällten durch HPLC unter Verwendung von 26 % Acetonitril (siehe "Analytische Untersuchungen") zeigt eine 60 %-ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) h-In. Das Ausgefällte wurde in 8 ml frisch entionisierter 8 molarer Harnstofflösung gelöst, der pH-Wert auf 8,0 mit 1 molarer Ammoniaklösung eingestellt, und die Lösung auf eine 2,4 x 25 cm Säule, gepackt mit QAE A-25 Sephadex, mit einem 0,1 molaren Ammoniumchloridpuffer äquilibriert, welcher 60 Vol.-% Ethanol enthielt und dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8,0 eingestellt worden war, auf getragen. Die

Elution wurde mit dem gleichen Puffer durchgeführt, und B30

Fraktionen von 15 ml gesammelt. (Thr-OMe) -h-In wurde in den Fraktionen 26 bis 46 gefunden, nicht reagiertes Schweineinsulin in den Fraktionen 90 bis 120. Die Fraktionen

Nr. 26 bis 46 wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum ver- , , B30 dampft und (Thr-OMe) -h-In in einem Citrat puffer, wie durch Schlichtkrüll et al., Handbuch der inneren Medizin 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York, 1975 beschrieben, kristallisiert. Die Ausbeute betrug 95 mg Kristalle mit der gleichen rhombischen Gestalt wie auf die gleiche Art und Weise kristallisiertes Schweineinsulin.

Die Aminosäurezusammensetzung wurde als identisch mit derjenigen von menschlichem Insulin befunden. Weitere analytische Untersuchungen, die in dem oberen Abschnitt "Analytische Untersuchungen" beschrieben sind, zeigten, daß das entstandene • Produkt (Thr-OMe)^^-h-ln war.

' r Beispiel 2 s 100 mg Schweineinsulin, welche den Reinheitsanforderungen der GB-PS 12 85 023 genügten, wurden in 0,9 ml 3,33 molarer

Essigsäure gelöst und anschließend 1 ml einer 2 molaren Lösung Threonin-Methylester in Ν,Ν-Dimethylformamid und 12 mg mit TPCK (Tosylphènylalaninchloromethylketon) behandeltes.

Trypsin, gelöst in 0,1 ml Wasser, zugegeben. Nach einer

Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 ml 1 molarer Phosphorsäure beendet. Das B30 .; erhaltene (Thr-OMe) -h-In wurde von dem nicht reagierten

Schweineinsulin durch Ionenaustauschchromatographie auf einer 2,5 x 25 cm Säule mit SP-Sephadex mittels eines Elutionsmittels, welches 0,09 M . Natriumchlorid und 0,02 M> Natriumdihydrogenphosphat (pH-Wert des Puffers: 5,5) in 60 % .Ethanol aufwies, abgetrennt. Fraktionen enthaltend 33 30 (Thr-OMe) -h~In wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum entfernt und das Produkt wie in Beispiel 1 kristallisiert.

B30

Die Ausbeute betrug 50 mg (Thr-OMe) -h-In.

Beispiel 3 100 mg Schweineproinsulin wurde in 0,9 ml 3,33 molarer Essig- B30 säure gelöst, in (Thr-OMe) -h-In umgewandelt und-wie für

Schweineinsulin in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Die B30

Umwandlung Von Proinsulin in (Thr-OMe) -h-In wurde mittels HPLC-Analyse des Aceton-Niederschlags zu 73 % B30 bestimmt. Die Ausbeute an kristallinem (Thr-OMe) -h-In betrug 54 mg.

Beispiel 4 ·· 100 mg Schweineinsulin werden in 0,9 ml 2,77 molarer Essigsäure in Wasser gelöst und analog dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren zur Reaktion gebracht. Nach Beendi-* gung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von Ü ' • l _ - 17 - m 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigt eine Umwandlung von 70 % in (Thr-OMe) -h-In.

Beispiel 5 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essig- säure gelöst und 1 ml 2 U Thr-OMe-Lösung in JSI-Iiethylpyrro- lidon zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 B30 beschriebenen durchgeführt und die Umwandlung in (Thr-OMe) h-In war 20 %.

Beispiel 6 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 2,77 M Essigsäure in Wasser gelöst und 1 ml einer 2 I! Thr-OMes-Lösung in HMPA (Hexamethylphosphortriamid) zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen durch-geführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 80 %.

Beispiel 7 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-C^fe-Iösung in N,N-Dimethylacet-amid zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 80 %.

✓

Beispiel 8 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M-Thr-Offe-Iösung in N ,1^-Dirrethylacet-; amid zugegeben. Anschließend wurde Trypsin mit 200 U Akti vität (gemessen gegen das Substrat BAEE), immobilisiert an 1 g Glasperlen.,zugegeben. Nach einer Inkubationszeit . von 24 Stunden bei 37°C wurde das an das Glas gebundene « r Trypsin durch Filtration abgetrennt. Nach Beendigung der

Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen . Λ -Aceton ausgefä-l-lt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte B30 eine Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In von 40 %.

Beispiel 9 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2M Thr-Oiie-Lösung in N,N-Dimethyl-acetamid zugegeben. Anschließend wurde Trypsin entsprechend einer Aktivität von 300 U (die Aktivität wurde gegen das Substrat BAEE gemessen') .immobilisiert a,n 200 ^,ug CNBr-aktiviei tem "Sephadex G-'150", zugegeben. Nach .einer Inkubation von 24 Stunden bei 37°C wurde das an Sephadex gebundene Trypsin durch Filtration abgetrennt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Volumen-Teiler

Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorcse B30 zeigte eine Umwandlung in (THr-OMe) -h-In von 70 %.

Beispiel 10

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Voraussetzung, daß der eingesetzte Ester eine 2 M Lö- t t sung von Thr-OBu (Bu . ist ert-Butyl) , in N,N-Dimethylacet-amid war. Die 'Umwandlung in ((Thr-OBu*") B^°-:h-Tn betrug 80

Beispiel 11

Das in Beispiel 8 beschriebene Beispiel wurde wiederholt, ’ t wobei der eingesetzte Ester eine 2 M lösung von Thr-OBu in N,N-Di- t B30 methylacetamid war. Die Umwandlung in (Thr-OBu ) -h-In betrug 30 %.

Beispiel 12

Das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, •wobei der eingesetzte Ester eine 2'M-Lösung von Thr-OBu*' in N,N-Di-l methylacetamid war. Die Umwaldung in (Thr-OBu*"}^^-h-In * 'Ä‘·; f betrug 70 %.

Beispiel 13 100 mg Schweineproinsulin wurde in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml 2 M Thr-OMe in N,N-Di- methylacetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 80 %.

Beispiel 14 100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml .einer 2 M Lösung von Thr-OMe in K,N~D methylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit immobilisiertem Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen B30

Verfahren behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 40 % :

Beispiel 15 100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Di-methylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren mit immobilisiertem * B30

Trypsin behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 70 %.

*

Beispiel 16 100 mg Schweineprodinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure und 1 ml einer 2 M Thr-OBu^-Iösung in K,N-Diirethyl-acetamid, . zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OBu^)^^^-h-In betrug 80 %.

"·> ____ * - 20 -

Beispiel 17 » 100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu^Lösung in N,N-t)i-methylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit an Glasperlen immobilisiertem Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-0But)B30-h-In betrug 40 %.

Beispiel 18 100 mg Schweineproinsulin v?urden in 0,9 ml 3,33 molarer ' * t "

Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu -Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit

Trypsin, immobilisiert an CNBr-aktiviertem Sephadex G-150, behandelt, analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Prozeß.

Die Umwandlung in (Thr-OBut)B^°-h-In betrug 70 %.

Beispiel 19 100.mg Schweineinsulin wurden in 0,5 ml 6 molarer Essigsäure gelöst und mit 1 ml 1 m Lösung von.Thr-OTmb (Tmb ist 2,4,6-Trimethylbenzyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid, , versetzt. Weiterhin wurden 0,5 ml Ν,Ν-Dimethylacetamid und 5 mg TPCK-behandeltes Trypsin in 0,1 ml Wasser zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 32°C 44 Stunden stehen gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Volumenteilen -

Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese B30 zeigte eine Umwandlung in (Thr-OTmb) -h-In von 50 %.

Beispiel 20 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3 molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-QMe in Dioxan zuge- f «i rv - ? 1 _ ί a.

geben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt; die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 10 %.

Beispiel 21 r 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3 molarer Essig säure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Acetonitril zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Art und Weise durchgeführt und die Umwandlung in (Thr-OMe) -h-In betrug 10 %.

t

Beispiel 22 B30 250 mg kristalline (Thr-OMe) -h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxic-lösung bis zu einem pH-Wert von 10,0( gelöst. Der pH-Wert wurde konstant für 24 Stunden bei 25°C auf 10 gehalten.

Das gebildete menschliche Insulin wurde durch Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natriumacetattrihydrat und 2,5 ir.: Zinkacetatdihydrat, gefolgt durch Zugabe von 1 N Salzsäure zum Erhalt eines pH-Wertes von 5,52 kristallisiert. Nach 24-stündigem Stehenlassen bei 4°C wurden die rhomboedrischer * Kristalle durch Zentrifugieren isoliert, mit 3 ml Wasser ge waschen, nochmals durch Zentifugation isoliert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 220 mg menschlichen Insulins.

Beispiel 23 B30 100 mg (Thr-OTmb) wurden in 1 ml eiskalter Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung 2 Stunden bei 0°C stehen gelassen. Das gebildete menschliche Insulin wurde durch Zugabe von IC ml Tetrahydrofuran und 0,97 ml 1,03 molarer Salzsäure in Tetrahydrofuran ausgefällt. Der gebildete Niederschlag / wurde durch Zentrifugation isoliert, mit 10 ml Tetrahydrofuran - · ü f Φ β ë gewaschen, durch Zentrifugation abgetrennt und vakuumgetrocknet Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mittels 1 N Natriumhydroxidlösung auf 2,5 eingestellt. Das menschliche Insulin wurde durch Zugabe von 1,5 g Natriumchlorid ausgefällt und durch Zentrifugation isoliert.' Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und das menschliche Insulin durch Zugabe von 0,8 g Natriumchlorid, 3,7 mg Zinkacetatdihydrat und 0,14 g Natriumacetat-trihydrat, gefolgt durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung zum Erhalt eines pH-Wertes von 5,52 ausgefällt. Nach Stehenlassen bei 4°C für 24 Stunden wurde der Niederschlag durch Zentrifugation isoliert, mit 0,9 ml Wasser gewaschen, l nochmals durch Zentrifugation isoliert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 90 mg menschliches Insulin.

Beispiel 24 100 mg Schweineinsulin wurden in 0,5 ml 10 molarer Essig- * säure gelöst und 1,3 ml einer 1,54 K Lösung von Thr-C^is in Ν,Ν-Diiæthyi acetamid zugegeben. Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt.

10 mg Trypsin, gelöst in 0,2 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung,

wurden zugegeben. Nach Stehenlassen von 48 Stunden bei 12°C

wurden die Proteine durch Zugabe von 20 ml Aceton ausgefällt.

B30

Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) -h-In betrug 97 %, wie durch HPLC festgestellt wurde.

Beispiel 25 20 mg Schweineinsulin wurden in einer Mischung von 0,08 ml 10 molarer Essigsäure und 0,14 ml Wasser gelöst. 0,2 ml einer - 2 M Lösung von .* Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde zuge geben und die Mischung auf -10°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, ! gelöst in 0,025 ml 0,5 M Calciunacetat-Lösung wurde zuge- .

geben. Nach 72 Stunden Stehenlassen bei -10°C wurden die

Proteine durch Zugabe von 5 ml Aceton ausgefällt. Die Um- B30

Wandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) -h-In betrug ί t 64 %, wie durch HPLC nachgewiesen wurde.

Beispiel 26 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml Wasser gegeben.

Zugabe von 0,6 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Di-methylacetamid veranlaßten das Insulin, sich zu lösen. Die ^ Mischung wurde auf 7°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 m Calciumacetats wurden zugegeben. Nach 24 Stunden wurden die Proteine durch Zugabe von 5 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) -h-In betrug 62 %,.wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte. λ

Beispiel 27 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,135 ml einer 4,45 m

Propionsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 m Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde zugegeben. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 m Calciumacetat-Lösung wurden zugegeben und die Mischung bei 37°C 24 Stunden gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von IO Volumenteilen 2-Propanol ausge- B30 fällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) --h-In betrug, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte,75 %.

( i

Beispiel 28 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml Wasser dispergiert.

0,4 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch 0,04 ml 10 N Salzsäure,’ welches das Insulin veranlaßte, sich zu lösen. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 .ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat wurde zugegeben und die Mischung bei 37°C 4 Stunden gehalten. Analyse durch HPLC zeigte eine 46 %-ige Umwandlung B30 des Schweineinsulins in (Thr-OMe) -h-In.

\ - 24 - * ♦

Beispiel 29 20 mg Schweineinsulin wurden in 0#175 ml 0,57 m Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 0,02 ml einer 0,05 m Lösung von Calciumacetat. 10 mg einer Rohpräparation von Achromobacter lyticus >1 Protease wurde zugegeben und die Mischung 22 Stunden bei 37°C gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von 10 Volu- 1 menteilen Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweine- B30 insulins in (Thr-OMe) -h-In betrug 12 %, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte.

\ \

Beispiel 30

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 0,5 molarer Essigsäure gelöst· Zugabe von 0,2 ml einer 0,1 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid löste das Insulin. Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12°C

Stehenlassen zeigte die HPLC-Analyse eine 42 %-ige Umwand- B 30 lung des Schweineinsulins in (Thr-OMe) -h-In.

Beispiel 31 2 mg Kanincheninsulin wurden in 0,135 ml 4,45 molarer Essigsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMes in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1,25 mg Trypsin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung. Die Mischung wurde bei 37°C 4 Stunden gehalten. HPLC-Analyse zeigte eine 88 %-ige Umwandlung B30 des Kanincheninsulins in (Thr-OMe) -h-In. Kanincheninsulin wird vor dem Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Eulutions-volumina des Kanincheninsulins zu (Thr-OMe) -h-In 0,72 beträgt.

ji.

- 25 -

Beispiel 32 » B3 -j g32 ' 2 mg Schweinediarginininsulins (Arg -Arg -Insulin) wurden in 0,135 ml 4,45 molarer Essigsäure gelöst. Of24 ml αίπατ 1,67 M Lösung von Thr-OMas in N,K-Djjæthylacetamid wurde zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1,25 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung.Die Mischung wurde 4 Stunden bei 37°C gehalten. Analyse durch HPLC zeigte eine 91 %-ige Umwandlung des Diarginininsulins in 23o (Thr-OMe) -h-In. Diearginininsulin wird vor Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Elutionsvolumina von Diarginininsulin zu (Thr-OMe) ^^-h-In 0,50 beträgt.

Beispiel 33 2 mg von Schweine-Zwischenprodukten (nämlich eine Mischung von Desdipeptid (Lys^-Arg*-'^)-Proinsulin und Desdipeptid 31 32 (Arg -Arg )-Proinsulin) wurde analog der in Beispiel 32 beschriebenen Reaktion reagieren gelassen. Analyse durch 230 HPLC zeigte eine 88 %-ige Ausbeute an (Thr-OMe) -h-In.

Beispiel 34 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 2 molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 K Losung von Thr-OMe in N,N-Dimethyl- acetamid wurden zugegeben und die Mischung auf -18°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung' wurden zugegeben und die Mischung 120

Stunden bei -18°C gehalten. HPLC-Analyse zeigte, daß die Umwandlung in (Thr-OMe ' B^°-h-In 83 % betrug.

Beispiel 35 ; Das in Beispiel 34 beschriebene Verfahren wurde unter der , / ,· .

Γ

Maßnahme wiederholt, daß die Reaktion bei 50°C in 4 Stunden durchgeführt wurde. HPLC-Analyse zeigte, daß die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In 23 % betrug.

Beispiel 36 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 3 molarer Essigsäure gelöst. 0,3 ml einer 0,33 M Lösung von Thr-0(CH2)2-S02~CH3, CH^COOH (Threonin-2-(methyisulfonyl)ethylester, Hydroacetat) in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde zugegeben. Die Mischung wurde v auf 12°C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12°C eine 77 %-ige Umwandlung in (Thr-0 (CK^) 2-502-^^)2^^ -h-In. Das Produkt eluiert ungefähr an der gleichen Stelle wi« (Thr-OMe)B30-h-In.

Beispiel 37 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 10 molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OEt (Et ist Ethyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 m Lsöung von Calciumacetat wurden zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12°C eine 75 %-ige Umwandlung in (Thr-OEt)B3^-h-In. Das Produkt eluierte in einer Portion kurz nach der von * ( Thr-OMe )B 3CÎ-h- In.

I Beispiel 38 * "· * 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 6 molarer Essigsäure gelöst. 0,3 ml einer 0,67 M Lösung von Thr(Bu**)-OBu^(Bu^ ist tertiäres Butyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde zugegeben.

| Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt und 2 mg Trypsin in » I 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12°C betrug die Umwandlung in (Thr(But)-0But)

I B3Q

! -h-In 77 %. Das Produkt wurde aus der HPLC Säule durch -i ‘1 vl____ I - 27 - - • ^

Anwendung eines Acetonitril-Gradienten von 27 % bis auf 40 % eluiert.

, Beispiel 39 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 m 4 molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 1,5 m Lösung von Thr-OMe, in Tetrahydrofuran, wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 molarem Calciumacetats wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12°C zeigte die Analyse durch HPLC eine Umwandlung von 75 % in (Thr-OMe)B30-h-In.

\

Beispiel 40 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 molarer Essigsäure gelöst. 0,8 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in 1,2-Ethandiol wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 ml Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung wurden zugegeben. Nach 4 Stunden Stehenlassen bei 12°C zeigte die HPLC-Analyse eine Umwandlung von 48 % in (Thr-OMe)B30-h-In.

Beispiel 41 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in Ethanol wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung wurden zugegeben und die Reaktion 4 Stunden lang bei 12°C durchgeführt. Analyse durch HPLC zeigte eine 46 %-ige Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In.

Beispiel 42 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Aceton wurden v.

a m zugegeben und die Mischung auf 12 C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12°C zeigte die HPLC-Analyse B30 eine Umwandlung von 48 % in (Thr-OMe) -h-In.

Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

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Claims (32)

1. 4 • 1 i __________________ *** Β3θ
2. 1. Verfahren zum Herstellen von Threonin -Estern menschlichen Insulins oder eines Salzes oder Komplexes desselben, gekennzeichnet durch Transpeptidieren einer Insulinverbindung oder eines Salzes oder eines Komplexes derselben, welche in diese umwandelbar sind, mit einem L-Threonin-Ester oder einem Salz desselben in einer Mischung von Wasser, einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel und Trypsin, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung weniger als 50 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb 50°C ist, gegebenenfalls in. Gegenwart einer Säure.
3. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des L-Threonin-Esters in der Reaktionsmischung über 0,1 Molar liegt, daß die Reaktionstemperatur oberhalb des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung liegt, und daß die Reak- 4 tionsmischung von O bis 10 Äquivalenten einer Säure pro Äquivalent des L-Threonin-Esters enthält.
4. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinverbindung eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schweine-, Hunde-, Finnwal-, Sperm-wal-und Kanincheninsulin, Schweinediarginininsulin, gespaltenes Schweineproinsulin, Schweinedesdipeptidproinsulin, Schweine-, Hund-, Affen-, und Menschen-Proinsulin und Mischungen derselben, ist. « 4 . A .
5. 4, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet/ daß die Insulinverbindung vom Schwein stammt.
6. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet/ daß relativ ' rohes' Insulin als Insulinverbindung -ieingesetzt wird. ’ 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktionstemperatur unterhalb von 37°C, bevorzugt unterhalb der Umgebungstemperatur, und oberhalb 0°C liegt. ' i
7. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 40 und 10 Vol.-% beträgt.
8. 8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Mol-Verhältnis zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung oberhalb 5 : 1 ^.beträgt. * 9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ein polares Lösungsmittel ist.
9. 10. Verfahren nach Anspruch 9 , dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Methanol, Äthanol, 2-Propanol, 1-2-Ethan-diol, Azeton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Formamid, N,N-Dimethyl-formamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid, N-Methyl-Pyrrolidon, Hexa- ‘ I i" i ^ ~3λ~ « ,â methylphosphortriamid oder Acetonitril ist. /
10. 11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure eine organische Säure, bevorzugt Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buton-säure ist.
11. 12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da- ~ durch gekennzeichnet, daß die Menge Säure in der Reaktions mischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalenten pro Äquivalent des L-Threonin-Esters beträgt. \ \
12. 13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung oberhalb von 1 : 200 liegt.
13. 14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das GewichtsVerhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung oberhalb von 1 : 50 und unterhalb von 1:1 liegt.
14. 15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da- * durch gekennzeichnet, daß die Transpeptidierung in der Ge- ' genwart von Calciumionen durchgeführt wird.
15. 16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Transpeptidierung in einem Puffersystem durchgeführt wird.
16. 17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der L-Threonin-Ester als Acetat oder Propionat, Butyrat oder als Halogenwasserstoff, wie Hydrochlorid, zugegeben wird.
17. 18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da- ' -32.- « t Λ durch gekennzeichnet, daß die Reaktionstemperatur, der Wassergehalt und die Säurekonzentration in der Reaktionsmischung derart ausgewählt werden, daß die Ausbeute des B 70 Threonin -Esters menschlichen Insulins höher als 60 % ist.
18. 19. Verfahren nach Anspruch'18, dadurch gekennzeichnet, daß B30 die Ausbeute des Threonin -Esters menschlichen Insulins höher als 80 % ist.
19. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß B30 die Ausbeute des Threonin -Esters menschlichen Insulins mehr als 90 % ist.
20. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 und 6 bis 1®, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinverbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I R1-(1—rAj—21) (I) 29)-R2 ist, wobei -(1—tAt—21) (1—U-L-29 >- - B30 die menschliche des(Thr )-Insulineinheit bezeichnet, in
21. 1 Al 1 B29 der Gly mit dem Substituenten R und Lys mit dem ßub- 2 2 stituenten R verbunden ist, wobei R eine Aminosäure oder eine Peptidkette, welche nicht mehr als 36 Aminosäuren ent- hält, bedeutet, und R Wasserstoff oder eine Gruppe der all- 3 gemeinen Formen R -X- bedeutet, wobei X Arginin oder Lysin 3 repräsentiert und R eine Peptidkette bedeutet, welche nicht 2 3 mehr als 35 Aminosäuren auf weist, oder R gemeinsam mit R eine Peptidkette, welche nicht mehr als 35 Aminosäuren enthält, bedeuten, unter der Voraussetzung, daß die Anzahl der 1 2 Aminosäuren, die in R plus R vorhanden sind, weniger als 37 ist. f _ 35 _ € * 22* Verfahren nach 21f dadurch gekennzeichnet, daß R1 Wasserstoff ist und R2 ist -Ala, -Ser, -Ala-Arg-Arg, oder -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val- -Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala- 3 -Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln, R Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-2 Lys- ist, und R -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln- -Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln- -Ala-Leu, oder R3 zusammen mit R2 -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu- -Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly- -Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, wo- B29 bei das teminale Alanyl mit Lys verbunden ist, ist, -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly--Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Al'a-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, wo- 329 bei das terminale Alanyl mit Lys verbunden ist, -Thr- -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu- -Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu- -Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threonyl . B29 mit Lys verbunden ist, oder -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu- -Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly- -Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, B3ö wobei das terminale Threonyl mit Lys verbunden ist.
22. 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß 1 2 R Wasserstoff ist und R Alanin repräsentiert. f « 2¾. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß der L-Threonin-Ester die allgemeine Formel II . Thr(R5)-OR4, (II) besitzt, 4 - 5 wobei R eine Carbony 1-Schutzgruppe und R Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeutet.
23. 23. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß / * ZU ßp' I # m Λ 0 4 R ein niedriges Alkyl-, Aryl-(niedriges Alkyl) wie ein substituiertes Benzyl- oder Diphenylmethyl oder eine Gruppe 6 6 der allgemeinen Formel -CI^CI^SC^R0 ist, wobei R ein niedriges Alkyl bedeutet. 4
24. 26. Verfahren nach Anspruch 25 , dadurch gekennzeichnet, daß R Methyl, Ethyl, tert-Butyl, p-Ilethoxybenzyl,' 2,4,6-Trimethylben- ζ zyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel-CI^CK^SC^R^ ist, wobei R6 Methyl, Ethyl, Propyl oder n-Butyl ist.
25. 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinverbindung Schweineinsulin ist, ^ t der L-Threonin-Ester Thr-OMe oder Thr-OBu ist, daß das wassermischbare organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid oder Ν,Ν-Dimethylacetamid ist, daß die Reaktionstemperatur etwa 37° beträgt, daß der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 41 und 43 % beträgt, daß das Gewichtsver-hältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung etwa 1 : 8 ist, daß das Mol-Verhältnis zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung etwa 1 ; 120 ist, und daß zwischen 1,2 und 1,5 Äquivalenten Essigsäure pro Äquivalent L-Threonin-Ester zugegeben werden.
26. 28. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, “ daß es unter den Reaktionsbedingungen, die in irgendeinem » der Beispiele 1 bis 21 oder 24 bis 42 beschrieben sind, bevorzugt unter denen, die in irgendeinem der Beispiele 4, 7, 10, 24, 34', 36 und 39 aufgeführt sind, durchgeführt wird.
27. 29. Threonin -Ester menschlichen Insulins, hergestellt durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 29.
28. 30. Verfahren zur Herstellung menschlichen Insulins, da durch gekennzeichnet, daß zunächst ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 24, durchgeführt wird und danach B30 der dabei entstehende Threonin -Ester des menschlichen Insulins entblockiert wird. -4**· 1·—^ I 4
29. 31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Entblockieren in wäßrigem Medium in Gegenwart einer Base, bevorzugt bei einem pH-Wert zwischen 8 und 12,durchgeführt wird. '32. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß £ das Entblockieren durch Acidolyse, bevorzugt mit Trifluor essigsäure, durchgeführt wird.
30. 33. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Entblockieren unter den in den Beispielen 22 oder 23 be- N bchriebenen Reaktionsbedingungen durchgeführt wird. B30
31. 34. Threonin -Ester menschlichen Insulins, wobei die Estergruppe sich von tert-Butyl und Methyl unterscheidet.
32. 35. Menschliches Insulin, das nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 33 hergestellt wurde. ik A Λ 9 A, ✓