KR840000947B1 - 인슐린의 제조방법 - Google Patents

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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

내용 없음.

Description

인슐린의 제조방법
본 발명은 인슐린 또는 인슐린 동족쳉듸 제조방법에 관한 것이다.
DNA 재결합법에 의한 단백질 생성물 제조 특히 이러한 기술 [참조 :
Figure kpo00001
]에 의한 인슐린 A-쇄 및 인슐린 B-쇄의 제조가 가능하게 됨에 따라 A-쇄 와 B-쇄를 결합시켜 인슐린을 효과적으로 제조할 수 있는 방법의 필요성이 매우 증대되어 왔다.
통상적으로 A-쇄 와 B-쇄를 결합시켜 인슐린을 제조하는 선행 기술이 방법에서는 출발물질로서 안정한 S-설포네이트 형태의 A-쇄 및 B-쇄를 사용한다. 일반적으로 티올 환원제 매우 과량을 사용하여 A-쇄 및 B-쇄 S-설포네이트를 별개로 또는 함께 상응하는 SH-화합물로 환원시킨다. 생성물을 환원 매질중에서 분리시키고, 함께 환원시키지 않은 경우에는 한꺼번에 산화 매질 예를들면 공기중에 넣고 A- 와 B-쇄를 결합시켜 인슐린 생성물을 수득한다. 이러한 방법의 예로는 다음을 들 수 있다 :
Figure kpo00002
이러한 방법의 변형법은 A-쇄 S-설포네이트를 환원시킨후 환원돈 A-쇄를 B-쇄 S-설포네이트와 산화 공기중에서 반응시키는 방법이다. 참조 :
Figure kpo00003
기타의 변형법은 A-쇄 SH-화합물을 부분적 산화하여 A-6 및 A-11 시스테인 잔기사이에 디설피드를 생성시킨후 생성물을 B-쇄-SH 또는 B-쇄 S-설포네이트로 기타의 변형법은 A-쇄-SH 화합물을 부분적 산화하여 A-6 및 A-11시스테인 잔기 사이에 디설피드를 생성시킨 후 생성물 B-쇄-SH 또는 B-쇄 S-설포네이트로 산호시키는 방법이다. 참조 ‥벨기에왕국 특허제 676,069호 및
Figure kpo00004
상기 선행 기술법중 한가지 즉 두 개의 독립적인 연속 단개 예를들면 S-설포네이트를 -SH로 환원시킨후 -S-S-로 산화시켜 인슐린을 제조하는 방법이 일반적이다.
Figure kpo00005
에서는 티올 환원제를 사용하고 공기 산화시켜 A-와 B-쇄 S-설포네이트를 인슐린으로 변환시키는 단일 용액 변환반응 조건을 기술하고 있다.
설명은 매우 개략적이며 단지 회수된 생성물 역가만으로 계산된 수득율을 1 내지 2%였다. 그러나
Figure kpo00006
에서는 좀더 상세하게 페이지 1211의 표Ⅳ에 초기 간행물중에 보고된 반응조건에는 각기 별개로 환원 및 산화시키는 단계가 포함됨을 밝히고 있다.
상기 선행 기술법에 비해 본 발명에서는 정의된 반응조건하에서 환원 및 산화 반응을 단일 단계의 단일 용액법에 의해 시행함으로써 S-설폰화된 A- 및 B-쇄로부터 인슐린 또는 인슐린 동족체를 다량 제조할 수 있음을 밝힌다. 본 발명은 이러한 방법에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 A-쇄의 S-설폰화된 형태, B-쇄의 S-설폰화된 형태 및 티올 환원제를 함께 수용성 매질중에서 (1) pH가 약 8내지 12이고 (2) 총 단백질 농도가 ml당 약 0.1 내지 50mg이며 (3) A- 및 B-쇄 S-설포네이트 총량중에 존재하는 각 -SSO3- 그룹당 총 약 0.4 내지 2.5-SH그룹을 수득하는 티올 환원제량을 갖는 혼합물을 생성할 수 있는 조건하에서 반응시킨후 혼합물을 약 0 내지 25℃의 온도이고 산소원이 공급되는 곳에서 유지시킴으로써 인슐린 또는 인슐린 동족체를 생성시킴을 특징으로 하는 산소원이 공급되는 곳에서 유지시킴으로써 인슐린 또는 인슐린 동족체를 생성시킴을 특징으로 하는 인슐린 또는 인슐린 동족체의 A-쇄 및 B-쇄를 결합시켜 인슐린 또는 인슐린 동족체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 인슐린의 구성 성분인 S-설폰화된 A- 및 B-쇄로부터 인슐린 또는 인슐린 동족체를 제조하는 효과적인 단일단계, 단일 용액법에 관한 것이다.
용어 “인슐린”은 사람, 소, 돼지, 양, 물고기, 색등과 같이 천연에 존재하는 인슐린은 물론 한종의 A-쇄와 다른종의 B-쇄를 결합하여 제조하여 제조한 혼성 (hybrid)인슐린을 의미한다.
용어 “인슐린 동족체”는 시스틴 잔기중의 반 모두가 천연 인슐린과 일치되는 A- 쇄와 B-쇄를 갖는 수종의 단백질을 의미한다. 동족체는 천연 인슐린중 한개 이상의 아미노산 잔기를 치환, 부가, 제거 또는 변형시킨점에 있어서는 차이가 있으나 디설피드 결합 배치를 갖으며 적어도 부분적인 인슐린양 작용을 지닌다. 이러한 동족체의 예로는 다음을 들 수 있다 : [N-포르밀-글리1-A]인슐린, 데스아미도-A1-인슐린, [사코신1-A]인슐린, [L-알아닌1-A]인슐린, [D-아스페라긴21-A]인슐린,[아르기닌21-A]인슐린, [아스파라긴아미드21-A]인슐린, [사코신1-A, 아스파라긴21-A]인슐린, [노르레우신2-A]인슐린, [트레오닌5-A]인슐린, [레우신5-A]인슐린, [페닐알라닌19-A]인슐린, [D-티로신19-A]인슐린, [티로신18-A, 아스파라긴19-A, 아르기닌21-A]인슐린, 데스[B28-30-트리펩타이드]인슐린, 데스[B27-30-네트라펩타이드]인슐린, 데스[B27-30-펜타펩타이드]인슐린, 데스[B26-30-트리라펩타이드, 티로신아미드26-B]인슐린, 데스[B26-30-펜타펩타이드, 페닐알라닌아미드25-B]-인슐린, 데스[B1-4-테트라펩타이드]-인슐린, 데스[B1-5-펜타펩타이드]인슐린,[리신22-B]인슐린, [레우신9-B]-인슐린, [레우신10-B]인슐린, 데스[페닐알라닌1-B]-인슐린 등과 같다.
이들 동족체 및 기타의 동족체는 본문중에 기술되어 있다. [참조 : 예를들면
Figure kpo00007
본 발명의 방법이 인슐린 및 인슐린 동족체 제조에 널리 적용될 수 있으나 천연에 존재하는 인슐린 특히 사람, 소 또는 돼지 인슐린 가장 특히는 사람의 인슐린 제조에 이용하는 것이 매우 바람직하다.
본 발명의 방법을 새행함에 있어 A-쇄와 B-쇄를 결합하여 인슐린 또는 인슐린 동족체를 제조할때 한가지 쇄에 대한 다른 한가지 쇄의 비율을 다양하게 하여 시행할 수 있다. 결합 반응은 물론 A든지 B든지 양적으로 보다 적은 쇄에 의해 제한된다. 어떠한 경우에도 필수적인 것은 아니지만 A쇄 : B쇄의 통상적 중량비는 약 0.1 : 1 내지 약 10 : 1이다. 약 1 : 1 내지 3 : 1 범위인 A-쇄 : B-쇄 중량비를 사용하여 본 발명의 방법을 시행하는 것이 매우 바람직하다. 또한 이러한 바람직한 범위내에서도 특정범위가 특종의 인슐린 제조에 특히 유리하다는 것이 밝혀졌다. 따라서 A-와 B-쇄 결합하여 소의 인슐린을 제조할 경우에는 A-쇄 : B-쇄의 비율이 약 1.4 ; 1.0 내지 1.8 : 1.0의 범위내에 있는 것이 바람직하다.
돼지 인슐린에 있어서는 바람직한 범위가 약 1.0 : 1.0 내지 약 1.4 ; 1.0이다. 사람의 인슐린에 있어서는 바람직한 범위가 약 1.8 : 1.0 내지 약 2.2 : 1.0이다.
본 발명의 방법을 최적으로 시행할 수 있는 기타의 특이적 매개변수는 반응매질중의 단백질 농도이다.
이 방법은 다양한 단백질 농도 범위에서 성공적으로 시행될 수 있다 : 그러나 일반적으로 단백질 농도는 반응매질 ml당 약 0.1 내지 50mg 범위이다. 바람직하게는 단백질 농도가 ml당 약 2내지 20mg 범위이다. 이러한 범위내에서도 생성되는 인슐린의 종류에 따라 최적 단백질 농도에 차이가 있다. 그러므로 단백질 농도 범위가 돼지 인슐린에서는 ml당 약 8 내지 16mg, 사람 또는 소의 인슐린 제조시에는 ml당 약 3내지 8mg이 바람직하다.
본 발명의 방법은 수용성 매질중에서 시행한다. 측정된 매질의 pH는 실온에서 일반적으로 약 8내지 12의 범위이다. 바람직하게는 약 9.5내지 11.0의 범위이고, 약 10.4 내지 10.6 범위내에서 유지시키는 것이 최적이다. 매질의 pH는 적절한 완충제를 첨가하여 원하는 범위로 유지시킬 수 있다. 대표적인 완충제로는 예를들면 글리신, 글리실 글리신, 카보네이트, 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄, N,N-비스(2하이드록시에틸)글리신, 피로포스페이트, N-트리스-(하이드록시메틸)비스-3-아미노 프로판설폰산 및 상기 기술된 범위내에서 pH를 조절하는 기타 제제가 있다. 통상적이면서 바람직한 완충제는 글리신이다.
완충제의 농도는 일반적으로 약 0.001M 내지 약 2M범위이다. 바람직하게는 농도가 약 0.01M 내지 1M이며 가장 바람직하게는 약 0.01M내지 0.1M이다.
A-와 B-쇄를 함께 티올 환원제 존재하에서 적절한 수용성 매질중에 넣는다. “티올 환원제”는 적어도 한개의 -SH 그룹을 함유하며 A-및 B-쇄중의 S-설포네이트 그룹을 환원시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 이러한 특징을 지닌 제제는 어느 것이든지 사용될 수 있지만 매우 바람직한 티올 환원제는 산화된 형태로써 매우 안정한 화합물로 환화되는 것이다. 티올 환원제는 A-화 B-쇄 총량증에 존재하는 각 SSO3-그룹당 약 0.4 내지 2.5-SH그룹, 바람직하게는 약 SSO3-그룹당 약 0.9 내지 1.1그룹을 수득할 수있는 양을 함유시킨다.
대표적인 티올 환원제의 예로는 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 2-메르캅토에탄올, 메틸티오글리콜레이트, 3-메르캅토-1,2-프로판디올, 3-메르캅토 푸로피온산 티오그리콜산, 2-아미노-3-메르캅토프로피온산(시스테인) 및 기타의 티올 화합물을 들 수 있다. 바람직한 티올 환원제는 디티오트레이톨 및 디티오에리트리톨이며 디티오트레이톨이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법에서 기본 조건중의 하나는 산소원이 공급되는 환경에서 시행하는 것이다. 이 종건은 단순히 반응 혼합물을 대기중에 노출시킴으로써 이루어질 수 있다. 좀더 직접적인 접촉법 예를들면 공기 또는 산소를 반응 매질중에 주입시키는 방법을 사용할 수도 있으나 그럴 필요는 없다.
그러므로 일반적으로 본 발명의 방법은 A-쇄 S-설포네이트, B-쇄 S-설포네이트 및 티올환원제의 혼합물을 수용성 매질중 약 8내지 12의 pH에서 원하는 농도로 제조함으로써 시행한다. 대기에 노출된 혼합물은 쇄 결합이 일어나기에 충분한 시간 일반적으로 적어도 약 30분간 천천히 교반한다. 교반시키는 동안 일반적으로 혼합물을 약 0내지 25℃ 온도로 유지시키거나 바람직하게는 혼합물을 중등도로 냉각시켜 이 온도 범위중 비교적 낮은 온도, 일반적으로 약 2내지 10℃로 유지시킨다.
반응 시간이 경과된 후에는 인슐린 또는 인슐린 동족체 생설물을 인슐린 공학분야에 인지되어 있는 여러가지 방법에 의해 분리시킬 수 있다 인슐린 정제에 가장 일반적으로 사용되는 기술은 크로마토그라피법이다. 이러한 방법은 본 발명의 방법에 의해 인슐린을 회수하는데 용이하게 사용될 수 있다. 여기에는 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그라피가 포함된다. 또한 플리아크릴아미드 겔 전기영등, 아미노산 분석, 인슐린 방사선 수용기분석, 인슐린 방사선 면역분석, 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC), uv스펙트럼, 단실화, 토끼 혈중 글루코즈 분석등의 인지된 방법으로 생성물의 순서 및 환성도를 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용되는 인슐린에는 한종의 인슐린 A-쇄와 다른종의 인슐린 B쇄를 함유하는 혼성인슐린이 포함된다. 본 발명의 방법의 쟁점은 A-와 B쇄 S-설포네이트의 적절한 결합법에 곤한것이며, 이 쇄들이 실제 인슐린 또는 인슐린 동족체 A- 및 B-쇄를 나타낸 경우에는 본 발명의 방법에서 이들 쇄의 특정 구조는 중요하지 않다.
인슐린 동족체 또는 한종의 A-쇄와 다른종의 B-쇄를 함유하는 혼성 인슐린이 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있으나 각기 천연에 존재하는 인슐린에서 나타난 아미노산 열을 갖는 A-쇄 S-설포네이트와 B-쇄 S-설포네이트를 사용하여 천연에 존재하는 인슐린과 구조적으로 동일한 인슐린을 제조하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 방법을 사용하여 돼지, 소 또는 사람의 인슐린을 제조하는 것이 매우 바람직하며 가장 바람직하기로는 사람의 인슐린을 제조하는 것이다.
이미 기술된 바와같이 인슐린 또는 인슐린 동족체 A- 및 B-쇄는 DNA재결합법에 의해 제조된다. 이들은 또한 천연인슐린으로부터 정통적인 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있으며, 여기에는 용액 또는 고체상 기술방법이 포함된다.
A- 및 B-쇄를 S-설포네이트와 같은 안전한 형태로 만든다. S-설포네이트 출발물질은 A- 및 B-쇄를 나트륨 테트라티오네이트와 같은 약한 산화제 존재하에 아황산 나트륨과 반응시켜 처리하는 산화적 가아황산 분해에 의해 제조된다.
본 발명의 방법을 설명하기 위해 다음 실시예를 제공한다. 이 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로만 제공되며 본 발명의 범위를 제한시키지는 않는다.
[실시예 1]
돼지의 A-쇄 S-설포네이트(360mg)를 0.1M 글리신 완충제 (pH10.5)36ml에 용해시키고 혼합물의 pH를 5N NaCH로 10.5로 조절한다. 돼지의 B-쇄 S-설포네이트(300mg)를 0.1M 글리신 완충제(pH0.5)30ml에 용해시키고 혼합물의 pH를 5N NaOH로 10.5로 조절한다.
디티오트레이톨(DTT)(123.4mg)을 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)4ml에 용해시키고 혼합물의 pH를 5N NaOH 0.2ml로 10.5로 조절한다.
A- 및 B-쇄 용액을 실온(~25℃)에서 100ml 바이알 중에서 합한 DTT 용액 1.91ml를 가하여 ―SSO3-에 대한 -SH가 1.04인 비율로 -SH를 얻는다. 생성된 용액을 개방된 비이커중 4내지 8℃에서 20시간동안 자기 교반기로 천천히 혼합한다 HLPC에 의한 분석에서 인슐린 수득량은 193.8mg 또는 총단백질의 29%임이 밝혀졌다.
최종 용액 10ml를 아세트산으로 pH3.15로 조절하나다. 혼합물을 세파덱스 G-50(Superfine)의 5×20m 컬럼 상에서 겔 여과시키고 4 내지 8℃에서 1M 아세트산으로 평형 및 용출시킨다. 인슐린 피크(용출용액, 약 2450 내지 2700ml)에서 모아 동결 건조시키고 인슐린 95mg 또는 총단백질 25%를 회수한다.돼지 인슐린을 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동, 아미노산분석, 인슐린 방사선 수용기 분석, HPHC 및 토끼 혈중 글루코즈 환원 시험에 의해 매우 순수한 형태로 된다.
[실시예 2]
0.01M 글리신 완충제(pH 105)중 10mg/ml 농도의 돼지의 A- 및 B-쇄 S-설포네이트 용액을 제조한다. 각각의 pH를 5N NaOH로 10.5로 조절한다.
DTT(61.7mg)를 0.1M 글리신 완충제 (pH 105) 4.0ml에 용해시키고 pH를 5N NaOH 0.15ml로 10.5로 조절한다. B-쇄 용액 0.5ml에 A-쇄 용액 0.8ml 및 DTT 용액 0.035ml를 실온 (~25℃)에서 가하여 -SH를 SSO3-에 대해 0.91의 비율로 수득한다. 생성된 용액을 개방된 3ml 바이알중 4내지 8℃에서 20시간 동안 교반한다. 혼합물의 HPLC 분석으로 소의 인슐린 수득량이 1.r6mg 또는 총 단백질의 30%임이 밝혀졌다.
[실시예 3]
0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)중 10mg/ml 농도의 돼지의 A- 및 B-쇄 S-설포네이트 용액을 제조한다. 각각의 pH를 5N NaOH로 10.5로 조절한다. DTT(61.7mg)를 유리 증류수 2.0ml에 용해시킨다. B-쇄 용액 0.5ml에 A-쇄 용액 0.8ml 및 DTT 용액 29.25ml를 실온에서 (~25℃) 가하여 -SH를 SSO3-에 대해 1.00의 비율로 수득한다. 생성된 용액을 4내지 8℃에서 개방된 3ml 바이알 중에서 20시간 동안 교반한다. 혼합물의 HPLC 분석으로 돼지의 인슐린 수득량이 3.81mg 또는 총 단백질의 35%임이 밝혀졌다.
[실시예 4]
0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)중 5mg/ml 농도를 갖는 사람(췌장)의 B-쇄 S-설포네이트 및 수종의 사람(췌장 및 E·콜리)과 돼지(췌장) A-쇄 S-설포네이트 용액을 제조한다. 각각의 pH를 5N NaOH로 10.5로 조절한다. DTT(61.7mg)를 0.1M 글리신 완충제 (pH 10.5) 4.0ml에 용해시키고 pH를 5 NaOH―0.16ml로 10.5로 조절한다.
A-쇄 S-설포네이트 용액 각 1.0ml에 B-쇄 S-설포네이트 용액 0.5ml 및 DTT 용액 0.05ml를 실온 (25℃)에서 가하여 -SH를 SSO3-에 대해 1.09의 비율로 수득한다. 모든 용액을 냉방에서(4내지 8℃)개방된 바이알중에서 20내지 22시간동안 교반한다. 다음에 수득량 계산을 위해 사람의 췌장 인슐린을 표준 물질로 사용하여 HPLC 분석한다. 결과는 다음 표와 같다.
[표 1]
Figure kpo00008
[실시예 5]
사람의 A- 및 B-쇄 S-설포네이트 각각의 용액을 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)중의 5mg/ml 농도로 제조한다. DTT(61.7mg)를 0.1M 글리신 완충제 (pH 10.5) 4.0ml에 용해시키고 pH를 5N NaOH 0.16ml로 10.5로 조절한다. B-쇄 용액 0.5ml에 A-쇄 용액 1.0ml를 실온에서 가한후 DTT 용액 5μl 를 가하여 -SH를 SSO3-에 대해 1.09의 비율로 수득한다. 생성된 용액을 4내지 8℃개방된 3ml 바이알 중에서 252시간동안 교반한 후 HPLC 분석하여 사람의 인슐린 수득량이 2.58mg 또는 총 단백질의 34%임이 밝혀졌다.
[실시예 6]
사람의 A- 및 S-설포네이트(328mg)를 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5) 65.6ml에 용해시키고 혼합물의 pH를 5N NaOH 75μl로 10.5로 조절한다. 사람의 B-쇄 S-설포네이트(164mg)을 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)32.8ml에 용해시키고 혼합물 pH를 5N NaOH 15μl로 10.5로 조절한다. DTT (61.7ml) 0.1M 글리신 완충제(pH10.5)4.0ml에 용해시키고 용액의 pH를 5N NaOH 160μl로 10.5로 조절한다.
A-와 B-쇄 용액을 150ml 유리 비이커중 실온(~25℃)에서 합하여 DTT 용액 3.28ml를 가하면 -SH를 -SSO2-에 대한 1.09의 비율로 수득한다. 개방된 비이커를 냉방중 빙수욕중에 놓고 30분간 활발히 교반한다. 이 용액은 냉방(4 내지 8℃)중에서 다시 24시간 동안 교반한다. 이때 HPLC 분석으로 사람의 인슐린 수득량이 148mg 또는 총 단백질의 30%임이 밝혀졌다.
이 용액 100ml에 빙초산 25ml를 가하여 최종 pH가 3.15가 되도록 한다. 순수 표본을 세파덱스 G-50(Superfine) 컬럼 5×200cm 상에서 겔 여과시키고 1M 아세트산으로 4 내지 8℃에서 평형 및 용출시킨다. 용출된 모든 단백질을 동결 건조시킨다. 인슐린 피크(용출용적 2465 내지 2781ml)의 중량이 125mg이며 회수된 단백질의 29.4%이다.
상기 인슐린 피크 부분(95.5mg)을 0.01M 트리스 -0.001M EDTA-7.5M 우레아-0.03M NaCl 완충제(4℃에서 pH 8.5) 약 9ml에 용해시킨다 혼합물을 DEAE(디에틸아미노에틸)-셀루로즈 이온 교환컬럼 2.5×90cm에 통과시켜 크로마토그라피하고 동일 완충제중에서 평형시킨다. 단백질 4내지 8℃에서 동일 완충제중의 0.03M 및 0.09M NaCl 각기 1ℓ로 용출시킨후 1M NaCl을 함유하는 완충제 1ℓ로 용출시킨다. 각 피크를 세파덱스 G-25(연속) 컬럼상 2% 아세트산중에서 제염시킨후 동결 건조시킨다. 인슐린 피크(용출 용액 878 내지 1008ml)의 중량은 55.73mg이며 회수된 단백질의 84%이었다.
아연 인슐린 결정은 0.1M HCl 240μl 에 인슐린(DEAE)피크 표본 11.90mg을 용해시킨후 신속히 유리원심 분리관중에서 0.04% ZnCl2-0.05M 나트륨 사이트 레이트 -15% 아세톤 용액 2.16ml로 용해시켜 제조한다. 실온에서 (~25℃) 72시간 동안 결정화 시킨후 상등액을 제거하고 결정을 pH 6.1의 냉수로 2회 세척하고 세척 중간에는 3℃에서 200rpm으로 원심분리시킨다. 결정을 분석용 0.01N HCl에 재용해시킨다.
생성된 사람의 인슐린 제제는 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(단일 밴드), 아미노산 분석, 인슐린 방사선 수용기분석, 인슐린 방사선 면역분석, HPLC, 단실화 및 UV 스펙트럼에 의해 매우 순수한 형태로 된다. USP 토끼 분석법(토끼 144마리)에서 mg당(무수물) 26.3±1.8 단위의 역가를 지미을 밝혀졌다.
[실시예 7]
0.1M 글리신 완충제(pH 10.5) 5mg/ml농도를 갖는 사람(이·콜리)의 [N-포밀-Gly'] A-쇄 S-설포네이트 및 사람의 (췌장) B-쇄 S- 설포네이트 용액을 제조한다.각각의 pH를 5N NaOH로 10.5로 조절한다. DTT (61.7ml) 0.1M 글리신 완충제(pH10.5)4.0ml에 용해시키고 pH로 5N NaOH 0.16ml로 10.5로 조절한다. B-쇄 S-설포네이트 용액 0.5ml [N-포밀-Gly'] A-쇄 S-설포네이트 용액 1.0ml 및 DTT 용액 0.05ml 및 DTT 용액을 냉방(4내지 8℃)에서 개봉돈 3ml 바이알중에서 23시간 동안 교반한 후 HPLC 분석하여 [N-포밀-Gly'- A]사람의 인슐린 수득량 1.46mg 또는 총 단백질의 19.5%임의 밝혀졌다.
빙초산으로 pH 3.15로 산성화시킨후 용액중의 일부를 세파덱스 G-50(Superfine) 1.5×90cm 컬럼상에서 겔 여과시키고 1M 아세트산으로 4 내지 8℃에서 평형 및 용출시킨다. [N-포밀-Gly'-A] 사람의 인슐린 피크(용출용적 87 내지 95ml)를 모아 분취 및 동결시킨다. HPLC 및 아미노산 분석으로 매우 순수한 형태로 정제할 수 있다. 방사선 수용기 분석법으로 평가한 [N-포밀-Gly'-A] 사람의 인슐린의 생물학적 활성도는 사람의 인슐린 표준물질에 대해 17%였다.
[실시예 8]
돼지의 A-쇄 S-설포네이트 및 인체의 (이·콜리)의 B-쇄 S-설포네이트 용액을 각기 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5)중의 10mg/ml 농도 용액으로 제조한다. B-쇄 용액 매 1ml에 대해 A-쇄 용액 2ml를 사용하여 A-B-푸울을 제조한다. A-B푸울을 5N NaOH로 pH 10.5로 조절한다. 시스테인 (121.mg)을 0.1M 글리신 완충제(pH 10.5) 3.0ml에 용해시키고 pH를 5N NaOH 0.35ml로 10.5로 조절한다. A-B 푸울 1.4ml에 시스테인 용액 52μl를 실온에서 가하여 -SSO3-에 대한 -SH의 비율이 0.95가 되도록한다. 생성된 용액을 4내지 8℃ 개봉된 3ml 바이알 중에서 20시간동안 교반한 후 HPLC 분석하면 인체인슐린이 3.25mg 또는 총 단백질의 23.2%가 수득됐음이 밝혀진다.

Claims (1)

  1. A-쇄와 B-쇄를 결합시켜 인슐린 또는 인슐린 동족체를 제조하는 방법에 있어서, A-쇄의 S-설폰화된 형태, B-쇄의 S-설폰화된 형태 및 티올 환원제를 수용성 매질중에서 함께 반응시켜 pH가 약 8내지 12이고 총단백질 농도가 ml당 약 0.1내지 50mg이며 티올 환원제를 A- 및 B-쇄 S-설포네이트 총량중에 존재하는 각 -SSO3- 그룹당 총 약 0.4 내지 2.5 -SH 그룹을 수득할 수 있는 량 함유하는 혼합물을 제조하여, 혼합물을 약 0내지 25℃의 온도이고 산소원이 공급되는 곳에서 유지시킴을 특징으로 하여 인슐린 또는 인슐린 동족체를 제조하는 방법.
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