JPH02233699A - インスリン前駆体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インスリンは、互いにジスルフイド橋を介して結合して
いる２個のポリペプチド鎖から構成される分子である。

Ａ鎖は２１個のアミノ酸、Ｂ鎖は３０個のアミノ酸から
なる。これらの２つの鎖は前駆体分子、プロインスリン
では、互いにペプチド、Ｃ−ベプチドによって結合して
いる。

ヒトプロインスリンのＣ−ペプチドは３５個のアミノ酸
からなる。このホルモンの成熟過程でＣーペプチドは特
異的なプロテアーゼによって切断され、プロインスリン
はこのようにしてインスリンに変換される（Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎら：　Ｎａｔｕｒｅ．影じー：９３〜９６．　１
９８８）。天然のＣ−ペプチドのほかに、Ａ鎖とＢ鎖の
間の結合については多くの可能性が文献に記載されてい
る（ＹＢｎａｉｈａｒａら：Ｄｉａｂｅｔｅｓ，　　２
７　：　１４９〜ｌ６０，　　１９７８　Ｈ　Ｂｕｓｓ
ｅら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１５　：　１６４
９〜ｌ６５７，　１９７１　；およびＧｅｉｇｅｒら：
　Ｂｉｏｃｈａ＋ｍ．　　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　　Ｒｅｓ
．　Ｃｏｍｍｕｎ．，肱：６０〜６６．　　１９７３）
　。

遺伝子工学によれば、現在では遺伝子工学で修飾した微
生物からインスリンを製造することが可能である。大腸
菌を微生物として使用すれば、生成物は多くの場合、融
合タンパク質として発現され、すなわち生成物は細菌の
内因性タンパク質たとえばβ−ガラクトシダーゼと連結
している。この融合タンパク質は細胞内で析出し、した
がってタンパク分解から保護される。

細胞を破壊したのち、融合タンパク質の構成要素を化学
的にまたは酵素的に分離し、インスリン前駆体の６個の
システインを酸化的加サルファイト分解によってＳ−ス
ルホネー｝　（−Ｓ−Ｓｏ，つに変換する。天然のプレ
プロインスリンはこのいわゆるプレプロインスリンＳ−
スルホネートから、次の工程で３個の正しいジスルフイ
ド橋を形成させて製造しなければならない。この工程は
たとえばＥＰ−Ｂ−０．０３７，２５５に記載された方
法により、出発のＳ−スルホネートをＳＳ０３一基１個
あたりＳＨ基１〜５個になる量のメルカブタンと、ｐＨ
７〜１１．５の水性メジウム中、水性メジウムｌｍｌ＋
２あたりＳ−スルホネート１０１１９までの濃度で、好
ましくは酸化剤の不存在下に反応させることによって行
われる。

しかしながら、高い折りたたみ収率−すなわち、「正し
い」ペプチド配列連鎖（Ａ６からＡ　１１．Ａ７からＢ
７およびＡ２０からＢｌ９の−Ｓ−Ｓ一橋）をもつプレ
プロインスリンの高収率一を得るためには、指定された
、せまい範囲内にＳＲ／ＳＳＯＳ比を維持することが必
要で、これはこの方法の実施にあｔ；り少なからぬ注意
と、とくに、出発のＳ−スルホネート中のあまり簡単で
はないＳＳＯ３−基の定量が要求される。

本発明は、驚くべきことに、この操作をより高いーすな
わち５：ｌを越えるＳＨ／ＳＳＯ３−比において、有機
レドツクス系または反応条件下に有機レドツクス系を形
成する化合物の存在下に実施することにより、事実上Ｓ
Ｈ／ＳＳＯｓ−比に関係なく広い範囲内で高い折りたた
み収率が得られることを発見し完成されたものである。

ＳＳＯ，一基の代わりに他のＳ一保護基を相当する出発
物質中に存在させることもできる。さらに、インスリン
ＡおよびＢ鎖のペプチド配列は１個もしくは２個以上の
アミノ酸の置換によって修飾することもできる。

より高いＳＨ／Ｓ５０３−（またはＳ一保護基）比は、
ただある最小量のメルカブタンが過剰にある限りこの操
作は過剰のメルカブタンのレベルには事実上無関係に、
収率に実質的な悪影響を与えることなく実施できること
を意味している。相当するインスリン出発物質中のＳＳ
Ｏｓ−（またはＳ−保護基）の正確な定量もこの方法で
は不必要となり、これはこの方法の注目すべき利点であ
る。

過剰なメルカブタンのレベルとは事実上無関係なこの方
法の実施は、有機レドツクス系または反応条件下にこの
ような有機レドツクス系を形成する化合物に存在によっ
て可能になる。

還元塁プロインスリン、すなわちそのＳ−Ｓ橋がたとえ
ばメルカプタンで還元的に切断されＳＨ基になっている
グロインスリンが元のプロインスリンに再び酸化できる
こと、またこの再酸化がデヒドロアスコルビン酸の存在
によって加速されることが公知であり（Ｄ．Ｆ．　　Ｓ
ｔｅｉｎｅｒ　＆Ｊ．Ｌ．　Ｃｌａｒｋ：Ｐｒｏｃ．　
Ｓｏｃ．　Ｎａｉｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
　６０　：　６２２〜６２９．　１９６８）、またデヒ
ドロアスコルビン酸とアスコルビン酸のレドックス系が
そこに記載された反応条件下に形成されたとしても、そ
れはＳ基が保護されていない還元型プロインスリンの酸
化の場合であり、本発明による本件では、保護されたＳ
基を有するインスリン前駆体のみが適当な出発物質であ
る。さらに、上述のＤ．Ｆ．　ＳＬｅｉｎｅｒとＪ．Ｌ
．　Ｃｌａｒｋの文献には、その使用の目的およびＳ−
保護基を含むインスリン前駆体のメルカプタンによる組
換えにおける有機レドツクス系の作用については全く、
指示も示唆もない． 詳細には、本発明は式Ｉ （式中、 ＲｌはＨまたは化学的もしくは酵素的に切断除去できる
アミノ酸もしくはペプチド残基であり、 Ｒ８はＯＨまたはアミノ酸もしくはペプチド残基、好ま
しくはＯＨであり、 ＸはインスリンＡおよびＢ鎖を結合する残基、好ましく
はアミノ酸またはペプチド残基であり、Ｙは遺伝子でコ
ード可能なアミノ酸好ましくはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳ
ｅｒ、とくにＴｈｒの残基であり、２は遺伝子でコード
可能なアミノ酸、好ましくはＡｓｎ，　Ｇｌｎｘ　Ａｓ
ｐ，　Ｇｌｕ％Ｃｌｙ，　Ｓｅ『、ＴｂｒＳＡｌａまた
はＭｅｔ，とくにＡｓｎの残基であり、ＡＩ−Ａ２０お
よびＢｌ−Ｂ２９は突然変異のないまたは１債もしくは
２個以上のアミノ酸残基の置換による突然変異があるイ
ンスリンのベプチド配列であり、好ましくは突然変異の
ないヒト、ブタまたはウシインスリンとくにヒトまたは
ブタインスリンのペプチド配列である）で示されるイン
スリン前駆体を、保護Ｃｙｓ−Ｓ基を有する前駆体の水
性メジ９ム中でのメルカブタンとの反応によって製造す
る方法において、式■ （ト７） （Ｂ−１９） （Ｂ−３０） （式中、Ｒｌ、Ｒ，、Ｘ，Ｙ，Ｚ，Ａｌ　〜Ａ２０８よ
びＢｌ−Ｂ２９は式Ｉの場合と同じ意味であり、Ｒ，は
Ｃｙｓ−Ｓ保護基、好ましくは−ＳＯ，一またはｔｅｒ
ｔ−プチル基である）で示される保護Ｃｙｓ−Ｓ基を有
する前駆体を、有機レドツクス系または反応条件下に有
機レドツクス系を形成する少なくとも１種の化合物の存
在下に、（メルカブタン）ＳＨ／（インスリン前駆体）
　Ｃｙｓ−Ｓ−Ｒ．の比が５を越える量のメルカブタン
と反応させる方法に関する。

式Ｉおよび■におけるＲ，がＨであれば、この物質はプ
ロインスリンまたはプロインスリンから誘導される生成
物であり、Ｒ１が化学的または酵素的に切断除去できる
アミノ酸またはペプチド残基である場合には、この物質
はプレプロインスリンおよびそれから誘導される生成物
である． 化学的に切断除去できるアミノ酸残基は、たとえばＢｒ
ＣＮまたはＮ−プロモスクシンイミトニよって切断除去
できるアミノ酸残基、たとえばメチオニン（Ｎｅｔ）ま
たはトリプトファ冫（Ｔｒｐ）である。

酵素的に切断除去できるアミノ酸残基は、たとえばトリ
プシンによって切断除去できるアミノ酸残基たとえばＡ
ｒｇまたはＬｙｓである。

化学的にまたは酵素的に切断除去できるペプチド残基は
少なくとも２ｆｉのアミノ酸残基を有するペプチド残基
である。

Ｒ１として可能なすべてのアミノ酸は、好ましくは天然
のアミノ酸、すなわち主としてｃｔｙ，Ａｌａ，　Ｓｅ
ｒ，　Ｔｈｒ，　Ｖａｔ，　Ｌｅｕ，　Ｉｔｓ，　Ａｓ
ｎ，　Ｇｉｎ，Ｃｙｓ，　Ｍｅｔ，　Ｔｙｒ，　Ｐｈｅ
，　Ｐｒｏ，　Ｈｙｐ，　Ａｒｇ，　Ｌｙｓ，Ｈｙｌ，
　Ｏｒｎ，　Ｃｉｔおよび旧Ｓから選ばれる。

Ｒ，はＯＨまたは、Ｒｌと類似して、同様のアミノ酸も
しくはペプチド残基であり、ＯＨであることが好ましい
。アミノ酸（少なくとも２個のアミノ酸残基からなるペ
プチド残基を形成したアミノ酸を包含する）は、Ｒ，の
場合と同様、天然アミノ酸群に由来することが好ましい
。

ＸはインスリンＡおよびＢ鎖を結合する残基で、アミノ
酸まＩ；はペプチド残ボであることが好ましい。

Ｘがアミノ酸残基の場合ＡｒｇまたはＬｙｓ残基が好ま
しい。Ｘがペプチド残基の場合には、天然のＣ−ペプチ
ドの残基、とくにヒト、ブタまたはウシインスリンＣ−
ペプチドの残基であることが好ましい。

Ｙについての遺伝子でコード可能なアミノ酸は、Ｇｌｙ
，　Ａｌａ，　Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，　Ｖａｌ，　Ｌａｕ，
　ＩＩｓ，　Ａｓｐ．Ａｓｎ，　Ｇｌｕ，　Ｇｌｎ，　
Ｃｙｓ，　Ｍｅｔ，　Ａｒｇ，　Ｌｙｓ，　Ｈｉｓ，Ｔ
ｙｒ，　Ｐｈｅ，　ＴｒｐおよびＰｒｏ　（いずれもＬ
型）である。

好ましい遺伝子でコード可能なアミノ酸は、Ｔｈｒ，　
ＡｌａおよびＳｅｒ，とくにＴｈｒである。

２はＹと同じく、遺伝子でコード可能なアミノ酸の残基
を同様に意味するが、この場合は、Ａｓｎ，　Ｇｌｎ，
　Ａｓｐ，　Ｇｌｕ，　Ｇｌｙ，　Ｓｅｒ，　Ｔｈｒ，
　ＡｌａおよびＭａｔ，とくにＡｓｎが好ましい。

Ａ１〜Ａ２０およびＢｌ−Ｂ２９は原則として、すべて
の可能なインスリンの突然変異がないまたは１個もしく
は２個以上のアミノ酸の置換による突然変異のあるペプ
チド配列である。突然変異体は遺伝子工学による公知の
方法で（部位特異的突然変異）製造できる。しかしなが
ら、ヒト、ブタまたはウシインスリン、とくにヒトまた
はブタインスリンの突然変異のないペプチド配列（ヒト
およびブタインスリンのＡＩ−Ａ２０およびＢｌ−Ｂ２
９配列は同一である）が好ましい。

式■のみにある基Ｒ，は実際には任意の所望のＣｙｓ−
Ｓ保護基を意味するが、好ましくはーＳＯ，一または三
級ブチル基であり、この場合一８０３一基の方がやや重
要度が大きい。

式■の出発物質は原則として、広い濃度範囲で使用でき
るが、溶液ｌｍＩｌあたり約ｌＯμ９〜１０１１９が有
利である。タンパク質の濃度が低いと凝集の傾向が低下
するので、すでに知られているように濃度が低いほど高
い再生収率を招く。好ましい濃度は約０．１ｍｇ〜０．
５ｍｇ／ｍｆｆの範囲である。

本発明の反応に適当なメルカブタンは原則として、ＳＨ
基を有するすべての可能な有機化合物、メルカプトエタ
ノール、チオグリコール酸、グルタチオンおよびシステ
インであり、とくにメルカプトエターノールおよびシス
テインが好ましい．メルカブタンは単独でまたは混合物
として使用できる。

メルカプタンの量は、そのＳＨ基と式■の出発原料のＣ
ｙｓ−ＳＲ．基の比が可能な限り５より大きくなるよう
に選択される。

この比の上限は実際、経済的理由によってのみ設けられ
る。約１００を上限とするのが有利である。約ｌＯ〜５
０、とくに約ｌθ〜３０の比が好ましい。反応バッチ中
のメルカブタン濃度は、したがって、使用される式■の
出発原料の量および選ばれるＳＲ／　ＣＹｓ−ＳＲｓ比
によって決定される．好ましい可能な有機レドツクス系
は一対の化合物であり、その一成分は弐■ １し （ｍ） の構造要素を有する有機化合物または芳香族０−もしく
はｐ−ジヒドロキシ化合物であり、他方の成分は式ｍ′ の構造要素、すなわち式■の酸化塁の構造要素を有する
有機化合物または０−もしくはｐ−キノンである。

式■および■′の構造要素の自由原子価は、水素または
、たとえば０１〜Ｃ４−アルキル基のような有機基によ
って満たされる。しかしながら、この構造要素は、好ま
しくは４、５または６Ｃ環原子および所望により１個も
しくは２個のたとえばＯのようなヘテロ原子を有する環
で、反応条件下に不活性な基たとえばアルキルもしくは
ヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい環の部分
であってもよい。

式■の構造要素を有する化合物の例としては、 がある。上述の式はいずれも互変異性塁のひとつとして
のみ記載されている。

すべての化合物は還元性である。酸化塁では、式■の構
造要素は弐■′の構造要素となる。

適当な芳香族０−およびｐ−ジヒドロキシ化合物は、原
則として０−またはｐ一位に２個のＯＨ基を有するすべ
ての可能な芳香族であるが、０−およびｐ−ジヒドロキ
シ化合物からの。−またはｐ−キノンの形成が特定の置
換基等によって妨害されないことだけは必要である。〇
一およびｐ−ジヒドロキシ化合物の例としては、１．２
−ジヒドロキシベンゼンーピロカテコール、 １．４−ジヒドロキシベンゼンーヒドロキノン、メチル
ーヒドロキノン、ナ７トー１．４−ヒドロキノンおよび
アントラヒドロキノンがある。相当するキノンはそれら
から酸化で生成する一本発明の反応では、たとえば、ア
スコルビン酸＋テヒドロアスコルビン酸、ピロカテコー
ル＋０−キノン、ヒドロキノン＋ｐ−キノン、ナフトヒ
ドロキノン＋ナフトキノン等のような化合物対からなる
特定の有機レドツクス系を事実上任意の所望の比率（好
ましくはほぼ等モル比）で使用することができる。しか
しながら、これらの化合物対の特定の各成分については
、すなわちたとえばアスコルビン酸のみもしくはデヒド
ロアスコルビン酸のみ、またはヒドロキノンのみ等、を
添加することが可能である。それぞれの場合、レドツク
ス化合物対に属する他の成分（デヒドロアスコルビン酸
もしくはアスコルビン酸またはｐ−キノン等）が反応メ
ジウム中に生成するからである。

好ましい有機レドツクス等は、アスコルビン酸十デヒド
ロアスコルビン酸、ピロカテコール＋０−キノンおよび
ヒドロキノン＋ｐ−キノンの化合物対からなる配合物で
あり、反応条件下にこのようなレドツクス系を形成する
好ましい債々の化合物はこれらの化合物の個々の成分で
ある。

アスコルビン酸および／またはデヒドロアスコルビン酸
はとくに好ましい。

有機レドツクス系を形成する化合物の使用量は広範囲の
限界内で変動させることができる。

有機レドツクス系を形成する化合物のモル数は、メルカ
プタンｌｇ当量（使用するメルカプタンの分子量の９数
／メルカブタン分子中のＳＨ基の数）に対して約１／１
０．０００〜１０，０００、好ましくは約１／１０〜ｌ
Ｏになるように選択できる。

本発明の反応は、アルカリ性のｐＨ範囲、好ましくは約
７〜ｌ２、とくに約９．５〜１１で実施するのが有利で
ある。所望のｐｕを維持するには、緩衝物質の添加が有
利である。緩衝剤の性質およびイオン強度は折りたＩ；
み収率にある影響を与える。イオン強度を低く、約１ｍ
Ｍ（ｍＭ一ミリモル）からＩＭ（Ｍ−モル）の範囲に保
持することが有利であり、とくに約５ｍＭ〜５０ｍＭの
間が好ましい。使用できる緩衝剤はホウ酸塩緩衝剤、炭
酸塩緩衝剤またはグリシン緩衝剤であり、後者がとくに
好ましい。

反応温度については約０〜４５℃の範囲を一般的な範囲
ということができるが、約４〜８゜Ｃの範囲が好ましい
。

．再生溶液をある種の気体、たとえば酸素、窒素または
ヘリウムで被覆することは、再生収率に見るべき影響を
与えない． 反応時間は一般的には約２〜２４時間、好ましくは約６
〜ｌ６時間である。

反応が終結したならば（これはたとえば高速液体クロマ
トグラフイーで確認でさる）、混合物の公知の方法で、
たとえば上述のＥＰ−Ｂ−０．０３７．２５５に記載さ
れているように後処理する． 式■の「正しい」折りたたみ生成物をついで、会知技術
により、酵素的または化学的に相当するインスリンに変
換できる。

以下の例は、本発明をさらに詳細に説明し、また従来技
術に対する利点を例示することを意図するものである。

遺伝子工学によって得られたプレプロインスリン−Ｓ−
ＳＯ，一を再生実験の出発原料として使用しＩ二。

発現系としては大腸菌を使用した．大腸菌においてはプ
レプロインスリンの遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の部分と連結し、融合タンパク質として合成され、こ
れは細胞内に沈殿して極帽内に沈積する（　ＤＥ−Ａ−
３．８０５．　１５０の方法による）。細胞を破壊した
のち、融合タンパク質の構成要素をシアノーゲンハライ
ドによって切除分離し（　ＤＥ−Ａ−３，４４０．９８
８の方法による）、ついで６システインをそのＳ−スノ
レホネート型に変換するために酸化的加サルファイト分
解に付す（Ｒ．Ｃ．　Ｍａｒｓｈａｌｌ　Ａ　Ａ．Ｓ．
　Ｉｎｇｌｅｓ：″Ｐ？ａｃ−ｔｉｃａｌ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　ＣｈｅｍｉｓＬｒｙ−Ａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ″１
９８６，Ａ．　Ｄｅｒｂｒｅ刊，　４９〜５３頁）。プ
レプロインスリン−　Ｓ　−ＳＯ，−　（接頭語の「プ
レ」はプロインスリンがそのＮ末端でアミノ酸５残基分
延長されていることを意味する）はこのようにして製造
されたのち、それ自体公知の方法でイオン交換樹脂を用
いて濃縮し、沈殿させ、凍結乾燥する。

高速液体クロマトグラフイーで定量すると、この方法で
得られた凍結乾燥出発原料は含量６０％を示す。

（１）折りたたみ収率に対するメルカプタン／アスコル
ビン酸此の影響 プレプロインスリン−ｓ　−　ＳＯｓ−　（６０％）を
２０１ＩＩＭグリシン緩衝液、ｐＨｌ０．５に濃度が０
．３３ｍｔｉ／　Ｉｌｌｌになるように溶解する。これ
はプレプロインスリン−Ｓ−ＳＯ，一濃度０．２１１９
／禦αに相当する。各バッチあたり２０ｓｉを使用し、
これに０．１Ｍシステイン溶液４８０μ１２（Ｓ−Ｓ０
３一基に対して約２０倍モル過剰）とＯ．ｌＭのアスフ
ルビン酸溶液θ〜４８０μａを加える。再生温度は８℃
、反応時間は１６時間とする。

Ｏμｇ ２５（対照） この例は折りたたみ収率に対するレドツクス化合物の影
響を示す。アスコルピン酸を加えないバッチでは正しく
折りたｔ；まれないタンパク質の生成のみが優先的に生
じるが、折りたたみ収率はレドツクス化合物の存在下に
上昇すφ。

（２）折りたたみ収率に対するメルカプタン／アスコル
ビン酸過剰の影響 秤量した量、容量、緩衝液、反応時間および温度、なら
びにｐＨは実験（１）と同様である。各場合とも、当モ
ル量のシステインとアスコルビン酸を加え、Ｓ−ＳＯ．
一基あたりの過剰モルは２．５〜１００である。

この例は、ある最小量のメルカブタンが過剰となると、
折りたたみ収率はメルカブタンの過剰量には広い範囲で
ほとんど依存しないことを示している。

（３）折りＩ；たみ収率に対するｐＨの影響秤量した量
、容量、緩衝剤濃度ならびに反応時間および温度は実験
（１）と同じである。この実験では０．１Ｍシステイン
溶液４８０μａと０．１Ｍ７スコルビン酸溶液４８０μ
Ｑを加える（Ｓ−ＳＯｓ−基あたり約２０倍モル過剰）
。

１１．０ １０．５ １０．０ ９．５ ９．０ ８．５ ８．０ （４）折りたたみ収率に対するメルカブタンの種類の影
響 秤量した量、容量、緩衝剤濃度、反応時間および温度、
ならびにｐＨは実験（１）と同じである．この実験では
、いずれの場合も、相当する０．１Ｍメルカプタン溶液
４８０μαＢよび０．ｌＭアスコルビン酸溶液４８０μ
ａを加える（Ｓ−ＳＯｓ一基あたり約２０倍モル過剰）
。

１００ｍＭホウ酸塩 ５ｌ システイン　　　　　　　　　　８ｌ メルカプトエタノール　　　　　８６ グルタチオン　　　　　　　　　７５ チオグリコール酸　　　　　　　７４ （５）折りたたみ収率に対する緩衝物質および緩衝剤の
イオン強度の影響 秤量しｔ；量、容量、反応時間および温度、ならびにｐ
Ｈは実験（１）と同じである。この実験では、いずれの
場合も、相当する０．１Ｍメルヵプタン溶液４８０μＱ
および０．１Ｍアスコルビン酸溶液４８０μａを加える
（Ｓ−ＳＯ．−基あたり約２０倍モル過剰）。

ｌＱｍＭ炭酸塩 １００ａＭ炭酸塩 （６）折りたたみ収率に対する反応時間の影響秤量した
量、容量、緩衝剤濃度、ｐＨおよび反応温度は実験（１
）と同じである。いずれの場合も，Ｏ．ｌＭメルカプト
エタノール溶液４８０μαおよび０．１Ｍアスコルピン
酸溶液４８０μαを加える（Ｓ−ＳＯ３−基あたり約２
０倍モル過剰）。

１０ｍＭグリシン １００ｍＭグリシン　　　　　　　　８２１０ｍＭホウ
酸塩 （７）折りだＩこみ収率に対するプレプロインスリンー
Ｓ−スルホネート濃度の影響 容量、緩衝剤組成、ｐＨ，反応時間および温度は実験（
１）で同じである。いずれの場合も、使用したプレプロ
インスリンーＳ−スルホネートの量に対してＳ−Ｓｏ１
一基あたり約２０倍モル過剰存在するのに十分なメルカ
プトエタノール保存溶液およびアスコルビン酸保存溶液
を加える。

インスリンＡおよびＢ鎖がアルギニンのみで連結されて
いる前駆体分子を使用する。この分子の遺伝子工学によ
る製造は、実験の記述の最初に記載したようにして行う
。凍結乾燥物質は含量６０％を有し、２０ｍＭグリシン
緩衝液、ｐＨｌＯ．５中０５ｍｇ／＋ｍＩ２の濃度に溶
解する。これは前駆体濃度０．３ａｅ／ｍαに相当する
。反応時間および温度は実験（１）と同じであり、アス
コルビン酸／メルカブタン混合物のモル過剰は２．５〜
５０倍の間で変動させる。

（８）修飾された出発材料を用いＩ；場合の折りなたみ
収率に対するアスコルビン酸／メルカ（９）折りたたみ
収゛率に対するレドツクス系の影響 プトエタノール過剰の影響 秤量した量、容量、緩衝剤組成、ｐＨならびに反応時間
および温度は実験（１）と同じである。

Ｓ−Ｓｏｎ基に対して２０倍モル過剰のメルカプトエタ
ノールおよび相当するレドツクス構成要素の２０倍モル
過剰を加える。

アスコルビン酸 デヒドロアスコルビン酸 ピロカテコール ヒドロキノン ベンゾ（ｐ）キノン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 I ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、 Ｒ＿１はＨ、または化学的もしくは酵素的に切断除去で
   きるアミノ酸もしくはペプチド残基であり、 Ｒ＿２はＯＨ、またはアミノ酸もしくはペプチド残基好
   ましくはＯＨであり、 ＸはインスリンＡおよびＢ鎖を結合する残 基、好ましくはアミノ酸またはペプチド残基であり、 Ｙは遺伝子でコード可能なアミノ酸好まし くはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ、とくに好ましくはＴ
   ｈｒの残基であり、 Ｚは遺伝子でコード可能なアミノ酸好まし くはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｃｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ
   、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔ、とくに好ましくはＡｓ
   ｎの残基であり、 Ａ１〜Ａ２０およびＢ１〜Ｂ２９は、突然変異のないま
   たは１個もしくは２個以上のアミノ酸残基の置換による
   突然変異があるインスリンのペプチド配列であり、好ま
   しくは突然変異のないヒト、ブタまたはウシインスリン
   とくにヒトまたはブタインスリンのペプチド配列である
   ）で示されるインスリン前駆体を、保護Ｃｙｓ−Ｓ基を
   有する前駆体の水性メジウム中でのメルカプタンとの反
   応で製造する方法において、式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ１〜Ａ２０お
   よびＢ１〜Ｂ２９は式 I の場合と同じ意味であり、Ｒ
   ＿３はＣｙｓ−Ｓ保護基、好ましくは−ＳＯ＿３＾−ま
   たはｔｅｒｔ−ブチル基である）で示される保護Ｃｙｓ
   −Ｓ基を有する前駆体を、有機レドックス系または反応
   条件下に有機レドックス系を形成する少なくとも１種の
   有機化合物の存在下に、（メルカプタン）ＳＨ／（イン
   スリン前駆体）Ｃｙｓ−Ｓ−Ｒ＿３の比が５を越える量
   のメルカプタンと反応させることを特徴とする方法。 ２）メルカプタンとしてメルカプトエタノールおよび／
   またはシステインを用いる請求項１記載の方法。 ３）（メルカプタン）ＳＨ／Ｃｙｓ−ＳＲ＿３（式II中
   ）の比が５を越え１００まで、好ましくは約１０〜５０
   、とくに約１０〜３０で行われる請求項１および２のい
   ずれかに記載の方法。 ４）用いられる有機レドックス系は１対の化合物であっ
   て、一方の成分は式III ▲数式、化学式、表等があります▼（III） の構造要素を有する有機化合物または芳香族ｏ−もしく
   はｐ−ジヒドロキシ化合物であり、他方の成分は式III
   ′ ▲数式、化学式、表等があります▼（III′） の構造要素、すなわち式IIIの酸化型の構造要素を有す
   る有機化合物またはｏ−もしくはｐ−キノンである請求
   項１から３までのいずれかに記載の方法。 ５）反応条件下に有機レドックス系を形成する用いられ
   る有機化合物は請求項４に挙げた各化合物からの１種ま
   たは２種以上である請求項１から３までのいずれかに記
   載の方法。 ６）用いられる有機レドックス系は、アスコルビン酸＋
   デヒドロアスコルビン酸、ピロカテコール＋ｏ−キノン
   、またはヒドロキノン＋ｐ−キノンの化合物対であり、
   反応条件下にレドックス系を形成できる用いられる有機
   化合物はそれぞれ上記化合物対の一成分である請求項１
   〜５のいずれかに記載の方法。 ７）アスコルビン酸および／またはデヒドロアスコルビ
   ン酸の存在下に行われる請求項１〜５のいずれかに記載
   の方法。 ８）メルカプタンと、有機レドックス系を形成する１種
   または２種以上の化合物は、メルカプタン１ｇ当量に対
   し有機レドックス系を形成する化合物１／１０，０００
   〜１０，０００モル好ましくは１／１０〜１０モルの割
   合で用いられる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９）反応は約７〜１２好ましくは約９．５〜１１のｐＨ
   で行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。