NO178861B - Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforlöper - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforlöper Download PDFInfo
- Publication number
- NO178861B NO178861B NO900278A NO900278A NO178861B NO 178861 B NO178861 B NO 178861B NO 900278 A NO900278 A NO 900278A NO 900278 A NO900278 A NO 900278A NO 178861 B NO178861 B NO 178861B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- mercaptan
- residue
- amino acid
- acid
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N Dehydro-L-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(=O)C1=O SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- SBJKKFFYIZUCET-UHFFFAOYSA-N Dehydroascorbic acid Natural products OCC(O)C1OC(=O)C(=O)C1=O SBJKKFFYIZUCET-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000020960 dehydroascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011615 dehydroascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 29
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 8
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 8
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC=CC1=O WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 claims description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- -1 benzcatechin Chemical compound 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CNHDIAIOKMXOLK-UHFFFAOYSA-N toluquinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1O CNHDIAIOKMXOLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylethanol Chemical group CC(O)S GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCFMUWBCZZUMRX-UHFFFAOYSA-N 9,10-Dihydroxyanthracene Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(C=CC=C3)C3=C(O)C2=C1 PCFMUWBCZZUMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930192627 Naphthoquinone Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100028703 Protein maestro Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229950001002 cianidanol Drugs 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N hydroquinone methyl ether Natural products COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000687 hydroquinonyl group Chemical group C1(O)=C(C=C(O)C=C1)* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- PCILLCXFKWDRMK-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(O)C2=C1 PCILLCXFKWDRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002791 naphthoquinones Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforløper.
Insulin er et molekyl som består av 2 polypeptidkjeder som er koblet sammen med disulfidbroer. A-kjeden består av 21 aminosyrer og B-kjeden av 30 aminosyrer. Begge disse kjedene er i forløpermolekylet, proinsulin, koblet med hverandre gjennom et peptid, C-peptidet. C-peptidet i humanproinsulin består av 35 aminosyrer. C-peptidet blir avspaltet av spesifikke proteaser i løpet av modningsprosessen til hormonet og proinsulinet blir deretter overført til insulin (Davidson et al., Nature 333, 93-96, 1988). Bortsett fra de naturlige forekommende C-peptidene, er det i litteraturen beskrevet mange muligheter når det gjelder koblingen mellom A-kjeden og B-kjeden (Yanaihara et al., Diabetes 27, 149-160
(1978), Busse et al., Biochemistry 15, 1649-1657 (1971), Geiger et al., Biochem, Biophys. Res. Com. 55, 60-66 (1973)).
Innen rammen av genteknologien er det idag mulig å fremstille insulin fra genteknisk modifiserte mikroorganismer. Dersom mikroorganismen E. coli blir anvendt, blir produktet uttrykt i store mengder som fusjonsprotein, dvs. produktet blir koblet med et protein fra bakterien, f.eks. med p<->galak-tosidase. Dette fusjonsproteinet faller ut i cellen og er dermed beskyttet for proteolytisk nedbrytning. Etter bearbeiding av cellene blir fusjonsproteinandelen avspaltet kjemisk eller enzymatisk og de 6 cysteinene til insulin-forløperen blir ved hjelp av oksidativ sulfittolyse overført til S-sulfonater (-S-SO3"). Fra dette såkalte preproinsulin-S-sulfonatet må nativt preproinsulin under dannelse av de 3 riktige disulfidbroene bli tilveiebragt i et følgende trinn.
Dette skrittet foregår f.eks. ifølge fremgangsmåten beskrevet i EP-B-00 37 255 ved omsetning av utgangs-S-sulfonatet med et merkaptan i en mengde som gir 1 til 5 SH-rester pr. SS03~-rest i vandig medium ved en pH-verdi på 7-11,5 ved en S-sulfonatkonsentrasjon på opptil 10 mg pr. ml vandig medium
fortrinnsvis i fravær av et oksydasjonsmiddel.
For oppnåelse av høyere foldingsutbytte, dvs. høyere utbytte av preproinsulin med den "riktige" peptidsekvenskoblingen (-S-S-broer fra A6 til All, fra A7 til B7 og fra A20 til B19), er det her nødvendig med det oppnådde, snevert begrensede, SH/SS03~-forholdet, som nødvendiggjør en ikke ubetydelig omhyggelighet ved gjennomføringen av fremgangsmåten og en ikke helt lett kvantitativ bestemming av SS03~-gruppene i utgangs-S-sulfonatet.
Det ble nå overraskende funnet at man oppnår høye foldingsut-bytter praktisk uavhengig av SH/SSC"3_-f orholdet når man arbeider ved et høyere, dvs. over 5:1 - SH/SS03~-forhold i nærvær av et organisk Redox-system eller fra forbindelser som under reaksjonsbetingelsene danner et slikt organisk Redox-system. I steden for SSO*^__gruppene kan andre S-beskyttelsesgrupper være tilstede i det tilsvarende utgangsproduktet. Peptidsekvensene til insulin-A- og -B-kjeden kan bli forandret ved utbytting av én eller flere aminosyrer.
Det høyere SH/SS03~-(hhv. S-beskyttelsesgruppen )-forholdet betyr at man, dersom man bare overskrider en bestemt merkaptan-minstemengde, kan arbeide praktisk uavhengig av høyden av merkaptan-overskuddet uten vesentlig innvirkning på utbyttet, og dette gjør også en nøyaktig kvantitativ bestemming av SS03~-(hhv. S-beskyttelses-)gruppe-bestemming i det tilsvarende insulin-utgangsproduktet overflødig, og dette er en betydelig fremgangsmåtefordel.
Det er mulig å arbeide praktisk uavhenig av høyden på merkaptan-overskuddet ved nærvær av et organisk Redox-system, hhv. av forbindelser som under reaksjonsbetingelsene danner et slikt organisk Redox-system.
Det er til og med kjent at redusert proinsulin, dvs. proinsulin hvor S-S-broene f.eks. er blitt spaltet med et merkaptanreduserende middel til SH-grupper, kan bli reok-sydert til det opprinnelige proinsulin og at denne reoksyda-sjonen blir akselerert ved nærvær av dehydroaskorbinsyre, jfr. D.F. Steiner og J.L. Clark, Proe. Nati. Mod. Sei. USA 60, 622-624 (1968); selv når det under de der beskrevne reaksjonsbetingelser fra dehydroaskorbinsyre dannes et Redox-system fra dehydroaskorbinsyre og askorbinsyre, dreier det seg der om oksydasjonen av redusert proinsulin med ube-skyttede S-grupper, mens det i foreliggende tilfelle ifølge oppfinnelsen dreier seg om bare insulinforprodukter som utgangsprodukter med beskyttede S-grupper. Den nevnte litteraturhenvisning til D.F. Steiner og J.L. Clark henviser ingen steder i retning av tilsetning og virkning av et organisk Redox-system ved rekombinasjon av insulinforløppro-dukter som inneholder S-beskyttelsesgrupper ved hjelp av merkaptaner.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforløper med formel I
hvor R1 = E,
en kjemisk eller enzymatisk avspaltbar aminosyre- eller peptidrest,
Rg = OH eller en aminosyre- eller peptidrest,
fortrinnsvis OH
X = en rest som forbinder insulin A- og B-kjeden,
fortrinnsvis en aminosyre- eller peptidrest,
Y = resten til en genetisk kodbar aminosyre,
fortrinnsvis Thr, Ala, Ser, spesielt Thr,
Z = resten til en genetisk kodbar aminosyre,
fortrinnsvis Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala eller Met, spesielt Asn,
A1-A20 og B1-B29 = umuterte eller ved utbytting av én eller flere aminosyrer muterte peptidsekvenser til insulin, fortrinnsvis de umuterte peptidsekvensene til human-, svine- eller okseinsulin, spesielt human- eller svineinsulin, ved omsetning av et forprodukt med beksyttede Cys-S-grupper og et merkaptan i vandig medium,
kjennetegnet ved at man omsetter et forprodukt med beskyttede Cys-S-grupper med formel II
hvori Rlt R2, X, Y, Z, A1-A20 og B1-B29 har samme betydning som i formel I og
R3 = en Cys-S-beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis -S03"-gruppe, med et merkaptan i en mengde som tilsvarer et (merkaptan)-SH/Cys-S-R3 (i formel II)-forhold på 10 til 30, en pH-verdi mellom 9,5 og 11, i nærvær av et organisk redoks-system eller minst en organisk forbindelse, som under reaksjonsbetingelsene danner et slikt organisk redoks-system, valgt fra gruppen askorbinsyre, dehydroaskorbinsyre, brenzkatechin, o-chinon, hydrochinon og p-chinon, i det man tilsetter merkaptanet og forbindelsen (ene) som danner det organiske redoks-systemet i et forhold på 1 gammaekvivalent merkaptan til 1/10 til 10 mol av forbindelsen (ene) som danner det organiske redoks-systemet.
Når R-^ = H i formel I og II, dreier det seg om proinsulin, hhv. proinsulinavledede produkter. Når R^ = kjemisk eller enzymatisk avspaltbar aminosyre- eller peptidrest, dreier det seg om preproinsulin samt produkter avledet derfra.
Kjemisk avspaltbare aminosyrerester er slike som f.eks. ved hjelp av BrCN eller N-bromsuksinimid blir avspaltet, disse er f.eks. metionin (Met) eller tryptofan (Trp).
Enzymatisk avspaltbare aminosyrerester er slike som f.eks. kan bli avspaltet ved hjelp av trypsin (som f.eks. Arg eller Lys).
Kjemisk eller enzymatisk avspaltbare peptidrester er peptidrester med minst 2 aminosyrer.
Samtlige aminosyrer som vedrører R^ er fortrinnsvis fra gruppen av naturlige aminosyrer, hovedsakelig Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit og His.
R2 er OH eller - som R^ - likeledes en aminosyre- eller peptidrest, hvor betydningen OH er foretrukket. Aminosyrene (som består av minst 2 aminosyrerester som danner peptidrester) stammer - som i R^ - fortrinnsvis av gruppen av de naturlige aminosyrene.
X er en insulin-A og -B-kjede bindende rest, fortrinnsvis en aminosyre- eller peptidrest.
Når X er en aminosyrerest, er en rest av Arg eller Lys foretrukket, når X er en peptidrest er resten av et naturlig forekommende C-peptid, spesielt humant-, svine- eller okseinsulin-C-peptider foretrukket.
Genteknisk kodbare aminosyrer er for Y (i L-form): Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.
Foretrukne genetisk kodbare aminosyrer er Thr, Ala og Ser, spesielt Thr.
Z kan - som Y - bety resten av en genetisk kodbar aminosyre, men her er Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala og Met, spesielt Asn, foretrukket.
Al - A20 og Bl - B29 kan i prinsippet være de umuterte eller gjennom utbytting av en eller flere aminosyrer muterte peptidsekvenser alle mulige insuliner, mutantene kan bekreftes ifølge kjente genteknologiske fremgangsmåter (seterettet mutagenese). De umuterte peptidsekvensene til human-, svine- eller okseinsulin, spesielt human- eller svineinsulin (Al - A20 og Bl - B29-sekvensene til human- og svineinsulin er identiske).
Resten R3 som bare forekommer i formel II, betyr en praktisk hvilken som helst Cys-S-beskyttelsesgruppe, derimot fortrinnsvis -S03~- eller tert.-butyl-gruppe, hvor -S03~-gruppen her har en noe større betydning.
Som utgangsprodukt kan formel II i prinsippet bli tilsatt i et vidt konsentrasjonsområde, hensiktsmessig mellom omtrent 10 pg og 10 mg/ml oppløsning, hvor som kjent lavere konsentrasjoner fører til høyere renatureringsutbytte, idet lavere proteinkonsentrasjoner blir aggregasjonstendens redusert. Foretrukne konsentrasjoner ligger mellom omtrent 0,1 mg og 0,5 mg/ml.
Som merkaptaner kommer for omsetningen ifølge oppfinnelsen i prinsipp alle mulige organiske forbindelser med SH-grupper i betraktning, merkaptoetanol, tioglykolsyre, ditioerytrit, ditioerytritol, glutation og cystein, spesielt merkaptoetanol og cystein er foretrukket. Merkaptanene kan bli tilsatt enkeltvis eller i blanding.
Merkaptan-mengden er tilmålt på en slik måte at forholdet mellom SH-gruppene og Cys-SRs-gruppene til utgangsmaterialene med formel II om mulig ligger over 5.
Ovenfor er dette forholdet nesten bare begrenset av øko-nomiske overveielser og en øvre grense på omtrent 100 er hensiktsmessig. Et forhold på omtrent 10-50, spesielt omtrent 10-30, er foretrukket. Merkaptankonsentrasjonen i reaksjons-tilsetningen retter seg da inn etter mengden av det tilsatte utgangsmaterialet med formel II og det valgte SH/Cys-SR3~ forholdet.
Organiske Redox-systemer er fortrinnsvis forbindingspar hvis ene komponent er en organisk forbindelse med strukturelement med formel III
eller en aromatisk o- eller p-dihydroksyforbindelse og hvis andre komponent er en organisk forbindelse med strukturele-
ment med formel III i oksydert form = strukturelement med formel III'
eller en o- eller p-kinon.
De frie valensene til strukturelementene med formel III, henholdsvis III', kan bli avmettet med hydrogen eller organiske grupper som f.eks. C^-C^alkylgrupper. Strukturelementet kan derimot også være del av en ring med fortrinnsvis 4,5 eller 6 C-ring-atomer, samt eventuelt enda ett eller to heteroatomer som f.eks. 0, hvor ringen videre kan være substituert med under reaksjonsbetingelsene inerte grupper som f.eks. alkyl- eller hydroksyalkylgrupper.
Eksempler på forbindelser med strukturelementet med formel III er:
Formlene er her bare beskrevet i den ene tautomere formen.
Samtlige forbindelser er reduserte. I den oksyderte formen blir fra strukturelement med formel III til formel III'.
Aromtiske o- og p-dihydroksyforbindelser omfatter i prinsippet alle mulige aromatiske forbindelser med to OH-grupper i o- eller p-posisjon, hvor det bare er nødvendig at o-henholdsvis p-kinon-dannelsen fra o- og p-dihydroksyfor-bindelsene ikke må være forhindret av noen spesielle sub-stituenter el.l. Eksempler på aromatiske o- og p-dihydroksyforbindelser er
1,2-dihydroksybenzen = brenzkatekin
1,4-dihydroksybenzen = hydrokinon,
metyl-hydrokinon, nafto-hydrokinon-1,4 og
antra-hydrokinon; hvorved oksydasjonen oppstår i de tilsvarende kinonene.
Ved omsetningen ifølge oppfinnelsen kan nå de organiske Redox-systemene, bestående f.eks. fra forbindelsesparene askorbinsyre + dehydroaskorbinsyre, benzkatekin + o-kinon, hydrokinon + p-kinon, naftohydrokinon + naftokinon, osv. i praktiske forhold (fortrinnsvis i omtrent ekvimolare forhold) bli tilsatt. Det er derimot også mulig å bare tilsette enkeltkomponentene av disse forbindelsesparene, også f.eks. bare askorbinsyre eller bare dehydroaskorbinsyre eller bare hydrokinon osv. - på grunn av at det i reaksjonsmediumet blir dannet de til Redox-forbindelsesparet hørende andre kom-ponenter (dehydroaskorbinsyre hhv. askorbinsyre hhv. p-kinon).
Foretrukne organiske Redox-systemer er de ut fra forbindelsesparene
askorbinsyre + dehydroaskorbinsyre,
brenzkatekin + o-kinon og
hydrokinon + p-kinon
bestående kombinasjoner
og foretrukne enkeltforbindelser som under reaksjonsbetingelsene danner et slikt Redox-system, er enkeltkomponentene av disse forbindelsesparene.
Spesielt foretrukket er askorbinsyre og/eller dehydroaskorbinsyre .
De tilsatte mengdene av den organiske Redox-system-dannende forbindelsen(e) kan bli variert innenfor vide grenser. Med hensyn på et gramekvivalent merkaptan (= molekylvekten til tilsatt merkaptan i g/tall av SH-gruppen i merkaptan-molekylet), kan moltallet til den organiske Redox-systemdan-nende forbindelsen(e) bli valgt mellom omtrent 1/10.000 og 10.000, fortrinnsvis mellom omtrent 1/10 og 10.
Omsetningen ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført i alkalisk pH-område, fortrinnsvis mellom omtrent 7 og 12, spesielt mellom omtrent 9,5 og 11. For opprettholdelse av den ønskede pH-verdien er det nødvendig med tilsetning av en bufferforbindelse, hvor typen og ionestyrken til bufferen har en viss innflytelse på foldingsutbyttet. Det er fordelaktig å holde ionestyrken lav, og et område på omtrent 1 mM (mM = millimolar) til 1 M (M = molar), spesielt på omtrent 5 mM til 50 mM er foretrukket. Som bufferforbindelser kan f.eks. boratbuffer, karbonatbuffer eller glysinbuffer bli anvendt, idet sistenevnte er foretrukket.
Som generelt område for reaksjonstemperaturen kan en mellom omtrent 0 og 4 5°C anvendes og foretrukket er et område på omtrent 4 til 80C.
Bedekking av renatureringsoppløsningen med bestemte gasser som f.eks. oksygen, nitrogen eller helium har ingen merkbar innflytelse på renatureringsutbyttet.
Omsetningstiden ligger generelt mellom omtrent 2 og 24 timer, foretrukket er mellom omtrent 6 og 16 timer.
Etter avsluttet omsetning (som f.eks. kan bestemmes ved HPLC) blir dette opparbeidet på kjent måte, som f.eks. beskrevet i EP-B-00 37 255.
Det "riktig" foldede produktet med formel I kan deretter enzymatisk eller kjemisk bli overført ifølge kjent teknikk til tilsvarende insulin.
De følgende eksemplene forklarer oppfinnelsen ytterligere og tydeliggjør fordelene ifølge teknikkens stand.
Som utgangsmateriale for renatureringseksperimentene ble preproinsulin-S-S03~ anvendt, og dette ble isolert ifølge genteknologiske teknikker.
Som ekspresjonssystem ble E.coli anvendt. I E. coli er genet for proinsulin koblet med en del av e-galaktosidasegenet og blir syntetisert som fusjonsprotein som faller ut i cellen og som blir avleiret på "polkapper") ifølge fremgangsmåten i DE-Å-38 05 150). Etter oppslemming av cellene, blir fusjons-proteindelen avspaltet ved hjelp av halogencyan ifølge fremgangsmåten i DE-A34 40 988) og til slutt underkastet oksidativ sulfittolyse (R.C. Marshall og A.S. Ingles i A.
Darbre (Hrsg. ) "Practical Protein Chemistry - A Handbook"
(1986), s.49-53), for å overføre de 6 cysteinene til deres S-sulfonatform. Det på denne måten fremstilte preproinsulin-S-S03~ (forstavelsen "pre" betyr at proinsulinet er forlenget med 5 aminosyrer ved den N-terminale enden) blir deretter anriket ved hjelp av ionebytter på i seg selv kjent måte og utfelt og frysetørket. Det oppnådde frysetørkede utgangsmaterialet har ifølge HPLC-bestemming et innhold på 60%.
1. Avhengigheten av foldingsutbyttet på
merkaptan/askorbinsyre-forholdet.
Preproinsulin-S-SOø (605é) blir løst i enkonsentrasjon av
0,33 mg/ml i 20 mM glycinbuf fer, pH 10,5, som tilsvarer en preproins"ulin-S-S03~-konsentrasjon på 0,2 mg/ml. Pr. blanding blir det tilsatt 20 ml, samt 480 pl av en 0,1 M cysteinopp-løsning (~20 ganger molart overskudd pr. S-S03~-gruppe) og mellom 0 og 480 pl av en 0,1 M askorbinsyreoppløsning. Renatureringstemperaturen er på 8°C, og reaksjonen varer i 16 timer.
Dette eksemplet viser innflytelsen av Redox-forbindelsen på foldingsutbyttet. På grunn av at det i blandingen uten askorbinsyre overveiende fører til dannelsen av proteiner som ikke er foldet riktig, stiger foldeingsutbyttet i nærvær av Redox-forbindelsen.
2. Avhengighet av foldingsutbyttet på
merkaptan/askorbinsyreoverskuddet
De tilveide mengdene, volumene, bufferen, reaksjonstiden og pH-verdien tilsvarer de i forsøk 1. Det blir tilsatt ekvimolare mengder av cystein og askorbinsyre, idet det molare overskuddet pr. S-SC>3_-gruppe ligger mellom 2,5 og 100.
Dette eksemplet viser at når man overskrider en bestemt merkaptan-minstemengde, er foldingsutbyttet i et stort område stort sett uavhengig av merkaptanoverskuddet.
3. Avhengighet av foldingsutbyttet på pH-verdien.
De innveide mengdene, volumene, bufferkonsentrasjonen, reaksjonstiden og temperaturen tilsvarer forsøk 1. I forsøket blir 480 pl 0,1 M cysteinoppløsning og 480pl 0,1 M askorbin-syreoppløsning tilsatt (~20 ganger molart overskudd pr. S-S03_-gruppe)
4. Avhengighet av foldingsutbyttet på merkaptantypen. Den innveide mengden, volumene, bufferkonsentrasjonen, reaksjonstiden og -temperaturen og pH-verdien tilsvarer forsøk 1. I forsøket blir det hver gang tilsatt 480 pl av den tilsvarende 0,1 M merkaptanoppløsningen og 480 pl 0,1 M askorbinsyreoppløsning (~20 ganger molart overskudd pr. S-S03_-gruppe) 5. Avhengighet av foldingsutbytte på bufferforbindelsen og ionestyrken til bufferen.
Den innveide mengden, volumene, reaksjonstiden og temperaturen og pH-verdien tilsvarer forsøk 1. I forsøket blir det hver gang tilsatt 480 pl av den tilsvarende 0,1 M merkaptan-oppløsningen og 480 pl 0,1 M askorbinsyreoppløsning (~20 ganger molart overskudd pr. S-S03~-gruppe).
6. Avhenighet av foldingsutbytte på
reaksjonstiden.
Den innveide mengden, volumene, bufferkonsentrasjonen, pH-verdien og reaksjonstemperaturen er det samme som i forsøk 1. Det blir hver gang tilsatt 480 pl av en 0,1 M merkaptoetanol-oppløsning og 480 pl av en 0,1 M askorbinsyreoppløsning (~20 ganger molart overskudd pr. S-S03~-gruppe).
7. Avhengighet av foldingsutbyttet på
preproinsulin S-sulf onat-konsentrasj on
Volumer, buffersammensetning, pH-verdi, reaksjonstid og temperatur tilsvarer forsøk 1. Til den tilsatte preproin-sul in-S-sulf onatmengden blir det tilsatt så mye av en merkaptoetanolstamoppløsning og askorbinsyrestamoppløsning at et ~20 ganger molart overskudd oppstår pr. S-S03~-gruppe.
8. Avhengighet av foldingsutbytte på askorbinsyre/mer-
kaptoetanoloverskuddet i modifisert utgangsmateriale Et forløpermolekyl tilsettes hvor A-og B-kjeden til insulinet er koblet med arginin. Den genteknologiske isoleringen av dette molekylet følger som beskrevet i begynnelsen av forsøksbeskrivelsen. Det frysetørkede materialet har et innhold på 60% og blir løst med en konsentrasjon på 0,5 mg/ml i 20 mM glycinbuffer, pH 10,5, som tilsvarer en forløperkon-sentrasjon på 0,3 mg/ml. Reaksjonstiden og -temperaturen tilsvarer forsøk 1 og det molare overskuddet av askorbinsyre/merkaptanblandingen varierer mellom 2,5 og 50 ganger. 9. Avhengighet av foldingsutbyttet for Redox-systemet Innveid mengde, volumer, buffersammensetning, pH-verdi, reaksjonstiden og -temperaturen tilsvarer forsøk 1. Det blir tilsatt en ~20 ganger molart overskudd av merkaptoetanol/S-S03_-gruppe og et 20 ganger molart overskudd av de tilsvarende Redox-partnerne.
Foldingsutbyttet til preproinsulin-S-S03 blir løst opp i 20 mM glycinbuffer, pH 10.8, 250 ml buffer, 0.2 mg prepro-insul in-S-S03/ml buffer ved omtrent 25°C. Forskjellige mengder av overskudd av merkaptan og askorbinsyre ifølge følgende tabell blir anvendt i reaksjonsoppløsningen. Reaksjonsoppløsningen blir omrørt i et åpent glass.
Følgende tabell viser resultatene
Foldingsutbyttet ble bestemt i følgende høytrykksvæske-kromatograf isystem:
kolonne waters C-^; 5 pm; fluks 1.5 ml/min; deteksjon ved 210 nm, gradient fra 28% til 40% buffer B i løpet av 41 minutter.
Resultatene viser sammenlignet med Steiner et al. (Biochemistry, Vol 60, 1968, s 622 til 629 ) et overraskende høyere foldingsutbytte på kortere tid.
Det var overraskende at dette høyere utbyttet kunne bli oppnådd innenfor et pH område som er meget forskjellig fra de beste reaksjonsbetingelsene beskrevet av Steiner et al.
Claims (3)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforløper med formel I
hvor Ri = H,
en kjemisk eller enzymatisk avspaltbar aminosyre- eller peptidrest,
Rg = OH eller en aminosyre- eller peptidrest,
fortrinnsvis OH
X = en rest som forbinder insulin A- og B-kjeden,
fortrinnsvis en aminosyre- eller peptidrest, Y = resten til en genetisk kodbar aminosyre,
fortrinnsvis Thr, Ala, Ser, spesielt Thr, Z = resten til en genetisk kodbar aminosyre,
fortrinnsvis Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala eller Met, spesielt Asn,
A1-A20 og B1-B29 = umuterte eller ved utbytting av én
eller flere aminosyrer muterte peptidsekvenser til insulin, fortrinnsvis de umuterte peptidsekvensene til human-, svine- eller okseinsulin, spesielt human- eller svineinsulin, ved omsetning av et forprodukt med beksyttede Cys-S-grupper og et merkaptan i vandig medium,
karakterisert ved at man omsetter et forprodukt med beskyttede Cys-S-grupper med formel II
hvori R-^ , R2 , X, Y, Z, A1-A20 og B1-B29 har samme betydning som i formel I og
R3 = en Cys-S-beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis -SC>3_-gruppe, med et merkaptan i en mengde som tilsvarer et (merkaptan)-SH/Cys-S-R3 (i formel II)-forhold på 10 til 30, en pH-verdi mellom 9,5 og 11, i nærvær av et organisk redoks-system eller minst en organisk forbindelse, som under reaksjonsbetingelsene danner et slikt organisk redoks-system, valgt fra gruppen askorbinsyre, dehydroaskorbinsyre, benzkatekin , o-chinon, hydrochinon og p-chinon, i det man tilsetter merkaptanet og forbindelsen (ene) som danner det organiske redoks-systemet i et forhold på 1 gammaekvivalent merkaptan til 1/10 til 10 mol av forbindelsen (ene) som danner det organiske redoks-systemet.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som merkaptan anvender merkaptoetanol og/eller cystein.
3.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 2, karakterisert ved at man arbeider i nærvær av askorbinsyre og/eller dehydroaskorbinsyre.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3901719A DE3901719A1 (de) | 1989-01-21 | 1989-01-21 | Verfahren zur herstellung eines insulinvorlaeufers |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO900278D0 NO900278D0 (no) | 1990-01-19 |
| NO900278L NO900278L (no) | 1990-07-23 |
| NO178861B true NO178861B (no) | 1996-03-11 |
| NO178861C NO178861C (no) | 1996-06-19 |
Family
ID=6372512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO900278A NO178861C (no) | 1989-01-21 | 1990-01-19 | Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforlöper |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0381958B1 (no) |
| JP (1) | JPH02233699A (no) |
| AT (1) | ATE126808T1 (no) |
| AU (1) | AU624894B2 (no) |
| CA (1) | CA2008245A1 (no) |
| DE (2) | DE3901719A1 (no) |
| DK (1) | DK0381958T3 (no) |
| ES (1) | ES2078249T3 (no) |
| FI (1) | FI900296A0 (no) |
| GR (1) | GR3017591T3 (no) |
| HU (1) | HU208704B (no) |
| IE (1) | IE900217L (no) |
| IL (1) | IL93115A (no) |
| NO (1) | NO178861C (no) |
| NZ (1) | NZ232178A (no) |
| PT (1) | PT92907B (no) |
| ZA (1) | ZA90396B (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3901718A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur renaturierung falscher rekombinanten von insulinvorlaeufern |
| ES2119779T3 (es) * | 1990-09-05 | 1998-10-16 | Southern Cross Biotech Pty Ltd | Solubilizacion de proteinas en formas activas. |
| EP0600372B1 (de) * | 1992-12-02 | 1997-02-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| JP4624495B2 (ja) * | 1994-12-29 | 2011-02-02 | フェリング・インターナショナル・センター・エス．・エー． | ヒト・インスリンの生成 |
| KR100253916B1 (ko) * | 1997-12-29 | 2000-05-01 | 김충환 | 사람 인슐린 전구체의 제조방법 |
| JP2003530316A (ja) | 1999-12-22 | 2003-10-14 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | スクランブルした一本鎖ポリペプチドの抽出的再生法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RO81951B (ro) * | 1980-03-27 | 1984-02-28 | Eli Lilly And Company | Procedeu de preparare a unui precursor de insulina |
| DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
| DE3901718A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur renaturierung falscher rekombinanten von insulinvorlaeufern |
-
1989
- 1989-01-21 DE DE3901719A patent/DE3901719A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-17 DK DK90100889.6T patent/DK0381958T3/da active
- 1990-01-17 AT AT90100889T patent/ATE126808T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-17 EP EP90100889A patent/EP0381958B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-17 ES ES90100889T patent/ES2078249T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-17 DE DE59009540T patent/DE59009540D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-18 FI FI900296A patent/FI900296A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-01-19 NO NO900278A patent/NO178861C/no unknown
- 1990-01-19 HU HU90197A patent/HU208704B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-01-19 NZ NZ232178A patent/NZ232178A/xx unknown
- 1990-01-19 IE IE900217A patent/IE900217L/xx unknown
- 1990-01-19 JP JP2008568A patent/JPH02233699A/ja active Pending
- 1990-01-19 PT PT92907A patent/PT92907B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-01-19 AU AU48621/90A patent/AU624894B2/en not_active Ceased
- 1990-01-19 ZA ZA90396A patent/ZA90396B/xx unknown
- 1990-01-19 IL IL9311590A patent/IL93115A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-01-22 CA CA002008245A patent/CA2008245A1/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-09-29 GR GR950402704T patent/GR3017591T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL93115A0 (en) | 1990-11-05 |
| NO900278L (no) | 1990-07-23 |
| ES2078249T3 (es) | 1995-12-16 |
| NO900278D0 (no) | 1990-01-19 |
| HU900197D0 (en) | 1990-03-28 |
| PT92907B (pt) | 1995-12-29 |
| NO178861C (no) | 1996-06-19 |
| NZ232178A (en) | 1991-10-25 |
| GR3017591T3 (en) | 1995-12-31 |
| JPH02233699A (ja) | 1990-09-17 |
| AU4862190A (en) | 1990-07-26 |
| CA2008245A1 (en) | 1990-07-21 |
| EP0381958A2 (de) | 1990-08-16 |
| IL93115A (en) | 1995-07-31 |
| HU208704B (en) | 1993-12-28 |
| DE3901719A1 (de) | 1990-07-26 |
| DE59009540D1 (de) | 1995-09-28 |
| ATE126808T1 (de) | 1995-09-15 |
| PT92907A (pt) | 1990-07-31 |
| FI900296A0 (fi) | 1990-01-18 |
| AU624894B2 (en) | 1992-06-25 |
| IE900217L (en) | 1990-07-21 |
| ZA90396B (en) | 1990-09-26 |
| EP0381958B1 (de) | 1995-08-23 |
| DK0381958T3 (da) | 1995-12-18 |
| HUT54389A (en) | 1991-02-28 |
| EP0381958A3 (de) | 1991-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5986048A (en) | Process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges | |
| US4421685A (en) | Process for producing an insulin | |
| US5352769A (en) | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence | |
| US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
| NO179587B (no) | Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog og mellomprodukt | |
| KR880001107B1 (ko) | 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 | |
| NO178861B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforlöper | |
| FI79853B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| Guiard et al. | Complete amino acid sequence of the heme-binding core in bakers' yeast cytochrome b2 (L-(+)-lactate dehydrogenase) | |
| McDermott et al. | The disulfide content of calf γ-crystallin | |
| WO2009133529A2 (en) | Processes for refolding of insulin | |
| EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| DK1735343T3 (en) | A process for recovering insulin USING IMPROVED LUFTGASNING of the fold | |
| DK154573B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende praeproinsulinanaloge | |
| EP0037256B1 (en) | Process for producing an insulin | |
| AU628473B2 (en) | Process for renaturing incorrect recombinants of insulin precursors | |
| Villa et al. | Expression in Escherichia coli and characterization of human growth‐hormone‐releasing factor | |
| VÉRTESY et al. | Disulphide bridge formation of proinsulin fusion proteins during secretion in Streptomyces | |
| MXPA98006666A (en) | Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni |