HU208704B

HU208704B - Process for producing insuline precurzor

Info

Publication number: HU208704B
Application number: HU90197A
Authority: HU
Inventors: Michael Doerschug
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-01-21
Filing date: 1990-01-19
Publication date: 1993-12-28
Also published as: IL93115A0; NO900278L; ES2078249T3; NO900278D0; HU900197D0; PT92907B; NO178861C; NO178861B; NZ232178A; GR3017591T3; JPH02233699A; AU4862190A; CA2008245A1; EP0381958A2; IL93115A; DE3901719A1; DE59009540D1; ATE126808T1; PT92907A; FI900296A0

Description

A találmány tárgya eljárás inzulin-prekurzor előállítására valamely szerves redox-rendszer jelenlétében.

Az inzulin molekula 2 polipeptidláncból áll, melyek diszulfidhídakkal kapcsolódnak egymáshoz. Az A-lánc 21, a B-lánc 30 aminosavból áll. Ezeket a láncokat a prekurzor-molekulában - a proinzulinban - a C-peptid kapcsolja össze. A humán-proinzulinban a C-peptid 35 aminosavból álló A-C-peptidet a hormon érési folyamata során specifikus proteázok ha le és így a proinzulin inzulinná alakul. (Davidson és tsai., Natúré 333, 93-96, 1988). A természetben előforduló Cpeptidek mellett az irodalom számos kötési lehetőséget ismertet az Α-lánc és a B-lánc között [Yanaihare és tsai., Diabetes 27, 149-160, (1978), Busse és tsai., Biochemistry 75, 1649-1657 (1971), Geiger és tsai., Biochem. Biophys. Rés. Com. 55,60-66 (1973)].

Ma már a géntechnológia révén lehetőség van arra, hogy géntechnikailag átalakított mikroorganizmusokból inzulint állítsanak elő. Ha mikroorganizmusként E. coli-t alkalmaznak, a terméket gyakran fúziósproteinként exprimálják; vagyis a terméket baktériummal összeférő proteinnel, pl. a β-galaktozidázzal kapcsolják. Ez a fúziósprotein a sejtben kicsapódik, így védve van a proteolitikus leépüléstől. A sejt feltárása után a fúziősprotein-részt kémiailag vagy enzimatikusan lehasítják és az inzulinprekurzor 6 ciszteinjét oxidatív szulfitolízissel S-szulfonáttá (-S-SO3-) alakítják. Ebből az úgynevezett preproinzulin-S-szulfonátból a következő lépésben, 3 megfelelő diszulfidhíd-képzés közben natív preproinzulint állítanak elő, melynek során az EP-B-0037255 sz. szabadalmi dokumentumban leírt eljárást követve a kiindulási S-szulfonátot annyi merkaptánnal reagáltatják, hogy egy SSO₃“-csoportra 1-5 SH-csoport jusson; az eljárást vizes közegben hajtják végre 7-11,5 közötti pH érték mellett, legfeljebb 10 mg S-szulfonát/10 ml vizes közeg koncentrációval, előnyösen oxidálószer távollétében.

Annak érdekében, hogy a diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozama - vagyis a „helyes” peptidszekvencia-kapcsolásokat (A6-A11, A7-B7 és A20B19 S-S-hidak) tartalmazó preproinzulin hozama nagy legyen, a megadott szorosan behatárolt - SH/SSOf arányokat meg kell tartani, ami az eljárás kivitelezésénél és különösen az SSO₃ ^_-csoportok kvantitatív - nem túl egyszerű - meghatározásánál jelentős gondosságot követel.

Kutatásaink során azt tapasztaltuk; hogy - gyakorlatilag függetlenül az SH/SSO₃“-aránytól, széles határokon belül - a diszulfidhíd kiépítésére irányuló reakció hozama nagy lesz, ha magasabb - azaz 5:1 feletti - SH/SSO₃“arány mellett dolgozunk egy szerves redox-rendszer vagy olyan vegyületek jelenlétében, melyek a reakciófeltételek között ilyen szerves redox-rendszert képeznek; a megfelelő kiindulási anyagban az SSO₃“-csoportok helyett más S-védőcsoportok is lehetnek; ezenfelül az inzulin A- és -B-lánc peptidszekvenciáit egy vagy több aminosav cseréjével meg lehet változtatni.

A magasabb SH/SSO₃“ - (illetve S-védőcsoportok)arány azt jelenti, hogy - amennyiben csak egy meghatározott legkisebb merkaptán-mennyiséget lépünk túl gyakorlatilag függetlenül a merkaptán-felesleg nagyságától a hozam jelentős csökkenése nélkül tudunk dolgozni; ezzel feleslegessé válik, hogy a megfelelő inzulin kiindulási anyagban az SSO₃~ - (illetve S-védő-) csoportokat egzakt módon, kvantitatíve meghatározzuk; ami az eljárást lényegesen előnyösebbé változtatja·

A merkaptán-felesleg nagyságától lényegében függetlenül valamely szerves redox-rendszer, illetve a reakció feltételei között ilyen szerves redox-rendszert képző vegyületek jelenlétében járunk el.

Ismeretes, hogy redukált proinzulint - azaz olyan proinzulint, melynek S-S-hídjait pl. merkaptánnal SHcsoportokká hasítják - az eredeti proinzulinná vissza lehet oxidálni, és ezt az oxidációt dehidroaszkorbinsav jelenlétével gyorsítják - 1. D. F. Steiner és J. L. Clark, Proc. Natl. Mód. Sci. USA 60, 622-624 (1968) - ha a megjelölt irodalmi helyen leírt reakciófeltételek között a dehidroaszkorbinsavból olyan redox-rendszer képződik, mely dehidroaszkorbinsavból és aszkorbinsavból áll, ebben az esetben is a védtelen S-csoportokkal rendelkező redukált proinzulin oxidációjáról van szó, miközben a találmányunk szerinti esetben kiindulási anyagként csak védett S-csoportokkal rendelkező inzulin-előtermékek jönnek számításba. Az említett irodalmi hely semmiféle utalást vagy javaslatot nem tartalmaz szerves redox-rendszer alkalmazására és hatására

S-védőcsoportokat tartalmazó inzulin-prekurzor-termékek merkaptánok révén való rekombinációjánál.

A találmány tárgya eljárás (I) általános képletű inzulin-prekurzor előállítására - a képletben R¹ jelentése hidrogénatom, kémiailag vagy enzimatikusan lehasítható aminosav- vagy peptidmaradék, R² jelentése OH-csoport vagy aminosav- vagy peptidmaradék, előnyösen OH-csoport,

X jelentése az inzulin-A- és -B-láncokat összekötő csoport, előnyösen aminosav- vagy peptidmaradék, Y jelentése valamely genetikusán kódolható aminosavmaradék, előnyösen Thr, Alá, Ser, különösen

Thr,

Z jelentése valamely genetikusán kódolható aminosavmaradék, előnyösen Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Alá vagy Met, különösen Asn,

A1-A20 és Bl-B29 jelentése az inzulin nem-mutált, illetve egy vagy több aminosav-maradék cseréjével mutált peptidszekvenciái, előnyösen a humán-, sertés- vagy marhainzulin, különösen a humán- vagy sertésinzulin nem-mutált peptidszekvenciái -, oly módon, hogy egy védett Cys-S-csoportokkal rendelkező prekurzort vizes közegben valamely merkaptánnal átalakítunk; az eljárást az jellemzi, hogy (Π) általános képletű, védett Cys-S-csoportokkal rendelkező prekurzort - a képletben R¹, R², X, Υ, Ζ, A1-A20 és B1-B29 jelentése egyezik az (I) általános képletnél megadottakkal és

R³ jelentése Cys-S- védőcsoport, előnyösen -SO₃ ^-vagy terc-butil-csoport -, az 5-100 (merkaptán-)SH: 1 Cys-SR³ (II képletben) aránynak megfelelő mennyiségű merkaptánnal reagáltatunk olyan szerves redox-rendszer jelenlétében,

HU 208 704 Β amelynek egyik komponense a (III) képletű szerkezeti elemet tartalmazó szerves vegyület vagy egy aromás orto- vagy para-dihidroxi-vegyület, másik komponense a (III) képletű szerkezeti elemet a (IIP) képletnek megfelelő oxidált alakban tartalmazó szerves vegyület vagy egy aromás orto- vagy para-kinon, vagy pedig egyetlen, a reakciókörülmények között redox-rendszerré alakuló szerves vegyületből, éspedig a fenti meghatározásnak megfelelő vegyületpárok egyik komponenséből áll.

Ha az (I) és (II) általános képletű vegyületeknél H jelentése hidrogénatom, a vegyület proinzulin vagy a proinzulinból származó termék. Ha R¹ jelentése kémiailag vagy enzimatikusan lehasítható aminosavvagy peptidmaradék, a vegyület preproinzulin vagy az abból származó termék.

A kémiailag lehasítható aminosavmaradékok sorába azok tartoznak, amelyek pl. BrCN-dal vagy Nbróm-szukcinimiddel hasíthatok; ilyenek pl. a metionin (Met) vagy a triptofán (Trp).

Enzimatikusan lehasítható aminosavmaradékok például azok, amelyek tripszinnel hasíthatók (pl. Arg vagy Lys).

Kémiailag vagy enzimatikusan hasítható peptidmaradékok azok, melyek legalább 2 aminosavat tartalmaznak.

Az R¹ helyettesítőként szóba jöhető aminosavak előnyösen a természetes aminosavak csoportjából származnak, azaz főleg Gly, Alá, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Arg, Lys, Hyl, Om, Cit és His.

Az R² jelentése OH-csoport vagy - hasonlóan az R'-hez ugyancsak egy aminosav- vagy peptidmaradék, előnyben részesül az OH-csoport. Az aminosavak (azok is, amelyek a - legalább 2 aminosav-maradékból álló - peptidmaradékot képezik) előnyösen - mint az R'-nél - a természetes aminosavak csoportjából származnak.

Az X jelentése az inzulin-A- és -B-láncot összekötő csoport, előnyösen valamely aminosav- vagy peptidmaradék.

Ha X jelentése aminosavmaiadék, előnyben részesül az Arg vagy Lys; ha X jelentése peptidmaradék, ez célszerűen természetes peptid, különösen humán-, sertés- vagy marhainzulin-C-peptid.

Az Y jelentése szerinti genetikusán kódolható aminosavak (minden esetben L-formában) a következők: Gly, Alá, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.

Előnyös, genetikusán kódolható aminosavak a Thr, Alá és Ser, különösen Thr.

A Z jelentése - az Y-hoz hasonlóan - ugyancsak egy genetikusán kódolható aminosavmaradék lehet, melynél azonban előnyben részesülnek az Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Alá és Met, különösen az Asn.

A1-A20 és B1-B29 valamennyi lehetséges inzulin nem-mutált, illetve egy vagy több aminosav cseréjével mutált peptidszekvenciái lehetnek; a mutánsokat ismert géntechnológiai eljárásokkal (oldalról induló rautagenezissel) lehet előállítani. Előnyben részesülnek mégis a humán-, sertés- vagy marhainzulin nem-mutált peptid-szekvenciái (a humán- és sertésinzulin A1-A20 és -Bl-B29-szekvenciái azonosak).

A csupán a (II) általános képletben előforduló R³gyakorlatilag tetszés szerinti Cys-S-védőcsoportot jelent, előnyösek azonban az -SO3^_- vagy a terc-butilcsoportok, ezek közül is az -SO3'-csoport valamivel nagyobb jelentőségű.

A (II) általános képletű kiindulási termék lényegében széles - célszerűen 10 pg-10 mg/ml oldat - koncentráció-tartományban használható, ami mellett ismert módon a kisebb koncentrációk nagyobb renaturálási hozamhoz vezetnek, minthogy csekélyebb proteinkoncentrációnál csökken az aggregálódási hajlam. Az előnyös koncentrációk kb. 0,1 mg és 0,5 mg/ml között vannak.

A találmány szerinti átalakításhoz merkaptánként lényegében valamennyi lehetséges, SH-csoportot tartalmazó vegyület számításba vehető, célszerűen a merkaptoetanol, tioglikolsav, glutation és cisztein, különösen a merkaptoetanol és a cisztein. A merkaptánokat egyenként vagy keverékben lehet alkalmazni.

A merkaptán mennyiségét úgy kell meghatározni, hogy az SH-csoportok és a (II) általános képletű kiindulási anyagban lévő Cys-SR³-csoportok aránya lehetőleg 5:1 fölött, célszerűen 5-100:1 legyen.

Ennek az aránynak felső határát gyakorlatilag csak gazdasági megfontolások korlátozzák; célszerű, ha a felső határ kb. 100. Előnyös, ha az arány 10-50, különösen 10-30 között van. A reakcióelegy merkaptánkoncentrációját a (II) általános képletű kiindulási anyag és a megválasztott SH Cys-SR³-arány szabja meg.

Szerves redox-rendszerként előnyösen olyan vegyületpárok jönnek számításba, amelyek egyik komponense a (II) képletű szerkezeti elemet tartalmazó szerves vegyület vagy egy aromás o- vagy p-dihidroxi-vegyület, a másik komponense pedig a (ΠΙ) képletű szerkezeti elemet a (III*) képletnek megfelelő oxidált alakban tartalmazó szerves vegyület, vagy egy ο-, illetve p-kinon.

A (III), illetve (IIP) képletű szerkezeti elem szabad vegyértékeit hidrogénnel vagy szerves csoportokkal, mint pl. 1-4 szénatomos alkilcsoportokkal lehet telíteni. A szerkezeti elem egy gyűrű része is lehet, a gyűrű előnyösen 4, 5 vagy 6 szén-gyűrűatomot, valamint adott esetben még egy vagy két heteroatomot, mint pl. O-t is tartalmazhat, mimellett a gyűrű még - a reakciókörülmények között - inért csoportokkal, mint pl. alkil- vagy hidroxi-alkilcsoporttal szubsztituált lehet.

A (III) képletű szerkezeti elemet tartalmazó vegyületek például a következők:

redukton (Illa) képlet reduktinsav (Illb) képlet metil-reduktinsav (lile) képlet aszkorbinsav (C vitamin) (Ilid) képlet dehidroaszkorbinsav (lile) képlet.

A képleteket itt csak egy tautomer alakban adtuk meg.

HU 208 704 B

Valamennyi vegyület redukálható hatású. Az oxidált alakban a (III) képletű szerkezeti elem a (IIP) képletű formává alakul.

Aromás o- és p-dihidroxi-vegyületekként lényegében minden lehetséges, az o- vagy p-helyzetben OHcsoportot tartalmazó aromás vegyület szóba jöhet, miközben még az is követelmény, hogy az o- és p-dihidroxi-vegyületekből az ο-, illetve p-kinon képződését bármilyen sajátos szubsztituens vagy hasonló ne befolyásolja. Aromás o- és p-dihidroxi-vegyületek például a következők:

1,2-dihidroxi-benzol=pirokatatechin

1,4-dihidroxi-benzol = hidrokinon, metil-hidrokinon, nafto-hidrokinon-1,4 és antrahidrokinon; az oxidációnál ezekből a megfelelő kinonok keletkeznek.

A találmány szerinti reakciónál a mindenkori szerves redox-rendszert lehet alkalmazni, gyakorlatilag tetszés szerinti arányban (előnyösen mintegy ekvimolekuláris arányban), e rendszerek pl. a következő vegyületpárok lehetnek: aszkorbinsav + dehidroaszkorbinsav, pirokatechín + o-kinon, hidrokinon + p-kinon, nafto-hidrokinon + naftokinon. Az is lehetséges azonban, hogy e vegyületpároknak csak egyes komponenseit alkalmazzuk - tehát pl. csak aszkorbinsavat vagy csak dehidroaszkorbinsavat vagy csak hidrokinont stb. -, mivel a reakcióközegben a redox-vegyületpárhoz tartozó másik komponens (dehidroaszkorbinsav, illetve aszkorbinsav, illetve p-kinon) is képződik.

Előnyös szerves redox-rendszereknek minősülnek a vegyületpárok közül az alábbiak:

aszkorbinsav + dehidroaszkorbinsav, pirokatechín + o-kinon és hidrokinon + p-kinon, előnyösek továbbá azok az egyes vegyületek, melyek a reakciófeltételek között képződő redox-rendszerek, azaz vegyületpárok egyik komponensei. Különösen előnyben részesülnek az aszkorbinsav és/vagy a dehidroaszkorbinsav.

A szerves redox-rendszert képző vegyület(ek) mennyiségét széles határok között lehet változtatni. Egy grammekvivalens merkaptánra számítva (= az alkalmazott merkaptán molekulasúlya grammban/a merkaptán-molekula SH-csoportjainak száma) a szerves és redox-rendszert képző vegyület(ek) mólszáma kb. 1/10000 és 10000, előnyösen kb. 1/10 és 10 között lehet.

A találmány szerinti reakciót célszerűen alkalikus pH-tartományban, előnyösen 7 és 12, különösen mintegy 9,5 és 11 közötti pH-értéken hajtjuk végre. A kívánt pH-érték fenntartására célszerűen pufferanyagot alkalmazunk, a puffer fajtája és ionerőssége bizonyos hatással van a diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamára. Előnyös, ha az ionerősséget csekély szinten tartjuk, ennek érdekében előnyben részesül egy kb. 1 mM és 1 M közötti, különösen kb. 5 és 50 mM közötti érték. Pufferként pl. borát-, karbonát- vagy glicinpuffert alkalmazunk, ez utóbbi előnyben részesül.

Reakció-hőmérsékletként általánosságban a 0 és °C közötti terület adható meg, előnyösek a 4 és 8 °C közötti értékek:

A renaturáló oldat gázokkal, mint pl. oxigénnel, nitrogénnel vagy héliummal való felülrétegezésének nincs figyelembevehetó befolyása a renaturálás hozamára.

Az átalakítás időtartama általában kb. 2 és 24 óra, előnyösen kb. 6 és 16 óra között van.

Az átalakulás befejezése után (ezt pl. HPLC révén lehet megállapítani) a terméket ismert módon dolgozzuk fel, pl. úgy, ahogy a bevezetőben említett EP-B0037255 sz. szabadalmi dokumentumban leírtak szerint járnak el.

Az (I) általános képletű termékből, melynél a diszulfidhídat „helyesen” alakítottuk ki, ismert módszerek szerint, enzimatikusan vagy kémiailag a megfelelő inzulint nyerhetjük.

A következő példák találmányunk további részleteire mutatnak rá, egyúttal megvilágítják a technika állásához képest mutatkozó előnyöket.

Expressziós-rendszerként E. coli-t alkalmazunk. A proinzulinhoz vezető gént a β-galaktozidáz-gén egy részével kapcsoljuk és fúziósproteinként szintetizáljuk, ami a sejtben kicsapódik (a DE-A-3 805 150 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat szerinti eljárásnak megfelelően). A sejt feltárása után a fúziósproteinrészt halogén-cianiddal, lehasítjuk (követve a DE-A3 440988 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat szerinti eljárást) és végül oxidatív szulfitolízisnek vetjük alá [R. C. Marshall és A. S. Ingles - A. Darbre „Practical Protein Chemistry - A Hand book” (1986), 49-53. old.], hogy a 6 cisztein S-szulfonátját megkapjuk. Az így előállított preproinzulin-S-SO₃-t (a „pre” előtag azt jelenti, hogy a proinzulin az N-terminálisán 5 aminosavval meg van hosszabbítva) végül ioncserélővel ismert módon koncentráljuk, kicsapjuk és fagyasztva szárítjuk. Az így nyert kiindulási anyag a HPLC-meghatározás szerint 60% tartalommal rendelkezik.

1. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a merkaptán/aszkorbinsav aránytól Preproinuzin-S-SO₃-t (60%) 0,33 mg/ml koncentrációban 20 mmólos glicinpufferben (pH = 10,5) oldunk, ez 0,2 mg/ml preproinzulin-S-SO₃-koncentrációnak felel meg. Kiindulási keverékenként 20 ml-t alkalmazunk, melyekhez 0,1 mólos ciszteinoldatból 480 μΐ-t (S-SO₃-csoportra számított 20-szoros moláris felesleg) és egy 0,1 mólos aszkorbinsavoldatból 0 és 480 μΐ közötti mennyiséget adunk. A renaturálási hőmérséklet 8 °C, a reakció időtartama 16 óra.

Aszkorbinsav (0,1 M) A reakció hozama

0	25%]	összehasonlító
24 μΐ	28%'
48 μΐ	53%	találmány szerinti
96 μΐ	78%
480 μΐ	81%.

Ez a példa a redoxvegyület befolyását mutatja a hozamra. Míg az aszkorbinsavat nem tartalmazó kiindulási keveréknél túlnyomóan olyan proteineket kapunk, me4

HU 208 704 Β lyeknél a diszulfidhíd hibásan alakul ki, redoxvegyület jelenlétében a kívánt termék hozama növekszik.

2. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a merkaptán/aszkorbinsav fölöslegtől

A mennyiség, térfogat, pufferkoncentráció, reakcióidő és -hőmérséklet, pH-érték megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. Minden esetben ekvimolekuláris mennyiségű ciszteint és aszkorbinsavat adagolunk, emellett az S-SO₃ ^_-csoportra számított moláris fölösleg

2,5 és 200 között van.

Cisztein és ászkor- S-SO₃~-cso- A reakció hozabinsav mennyiség portra vonatko- ma zó fölösleg

60 pl	2,5	38%] összehasonlító
120 pl	5	70%
240 pl	10	83%
480 pl	20	85%	találmány szerinti
1200 pl	50	81%
2400 pl	100	72%

Ez a példa azt mutatja, hogy mihelyt a merkaptánnak egy meghatározott legkisebb mennyiségét túllépjük a diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozama, széles tartományban messzemenően független a merkaptán fölöslegtől.

3. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a pH-értéktől A mennyiség, térfogat, pufferkoncentráció, reakcióidő és -hőmérséklet megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. A kísérlet során 480 μ! 0,1 mólos ciszteinoldatot és 480 pl 0,1 mólos aszkorbinsavoldatot adagolunk (S-SO₃“csoportra számított 20-szoros moláris fölösleg). pH-érték A reakció hozama

11,0 79%

10,5 81%

10,0 66%

9.5 53%

9,0 46%

8.5 33%

8,0 24%

4. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a merkaptán típusától.

A mennyiség, térfogat, pufferkoncentráció, reakcióidő és -hőmérséklet valamint pH-érték megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. A kísérlet során mindenkor a megfelelő merkaptánoldatból 480 pl-t és 480 pl 0,1 mólos aszkorbinsavoldatot adagolunk (S-SO₃ ^_-cso45 portra számított 20-szoros moláris fölösleg).

Merkaptán típusa A reakció hozama cisztein 81% merkaptoetanol 86% glutation 75% tioglikolsav 74%

3-merkapto-1,2-propán-diol 76%

5. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a puffer típusától és a puffer ionerősségétől.

A mennyiség, térfogat, reakcióidő -hőmérséklet, valamint a pH-érték megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. A kísérlet során mindenkor a megfelelő merkaptán 0,1 mólos oldatából 480 pl-t és 480 pl 0,1 mólos aszkorbinsavoldatot adagolunk (S-SO₃“-csoportra számítva 20-szoros moláris fölösleg).

Puffer A reakció hozama

10 mM glicin	89%
100 mM glicin	82%
10 mM borát	82%
100 mM borát	51%
10 mM karbonát	88%
100 mM karbonát	72%

6. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a reakció idejétől.

A mennyiség, térfogat, pufferkoncentráció, pH-érték és reakció-hőmérséklet megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. A kísérlet során mindenkor egy 0,1 mólos merkaptoetanol-oldatból 480 pl-t és 480 mól 0,1 mólos aszkorbinsav-oldatot adagolunk (S-SO₃-csoportra számítva 20-szoros moláris fölösleg).

Reakcióidő (h) A reakció hozama

0,25 25%

0,5 40%

46%

61%

70%

77%

83%

79%

7. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése a preproinzulin-S-szulfonát koncentrációjától

A térfogat, puffer-összetétel, pH-érték, reakcióidő és -hőmérséklet megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak: A preproinzulin-S-szulfonát-mennyiséghez mindenkor annyi merkapto-etanol és aszkorbinsav törzsoldatot adunk; hogy az S-S0₃ ^_-csoportra számítva 20szoros moláris fölösleg jöjjön létre.

Preproinzulin-S-SCT-koncentráció A reakció hozama 0,1 mg/ml 86%

0,2 mg/ml 84%

0,3 mg/ml 78%

0,4 mg/ml 65%

0,5 mg/ml 55%

1,0 mg/ml 19%

2,5 mg/ml 5%

8. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció hozamának függése az aszkorbinsav/merkaptoetanol fölöslegtől modifikált kiindulási anyag esetén.

Olyan prekurzor-molekulát alkalmazunk, melynél az inzulin-A- és -B-láncot csupán egy arginin kapcsolja össze. E molekula géntechnológiai előállítására a kísérletsorozat elején leírt módon kerül sor. A fagyasztva szárított anyag tartalma 60%, az anyagot 0,5 mg/ml koncentrációval 20 mM 10,5 pH-jú glicinpufferben oldjuk, ez 0,3 mg/ml prekurzor-koncentrációnak felel meg. A reakcióidő és -hőmérséklet azonos az 1. kísérletben leírtakkal, az aszkorbinsav/merkaptán keverék moláris fölöslege 2,5- és 50-szeres érték között váltakozik.

HU 208 704 Β

S-SO₃ -csoportra számított fölösleg A reakció hozama

2,5	56%]	összehasonlító
5	61%'
10	74%	találmány szerinti
20	75%
50	55%

9. A diszulfidhíd kialakítására irányuló reakció függése a redox-rendszertől.

Mennyiség, térfogat, puffer-összetétel, pH-érték reakcióidő és -hőmérséklet megfelel az 1. kísérletben foglaltaknak. A merkaptoetanolt a preproinzulin-SSO₃ kiindulási vegyület -S-SO₃ ^_-csoportjaira számítva 20-szoros moláris feleslegben alkalmazzuk, és ugyanilyen feleslegben adjuk a megfelelő redox-partnert is az elegyhez.

Redox-partner A reakció hozama

Aszkorbinsav 77%

Dehidroaszkorbinsav 70%

Pirokatechin 66%

Hidrokinon 40%

Benzo (-p-) kínon 23%

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű inzulinprekurzor előállítására - a képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, kémiailag vagy enzimatikusan hasítható aminosav- vagy peptidmaradék;

R² jelentése OH-csoport, aminosav- vagy peptidmaradék; előnyösen OH-csoport,

X jelentése az inzulin-A- és -B-láncokat összekötő csoport, előnyösen aminosav- vagy peptidmaradék; Y jelentése valamely genetikusán kódolható aminosavmaradék, előnyösen Thr, Alá, Ser, különösen

Thr,

Z jelentése valamely genetikusán kódolható aminosavmaradék; előnyösen Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Alá vagy Met, különösen Asn,

A1-A20 és B1-B29 jelentése az inzulin nem-mutált, illetve egy vagy több aminosav-maradék cseréje révén mutált peptidszekvenciái, előnyösen a humán-, sertés- vagy marhainzulin, különösen a humán- vagy sertésinzulin nem-mutált peptidszekvenciái -, oly módon, hogy védett Cys-S-csoportokkal rendelkező prekurzort vizes közegben valamely merkaptánnal átalakítunk, azzal jellemezve, hogy egy védett Cys-Scsoportokkal rendelkező (II) általános képletű prekurzort - a képletben R¹, R², X, Y, Z, A1-A20 és Β1-B29 jelentése egyezik az (I) általános képletnél megadottakkal és R³ jelentése Cys-S-védőcsoport, előnyösen -SO₃~- vagy terc-butil-csoport - az 5-100 (merkaptán-)SH: 1 Cys-SR³ (II képletben) aránynak megfelelő mennyiségű merkaptánnal reagáltatunk olyan szerves redox-rendszer jelenlétében, amelynek egyik komponense a (III) képletű szerkezeti elemet tartalmazó szerves vegyület vagy egy aromás orto- vagy para-dihidroxi vegyület, másik komponense a (ΙΠ) képletű szerkezeti elemet a (ΠΓ) képletnek megfelelő oxidált alakban tartalmazó szerves vegyület vagy egy aromás orto vagy para-kinon, vagy pedig egyetlen, a reakciókörülmények között redox-rendszerré alakuló szerves vegyületből, éspedig a fenti meghatározásnak megfelelő vegyületpárok egyik komponenséből áll.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10-50: 1, különösen 10-30: 1 (merkaptán-)SH: Cys-SR (II képletben) arány mellett játszatjuk le a reakciót.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy merkaptánként merkaptoetanolt és/vagy ciszteint alkalmazunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (IH) képletű szerkezeti elemet tartalmazó szerves redox-rendszerként az aszkorbinsav-dihidroaszkorbinsav vegyületpárt alkalmazzuk.

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szerves redox-rendszerként a pirokatechin-o-kinon vagy hidrokinon-o-kinon vegyületpárt alkalmazzuk.

6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciófeltételek mellett redox-rendszert képező szerves vegyületként a 4. vagy 5. igénypontban felsorolt vegyületpárok egyik komponensét alkalmazzuk.

7. Az 1-6. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merkaptánt és a szerves redox-rendszert képző vegyülete(ke)t 1 grammekvivalens merkaptánra számított 1/10000-10000, előnyösen 1/10-10 mól szerves redox-rendszert képző vegyület(ek) aránynak megfelelően alkalmazzuk.

8. Az 1-7. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 7-12, előnyösen 9,5-11 közötti pH-értéken hajtjuk végre.