HU185416B

HU185416B - Process for preparing insuline

Info

Publication number: HU185416B
Application number: HU81771A
Authority: HU
Inventors: Ronald E Chance; James A Hoffmann
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1985-02-28
Also published as: FI810918L; RO81640B; PT72733A; DE3160862D1; SU1327790A3; NO811038L; JPS56154443A; AR227305A1; RO81640A; AU540645B2; JPS6318960B2; ES8207551A1; DK149756C; ES500750A0; CS236463B2; IE810680L; DD157613A5; PL128599B1; IE51608B1; IL62483A0

Description

A találmány tárgya új eljárás inzulin előállítására.

Azóta, hogy DNS-rekombinációs módszerrel fehérjetermékek szintézise, és különösen ezen módszerrel inzulin A-lánc és inzulin B-lánc előállítása lehetővé vált [Goeddel és mtsai.: Proc. Nat’l. Acad. Sci., USA, 76, 106-110 (1979)], rendkívül megnövekedett annak a szükségessége, hogy az inzulin képzésére, az A- és B-lánc egyesítésével hatásos módszert dolgozzanak ki.

Jellemzően, az A- és B-lánc egyesítésének korábbi módszerében, az inzulin termeléséhez kiindulási anyagként az A- és B-láncot stabil S-szulfonátjaik formájában használják. Általában, az A- és B-láncú S-szulfonátokát külön vagy együtt, szokásosan nagy feleslegű tiol-redukálószer alkalmazásával megfelelő szulfhidril-vegyületekké redukálják. A terméket ezután, ha nem együtt redukálták, a redukáló elegyből elkülönítik és együtt egy oxidáló közegbe, például levegő, viszik, hogy az Aés B-láncok egyesítése inzulinná végbemenjen. Ezen metodika példáit Du és munkatársai: Scientia Sinica 10, 84—104 (1961); Wilson és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 62, 483—489 (1962); Du és munkatársai: Scientia Sinica 14, 229—236 (1965); Kung és munkatársai: Scientia Sinica 75, 544-561 (1966);Kexue Tongbao (Kínai Köztársaság) 7 7, 241-277 (1966) és Markussen: J. Acta Paediatrica Scandinavica, Suppl. 270, 121— 126 (1977) közleményeiben találjuk.

Az előbbi eljárás módosítása abból áll, hegy az Aláncú S-szulfonátot redukálják, majd a redukált A-láncot B-láncú S-szulfonáttal oxidáló atmoszférában reagáltatják: lásd például Katsoyannis és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 55, 1554-1561 (1966); Katsoyannis: Science 154, 1509-1514 (1966); Katsoyannis és mtsai: Biochemistiy 6, 2642-2655 (1967); 3 420 810 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és Jentsch: Journal of Chromatography 76, 167—174(1973).

A másik módosítás magába foglalja az A-lánc szulfhidril vegyületének parciális oxidálását diszulfiddá az A-6 és A-ll cisztein-részek között, majd a termék Bláncú szulfhidrillel, vagy B-láncú S-szulfonáttal való oxidálását: lásd például 676 069 számú belga szabadalmi leírás és Zahn és mtsai: Liebigs Ann. Chem, 691, 225231 (1966).

Mindegyik előbbi módszerben azonban egy elem közös, mégpedig az inzulin termelése két egymástól külön, egymást követő művelettel, nevezetesen az Sszulfonát redukciója szulfhidrillé, majd az ezt követő oxidálás diszulfiddá.

Dixon és munkatársai a Natúré 188, 721-724(1960) közleményben olyan körülményeket ajánlanak, melyben a2 A- és B-láncú S-szulfonátok inzulinná történő átalakításához egyetlen oldatban tiol redukálószert és levegő oxidálást alkalmaznak. A részletek eléggé vázlatosak, és a kitermelést csak a kinyert termék aktivitására vonatkoztatják, mely 1-2%. Dixon azonban a Proc. Intern. Congr. Endecrinol. 2. kiadás, London, 1964, 12071215 (1965) közleményében kissé részletesebben kifejtve arra utal (1211 oldal IV. táblázat), hogy a korábbi közlemény kísérleti körülményei külön redukciós és oxidációs műveletből állanak.

Az előző módszerekkel szemben felismertük azt, hogy meghatározott körülmények között lehetséges az inzulin, vagy inzulin analógok kedvező szintű termelése

S-szulfonált A- és B-láncból olyan eljárással, melyben mind a redukció, mind az oxidáció reakcióját egyetlen művelettel, egy oldatban folytatjuk le. Ez az az eljárás, melyre a találmány vonatkozik.

Következésképpen, a találmány tárgya eljárás inzulin \agy inzulin analóg A-láncának és inzulin vagy inzulin rnalóg B-láncának egyesítésével inzulin vagy inzulin rnalóg előállítására oly módon, hogy az A-lánc S-szulfonált származékát, a B-lánc S-szulfonált származékát vizes közegben — 8—12 pH-értéken, — 0,1-50 mg/ml összes proteinkoncentráció mellett, és az összes A- és B-lánc S-szulfonált származékában jelenlévő, egy -SSO₃ csoportra számítva 0,4-2,5 -SHcsoportot tartalmazó merkaptán jelenlétében reagáltatjuk, és az elegyet 0°C és 25 °C közötti hőmérsékleten, levegő, mint oxigénfonás vagy oxigén jelenlétében ártjuk.

A találmány tárgya jó kitermelésű, egyműveletes eljárás inzulin vagy inzulin analóg előállítására A- és B-lánc

S-szulfonát-származékokból.

Az „inzulin” kifejezés alatt természetesen bármelyik természetben előforduló inzulint értünk, mint amilyen az emberi szarvasmarha, sertés, juh, hal, madár és hasonló, valamint az egyik fajta A-lánc, és másik fajta B'ánc kombinációjával képzett hibrid inzulin.

Az „inzulin analóg” kifejezés a proteinek bármilyen széles változatára vonatkozik, melyek mindegyike, a természetes inzulinokkal megegyezésben, a fél-cisztin maradékot szekvenciális sorozatban tartalmazó A-láncból és B-láncból állnak. Az analógok a természetes inzulintól egy vagy több aminosavmaradék szubsztitúciójában, addíciójában, elhagyásában, vagy módosításában különbözik, megtartva a diszulfidkötés elrendezését és az inzulinhoz hasonló aktivitás legalább egy részét. Ilyen analógok például az [N-formil-Gly¹-Ajinzulin, dezaminoA’-inzulin, [szarkozin¹-Ajinzulin, [L-alaninUAjinzulin, [D-alanin’-Ajinzuün, [izoaszparagin -Ajinzulin, [D-aszparagin²¹-Ajinzulin, [arginin²¹ -Ajinzulin, [aszparaginamid²¹-Ajinzulin, [szarkozin¹-A, aszparagin²¹ -Ajinzulin, [norleucin²-Ajinzulin, [treonin⁵-A]inzulin, [leucin^s-A]inzulín, [fenil-alanin^,9-A]inzulin, [D-tirozin¹⁹-Ajinzulin, [tirozin¹⁸-A, aszparagin ¹⁹-A, arginin²¹-Ajinzulin, dez[B^28-30-tripeptidjinzulin, dez[B²⁷”³⁰-tetrapeptid]iiizurin, dez[B²⁶³⁰-pentapeptidjinzulin, dez[B^z,~³⁰-tetrapeptid, tirozín-amid²⁶-B]inzulin, des[B^26_30-pentapeptid, fenilalanin-amid²⁵-B]inzulín, des[B¹ ⁴-tetrapeptid]inzulin, des/B¹’⁵-pentapeptid]inzulin, [lizin²²-B]inzulin, [leucin⁹-B]inzulin, [leucin¹⁰-B]inzulin, desffenil-alanin ¹-Bjinzulin és hasonlók. Az irodalmak ilyen és más analógokat írnak le, például Blundell T. és munkatársai: Advances in Protein Chemistry, 26, 330—362, Aeademic Press, N.Y., N.Y. (1972); Katsoyannis P.G.: Treatment of Early Diabetes, 319-327, Plenum Publishing Corp. (1979); Geiger R.: Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111-129, Dr. A. Hütliig, Publisher, Heidelberg, W. Germany (1976); Brandenburg, D. és mtsai: Biochem. J. 125, 51-52 (1971).

Bár a találmány szerinti eljárás széles körben alkalmazható inzulinok és inzulin analógok előállítására, azonban az eljárás főleg a természetben előforduló inzulinok, különösen az emberi, szarvasmarha vagy sertés inzulin, és legfőképp, emberi inzulin előállítására használható.

A találmány szerinti eljárás lefolytatásában, az inzulin vagy inzulin analóg kialakításához az A-és B-lánc egyesí-2185 4,6 tése, az egyik láncnak a másik lánchoz viszonyított igen változatos arányával történhet. Az egyesítést természetesen a kisebb mennyiségben jelen levő lánc, akár az Alánc, vagy akár a B-lánc alapvetően meghatározza. Az A-láncnak B-lánchoz viszonyított szokásos aránya mintegy 0,1:1 és 10:1 közötti súlyarány. A találmány szerinti eljárás lefolytatásához az A-láncnak B-lánchoz viszonyított súlyaránya igen előnyösen 1:1 és 3:1 közötti tartomány. Továbbá azt is felismertük, hogy az előnyös határon belül, bizonyos tartomány különösen kedvező az inzulin különleges fajtáinak előállítására. Ilyen módon, a szarvasmarha inzulin előállításához az A- és B-lánc egyesítésében előnyös az, ha az A-láncnak B-lánchoz viszonyított aránya 1,4:1,0 és 1,8:1,0 között van. A sertésinzulinhoz előnyös tartomány az 1,0:1,0 és 1,4:1,0 közötti arány. Az emberi inzulinnál előnyös tartomány az 1,8:1,0 és 2,2:1,0 közötti arány.

A találmány szerinti eljárás lefolytatásánál másik jellemző paraméter a reakcióelegy proteinkoncentrációjának optimális szintje. Az eljárás a proteinkoncentráció széles tartományával sikeresen lefolytatható. Általában, a reakcióelegy proteinkoncentrációja 0,1-50 mg/ml. Előnyösen, a proteinkoncentráció 2-20 mg/ml. Felismertük továbbá azt is, hogy ez utóbbi tartományon belül, az optimális proteinkoncentráció az előállított inzulin fajtájától függően változik. Következésképpen, sertésinzulin esetén előnyös, ha a proteinkoncentráció 8—16 mg/ml, míg emberi vagy szarvasmarha-inzulin esetén az előnyös tartomány 3 -8 mg/ml.

A találmány szerinti eljárást vizes közegben folytatjuk le. A közeg szobahőmérsékleten mért pH-ja általában 8—12. Előnyösen, a reakcióelegy pH-ját 9,5 és 11,0, optimálisan 10,4 és 10,6 pH között tartjuk. A reakcióelegy pH-ját a kívánt tartományban erre alkalmas puffer hozzáadásával tartjuk. Ilyen jellemző puffer például a glicin, glicil-glicin, karbonát, trisz(hidroxi-metil)amino-metán, NJ4-bisz(2-hidroxi-etil)-glicin, pirofoszfát, N-trisz(hidroxi-metil)-metil-3-amino-propánszulfonsav és más hasonló szerek, melyek az előbb említett tartományon belül a pH-t szabályozzák. Szokásos és előnyös puffer a glicin.

A puffer koncentrációja általában 0,001-2 mól. Előnyös koncentráció a 0,01—1 mól, legelőnyösebben 0,01—0,1 mól.

Az A- és B-láncokat egymással megfelelő vizes közegben, merkaptánok jelenlétében reagáltatjuk, melyek legalább egy szulfhidrilcsoportot tartalmaznak, valamint az A- és B-lánc S-szulfonát-csoportjainak hatásos redukálásához, megfelelő kapacitással rendelkeznek. Annak ellenére, hogy ilyen jellemzőkkel rendelkező szerek bármelyike alkalmazható, azonban legelőnyösebbek azok a tiol-redukálószerek, melyek oxidált formájukban igen stabil vegyületekké ciklizálódnak, A jelenlevő redukálószer mennyisége összesen 0,4-2,5 —SH csoport egy —SSO3 csoportra számítva, mely az A- és B-láncú Sszulfonát egész mennyiségében jelen van, és előnyösen mintegy 0,9-1,1 —SH csoport egy —SSO3 csoportra számítva.

Jellemző merkaptán például a ditiotreitol, ditioeritritol, 2-merkapto-etanol, metil-tioglikolát, 3-merkapto1.2-propándiol, 3-merkapto-propionsav, tioglikolsav és más ilyen tiolvegyület. Előnyös merkaptán a ditiotreitol és a ditioeritritol, legelőnyösebb azonban a ditiotreitol.

A találmány szerinti eljárás egyik lényeges körülménye az, hogy az eljárást oxigén jelenlétében folytatjuk ie. Ez a körülmény egyszerűen teljesíthető a reakcióelegy nyitott edényben levegőn történő kezelésével. Bár közvetlenebb érintkeztetési módszer is alkalmazható, mint például levegő vagy oxigén buborékoltatása a reakcióelegybe és a reakcióelegyen keresztül, ez azonban nem feltétlenül szükséges.

Általában, a találmány szerinti eljárást az A-lánc Sszulfonát-származékát, a B-lánc S-szulfonát-származékát és a merkaptánt kívánt koncentrációban tartalmazó elegy elkészítésével vizes közegben, 8-12 pH tartományban folytatjuk le. Az elegyet, levegővel érintkeztetve, a láncegyesülés végbemeneteléhez elegendő ideig, általában legalább 30 percig, enyhén keverjük. A keverés ideje közben az elegyet általában 0°C és 25 °C közötti hőmérsékleten tartjuk; előnyösen azonban, az elegyet mérsékelten hűtve ezen tartomány alsó határánál, általában 2-10 °C. hőmérsékleten tartjuk.

Amint a reakció végbement, az inzulin vagy az inzulin analóg termék a módszerek széles változatának bármelyikével elkülöníthető, melyek mindegyike az inzulin-technológia területéről ismert. Az inzulin tisztítására leginkább használt módszer a kromatográfiás technika. Ezek egyszerűen alkalmazhatók inzulin kinyerésére a találmány szerinti eljárásban. Ilyen technika a gélszűrés és az ioncserélő kromatográfia.

Másfelől, a termék tisztasága és aktivitása ismert módszerekkel mérhető. Ilyen például a poliakrilamid-gél elektroforézis, az aminosav-analízis, az inzulin radioreceptor-analízis, az inzulin radioimmun-analízis, a nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), ultraibolya spektroszkópia, danzilezés, házinyúl vércukor vizsgálat, és hasonlók.

Az inzulinok, melyek a találmány szerinti eljárásból kaphatók, magukba foglalják az egyik faj inzulin A-láncból, és a másik faj inzulin B-láncból álló hibrideket is. A találmány szerinti eljárás célja az A-és B-láncú S-szulfonátok megfelelő egyesítése, és ezen láncok részletes szerkezete - amennyiben ezek az inzulin vagy inzulin analóg A- és B-láncot hűen tükrözik - a találmány szerinti eljárás szempontjából nem lényegesek.

Bár az inzulin, vagy egy inzulin hibrid, vagyis az egyik fajta A-lánc és egy másik fajta B-lánc egyesítése, a találmány szerinti eljárással előállítható, azonban természetesen, az A-láncú S-szulfonát és B-láncú S-szulfonát alkalmazásával, melyek mindegyike az ilyen inzulin iminösav-szekvenciáját tartalmazzák, előnyös olyan inzulin előállítása, mely szerkezetileg azonos a természetben előforduló inzulinnal. Következésképpen, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával előnyös sertés, szarvasmarha vagy emberi inzulin, és legelőnyösebb emberi inzulin előállítása.

Az inzulin, vagy inzulin analóg A- és B-láncok, mint már közöltük, DNS rekombinációs metodikával előállíthatok [lásd például R. E. Chance és munkatársai: Peptides: Synthesis-Structure, 1981 Pierce Chemical Co., 721-728]. Ezek természetes inzulinból és klasszikus leptidszinlézisscl, beleértve vagy az oldat, vagy a szilárd fázisú technikát, szintén előállíthatok.

Az A- cs B-Iáncokat stabil S-szulfonátok formájában tartjuk. Az S-szulfonát kiindulási anyagok oxidatív szulfitolízissel kaphatók, melyben az A- és B-láncokat nátrium-szulfittal, enyhe oxidálószer, mint nátriumtetrationát, jelenlétében reagáltatjuk.

A találmány szerinti eljárás szemléltetésére a következő példákat adjuk meg. Ezek a példák csupán a talál3

-3185 4 6 mány szemléltetésére szolgálnak, de a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

360 mg sertés A-láncú S-szulfonátot 36 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az elegyet 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 300 mg sertés B-láncú S-szulfonátot 30 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az elegyet 5 n nátrium-hidroxiddal

10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 123,4 mg ditiotreitolt 4 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 0,2 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk.

Az A- és B-lánc oldatait egy 100 ml-es lombikban szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) összeöntjük, és 1,91 ml ditio-treitol-oldatot adunk hozzá, hogy az -SH csoportnak —SSO-j csoportra viszonyított aránya 1,04 legyen. A kapott oldatot nyitott főzőpohárban mágneses keverővei 4-8 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat enyhén keverjük. Nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC)

193,8 mg inzulint, vagy 29 % összes proteint mutat.

Ebből az oldatból 40 ml-t ecetsavval 3,15 ρΗ-ra beállítunk. Az oldatot gélszűréssel 5 X 200 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szűrjük, és az egyensúly beállta után az oszlopot 1 mól ecetsawal 4-8 °C hőmérsékleten eluáljuk. Az inzulin csúcsnak megfelelő frakciót (2450—2700 ml) egyesítjük, és liofilizáljuk. Kitermelés: 95 mg inzulin, vagy 25 % összes fehérje. A sertésinzulin poliakrilamid-gél elektroforézis, aminosavanalízis, inzulin radioreceptor vizsgálat, HPLC és házinyúl vércukor csökkenési teszt szerint teljesen tiszta.

2. példa

Szarvasmarha A- és B-láncú S-szulfonátokból 0,01 mól glicin-pufferben (pH 10,5) 5 mg/ml koncentrációjú oldatokat készítünk. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-puffeiben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 0,15 ml 5 n nátrium-hidroxiddal

10,5 ρΗ-ra beállítjuk. A B-lánc 0,5 ml oldatához szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) 0,8 ml A-láncú oldatot, és 0,035 ml ditiotreitol oldatot adunk, így az -SH csoportnak -SSOá csoporthoz viszonyított aránya 0,91. A kapott oldatot 4-8 °C hőmérsékleten 3 ml-es nyitott ampullában 20 óra hosszat keverjük. Az elegy HPLC analízise 1,96 mg szarvasmarha-inzulin kitermelést, vagy 30 % összes fehérjét mutat.

3. példa

A sertés A- és B-láncú S-szulfonátok oldatait 10 mg/ml koncentrációban, 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) készítjük el. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátriumhidroxid-oldattal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 2,0 ml üvegben desztillált vízben oldunk. Szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) 0,5 ml B-láncú oldathoz 0,6 ml A-láncú oldatot és 29,25 μΙ ditiotreiiololdatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,00. A kapott oldatot 3 ml-es nyitott fiolában 4-8 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat keverjük. HPLC analízis az oldatban 3,81 mg sertésinzulin kitermelést, vagy 35 % összes proteint mutat.

4. példa

Emberi (hasnyálmirigy) B-lánc S-szulfonátból, és különféle emberi (hasnyálmirigy és E. coli) és sertés (hasnyálmirigy) A-lánc S-szulfonátból 50 mg/inl koncentrációban, 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldatokat készítünk. Mindegyik oldatot 5 n nátrium-hidroxidoldattal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. Mindegyik 1,0 ml Á-láncú S-szulfonát oldatokhoz szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) 0,5 ml Bláncú S-szulfonát-oldatot, és 0,05 ml ditiotreitol-oldatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,09. Mindegyik oldatot hűtött helyiségben (4-8 °C), nyitott fiolában 20-22 óra hosszat keverjük. A kitermelés kiszámításához az oldatokat HPLC analízissel hasnyálmirigyből nyert emberi inzulin, mint standard, alkalmazásával vizsgáljuk.

Az eredményeket a következő táblázat mutatja.

1. Táblázat

A-lánc eredete	Emberi inzulin kitermelés, mg	Összes proteinhez viszonyított kitermelés %
sertés (hasnyálmirigy)	2,00	26,7
sertés (hasnyálmirigy)	2,11	28,1
emberi (hasnyálmirigy)	1,95	26,0
emberi (hasnyálmirigy)	2,03	27,1
emberi (E. coli)	1,99	26,5

5. példa

Emberi A- és B-lánc S-szulfonát mindegyikéből 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 ρΗ-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxid-oldattal

10,5-re beállítjuk. 0,5 ml B-láncú oldathoz szobahőmérsékleten 1 ml A-láncú oldatot, majd 50 pl ditiotreitololdatot adunk, így az -SH csoportnak az -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,09. A kapott oldatot 3 ml-es nyitott fiolában 4-8 °C hőmérsékleten 22 óra hosszat keverjük, majd HPLC analízissel vizsgáljuk. Az emberi inzulin kitermelése 2,58 mg, vagy 34 % összes fehérje.

6. példa

328 mg emberi A-lánc S-szulfonátot 65,6 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 75 μΐ

185 416 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 164 mg emberi B-Iánc S-szulfonátot 32,8 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 15 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk.

61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 160 pl 5 n nátriumhidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk.

Az A- és B-láncú oldatokat egy 150 ml-es üveg főzőpohárban szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) egyesítjük, és 3,28 ml ditiotreitol-oldatot adunk hozzá, így az —SH csoportnak az —SSO₃ csoporthoz viszonyított aránya 1,09. A nyitott főzőpoharat hűtött helyiségben jeges vízfürdőbe tesszük és 30 percig erősen keveijük. Az oldatot hűtött helyiségben (4-8 °C) 24 óra hosszat tovább keveijük. Ebben az időben a HPLC analízis 148 mg emberi inzulin kitermelést, vagy 30% összes proteint mutat.

100 ml ilyen oldathoz 25 ml jégecetet adunk, a végső pH 3,15. Az egész mintát gélszűréssel 5X 200 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szüljük és az egyensúly beállta után az oszlopot 1 mól ecetsavval 4— 8 °C hőmérsékleten eluáljuk. Az eluált proteint liofilizáljuk. Az inzulin csúcsnak megfelelő frakció (2465—2781 ml-ből) 125 mg, és 29,4 % kinyert proteinnek felel meg.

Ennek az inzulinnak egy részét (95,5 mg) 9 ml 0,01 mól trisz-puffer, 0,001 mól etilén-diamin-tetraecetsav,

7.5 mól karbamid, 0,03 mól nátrium-klorid pufferelegyben (pH 8,5) 4°C hőmérsékleten oldjuk. Az elegyet

2.5 X 90 cm (dietil-amino-etil)-cellulóz ioncserélő oszlopon kromatografáljuk, és azonos pufferrel mossuk. A proteint 4-8 °C hőmérsékleten 1-1 liter 0,03 mól és 0,09 mól nátrium-klorid növekvő koncentrációját tartalmazó azonos pufferrel, majd 1 liter 1 mól nátriumkloridot tartalmazó pufferrel eluáljuk. Mindegyik frakciót Sephadex G-25 oszlopon 2 % ecetsavban sómentesítjük, és liofilizáljuk. Az inzulin csúcsot tartalmazó frakció (elúciós térfogat 878—1008 ml) súlya 55,73 mg, mely 84 % kinyert proteint jelent.

Cink-inzulin kristály előállításához üveg centrifugacsőben 11,90 mg inzulint 240 pl 0,1 n sósavban, majd azonnal 2,16 ml 0,04 %-os cink-klorid, 0,05 mól nátrium-citrát, 15 % aceton elegyben oldjuk. Az oldatot 72 óra hosszat szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) kristályosítjuk, majd a felső folyadékot leöntjük. A kristályokat centrifugán 2000 ford/perc fordulattal kétszer 3 °C hideg 6,1 pH-jú vízzel mossuk. A kristályokat analízishez 0,01 n sósavban újra oldjuk.

A kapott emberi inzulin teljesen tiszta, melyet a poliakrilamid-gél elektroforézis (egyetlen csúcs), aminosavanalízis, inzulin radioreceptor-vizsgálat, inzulin radioimmun-vizsgálat, HPLC, danzilezés és UV-spektrum igazol. Az USP házinyúl vizsgálat (144 házinyúl)

26,3 ±1,8 egység/mg (vízmentes) hatékonyságot mutat.

7. példa

Emberi (E. coli) [N-formil-Gly¹ ]-A-lánc S-szulfonát és emberi (hasnyálmirigyből) B-lánc S-szulfonát 5 mg/ml koncentrációjú oldatát 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) készítjük el. Mindegyik oldat pH-t 5 n nátriumhidroxíddal 10,5 pH-ra állítjuk be. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1· mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. Szobahőmérsékleten (25 °C) 0,5 mi B-láncú

S-szulfonát oldathoz 1,0 ml [N-formil-Gly¹ ]-A-láncú S-szulfonát oldatot és 0,05 ml ditiotreitol oldatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,10. Az oldatot hűtött helyiségben (4—8 °C) 3 ml-es nyitott fiolában 23 óra hosszat keverjük, majd HPLC analízissel vizsgáljuk. Az [N-formil-Gly¹-Aj emberi inzulin kitermelése 1,46 mg, vagy 19,5 % összes potein.

Az oldat egy részét jégecettel 3,15 pH-ra savanyítva gélszűréssel 1,5 X 90 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szűrjük, és az egyensúly beállta után 4—8 °C hőmérsékleten 1 mól ecetsawal eluáljuk. Az [N-formilGly¹-A] emberi inzulin frakciókat (elúciós térfogat 87— 95 ml) egyesítjük, és egy részét liofilizáljuk. A protein HPLC és aminosav-analízis szerint teljesen tiszta. Az [Nfonnil-Gly’-A] emberi inzulin bioaktivitása radioreceptor vizsgálattal értékelve 17%, az emberi inzulin standardhoz viszonyítva.

8. példa

Sertés A-láncú S-szulfonátból, illetve emberi B-lánc S-szulfonútból külön-külön 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk 0,1 m glicin-pufferrel (pH =10,5). 2 ml A-lánc oldatra 1 ml B-lánc oldatot számítva A—B elegyet készítünk. Az A-B elegy pH-értékét 5 n nátriumhidroxiddal 10,5-re állítjuk. 121,2 mg ciszteint 2,0 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH = 10,5) oldunk és az oldat pH-értékét 0,35 ml 5 n nátriumhidroxiddal

10,5-re állítjuk. Az A-B elegy 1,5 ml-éhez szobahőmérsékleten 52 pl fenti cisztein-oldatot adunk, mellyel az —SH: —SSO3 arányt 0,95-re állítjuk. A kapott oldatot

4—8 C hőmérsékleten nyitott 3 ml-es ampullákban 20 órán át keverjük, melynek elteltével a HPLC analízis 3,25 mg emberi inzulin kitermelést mutat (a teljes prolein 23,2%-a).

9. példa

A következő példában az emberi A- és B-lánc Sszulfonát kapcsolási reakciójának optimális teljes protein-koncentrációját vizsgáljuk.

0,1 mól pH= 10,5 glicin-pufferral 7 ml, 25 mg/ml koncentrációjú sertés A-lánc S-szulfonát-oldatot és 4 ml, 25 mg/ml koncentrációjú E. coli (ft-gal.) B-lánc S-szulfouát-oldatot készítünk, 6,0 ml A-lánc oldatot és 3,0 ml B-lánc oldatot egyesítünk, majd az oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra állítjuk be.

61,7 mg ditio-eritroitolt (DTT) oldunk4,0 ml 0,1 mól

10,5 pH-értékű glicin-pufferban, majd az oldat pHértékét 140 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával

10,5 értékre állítjuk vissza. Ebből az oldatból 1,64 ml-t adunk az A- és B-láncot tartalmazó oldathoz.

Ily módon az —SH/SSO3 arány 1,20, melyet korábbi vizsgálatok során 10 mg/ml proteinkoncentráció esetén optimálisnak találtunk. A kísérletek során az A- és B-lánc proteinkoncentrációjának változása nem befolyásolja jelentősen az optimális DTT koncentrációt.

Az egyesített oldatot közvetlenül ezután II db 3 ml-es ampullába töltjük, melyek különböző mennyiségű 0,1 mól glicin-puffert tartalmaznak. (Lásd az alábbi táblázatot.) Az ampullákat egy éjszakán át 5 °C hőmérsékleten rázatjuk.

Minta száma	Glicin-puffer ml	Egyesített oldat ml	Valódi összes proteinkoncentráció
1	1,0	0,1	1,70 mg/ml
2	1,0	0,2	3,12 mg/ml
3	1,0	0,35	4,85 mg/ml
4	0,8	0,4	6,24 mg/ml
5	0,75	0,5	7,48 mg/ml
6	0,6	0,5	8,50 mg/ml
7	0,6	0,6	9,36 mg/ml
8	0,45	0,7	11,39 mg/ml
9	0,3	0,8	13,61 mg/ml
10	0,15	1,0	16,27 mg/ml
11	0	1,3	18,71 mg/ml

A fenti minták HPLC-analízisét 22—25 órás reakcióidő után végeztük el. A kitermelési adatokat a minták valódi proteintartalmából számítottuk.

Az eredményeket az alábbi táblázat ismerteti, melyből megállapítható, hogy a lánc-egyesítési reakció során a valódi proteinkoncentráció optimuma 8 mg/ml körüli érték.

Minta száma	Protein mg/ml	Inzulir mg/ml	Kapcsolás kitermelése %	Legjobb kitermelés %-a
1	1,70	0,29	17,3	67,9
2	3,12	0,69	22,1	86,5
3	4,85	1,16	24,0	94,0
4	6,24	1,55	24,9	97,5
5	7,48	1,91	25,5	99,9
6	8,50	2,17	25,5	100
7	9,36	2,31	24,7	96,6
8	11,39	2,62	23,0	90,1
9	13,61	2,88	21,2	82,9
10	16,27	3,10	19,0	74,6
11	18,71	3,28	17,5	68,8

10. példa

A következő példában az A- és B-lánc cisztein jelenlétében végzett kapcsolási reakciójának pH optimumát vizsgáljuk. 0,1 mól pH =10,5 értékű glicin-pufferral készített 10 ml A-lánc S-szulfonát (10 mg/ml) és 5 ml B-lánc S-szulfonát oldatot egyesítünk, majd hozzáadjuk 121,2 mg cisztein 3 ml glicin-pufferral készített, és 350 μΐ 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-értékre állított oldatát.

A fenti oldat 1,4 ml-es mintáit szobahőmérsékleten, az alábbi táblázatban megadott kiindulási pH-értékre áüítottuk. Á cisztein-oldat 57 μΐ-ének hozzáadása után 55 _a pH-t azonnal a kiindulási pH-ra állítjuk. Ezután a mintákat 6 °C hőmérsékletű hűtőszobában helyezzük el, és 3 ml-es nyitott fiolákban egy éjszakán át rázatjuk. Az alábbi táblázat az egyes minták készítésének és kitermeléseinek jellemzőit adja meg;

1	185 416	2
Minta száma	Kiindulási pH	pH-beállító oldat	Inzulin mg/ml	Valódi lánckapcsolási kitermelés %-a
1	7,4	22 pl 6 n HCi	0	0
2	8,5	18pl6nHC:	0,327	4,0
3	9,0	12 pl 6 n HCi	0,813	10,0
4	9,5	5 pl 6 n HCI	1,284	15,8
5	10,0	5 pl 1 n HCi	1,659	20,4
6	10,5	5 pl 5 n NaOH	2,113	26,0
7	11	10 pl 5 n NaOH	1,659	20,4
8	11,5	15 pl 5 n NaOH	1,308	16,2
9	12,1	20 pl 5 n NaOH	0,048	0,6

A mintákat HPLC-analízíssel 24—27 órás reakcióidő elteltével vizsgáltuk, a mintákat 1:2 arányban jégecettel hígítva. 20

A táblázatból látható, hogy a pH-érték optimuma 10,5.

11. példa 25

A következő példában az A- és B-lánc ditio-erítroitol jelenlétében végzett kapcsolási reakciójának pH-függését vizsgáljuk a 10,5 körüli tartományban.

0,1 mól pH =10,5 értékű glicin-pufferral 12 ml, 30 10 mg/ml koncentrációjú sertés A-lánc S-szulfonátoldatot, illetve 6,0 ml, 10 mg/ml koncentrációjú E. coli (trpE) humán B-lánc S-szulfonát-oldatot készítünk, és pH-értéküket 5 n nátrium-hídroxid-oldat hozzáadásával

10,5-re állítjuk vissza.

61,7 mg ditio-eritroitolt (DTT)4,0 ml, 0,1 mól glicinpufferban oldjuk, majd pH-értékét 140 pl 5 n nátriumhilroxid-oldat hozzáadásával 10,5 pH-értékre állítjuk vissza.

A fenti oldatokat az egyes reakcióelegyek készítése közben jégen tartjuk. Mindegyik mintát a következő minta készítése előtt teljesen elkészítünk.

Az alábbi táblázatban szereplő mintákat úgy készítettük, hogy a reagenseket meghatározott sorrendben 3 ml-es nyitott fiolákba adagoltuk, majd 6 °C hőmérsékletű hűtőszobákban mágneses keverővei kevertük. A pHértékeket igen gyorsan és pontosan állítottuk be. A táblázatban szereplő végső pH-érték a reakció beindításakor 6 °C hőmérsékleten mért érték.

Minta száma	A-lánc ml	B-lánc ml	DTT Ml	Végső pH	Beállító oldat
0	1,0	0,5	100	9,0	100 pl 1 n HCI
1	1,0	0,5	100	9,5	50 pl In HCI
2	1,0	0,5	100	10,0	16 pl 1 nHCl
3	1,0	0,5	100	10,3	2 pl 1 n HCI
4	1,0	0,5	100	10,5	1 pl 5 n NaOH
5	1,0	0,5	100	10,7	3 pl 5 n NaOH
6	1,0	0,5	100	11,0	10 pl 5 n NaOH
7	1,0	0,5	100	11,5	25 pl 5 n NaOH

4-6 órás reakció után a mintákat közvetlenül HPLCanalízissel vizsgáltuk, majd a mérést 1 nap elteltével megismételtük. Az alábbi táblázat a HPLC-analízis értékeit mutatja, sertés inzulin standarddal szemben.

-7185 4 56

Minta száma	4- mg/ml	-6 óra inzulin kitermelés, %	1 nap inzulin
mg/ml	kapcsolás, %
0	0,62	6,5	0,81	9,2
1	-	-	1,22	13,4
2	1,63	17,5	1,74	18,7
3	-	-	2,02	21,6
4	1,89	20,2	2,17	23,1
5	-	-	2,01	21,5
6	1,61	17,3	1,72	18,4
7	0,91	9,8	1,18	12,7

A fenti táblázatból látható, hogy az A- és B-lánc kapcsolásának optimális kezdeti pH-értéke 10,5.

12. példa

A következő példában a cisztein szerepét vizsgáljuk az A- és B-lánc S-szulfonát kapcsolási reakciójában. Ezenkívül vizsgáljuk a 0-merkapto-propionsav, β-merkapto-borostyánkősav, merkapto-etanol és DTT, illetve ezek ciszteinnel alkotott keverékének hatását.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH= 10,5 ghcin-pufferral 10 mg/ml-es oldatot készítünk.

Szabad L-cisztein bázisból (ms = 121,16) 121,2 mg-ot 20 3,0 ml, 0,1 mólos glicin-pufferban oldunk, majd az oldat pH-értékét 350 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. Az A- és B-lánc elegyének 1,4 ml oldataihoz különböző mennyiségű cisztcin-oldatot adunk. A reakciót 6’C hőmérsékleten 17-21 órán át végezzük.

Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja:

Minta száma	Cisztein Pl	-SH/SSO's	Inzulin mg/ml	Kapcsolás kitermelése, %
1	26	0,5	0,640	7,4
2	47	0,9	1,520	17,7
3	57	1,1	1,917	22,5
4	62	1,2	1,975	23,3
5	67	1,3	1,917	22,7
6	72	1,4	1,750	20,8
7	88	1,7	1,479	17,7
8	104	2,0	1,192	14,5
9	129	2,5	0,849	10,5
10	155	3,0	0,515	6,5

A táblázatból látható, hogy a reakció —SH/SSO3 lefutása lényegében hasonló a DTT adagolásával végzett kapcsolási reakció lefutásához. Az így kapott 23,3 %-os kitermelés lényegében hasonló a DTT alkalmazása esetén kapottakhoz, és mindkét esetben az optimális kitermelést az —SH/SSO3 = 1,2 aránynál kapjuk. így a cisztein az A- és B-lánc kapcsolásában a DTT helyett alkalmazható:

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a 0-merkapto-propionsav (MPS) vagy merkapto-borostyánkősav (MBS) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH = 10,5 értékű 1 mól glicin-pufferral 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. E törzsoldatból a min50 ták készítéséhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

pl MPS-t 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd 200 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal pH-értékét

10,5-re állítjuk. 150,1 mg MBS-t 3,5 ml, 0,1 mól glicinpufferban oldunk, majd 700 pl 5 n nátrium-hidroxid55 oldattal pH-értékét 10,5-re állítjuk be.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában leírtuk szerint határozzuk meg. Az alábbi táblázat a minták készítésének módját és a kitermelési értékeket mutatja:

185 416

Minta száma	Merkaptán pl	-sh/sso;	Inzulin mg/ml	Kapcsolás kitermelése, %
1	34,5 MPS	0,5	0,272	3,2
2	83 MPS	1,2	1,179	14,2
3	97 MPS	1,4	1,376	16,6
4	138 MPS	2,0	0,952	11,9
5	207 MPS	3,0	0,771	10,0
6	34,5 MBS	0,5	0	0
7	83 MBS	1,2	0,038	0,4
8	97 MBS	1,4	0,083	1,0
9	138 MBS	2,0	0,136	1,7
10	207 MBS	3,0	0,053	0,7

A fenti táblázatból látható, hogy a 0-merkaptopropionsav igen jó inzulin-kitermelést biztosít, melynek SH/SSO3 = 1,40 optimuma magasabb, mint DTT és 20 cisztein esetén.

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a merkapto-ecetsav (MES) és o-merkapto-benzoesav (OMBS) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfo- 25 nátból pH = 10,5 értékű 1 mól glicin-pufferral 10 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk. Ebből a minták készítéséhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

pl MES-t 3,9 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd pH-ját 300 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. 154,2 mg OMBS-t 3,8 ml, 0,1 mól glicin-pufferfcan oldunk, és pH-ját 10,5-re állítjuk.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában leírtak szerint határozzuk meg. Az alábbi táblázat a minták készítésének módját és a kitermelési értékeket mutatja:

Minta száma	Merkaptán μΐ	-SH/SSOj	Inzulin mg/ml	Kapcsolás kitermelése, %
1	34,5 MES	0,5	0,615	7,2
2	83 MES	1,2	1,638	19,7
3	97 MES	1,4	1,738	21,1
4	138 MES	2,0	1,646	20,5
5	207 MES	3,0	0,469	6,1
6	34,5 OMBS	0,5	0,169	2,0
7	83 OMBS	1,2	0,662	8,0
8	97 OMBS	1,4	0.692	8,4
9	138 OMBS	2,0	0,669	8,4
10	207 OMBS	3,0	0,662	8,6

A fenti táblázatból látható, hogy elsősorban a merkapto-ecetsav a DTT és cisztein alkalmazásával végzett kapcsoláshoz hasonló jó kitermeléseket ad, ugyanakkor az -SH/SSO3 optimuma igen széles.

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok 55 kapcsolási reakciójában a /3-merkapto-etanol (ME) vagy cisztamin (merkapto-etil-amin, MEA) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH = 10,5 értékű, 0,1 mól glicin-pufferral 10 mg/ml-es törzsoldatot készítünk. Ebből a minták készíté- 60 séhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

pl (3-merkapto-etanolt 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd pH-értékét 5 n nátrium-hidroxidoldat hozzáadásával (200 pl) 10,5-re állítjuk. 113,6 mg MEA-t 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd az oldat pH-értékét 200 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal

10,5-re állítjuk.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában megadottak szerint határozzuk meg.

-9185 415

Minta száma Merkaptán -SH/SSOj ^Inzulin Kapcsolás kiterme pl ' ³ mg/ml %

1	34,5 ME		0,5	0,515	6,0
2	83 ME		1,2	0,770	9,2
3	97 ME		1,4	0,718	8,7
4	138 ME		2,0	0,470	5,8
5	207 ME		3,0	0,274	3,6
6	34,5 MEA		0,5	0,529	6,1
7	83 MEA		1,2	0,672	8,1
8	97 MEA		1,4	0,629	7,6
9	138 MEA		2,0	0,457	5,7
10	207 MEA		3,0	0,261	3,4
A táblázatból látható, hogy az ME és MEA —SH/SSO₃		oldunk, és 61,7 mg DTT-t 4,14 ml hasonló pufferral
optimuma egyaránt 1,25.	Bár a kitermelési értékek	nem	20	oldunk. A pH-értékeket 5 n nátrium-hidroxid-oldattal
olyan magasak, a kapcsolási reakció ezen merkaptánok-	10,5-re állítjuk. Az A- és B-lánc S-szulfonát-oldat 1,4 ml
kai is végbemegy.				mintáihoz különböző mennyiségű cisztein- és DTT-
A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok		oldatokat adunk, és a mintákat	egy éjszakán át 6 C
kapcsolási reakciójában a	cisztein és DTT szerepét	vizs-		'Hőmérsékleten nyitott, 3 ml-es fiolákban tartjuk.
gáljuk.			A mintákat HPLC-analízissel vizsgáltuk, és a kiterme-
Az A- és B-lánc S-szulfonát egyesített oldatait az	' elő-	25	iési értékeket és az —SH/SSO3	arányt az előzőekben
zőekben megadottak szerint készítjük. 121,2 mg	cisz-		megadottak szerint határozzuk meg.
teint 3,35 ml, 0,1 mól	pH = 10,5 értékű pufferral
Minta száma	Merkaptán pl	-sH/ssoá ^,nz,3l7 mg/ml	Kapcsolási kitermelés, %
1	75 DTT		0,90	0,684	9,0
2	100 DTT		1,20	1,645	22,0
3	109 DTT		1,30	1,783	24,0
4	117 DTT		1,40	1,237	16,8
5	134 DTT		1,60	1,131	15,5
6	159 DTT		1,90	0,500	7,0
7	43,5 Cys		0,80	1,184	15,2
8	54 Cys		1,00	1,493	19,4
9	60 Cys		1,10	1,711	22,3
10	65 Cys		1,20	1,658	21,7
11	71 Cys		1.30	1,711	22,5
12	81,5 Cys		1,50	1,467	19,4
13	103 Cys		1,90	1,112	13,9

A táblázatból látható, hogy cisztein alkalmazása mellett a legjobb kitermelés a DTT alkalmazásánál kapott legjobb inzulin kitermelésének csak 94 %-a, ugyanakkor az optimális —SH/SSO3 arány cisztein esetén szélesebb.

13. példa

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a hőmérséklet szerepét vizsgáljuk a reakció konverziós fokára és az inzulin-kitermelésre.

149 mg sertés A-lánc S-szulfonátot és 70 mg E. coli (trpE) B-lánc S-szulfonátot oldunk 14,9, illetve 7,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban, és az oldatok pH-értékét 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. 61,7 mg DTT’t 4 ml pufferhan oldunk, majd az oldat pH-értékét

140 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. Három különböző mintát készítünk, különböző hőmérsékleten, 15 ml-es fiolákban. Ezek összetételét az alábbi táblázat mutatja. Az oldatok egyesítését —1 °C 1 őmérsékleten végezzük. A kísérletek során az A-lánc és B-lánc oldat aránya 2,0, és az —SH/SSO3 érték 1,11.

-101

185 416

Minta száma	ml A	mlB	Ml DTT	Hőmérséklet
1	4,0	2,0	3,90	0 °C (jégfürdő)
2	4,0	2,0	3,90	6 °C (hűtőszoba)
3	4,0	2,0	3,90	22 °C (szobahőmérséklet)

Különböző időpontokban a mintákból ecetsawal 1: 2 arányú hígításokat készítünk, és humán inzulin tartalmukat HPLC-analízissel vizsgáljuk. Standardként UV₂₇₆ analizált sertés inzulint használtunk (15,5 mm²/Mg, R =0,2).

Idő	1-es számú minta Inzulin mg Kapcsolás, %	2-es számú minta	3-as számú minta
Idő	Inzulin mg	Kapcsolás, %	Idő	Inzulin mg	Kapcsolás, %
35 perc	3,08	5,1	30 perc	3,80	6,3	4 perc	1,79	3,0
- 87 p.	4,94	8,2	60 p.	5,01	8,4	20 p.	3,08	5,1
2 ó. 25 p.	6,23	10,4	100 p.	6,09	10,2	40 p.	3,44	5,7
3 ó. 3 p.	8,02	13,4	2Ó.40	p. 8,31	13,9	2 ó.	5,16	8,6
4 ó.	8,88	14,8	3 ó. 37	p. 10,17	17,0	3 ó. 14 p	5,87	9,8
5 ó. 52 p.	10,60	17,7	5,5 ó.	10,89	18,2	5 ó. 7 p.	5,33	8,9

Az előző mintákat körülbelül 1 nap elteltével ismét analizáltuk, és megállapítottuk a végső inzulin-kitermelést. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja:

Minta száma	Idő	HPLC	összes inzulin mg	Protein kapcsolás kitermelése, %
1	23 ó. 27 p.	1351	14,83	24,7
2	23 ó. 3 p.	1350	14,61	24,4
3	22 ó. 40 p.	1349	2,87	4,8

A fenti táblázatból látliató, hogy szobahőmérsékleten 45 a kapcsolási reakció gyorsan kezdődik, azonban hamar (kb. 3 óra alatt) viszonylag alacsony inzulin-kitermelésnél (9,8 %) leáll, majd a reakcióelegyből az inzulin-tartalom lassan csökken. 6 °C hőmérsékleten az inzulin kissé gyorsabban képződik, mint 0 °C hőmérsékleten, mintegy 50 6 óra időtartamig, a végső kapcsolási kitermelések azonban gyakorlatilag azonosak. Ez utóbbi két esetben nem tapasztalható inzulin-bomlás.

A fenti táblázatokból kiszámoltuk a t]/₂ (max) értékeket, azaz azt az időt, amely alatt a maximális inzulinmennyiség fele termelődött. Ezen értékeket az alábbi -táblázat mutatja:

Minta száma	T°C	Maximális inzulin kitermelés, %	t_V2 (max)
1	0°C	24,7	171
2	6 °C	24,4	126
3	22 °C	9,8	18

A fenti táblázatokból összefoglalva megállapítható, hogy a lánckapcsolási reakció 0 °C hőmérsékleten és szobahőmérsékleten lassúbb, azonban azonos végső inzulin-kitermelést ad. Szobahőmérsékleten gyengébb kitermelési értékeket kapunk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás inzulin- vagy inzulin-analóg A-lánc S-szulfonát és inzulin- vagy inzulin-analóg B-lánc S-szulfonát oxidáló atmoszférában végzett egyesítésével inzulin- vagy inzulin-analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy az A-lánc S-szulfonált származékát, a B-lánc S-szulfonált származékát vizes közegben — 8—12 pH-értéken,

- 0,1-50 mg/ml összes proteinkoncentráció mellett, és az összes A- és B-lánc S-szulfonált származékában jelenlévő, egy —SSO₃ csoportra számítva 0,4-2,5 —SH csoportot tartalmazó merkaptán jelenlétében reagáltatjuk, és az elegyet 0 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten, levegő, mint oxigénforrás vagy oxigén jelenlétében tartjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A-láncú S-szulfonátként és B-láncú S-szulfonátként a természetben előforduló inzulin A- és B-lánc aminosavszekvenciájának megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-lánc S-szulfonát-származékát a B-lánc S-szulfonát-származékához viszonyítva 0,1:1-10:1 súlyarányban alkalmazzuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-láncú S-szulfonát-származékot a B-láncú Sszulfonát-származékhoz viszonyítva 1:1-3:1 súlyarányban alkalmazzuk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 2-20 mg/ml proteinkoncentráció mellett végezzük.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegy pH-ját 9,5-11,0 közötti értéken tartjuk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle> hogy a reakcióelegy pH-ját 10,4-10,6 közötti p tartjuk.
8. Az 1—7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5 azzal jellemezve, hogy az összes A- és B-láncú S-szulfonát-származékban jelenlévő, egy -SSO₃ csoportra számítva 0,9-1,1 -SH csoportot tartalmazó merkaptánt alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 10 hogy merkaptánként a ditio-treitolt vagy a ditío-eritritolt alkalmazzuk.
10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyet 2—10 °C hőmérsékleten tartjuk.

15
11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás szarvasmarha, sertés vagy emberi inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti inzulinnak megfelelő A- és B-lánc S-szulfonált származékából indulunk ki.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás szarvasmarha20 inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha-inzulin A-lánc S-szulfonát-származékot a B-lánc

S-szulfonát-származékhoz viszonyítva 1,4:1,0-1,8:1,0 súlyarányban, 3-8 mg/ml proteinkoncentráció mellett alkalmazzuk.

25 13. A 11. igénypont szerinti eljárás sertésinzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a sertésinzulin A-lánc

S-szulfonát-származékot a B-lánc S-szulfonát-származékhcz viszonyítva 1,0:1,0-1,4:1,0 súlyarányban, 816 mg/ml proteinkoncentráció mellett alkalmazzuk.

30 14. A 11. igénypont szerinti eljárás emberi inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy az emberi inzulin az A-’ánc S-szulfonát-származékot a B-lánc S-szuifonátszármazékhoz viszonyítva 1,8:1,0-2,2:1,0 súlyarányban, 3-8 mg/ml proteinkoncentráció mellett alkalmaz35 zuk.