NO151897B - Fremgangsmaate for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog Download PDFInfo
- Publication number
- NO151897B NO151897B NO811038A NO811038A NO151897B NO 151897 B NO151897 B NO 151897B NO 811038 A NO811038 A NO 811038A NO 811038 A NO811038 A NO 811038A NO 151897 B NO151897 B NO 151897B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- chain
- solution
- molar
- approx
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 164
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 81
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 81
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 73
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 13
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 19
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 19
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 11
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 11
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YVOOPGWEIRIUOX-DKWTVANSSA-N (2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid;2-amino-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SC[C@H](N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229930195709 D-tyrosine Natural products 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PMLJIHNCYNOQEQ-REOHCLBHSA-N L-aspartic 1-amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PMLJIHNCYNOQEQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N L-tyrosinamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005684 Liebig rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- MKIJJIMOAABWGF-UHFFFAOYSA-N methyl 2-sulfanylacetate Chemical compound COC(=O)CS MKIJJIMOAABWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- -1 thiol compounds Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/067—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for sulfur-containing functions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog.
Med de muligheter som i dag foreligger for å fremstille proteinprodukter ved hjelp av rekambinante DNA-metoder og mer spesielt fremstillingen av insulin-A-kjeden og insulin-B-kjeden ved den teknikk, som f.eks. er beskrevet i Goeddel et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 76, 106-110 (1979, har det blitt et stadig økende behov for en effektiv fremgangsmåte som kan kombinere de nevnte A- og B-kjeder til insulin.
Tidligere kjente fremgangsmåter for fremstilling
av insulin ved å kombinere A- og B-kjedene, brukte som ut-gangsmaterialer A- og B-kjedene i form av deres stabile S-sulfonater. Vanligvis ble A- og B-kjede-S-sulfonatene,
enten separat eller sammen, redusert til d tilsvarende -6H-forbindelsene, vanligvis ved å bruke et stort overskudd av et tiolreduksjonsmiddel. Produktene ble så isolert fra det reduserende medium, og hvis de ikke var redusert sammen,
bragt sammen i et oksyderende medium, f.eks. luft, hvorved man fikk en kombinasjon av A- og B-kjedene og en fremstilling av insulin. Eksempler på denne metodeteknikk kan bl.a.
finnes i Du et al., Scientia Sinica 10, 84-104 (1961), Wilson et al., Biochim. Biophys. Acta 62, 483-489 (1962), Du et al., Scientia Sinica 14, 229-236 (1965), Kung et al., Scientia Sinica 15, 544-561 (1966), Kexue Tongbao (Kina) 17, 241-277
(1966), og Markussen, J. Acta Paediatrica Scandinavica,
Suppl. 270, 121-126 (1977).
En modifikasjon av denne fremgangsmåte innbefatter
at man reduserer A-kjede-S-sulfonatet fulgt av en reaksjon mellom den reduserte A-kjeden og B-kjede-S-sulfonatet i en oksyderende atmosfære. Se f.eks. Katsoyannis et al., Proe.
Nat. Acad. Sei. (U.S.A.) 55, 1554-1561 (1966), Katsoyannis, Science 154', 1509-1514 (1966), Katsoyannis et al., Bio-chemistry 6, 2642-2655 (1967), U.S. patent nr. 3.420.810 og Jentsch, Journal of Chromotography 76, 167-174 (1973).
En annen modifikasjon innbefatter delvis oksyda-
sjon av A-kjede-SH-forbindelsen til et disulfid mellom A-6-
og A-ll-cysteinresiduaene fulgt av en oksydasjon av produk-
tet med B-kjede-SH- eller B-kjede-S-sulfonat. Se f.eks.
belgisk patent nr. 676.069 og Zahn et al., Liebigs Ann. Chem. 691, 225-231 (1966).
I alle de ovennevnte kjente fremgangsmåter er det
ett felles trekk, dvs. fremstillingen av insulin ved to uav-hengige etterfølgende trinn, dvs. reduksjon av S-sulfonat til -SH, fulgt av oksydasjon til -S-S-.
Dixon et al., Nature 188, 721-724 (1960) beskriver tilstander som antyder en enkelt oppløsningsomdannelse av A- og B-kjede-S-sulfonater til insulin ved å bruke et tiolreduksjonsmiddel og luftoksydasjon. Detaljene er relativt sparsomme, og utbyttet, basert på aktiviteten av det innvundne produkt, er angitt til 1-2%. Imidlertid så er Dixon i Proe. Intern. Congr. Endecrinol, 2. utgave, London 1964, 1207-1215 (1965) mer detaljert, og antyder i tabell IV på side 1211 at de tilstander som er angitt i den tidligere publikasjonen, innbefatter separate reduksjons- og oksy-dasjonstrinn.
I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter
har man nå oppdaget at det er mulig under definerte reak-sjonsbetingelser å oppnå tilfredsstillende nivåer med hen-
syn til fremstillingen av insuliner eller analoger av insuliner fra S-sulfonerte A- og B-kjeder, ved at man utfører både reduksjon og oksydasjonsreaksjon i ett enkelt trinn i en prosess hvor man anvender én enkelt oppløsning. Oppfinnelsen angår en slik fremgangsmåte.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt
en fremgangsmåte for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog ved å kombinere en A-kjede av et insulin eller en insulinanalog og en B-kjede av et insulin eller en insulinanalog, og denne fremgangsmåte er kjenne-tegnet ved at man reagerer den S-sulfonerte formen av A-kjeden, den S-sulfonerte formen av B-kjeden og et tiolreduksjonsmiddel i et vandig medium under slike betingelser at man får en blanding med (1) pH 8-12, (2) en total proteinkonsentrasjon på 0,1-50 mg pr. ml og (3) en total mengde av nevnte
tiolreduksjonsmiddel slik at man får tilveiebragt fra 0,4 til 2,5 -SH-grupper pr. -SS03 -grupper i den totale mengde av nevnte A- og B-kjede-S-sulfonater, hvorved man får dannet et insulin eller en insulinanalog ved å holde blandingen ved en temperatur på 0-25°C i et miljø sem tilveiebringer en oksygenkilde.
Denne fremgangsmåte representerer en effektiv, enkelt-trinns, enkeltoppløsnings-prosess for fremstilling av insu-
lin eller en analog av insulin fra dens S-suifonerte A- og B-kjeder.
Med begrepet "insulin" forstås selvsagt ethvert naturlig forekommende insulin, såsom det som forekommer hos mennesker, svin, fjærkre, sau, fisk, fugler o.l., så-
vel som hybrider dannet ved en kombinasjon av en A-kjede fra én art og en .B-kjede fra en annen.
Med begrepet "insulinanalog" forstås enhver av
en rekke proteiner som hvert enkelt inneholder den basiske A-kjede og B-kjede inneholdende alle de halv-cysteinresidua
i samme rekkefølge som man finner i naturlige insuliner.
Disse analoger skiller seg fra naturlige insuliner ved sub-stitusjon, addisjon, utelukkelse eller modifikasjon i ett eller flere aminosyreresidua, men har bibeholdt disulfid-bindingsarrangementet og i det minste en del av en insulin-lignende aktivitet. Eksempler på slike analoger er [N-formyl-Gly^"-A] insulin, Desamino-A^-insulin, [Sarcosin^-A]-1 21
insulin, [L-Alanin -A]insulin, [D-Aspargin -A]insulin,
21 0 21 21 [Isoaspargin -A]insulin, [D-Aspargin -A]insulin, [Arginin 21 1
A]insulin, [Asparaginamid -A]insulin, [Sarcosin -A, Asparagin 21 -A]insulin, [Norleucin 2 -A]insulin, [Threonin 5-A]insulin,
5 19 19 [Leucin -A]insulin, [Fenylalanin -A]insulin, [D-Tyrosin A]insulin, [Tyrosin 18 -A, Asparagin 19 -A, Arginin <21->A]insulin, 28—30 27—30 Des[B -tripeptid]insulin, Des[B -tetrapeptid]insu-
lin, Des[B -pentapeptid]insulin, Des[B ~ -tetrapeptid, Tyrosinamid -B]insulin, Des[B ~ -pentapeptid, Fenylalanin-amid^-B] insulin, [Leucin^-B] insulin, Des [Fenylalanin^-B]-insulin og lignende. Disse og andre analoger er beskrevet i litteraturen, se f.eks. Blundell, T. et al., Advances in Protein Chemistry, 26, 330-362, Academic Press, New York,
(1972), Katsoyannis, P.G., Treatment of Early Diabetes, 319-327, Plenum Publishing Corp. (1979), Geiger, R., Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111-12 9, Dr. A. Huthig, Publsher, Heidelberg, Vest-Tyskland (1976), Brandenburg, D. et al., Biochem. J. 125, 51-52 (1971).
Skjønt foreliggende fremgangsmåte er anvendbar
for fremstilling av insuliner og insulinanaloger, så er det foretrukket å bruke den for fremstilling av naturlig forekommende insuliner, da spesielt insulin fra mennesker, storfe eller svin, og da spesielt insulin for mennesker.
Ved gjennomføring av foreliggende fremgangsmåte så kan en kombinasjon av A- og B-kjeden for fremstilling insulin eller en insulinanalog oppnås innenfor et vidt område med hensyn til forhold mellom én kjede til den annen. Kom-binasjonen er selvsagt begrenset av den kjede, enten dette nå er A eller B,som er tilstede i den minste mengde. I ethvert tilfelle, skjønt det ikke er kritisk, så vil det van-lige forhold mellom A- og B-kjeden på vektbasis ligge fra 0,1:1 til ca. 10:1. Det er foretrukket å gjennomføre foreliggende fremgangsmåte ved å bruke et vektforhold mellom A-og B-kjeden i området fra 1:1 til 3:1. Man har også oppdaget at innenfor dette området er det visse områder som er spesielt fordelaktige for fremstilling av en spesiell type insulin. Når man f.eks. ønsker å kombinere en A- og B-kjede for fremstilling av storfeinsulin, så er det foretrukket at forholdet mellom A-og B-kjeden ligger i området fra ca.1,4:1 til 1,8:1. • Med hensyn til svineinsulin, så
er det foretrukket at nevnte variasjonsområde ligger fra 1,0:1,0 til 1,4:1,0. Med hensyn til menneskeinsulin, så
er det foretrukne området fra ca. 1,8:1,0 til ca. 2,2:1,0.
En annen parameter som er av betydning for gjennom-føring av foreliggende fremgangsmåte er proteinkonsentra-sjonen i reaksjonsmediet. Fremgangsmåten kan gjennomføres med godt resultat innenfor et vidt område med hensyn til proteinkonsentrasjoner. Vanligvis vil imidlertid protein-konsentrasjonen variere fra 0,1 - 50 mg pr. ml reaksjons-medium. Fortrinnsvis bør nevnte konsentrasjon av protein ligge i området fra ca. 2 - ca. 20 mg pr. ml. Igjen har man oppdaget at innenfor nevnte variasjonsområde så fins der optimale proteinkonsentrasjoner som varierer avhengig av den type insulin som fremstilles. Hvis man f.eks. ønsker å fremstille svineinsulin, så er det foretrukket at protein-konsentras jonen varierer fra ca. 8 - 16 mg pr. ml, mens man ved fremstillingen av menneske- eller storfeinsulin har et foretrukket område fra ca. 3 - ca. 8 mg pr. ml.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gjennomføres i et vandig medium. pH på nevnte medium målt ved romtemperatur vil vanligvis ligge fra ca. 8 - ca. 12. Fortrinnsvis vil den ligge i området fra 9,5 - 11,0 og op-timalt i området fra ca. 10,4 - ca. 10,6. pH i mediet kan opprettholdes i det forønskede området ved hjelp av egnede bufringsmidler. Typiske bufringsmidler i så henseende er f. eks. glycin, glycylglycin, karbonat, tris(hydroksymetyl)-aminometan, N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin, pyrofosfat, fil-tr is (hydroksymetyl) me tyl-3-aminopropansulfonsyre og lignende som effektivt gir en pH-kontroll innenfor de foran-nevnte områder. Et vanlig og foretrukket bufringsmiddel er glycin.
Konsentrasjonen av bufringsmidlet ligger vanligvis fra ca. 0,001-molar til 2-molar. Foretrukket er konsentrasjonen fra 0,01- til ca. 1-molar, mest foretrukket fra 0,01-molar til 0,1-molar.
A- og B-kjedene bringes sammen i nevnte passende vandige medium i nærvær av et tiolreduksjonsmiddel. Med begrepet "tiolreduksjonsmiddel" forstås en forbindelse som inneholder minst én -SH-gruppe og som har evne til effektivt å redusere S-sulfonatgruppene i A- og B-kjedene. Skjønt man kan bruke enhver forbindelse som har de nevnte egenskap-er, så er det foretrukket at det brukte tiolreduksjonsmidlet er ett som i sin oksyderte form kan sykliseres til en meget stabil forbindelse. Tiolreduksjonsmidlet brukes i en mengde som gir fra 0,4 - 2,5 -SH-grupper pr. -SS03~-grupper som er tilstede totalt i A- og B-gruppen, og fortrinnsvis bør mengden være slik at man får 0,9 - 1,1 -SH-grupper pr. hver
-SSO^--gruppe.
Eksempler på typiske tiolreduksjonsmidler er ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE), 2-merkaptoetanol, metyltioglykolat, 3-merkapto-l,2-propandiol, 3-merkapto-propionsyre, tioglykolinsyre, 2-amino-3-merkaptopropion-syre (cystein) og andre slike tiolforbindelser. Foretrukne tiolreduksjonsmidler er ditiotreitol og ditioerytritol og av disse er ditiotreitol den mest foretrukne.
Et vesentlig trekk ved foreliggende fremgangsmåte er at den gjennomføres i et miljø som tilveiebringer en oksygenkilde. Dette kan lett oppfylles ved at reaksjons-blandingen eksponeres overfor luft. Skjønt man kan bruke en mer direkte kontaktmetode, f.eks. ved at man bobler luft eller oksygen inn og gjennom reaksjonsmediet, så er dette vanligvis ikke nødvendig.
Foreliggende fremgangsmåte gjennomføres derfor generelt ved at man fremstiller en blanding av A-kjede-S-sulfonat, B-kjede-S-sulfonat og nevnte tiolreduksjonsmiddel i de forønskede konsentrasjoner i et vandig medium ved en pH fra 8-12. Blandingen som står åpen for luftkontakt blir forsiktig rørt i et tilstrekkelig langt tidsrom til at man får en kjedekombinasjon, dvs. vanligvis minst ca. en halv time. Under denne røreperiode vil blandingen generelt holdes på en temperatur fra ca. 0 - ca. 25°C, vanligvis er det imidlertid foretrukket at blandingen underkastes mode-rat avkjøling slik at temperaturen holder seg i den nedre ende av nevnte temperaturområde, vanligvis fra ca. 2 - ca. 10°C.
Så snart reaksjonen er fullstendig, så kan insulin eller insulinanalogproduktet isoleres på en rekke forskjel-lige måter, og en rekke av disse er kjent innenfor insulin-teknologien. Den mest vanlig anvendte teknikk for insulin-rensing er kromatografisk teknikk. Disse lar seg lett an-vende for innvinning av insulin fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Nevnte teknikk kan innbefatte gel-filtreringskromatografi eller ioneutbyttingskromatografi. Videre kan produktet bedømmes for renhet og aktivitet ved hjelp av kjente fremgangsmåter, såsom polyakrylamid-gelelektroforese, aminosyreanalyse, insulinradioreseptor-prøve, insulinradioimmunoprøve, høytrykks-væskekromatogra-fi (HPLC), ultraviolett spektrumsundersøkelse, dansylering, prøver ved hjelp av kaninblodglukose og lignende.
De insuliner som er tilgjengelige ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte innbefatter hybrider som består av A-kjeden fra én art av insulin og B-kjeden fra en annen type. Foreliggende oppfinnelse angår generelt en kombinasjon av A- og B-kjede-S-sulfonatene, og den spesielle struk-tur som måtte forefinnes i disse kjeder, så lenge de er virkelige representanter for insulin og insulinanalog-A- og B-kjeder er uten betydning for foreliggende fremgangsmåte.
Skjønt man kan fremstille en insulinanalog eller en insulinhybrid, f.eks. ved hjelp av en A-kjede fra én type insulin og en B-kjede fra en annen, så er det selvsagt foretrukket å fremstille et insulin som er strukturelt iden-tisk med et naturlig forekommende insulin, noe som kan gjøres ved å bruke et A-kjede-S-sulfonat og et B-kjede-S-sulfonat som hver har samme aminosyresekvens som i nevnte naturlige insulin. Det er videre meget foretrukket å bruke foreliggende fremgangsmåte for å fremstille svineinsulin, storfeinsulin eller menneskeinsulin, og mest foretrukket er det å fremstille sistnevnte type insulin.
Insulin eller insulinanalog-A- eller B-kjeder er som allerede angitt, tilgjengelige ved hjelp av rekombinant DNA-hetoder. De kan også fremstilles fra naturlige insuliner eller ved klassisk peptidsynteseteknikk, enten dette fore-går i fast fase eller i oppløsning.
A- og B-kjedene holdes i stabil form som S-sulfonater. Disse S-sulfonat-utgangsmaterialene er tilgjengelige ved oksydativ sulfittolyse, en behandling ved hjelp av hvil-ken A- og B-kjedene reageres med natriumsulfitt i nærvær av et svakt oksydasjonsmiddel, såsom natriumtetrationat.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Eksemplene er tilveiebragt kun for illustrerende formål og er således ikke begrensende for oppfinnelsen som sådan.
Eksempel 1
360 mg svine A-kjede-S-sulfonat ble oppløst i
36 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 5N NaOH. Svine B-kjede-S-sulfonat (300 mg) ble oppløst i 30 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på denne blandingen ble justert til 10,5 med 5N NaOH. Ditiotreitol (DTT) (123,4 mg) ble oppløst i 0,4 ml av nevnte 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 0,2 ml 5N NaOH. A- og B-kjedeoppløsningene ble kombinert i en 100 ml ampulle ved romtemperatur (ca. 25°C) og 1,91 ml av DTT-oppløsning ble tilsatt slik at man fikk et -SH til -SSO^ - forhold på 1,04. Den resulterende oppløsningen ble forsiktig rørt i et åpent beger med magnetisk røring ved 4 - 8°C i 20 timer. Analyse ved hjelp av høytrykks-væskekromatogra-fi (HPLC) indikerte et insulinutbytte på 193,8 mg eller 29% av det totale protein. 40 ml av denne oppløsningen ble justert til pH 3,15 med eddiksyre. Blandingen ble gelfiltrert på en 5 x 200 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. Insulintoppen (elueringsvolum 2450-2700 ml) ble kombinert og lyofilisert med et utbytte på 95 mg insulin eller ca. 25% av det totale protein. Nevnte svineinsulin ble bedømt relativt rent ved hjelp av en polyakrylamidgel-elektroforese, aminosyreanalyse, insulinradioreseptorprøve og HPLC og en reduksjonsprøve ved hjelp av kaninblodglukose.
Eksempel 2
Oppløsninger av storfe A- og B-kjede-S-sulfonater med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,01-molar glycinbuffer (pH 10,5) ble fremstilt. pH for hver av oppløsningene ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst
i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH ble justert til nevnte verdi med 0,15 ml 5N NaOH. 0,5 ml av B-kjedeopp-løsningen ble tilsatt 0,8 ml av A-kjedeoppløsningen og 0,035 ml av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (ca. 25°C), hvorved man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 0,91. Den resulter-
ende oppløsningen ble rørt ved 4 - 8°C i 2 0 timer i en cipen 3 ml ampulle. Høytrykkskromatografianalyse av blandingen indikerte et utbytte av storfeinsulin på 1,96 mg eller ca. 30% av det totale protein.
Eksempel 3
Oppløsninger av svine A- og B-kjede-S-sulfonater med en konsentrasjon på 10 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) ble fremstilt. pH for hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 2,0 ml glassdestillert vann. 0,5 ml av B-kjedeoppløsningen ble tilsatt 0,6 ml av A-kjedeoppløsningen, og det hele ble tilsatt 29,25 yl av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (ca. 25°C), hvorved man fikk et -SH til -SS03"-forhold på 1,00. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8 C i en åpen 3 ml ampulle i 20 timer. En høytrykkskromatografianalyse av blandingen indikerte et utbytte av svineinsulin på 3,81 mg eller ca. 35% av det totale protein.
Eksempel 4
Det ble fremstilt humant (pankreatisk) B-kjede-S-sulfonat og flere typer humane (pankreatiske og E. coli) og svine (pankreatiske) A-kjede-S-sulfonatoppløsninger med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer
(pH 10,5). pH på hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH justert til denne verdi med 0,16 ml 5N NaOH. 1,0 ml av hver av A-kjede-S-sulfonatoppløs-ningene ble tilsatt 0,5 ml av B-kjede-S-sulfonatoppløsningen og 0,05 ml DTT-oppløsning ved romtemperatur (ca. 25°C) hvorved man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Alle opp-løsninger ble rørt ved 4 - 8°C i en åpen ampulle i 20 - 22 timer. De ble så analysert ved hjelp av høytrykkskromato-grafi idet man brukte en pankreatisk menneskeinsulinstan-dard for beregning av utbyttet. Resultatene er angitt i den nedenforstående tabell.
Eksempel 5
En oppløsning av hver av de humane A- og B-kjede-S-sulfonater ble fremstilt med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). pH i hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5),
og pH ble justert til 10,5 med 0,16 ml 5N NaOH. 0,5 ml av nevnte B-kjedeoppløsning ble ved romtemperatur tilsatt 1,0
ml A-kjedeoppløsning fulgt av 50 yl av DTT-oppløsningen slik at man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8 C i en åpen 3 ml ampulle i 22 timer hvoretter en analyse ved hjelp av høy-trykkskromatografi indikerte et utbytte av humant insulin på 2,58 mg eller 34% av det totale protein.
Eksempel 6
328 mg humant A-kjede-S-sulfonat ble oppløst i
65,6 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og blandingens pH ble justert til 10,5 med 75 yl 5N NaOH. 164 mg humant B-kjede-S-sulfonat ble oppløst i 32,8 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 15 ml 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml av nevnte 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på oppløsning-en ble justert til nevnte 10,5 med 160 yl 5N NaOH.
A- og B-kjedeoppløsningene ble slått sammen i et 150 ml glassbeger ved romtemperatur (ca. 25°C) og 3,28 ml DTT-oppløsning ble tilsatt slik at man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Det åpne begeret ble plassert i et is-vannbad i et avkjølt rom og rørt kraftig en halv time. Opp-løsningen ble så rørt ytterligere 24 timer i et avkjølt rom ved 4 - 8°C. Kromatografisk analyse på dette tidspunkt indikerte et utbytte av humant insulin på 148 mg eller 30% av det totale protein.
100 ml av denne oppløsningen ble tilsatt 25 ml iseddik til en slutt-pH på 3,15. Denne hele prøven ble gelfiltrert på en 5 x 200 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. Alt eluert protein ble lyofilisert. Insulintoppen (elueringsvolum 2465-2781 ml) veide 125 mg og representerte 29,4% av det innvundne protein.
En del av den ovennevnte insulintopp (95,5 mg)
ble oppløst i 9 ml 0,01-molar tris-0,001-molar EDTA - 7,5-molar urea-0,03-molar NaCl-buffer (pH 8,5 ved 4°C). Blandingen ble kromatografert gjennom en 2,5 x 90 cm DEAE (dietyl-aminoetyl)-cellulose-ioneutbytningskolonne ekvilibrert med samme buffer. Proteinet ble eluert ved 4 - 8°C med en gra-dient på 1 liter hver av 0,03-molar og 0,09-molar NaCl i samme buffer fulgt av 1 liter buffer inneholdende 1-molar NaCl. Hver av toppene ble avsaltet på "Sephadex G-25"
(grov type) kolonne i 2% eddiksyre og lyofilisert. Insulintoppen (elueringsvolum 878-1008 ml) veide 55,73 mg og representerte 84% av det innvundne protein.
Sinkinsulinkrystaller ble fremstilt ved å oppløse 11,90 mg av insulin-(DEAE)topprøven i 240 yl 0,1N HC1 fulgt raskt av 2,16 ml av 0,04% oppløsning av en ZnC^-0,05-molar natriumcitrat-15% aceton i et glassentrifugerør. Utkrystal-liseringen skjer i løpet av 72 timer ved romtemperatur (ca. 25°C) hvoretter den overliggende væske ble fjernet og krystallene vasket to ganger med kaldt vann med pH 6,1 og sen-trifugert ved 2000 omdr./min. ved 3°C mellom vaskingene. Krystallene ble så gjenoppløst i 0,01N HC1 for analyse.
Det resulterende humane insulinpreparat ble be-dømt til å være relativt rent ved en polyakrylamidgelelektro-forese (et enkelt bånd), aminosyreanalyse, insulinradiore-septorprøve, insulinradioimmunoprøve, HPLC, dansylering og
UV-spektrum. USP- kaninprøven (144 kaniner) ga en styrke
på 26,3 - 1,8 enheter pr. mg (vannfritt).
Eksempel 7
Det ble fremstilt oppløsninger av humant (E. coli)
[N-formyl-Gly^]-A-kjede-S-sulfonat og humant (pankreatisk) B-kjede-S-sulfonat i en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). pH i hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH ble justert til 10,5 med 0,16 ml 5N NaOH. 0,5 ml av B-kjede-S-sulfo-natoppløsningen ble tilsatt 0,1 ml av [N-formyl-Gly"'"] -A-kjede-S-sulf onatoppløsningen og 0,05 ml av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (25°C), hvorved man fikk et -SH til -SSO^ - forhold på 1,10. Oppløsningen ble rørt i et avkjølt rom
(4 - 8°C) i en åpen 3 ml ampulle i 23 timer og en analyse indikerte et utbytte av [N-formyl-Gly^-A] humant insulin på 1,46 mg eller 19,5% av det totale protein.
Etter surgjøring til pH 3,15 med iseddik ble en
del av oppløsningen gelfUtrert på en 1,5 x 90 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. ■ [N-f ormyl-Gly^A] human-insulintoppen (elueringsvolum 87-95 ml) ble slått sammen, oppdelt i porsjoner og lyofilisert. Proteinet ble bedømt som relativt rent ved kromatografisk analyse og aminosyreanalyse. Bioaktiviteten for dette [N-formyl-Gly^-A] humane insulin ble ved hjelp av en radioreseptorprøve bedømt til å være 17% i forhold til en human insulinstandard.
Eksempel 8
En oppløsning av svin A-kjede-S-sulfonat og
humant (E. coli) B-kjede-S-sulfonat ble fremstilt i en konsentrasjon på 10 mg pr. ml i en 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). En A-B-blanding ble fremstilt ved å bruke 2 ml av A-kjedeoppløsningen for hver 1 ml av B-kjedeoppløsningen. A-B-blandingen ble justert til pH 10,5 med 5N NaOH. 121,2
mg cystein ble oppløst i 3,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH ble justert til nevnte verdi med 0,35 ml 5N NaOH. 1,4 ml av A-B-blandingen ble ved romtemperatur til-
satt 52 yl av cysteinoppløsningen, slik at man fikk et -SH til -SSO^ -forhold på 0,95. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8°C i en åpen 3 ml ampulle i 20 timer, og kromatografisk analyse ga et humant insulinutbytte på
3,25 g eller 23,2% av det totale protein.
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av et insulin elleren insulinanalog ved å kombinere en A-kjede av et insulin eller en insulinanalog og en B-kjede av et insulin eller en insulinanalog, karakterisert ved at man reagerer den S-sulfonerte formen av A-kjeden, den S-sulfonerte formen av B-kjeden og et tiolreduksjonsmiddel i et vandig medium under slike betingelser at man får en blanding med (1) pH 8-12, (2) en totalproteinkonsentrasjon på 0,1-50 mg pr. ml, og (3) en total mengde av nevnte tiolreduksjonsmiddel slik at man får tilveiebragt på 0,4 til 2,5 -SH-grupper pr. -SS03~-gruppe i den totale mengde av nevnte A- og B-kjede-S-sulfonater, hvorved man får dannet et insulin eller en insulinanalog ved å holde blandingen ved en temperatur på 0-25°C i et miljø som tilveiebringer en oksygenkilde.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13439080A | 1980-03-27 | 1980-03-27 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO811038L NO811038L (no) | 1981-09-28 |
| NO151897B true NO151897B (no) | 1985-03-18 |
| NO151897C NO151897C (no) | 1985-06-26 |
Family
ID=22463156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO811038A NO151897C (no) | 1980-03-27 | 1981-03-26 | Fremgangsmaate for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0037256B1 (no) |
| JP (1) | JPS56154443A (no) |
| KR (1) | KR840000947B1 (no) |
| AR (1) | AR227305A1 (no) |
| AT (1) | ATE4638T1 (no) |
| AU (1) | AU540645B2 (no) |
| CA (1) | CA1155109A (no) |
| CS (1) | CS236463B2 (no) |
| DD (1) | DD157613A5 (no) |
| DE (1) | DE3160862D1 (no) |
| DK (1) | DK149756C (no) |
| EG (1) | EG15248A (no) |
| ES (1) | ES8207551A1 (no) |
| FI (1) | FI810918L (no) |
| GB (1) | GB2072680B (no) |
| GR (1) | GR73619B (no) |
| HU (1) | HU185416B (no) |
| IE (1) | IE51608B1 (no) |
| IL (1) | IL62483A (no) |
| NO (1) | NO151897C (no) |
| NZ (1) | NZ196610A (no) |
| PH (1) | PH16153A (no) |
| PL (1) | PL128599B1 (no) |
| PT (1) | PT72733B (no) |
| RO (1) | RO81640B (no) |
| SU (1) | SU1327790A3 (no) |
| YU (1) | YU76981A (no) |
| ZA (1) | ZA811970B (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4451396A (en) * | 1983-08-01 | 1984-05-29 | Eli Lilly And Company | Process for inhibiting undesired thiol reactions during cyanogen bromide cleavage of peptides |
| DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
| US4835251A (en) * | 1986-06-23 | 1989-05-30 | Genetech, Inc. | Method of chain combination |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| JP2606100Y2 (ja) * | 1992-04-15 | 2000-09-11 | 松下電器産業株式会社 | 電気掃除機とそのパックフィルター |
| JP3406244B2 (ja) * | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
-
1981
- 1981-03-24 YU YU00769/81A patent/YU76981A/xx unknown
- 1981-03-24 PL PL1981230295A patent/PL128599B1/pl unknown
- 1981-03-24 EG EG159/81A patent/EG15248A/xx active
- 1981-03-24 PH PH25409A patent/PH16153A/en unknown
- 1981-03-24 NZ NZ196610A patent/NZ196610A/en unknown
- 1981-03-24 ZA ZA00811970A patent/ZA811970B/xx unknown
- 1981-03-24 CA CA000373706A patent/CA1155109A/en not_active Expired
- 1981-03-24 RO RO103807A patent/RO81640B/ro unknown
- 1981-03-25 FI FI810918A patent/FI810918L/fi not_active Application Discontinuation
- 1981-03-25 IL IL62483A patent/IL62483A/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-03-25 PT PT72733A patent/PT72733B/pt unknown
- 1981-03-26 GB GB8109542A patent/GB2072680B/en not_active Expired
- 1981-03-26 SU SU813269596A patent/SU1327790A3/ru active
- 1981-03-26 AT AT81301306T patent/ATE4638T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-03-26 DK DK136581A patent/DK149756C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-03-26 IE IE680/81A patent/IE51608B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-03-26 GR GR64491A patent/GR73619B/el unknown
- 1981-03-26 EP EP81301306A patent/EP0037256B1/en not_active Expired
- 1981-03-26 NO NO811038A patent/NO151897C/no unknown
- 1981-03-26 HU HU81771A patent/HU185416B/hu not_active IP Right Cessation
- 1981-03-26 DD DD81228623A patent/DD157613A5/de unknown
- 1981-03-26 KR KR1019810000990A patent/KR840000947B1/ko active
- 1981-03-26 DE DE8181301306T patent/DE3160862D1/de not_active Expired
- 1981-03-26 ES ES500750A patent/ES8207551A1/es not_active Expired
- 1981-03-27 CS CS812273A patent/CS236463B2/cs unknown
- 1981-03-27 JP JP4612481A patent/JPS56154443A/ja active Granted
- 1981-03-27 AU AU68844/81A patent/AU540645B2/en not_active Ceased
- 1981-03-27 AR AR284772A patent/AR227305A1/es active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4743679A (en) | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof | |
| Inouye et al. | Overexpression and purification of the recombinant Ca2+-binding protein, apoaequorin | |
| NO864555L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinpreparat. | |
| FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| Chang et al. | Chemical modification of the tryptophan residue in cobratoxin | |
| WO1999042116A1 (en) | Novel disulfides and thiol compounds | |
| Matsueda et al. | 3-Nitro-2-pyridinesulfenyl group for protection and activation of the thiol function of cysteine | |
| US4351764A (en) | Process for the selective formation of disulfide bridges in polypeptides and therapeutic compositions | |
| Greff et al. | Conformational studies of corticotropin1–32 and constitutive peptides by circular dichroism | |
| US4489159A (en) | Process for preparing esters of human insulin | |
| NO151897B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog | |
| CA2063273C (en) | Surfactant compositions and methods | |
| Caccia et al. | Stabilization of recombinant human basic fibroblast growth factor by chemical modifications of cysteine residues | |
| WO2012115638A1 (en) | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom | |
| EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| DK154573B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende praeproinsulinanaloge | |
| CA1045626A (en) | Process for the manufacture of peptides containing cystine | |
| CS271191A3 (en) | Enzymatic process of pre-proinsulins to insulins conversion | |
| EP0226827B1 (en) | Protection of methionine in a polypeptide chain from irreversible oxidation | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| NO178861B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforlöper | |
| Hua et al. | The interaction of the S-thiomethyl insulin A and B chains in solution | |
| US20160039899A1 (en) | Lis-pro proinsulin compositions and methods of producing lis-pro insulin analogs therefrom | |
| PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
| Markussen et al. | SEPARATION OF THE TWO DOUBLE‐CHAIN BOVINE INTERMEDIATES OF THE PROINSULIN‐INSULIN CONVERSION I. CHEMICAL, IMMUNOCHEMICAL, CIRCULAR DICHROISM, AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION |