NO151897B - Fremgangsmaate for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog.

Med de muligheter som i dag foreligger for å fremstille proteinprodukter ved hjelp av rekambinante DNA-metoder og mer spesielt fremstillingen av insulin-A-kjeden og insulin-B-kjeden ved den teknikk, som f.eks. er beskrevet i Goeddel et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 76, 106-110 (1979, har det blitt et stadig økende behov for en effektiv fremgangsmåte som kan kombinere de nevnte A- og B-kjeder til insulin.

Tidligere kjente fremgangsmåter for fremstilling

av insulin ved å kombinere A- og B-kjedene, brukte som ut-gangsmaterialer A- og B-kjedene i form av deres stabile S-sulfonater. Vanligvis ble A- og B-kjede-S-sulfonatene,

enten separat eller sammen, redusert til d tilsvarende -6H-forbindelsene, vanligvis ved å bruke et stort overskudd av et tiolreduksjonsmiddel. Produktene ble så isolert fra det reduserende medium, og hvis de ikke var redusert sammen,

bragt sammen i et oksyderende medium, f.eks. luft, hvorved man fikk en kombinasjon av A- og B-kjedene og en fremstilling av insulin. Eksempler på denne metodeteknikk kan bl.a.

finnes i Du et al., Scientia Sinica 10, 84-104 (1961), Wilson et al., Biochim. Biophys. Acta 62, 483-489 (1962), Du et al., Scientia Sinica 14, 229-236 (1965), Kung et al., Scientia Sinica 15, 544-561 (1966), Kexue Tongbao (Kina) 17, 241-277

(1966), og Markussen, J. Acta Paediatrica Scandinavica,

Suppl. 270, 121-126 (1977).

En modifikasjon av denne fremgangsmåte innbefatter

at man reduserer A-kjede-S-sulfonatet fulgt av en reaksjon mellom den reduserte A-kjeden og B-kjede-S-sulfonatet i en oksyderende atmosfære. Se f.eks. Katsoyannis et al., Proe.

Nat. Acad. Sei. (U.S.A.) 55, 1554-1561 (1966), Katsoyannis, Science 154', 1509-1514 (1966), Katsoyannis et al., Bio-chemistry 6, 2642-2655 (1967), U.S. patent nr. 3.420.810 og Jentsch, Journal of Chromotography 76, 167-174 (1973).

En annen modifikasjon innbefatter delvis oksyda-

sjon av A-kjede-SH-forbindelsen til et disulfid mellom A-6-

og A-ll-cysteinresiduaene fulgt av en oksydasjon av produk-

tet med B-kjede-SH- eller B-kjede-S-sulfonat. Se f.eks.

belgisk patent nr. 676.069 og Zahn et al., Liebigs Ann. Chem. 691, 225-231 (1966).

I alle de ovennevnte kjente fremgangsmåter er det

ett felles trekk, dvs. fremstillingen av insulin ved to uav-hengige etterfølgende trinn, dvs. reduksjon av S-sulfonat til -SH, fulgt av oksydasjon til -S-S-.

Dixon et al., Nature 188, 721-724 (1960) beskriver tilstander som antyder en enkelt oppløsningsomdannelse av A- og B-kjede-S-sulfonater til insulin ved å bruke et tiolreduksjonsmiddel og luftoksydasjon. Detaljene er relativt sparsomme, og utbyttet, basert på aktiviteten av det innvundne produkt, er angitt til 1-2%. Imidlertid så er Dixon i Proe. Intern. Congr. Endecrinol, 2. utgave, London 1964, 1207-1215 (1965) mer detaljert, og antyder i tabell IV på side 1211 at de tilstander som er angitt i den tidligere publikasjonen, innbefatter separate reduksjons- og oksy-dasjonstrinn.

I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter

har man nå oppdaget at det er mulig under definerte reak-sjonsbetingelser å oppnå tilfredsstillende nivåer med hen-

syn til fremstillingen av insuliner eller analoger av insuliner fra S-sulfonerte A- og B-kjeder, ved at man utfører både reduksjon og oksydasjonsreaksjon i ett enkelt trinn i en prosess hvor man anvender én enkelt oppløsning. Oppfinnelsen angår en slik fremgangsmåte.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt

en fremgangsmåte for fremstilling av et insulin eller en insulinanalog ved å kombinere en A-kjede av et insulin eller en insulinanalog og en B-kjede av et insulin eller en insulinanalog, og denne fremgangsmåte er kjenne-tegnet ved at man reagerer den S-sulfonerte formen av A-kjeden, den S-sulfonerte formen av B-kjeden og et tiolreduksjonsmiddel i et vandig medium under slike betingelser at man får en blanding med (1) pH 8-12, (2) en total proteinkonsentrasjon på 0,1-50 mg pr. ml og (3) en total mengde av nevnte

tiolreduksjonsmiddel slik at man får tilveiebragt fra 0,4 til 2,5 -SH-grupper pr. -SS03 -grupper i den totale mengde av nevnte A- og B-kjede-S-sulfonater, hvorved man får dannet et insulin eller en insulinanalog ved å holde blandingen ved en temperatur på 0-25°C i et miljø sem tilveiebringer en oksygenkilde.

Denne fremgangsmåte representerer en effektiv, enkelt-trinns, enkeltoppløsnings-prosess for fremstilling av insu-

lin eller en analog av insulin fra dens S-suifonerte A- og B-kjeder.

Med begrepet "insulin" forstås selvsagt ethvert naturlig forekommende insulin, såsom det som forekommer hos mennesker, svin, fjærkre, sau, fisk, fugler o.l., så-

vel som hybrider dannet ved en kombinasjon av en A-kjede fra én art og en .B-kjede fra en annen.

Med begrepet "insulinanalog" forstås enhver av

en rekke proteiner som hvert enkelt inneholder den basiske A-kjede og B-kjede inneholdende alle de halv-cysteinresidua

i samme rekkefølge som man finner i naturlige insuliner.

Disse analoger skiller seg fra naturlige insuliner ved sub-stitusjon, addisjon, utelukkelse eller modifikasjon i ett eller flere aminosyreresidua, men har bibeholdt disulfid-bindingsarrangementet og i det minste en del av en insulin-lignende aktivitet. Eksempler på slike analoger er [N-formyl-Gly^"-A] insulin, Desamino-A^-insulin, [Sarcosin^-A]-1 21

insulin, [L-Alanin -A]insulin, [D-Aspargin -A]insulin,

21 0 21 21 [Isoaspargin -A]insulin, [D-Aspargin -A]insulin, [Arginin 21 1

A]insulin, [Asparaginamid -A]insulin, [Sarcosin -A, Asparagin 21 -A]insulin, [Norleucin 2 -A]insulin, [Threonin 5-A]insulin,

5 19 19 [Leucin -A]insulin, [Fenylalanin -A]insulin, [D-Tyrosin A]insulin, [Tyrosin 18 -A, Asparagin 19 -A, Arginin <21->A]insulin, 28—30 27—30 Des[B -tripeptid]insulin, Des[B -tetrapeptid]insu-

lin, Des[B -pentapeptid]insulin, Des[B ~ -tetrapeptid, Tyrosinamid -B]insulin, Des[B ~ -pentapeptid, Fenylalanin-amid^-B] insulin, [Leucin^-B] insulin, Des [Fenylalanin^-B]-insulin og lignende. Disse og andre analoger er beskrevet i litteraturen, se f.eks. Blundell, T. et al., Advances in Protein Chemistry, 26, 330-362, Academic Press, New York,

(1972), Katsoyannis, P.G., Treatment of Early Diabetes, 319-327, Plenum Publishing Corp. (1979), Geiger, R., Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111-12 9, Dr. A. Huthig, Publsher, Heidelberg, Vest-Tyskland (1976), Brandenburg, D. et al., Biochem. J. 125, 51-52 (1971).

Skjønt foreliggende fremgangsmåte er anvendbar

for fremstilling av insuliner og insulinanaloger, så er det foretrukket å bruke den for fremstilling av naturlig forekommende insuliner, da spesielt insulin fra mennesker, storfe eller svin, og da spesielt insulin for mennesker.

Ved gjennomføring av foreliggende fremgangsmåte så kan en kombinasjon av A- og B-kjeden for fremstilling insulin eller en insulinanalog oppnås innenfor et vidt område med hensyn til forhold mellom én kjede til den annen. Kom-binasjonen er selvsagt begrenset av den kjede, enten dette nå er A eller B,som er tilstede i den minste mengde. I ethvert tilfelle, skjønt det ikke er kritisk, så vil det van-lige forhold mellom A- og B-kjeden på vektbasis ligge fra 0,1:1 til ca. 10:1. Det er foretrukket å gjennomføre foreliggende fremgangsmåte ved å bruke et vektforhold mellom A-og B-kjeden i området fra 1:1 til 3:1. Man har også oppdaget at innenfor dette området er det visse områder som er spesielt fordelaktige for fremstilling av en spesiell type insulin. Når man f.eks. ønsker å kombinere en A- og B-kjede for fremstilling av storfeinsulin, så er det foretrukket at forholdet mellom A-og B-kjeden ligger i området fra ca.1,4:1 til 1,8:1. • Med hensyn til svineinsulin, så

er det foretrukket at nevnte variasjonsområde ligger fra 1,0:1,0 til 1,4:1,0. Med hensyn til menneskeinsulin, så

er det foretrukne området fra ca. 1,8:1,0 til ca. 2,2:1,0.

En annen parameter som er av betydning for gjennom-føring av foreliggende fremgangsmåte er proteinkonsentra-sjonen i reaksjonsmediet. Fremgangsmåten kan gjennomføres med godt resultat innenfor et vidt område med hensyn til proteinkonsentrasjoner. Vanligvis vil imidlertid protein-konsentrasjonen variere fra 0,1 - 50 mg pr. ml reaksjons-medium. Fortrinnsvis bør nevnte konsentrasjon av protein ligge i området fra ca. 2 - ca. 20 mg pr. ml. Igjen har man oppdaget at innenfor nevnte variasjonsområde så fins der optimale proteinkonsentrasjoner som varierer avhengig av den type insulin som fremstilles. Hvis man f.eks. ønsker å fremstille svineinsulin, så er det foretrukket at protein-konsentras jonen varierer fra ca. 8 - 16 mg pr. ml, mens man ved fremstillingen av menneske- eller storfeinsulin har et foretrukket område fra ca. 3 - ca. 8 mg pr. ml.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gjennomføres i et vandig medium. pH på nevnte medium målt ved romtemperatur vil vanligvis ligge fra ca. 8 - ca. 12. Fortrinnsvis vil den ligge i området fra 9,5 - 11,0 og op-timalt i området fra ca. 10,4 - ca. 10,6. pH i mediet kan opprettholdes i det forønskede området ved hjelp av egnede bufringsmidler. Typiske bufringsmidler i så henseende er f. eks. glycin, glycylglycin, karbonat, tris(hydroksymetyl)-aminometan, N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin, pyrofosfat, fil-tr is (hydroksymetyl) me tyl-3-aminopropansulfonsyre og lignende som effektivt gir en pH-kontroll innenfor de foran-nevnte områder. Et vanlig og foretrukket bufringsmiddel er glycin.

Konsentrasjonen av bufringsmidlet ligger vanligvis fra ca. 0,001-molar til 2-molar. Foretrukket er konsentrasjonen fra 0,01- til ca. 1-molar, mest foretrukket fra 0,01-molar til 0,1-molar.

A- og B-kjedene bringes sammen i nevnte passende vandige medium i nærvær av et tiolreduksjonsmiddel. Med begrepet "tiolreduksjonsmiddel" forstås en forbindelse som inneholder minst én -SH-gruppe og som har evne til effektivt å redusere S-sulfonatgruppene i A- og B-kjedene. Skjønt man kan bruke enhver forbindelse som har de nevnte egenskap-er, så er det foretrukket at det brukte tiolreduksjonsmidlet er ett som i sin oksyderte form kan sykliseres til en meget stabil forbindelse. Tiolreduksjonsmidlet brukes i en mengde som gir fra 0,4 - 2,5 -SH-grupper pr. -SS03~-grupper som er tilstede totalt i A- og B-gruppen, og fortrinnsvis bør mengden være slik at man får 0,9 - 1,1 -SH-grupper pr. hver

-SSO^--gruppe.

Eksempler på typiske tiolreduksjonsmidler er ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE), 2-merkaptoetanol, metyltioglykolat, 3-merkapto-l,2-propandiol, 3-merkapto-propionsyre, tioglykolinsyre, 2-amino-3-merkaptopropion-syre (cystein) og andre slike tiolforbindelser. Foretrukne tiolreduksjonsmidler er ditiotreitol og ditioerytritol og av disse er ditiotreitol den mest foretrukne.

Et vesentlig trekk ved foreliggende fremgangsmåte er at den gjennomføres i et miljø som tilveiebringer en oksygenkilde. Dette kan lett oppfylles ved at reaksjons-blandingen eksponeres overfor luft. Skjønt man kan bruke en mer direkte kontaktmetode, f.eks. ved at man bobler luft eller oksygen inn og gjennom reaksjonsmediet, så er dette vanligvis ikke nødvendig.

Foreliggende fremgangsmåte gjennomføres derfor generelt ved at man fremstiller en blanding av A-kjede-S-sulfonat, B-kjede-S-sulfonat og nevnte tiolreduksjonsmiddel i de forønskede konsentrasjoner i et vandig medium ved en pH fra 8-12. Blandingen som står åpen for luftkontakt blir forsiktig rørt i et tilstrekkelig langt tidsrom til at man får en kjedekombinasjon, dvs. vanligvis minst ca. en halv time. Under denne røreperiode vil blandingen generelt holdes på en temperatur fra ca. 0 - ca. 25°C, vanligvis er det imidlertid foretrukket at blandingen underkastes mode-rat avkjøling slik at temperaturen holder seg i den nedre ende av nevnte temperaturområde, vanligvis fra ca. 2 - ca. 10°C.

Så snart reaksjonen er fullstendig, så kan insulin eller insulinanalogproduktet isoleres på en rekke forskjel-lige måter, og en rekke av disse er kjent innenfor insulin-teknologien. Den mest vanlig anvendte teknikk for insulin-rensing er kromatografisk teknikk. Disse lar seg lett an-vende for innvinning av insulin fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Nevnte teknikk kan innbefatte gel-filtreringskromatografi eller ioneutbyttingskromatografi. Videre kan produktet bedømmes for renhet og aktivitet ved hjelp av kjente fremgangsmåter, såsom polyakrylamid-gelelektroforese, aminosyreanalyse, insulinradioreseptor-prøve, insulinradioimmunoprøve, høytrykks-væskekromatogra-fi (HPLC), ultraviolett spektrumsundersøkelse, dansylering, prøver ved hjelp av kaninblodglukose og lignende.

De insuliner som er tilgjengelige ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte innbefatter hybrider som består av A-kjeden fra én art av insulin og B-kjeden fra en annen type. Foreliggende oppfinnelse angår generelt en kombinasjon av A- og B-kjede-S-sulfonatene, og den spesielle struk-tur som måtte forefinnes i disse kjeder, så lenge de er virkelige representanter for insulin og insulinanalog-A- og B-kjeder er uten betydning for foreliggende fremgangsmåte.

Skjønt man kan fremstille en insulinanalog eller en insulinhybrid, f.eks. ved hjelp av en A-kjede fra én type insulin og en B-kjede fra en annen, så er det selvsagt foretrukket å fremstille et insulin som er strukturelt iden-tisk med et naturlig forekommende insulin, noe som kan gjøres ved å bruke et A-kjede-S-sulfonat og et B-kjede-S-sulfonat som hver har samme aminosyresekvens som i nevnte naturlige insulin. Det er videre meget foretrukket å bruke foreliggende fremgangsmåte for å fremstille svineinsulin, storfeinsulin eller menneskeinsulin, og mest foretrukket er det å fremstille sistnevnte type insulin.

Insulin eller insulinanalog-A- eller B-kjeder er som allerede angitt, tilgjengelige ved hjelp av rekombinant DNA-hetoder. De kan også fremstilles fra naturlige insuliner eller ved klassisk peptidsynteseteknikk, enten dette fore-går i fast fase eller i oppløsning.

A- og B-kjedene holdes i stabil form som S-sulfonater. Disse S-sulfonat-utgangsmaterialene er tilgjengelige ved oksydativ sulfittolyse, en behandling ved hjelp av hvil-ken A- og B-kjedene reageres med natriumsulfitt i nærvær av et svakt oksydasjonsmiddel, såsom natriumtetrationat.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Eksemplene er tilveiebragt kun for illustrerende formål og er således ikke begrensende for oppfinnelsen som sådan.

Eksempel 1

360 mg svine A-kjede-S-sulfonat ble oppløst i

36 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 5N NaOH. Svine B-kjede-S-sulfonat (300 mg) ble oppløst i 30 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på denne blandingen ble justert til 10,5 med 5N NaOH. Ditiotreitol (DTT) (123,4 mg) ble oppløst i 0,4 ml av nevnte 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 0,2 ml 5N NaOH. A- og B-kjedeoppløsningene ble kombinert i en 100 ml ampulle ved romtemperatur (ca. 25°C) og 1,91 ml av DTT-oppløsning ble tilsatt slik at man fikk et -SH til -SSO^ - forhold på 1,04. Den resulterende oppløsningen ble forsiktig rørt i et åpent beger med magnetisk røring ved 4 - 8°C i 20 timer. Analyse ved hjelp av høytrykks-væskekromatogra-fi (HPLC) indikerte et insulinutbytte på 193,8 mg eller 29% av det totale protein. 40 ml av denne oppløsningen ble justert til pH 3,15 med eddiksyre. Blandingen ble gelfiltrert på en 5 x 200 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. Insulintoppen (elueringsvolum 2450-2700 ml) ble kombinert og lyofilisert med et utbytte på 95 mg insulin eller ca. 25% av det totale protein. Nevnte svineinsulin ble bedømt relativt rent ved hjelp av en polyakrylamidgel-elektroforese, aminosyreanalyse, insulinradioreseptorprøve og HPLC og en reduksjonsprøve ved hjelp av kaninblodglukose.

Eksempel 2

Oppløsninger av storfe A- og B-kjede-S-sulfonater med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,01-molar glycinbuffer (pH 10,5) ble fremstilt. pH for hver av oppløsningene ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst

i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH ble justert til nevnte verdi med 0,15 ml 5N NaOH. 0,5 ml av B-kjedeopp-løsningen ble tilsatt 0,8 ml av A-kjedeoppløsningen og 0,035 ml av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (ca. 25°C), hvorved man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 0,91. Den resulter-

ende oppløsningen ble rørt ved 4 - 8°C i 2 0 timer i en cipen 3 ml ampulle. Høytrykkskromatografianalyse av blandingen indikerte et utbytte av storfeinsulin på 1,96 mg eller ca. 30% av det totale protein.

Eksempel 3

Oppløsninger av svine A- og B-kjede-S-sulfonater med en konsentrasjon på 10 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) ble fremstilt. pH for hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 2,0 ml glassdestillert vann. 0,5 ml av B-kjedeoppløsningen ble tilsatt 0,6 ml av A-kjedeoppløsningen, og det hele ble tilsatt 29,25 yl av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (ca. 25°C), hvorved man fikk et -SH til -SS03"-forhold på 1,00. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8 C i en åpen 3 ml ampulle i 20 timer. En høytrykkskromatografianalyse av blandingen indikerte et utbytte av svineinsulin på 3,81 mg eller ca. 35% av det totale protein.

Eksempel 4

Det ble fremstilt humant (pankreatisk) B-kjede-S-sulfonat og flere typer humane (pankreatiske og E. coli) og svine (pankreatiske) A-kjede-S-sulfonatoppløsninger med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer

(pH 10,5). pH på hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH justert til denne verdi med 0,16 ml 5N NaOH. 1,0 ml av hver av A-kjede-S-sulfonatoppløs-ningene ble tilsatt 0,5 ml av B-kjede-S-sulfonatoppløsningen og 0,05 ml DTT-oppløsning ved romtemperatur (ca. 25°C) hvorved man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Alle opp-løsninger ble rørt ved 4 - 8°C i en åpen ampulle i 20 - 22 timer. De ble så analysert ved hjelp av høytrykkskromato-grafi idet man brukte en pankreatisk menneskeinsulinstan-dard for beregning av utbyttet. Resultatene er angitt i den nedenforstående tabell.

Eksempel 5

En oppløsning av hver av de humane A- og B-kjede-S-sulfonater ble fremstilt med en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). pH i hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5),

og pH ble justert til 10,5 med 0,16 ml 5N NaOH. 0,5 ml av nevnte B-kjedeoppløsning ble ved romtemperatur tilsatt 1,0

ml A-kjedeoppløsning fulgt av 50 yl av DTT-oppløsningen slik at man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8 C i en åpen 3 ml ampulle i 22 timer hvoretter en analyse ved hjelp av høy-trykkskromatografi indikerte et utbytte av humant insulin på 2,58 mg eller 34% av det totale protein.

Eksempel 6

328 mg humant A-kjede-S-sulfonat ble oppløst i

65,6 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og blandingens pH ble justert til 10,5 med 75 yl 5N NaOH. 164 mg humant B-kjede-S-sulfonat ble oppløst i 32,8 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH på blandingen ble justert til 10,5 med 15 ml 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml av nevnte 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5) og pH på oppløsning-en ble justert til nevnte 10,5 med 160 yl 5N NaOH.

A- og B-kjedeoppløsningene ble slått sammen i et 150 ml glassbeger ved romtemperatur (ca. 25°C) og 3,28 ml DTT-oppløsning ble tilsatt slik at man fikk et -SH til -SS03~-forhold på 1,09. Det åpne begeret ble plassert i et is-vannbad i et avkjølt rom og rørt kraftig en halv time. Opp-løsningen ble så rørt ytterligere 24 timer i et avkjølt rom ved 4 - 8°C. Kromatografisk analyse på dette tidspunkt indikerte et utbytte av humant insulin på 148 mg eller 30% av det totale protein.

100 ml av denne oppløsningen ble tilsatt 25 ml iseddik til en slutt-pH på 3,15. Denne hele prøven ble gelfiltrert på en 5 x 200 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. Alt eluert protein ble lyofilisert. Insulintoppen (elueringsvolum 2465-2781 ml) veide 125 mg og representerte 29,4% av det innvundne protein.

En del av den ovennevnte insulintopp (95,5 mg)

ble oppløst i 9 ml 0,01-molar tris-0,001-molar EDTA - 7,5-molar urea-0,03-molar NaCl-buffer (pH 8,5 ved 4°C). Blandingen ble kromatografert gjennom en 2,5 x 90 cm DEAE (dietyl-aminoetyl)-cellulose-ioneutbytningskolonne ekvilibrert med samme buffer. Proteinet ble eluert ved 4 - 8°C med en gra-dient på 1 liter hver av 0,03-molar og 0,09-molar NaCl i samme buffer fulgt av 1 liter buffer inneholdende 1-molar NaCl. Hver av toppene ble avsaltet på "Sephadex G-25"

(grov type) kolonne i 2% eddiksyre og lyofilisert. Insulintoppen (elueringsvolum 878-1008 ml) veide 55,73 mg og representerte 84% av det innvundne protein.

Sinkinsulinkrystaller ble fremstilt ved å oppløse 11,90 mg av insulin-(DEAE)topprøven i 240 yl 0,1N HC1 fulgt raskt av 2,16 ml av 0,04% oppløsning av en ZnC^-0,05-molar natriumcitrat-15% aceton i et glassentrifugerør. Utkrystal-liseringen skjer i løpet av 72 timer ved romtemperatur (ca. 25°C) hvoretter den overliggende væske ble fjernet og krystallene vasket to ganger med kaldt vann med pH 6,1 og sen-trifugert ved 2000 omdr./min. ved 3°C mellom vaskingene. Krystallene ble så gjenoppløst i 0,01N HC1 for analyse.

Det resulterende humane insulinpreparat ble be-dømt til å være relativt rent ved en polyakrylamidgelelektro-forese (et enkelt bånd), aminosyreanalyse, insulinradiore-septorprøve, insulinradioimmunoprøve, HPLC, dansylering og

UV-spektrum. USP- kaninprøven (144 kaniner) ga en styrke

på 26,3 - 1,8 enheter pr. mg (vannfritt).

Eksempel 7

Det ble fremstilt oppløsninger av humant (E. coli)

[N-formyl-Gly^]-A-kjede-S-sulfonat og humant (pankreatisk) B-kjede-S-sulfonat i en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). pH i hver oppløsning ble justert til 10,5 med 5N NaOH. 61,7 mg DTT ble oppløst i 4,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH ble justert til 10,5 med 0,16 ml 5N NaOH. 0,5 ml av B-kjede-S-sulfo-natoppløsningen ble tilsatt 0,1 ml av [N-formyl-Gly"'"] -A-kjede-S-sulf onatoppløsningen og 0,05 ml av DTT-oppløsningen ved romtemperatur (25°C), hvorved man fikk et -SH til -SSO^ - forhold på 1,10. Oppløsningen ble rørt i et avkjølt rom

(4 - 8°C) i en åpen 3 ml ampulle i 23 timer og en analyse indikerte et utbytte av [N-formyl-Gly^-A] humant insulin på 1,46 mg eller 19,5% av det totale protein.

Etter surgjøring til pH 3,15 med iseddik ble en

del av oppløsningen gelfUtrert på en 1,5 x 90 cm kolonne av "Sephadex G-50" (Superfine) ekvilibrert og eluert med 1-molar eddiksyre ved 4 - 8°C. ■ [N-f ormyl-Gly^A] human-insulintoppen (elueringsvolum 87-95 ml) ble slått sammen, oppdelt i porsjoner og lyofilisert. Proteinet ble bedømt som relativt rent ved kromatografisk analyse og aminosyreanalyse. Bioaktiviteten for dette [N-formyl-Gly^-A] humane insulin ble ved hjelp av en radioreseptorprøve bedømt til å være 17% i forhold til en human insulinstandard.

Eksempel 8

En oppløsning av svin A-kjede-S-sulfonat og

humant (E. coli) B-kjede-S-sulfonat ble fremstilt i en konsentrasjon på 10 mg pr. ml i en 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5). En A-B-blanding ble fremstilt ved å bruke 2 ml av A-kjedeoppløsningen for hver 1 ml av B-kjedeoppløsningen. A-B-blandingen ble justert til pH 10,5 med 5N NaOH. 121,2

mg cystein ble oppløst i 3,0 ml 0,1-molar glycinbuffer (pH 10,5), og pH ble justert til nevnte verdi med 0,35 ml 5N NaOH. 1,4 ml av A-B-blandingen ble ved romtemperatur til-

satt 52 yl av cysteinoppløsningen, slik at man fikk et -SH til -SSO^ -forhold på 0,95. Den resulterende oppløsning ble rørt ved 4 - 8°C i en åpen 3 ml ampulle i 20 timer, og kromatografisk analyse ga et humant insulinutbytte på

3,25 g eller 23,2% av det totale protein.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et insulin eller

   en insulinanalog ved å kombinere en A-kjede av et insulin eller en insulinanalog og en B-kjede av et insulin eller en insulinanalog, karakterisert ved at man reagerer den S-sulfonerte formen av A-kjeden, den S-sulfonerte formen av B-kjeden og et tiolreduksjonsmiddel i et vandig medium under slike betingelser at man får en blanding med (1) pH 8-12, (2) en totalproteinkonsentrasjon på 0,1-50 mg pr. ml, og (3) en total mengde av nevnte tiolreduksjonsmiddel slik at man får tilveiebragt på 0,4 til 2,5 -SH-grupper pr. -SS03~-gruppe i den totale mengde av nevnte A- og B-kjede-S-sulfonater, hvorved man får dannet et insulin eller en insulinanalog ved å holde blandingen ved en temperatur på 0-25°C i et miljø som tilveiebringer en oksygenkilde.