CS236463B2 - Method of insulin production - Google Patents

Description

Se zásadní možností získat bílkoviny rekombinací DNA, zvláětě A řetězce inzulínu a B řetězce, jak bylo poptáno v pubbikaci Geeddel a další, Proč. Nit. Acad. Sci. USA 2£, 106 až 110 (1979) stouply požadavky oa účinnou metodu pro spojení řetězce A a B oa výsledný inzUiín.

Dříve známé způsoby pro výrobu inzulínu spojením řetězce A a B . poožíwjí jako výchozích Látek uvedené řetězce ve formě stálých S-sulfonátů. Tyto muLfonáty, odděleně nebo spoleCně, je nutno redukovat na odpooíd&jící sLouCeniny -SH, přičemž se obvykle podívá velkého přebytku thiolu jako redukčního Činidla. Produkty ae oddděí z redukčního prostředí a v případě, že nebyly redukovány společně, uvedou se do oxidačního prostředí, například vzduchu k dosaften! vazby mezi řetězci A a B za vzniku výsledného inzulínu. Tento způsob je zásadná popsán v pubbikacích Du a daTší, Scientia Sinica 12, 84 až 104 (1961), WiLson a deaší, Biochim. BLophye. Acta £3, 483 až 489 (1962), Du a .dalěí, Scientia Sinica 15. 544 až 561 (1966), Kexue Tongbao (republika Čína) IX, 241 až 277 (1966) a Murkussen, J. Acta Paeedatrica Scianldnavica, SuppP. 270. 121 až 126 (1977).

Při moodfikaci tohoto'způsobu se redukuje S-suLfonát řetězce A β ' následnou reakcí redukovaného řetězce A s řetězcem B ve foímě S-suLfonátu v oxidační atmoaséře, jak bylo popsáno v p^t^bikacích KattoytшOLt a další, Proč. Nit. Acad. Sci. USA 25» 1554 až 1561 (1966), Kattoyшmit, Science 154. 1509 až 1514, (1966), Kattoytonit a dalěí, Biochemietry £, 2642 až 2655 (1967), US patent C. 3 '420 810 a Jentsch, Jowrnal of Cjhiomítography 167 až 174 (1973).

DQěí moodfikace spočívá ,v tom, že částečně oxiduje řetězec A ve formě -SH za vzniku ěitulfddového můstku mezi cysteinovými zbytky v poloze A-6 a A-11 s následnou oxidací produktu spolu s řetězcem B ve formě -SH nebo ve formě S-tιžLfonátž, jak bylo popsáno v belgickém patentu č. 676 069 a v p^bi^ci Zahn a další, Liebigs Ann. Chem. 691. 225 až 231 (1966).

Všem shora uvedeným známým způsobům je společné to, že se inzmín vyrábí ve dvou na sobě nezávislých po sobě následnících stupňů a to redukcí S-^^^onátu oa -SH s následnou oxidací na -S-S-.

V oubbiktci Dixon a další, Nátuře JJ88. ' 721 až 724 (1960) se p^j^P^i^ujÍ podmínky, za nichž se předpokládá možnost přeměny S-tULfooátž řetězce A a řetězce B v jediném ztupni přímo na inzuLín při porážtí thiolu jako redukčního činidla a vzduchu jako oxidačního činidla. Podrobnc^si nejsou uvedeny a výtěžek je pouze 1 až 2 %, vztaženo . na účinnost výsledné látky. V p^bi^ci Dixon, Proč. Intern. Coung¹. Enldcrinol. 2nd Londýn 1964, 1207 až 1215 (1965) se popisuje v tabulce IV na straně 1211, že've skuteČnQSti běží o oddělenou redukci a oxidaci..

Nyní bylo na rozádl od dříve známých způsobů zjištěno, že je možno sa určitých reakčních podmínek dosáhnout dobrého výtěžku inzulínu nebo jeho analogů při' poi^žtí S-tulfonoítných řetězců A a B jako výchozích látek tak, že ae redukce a oxidace skutečně provede v jediném stupni.

Vynález se tedy týká způsobu vazby řetězce A inzulínu nebo jeho analogu a řetězce B inzulínu nebo jeho analogu sa vzniku inzulínu nebo jeho analogu tak, že se uvede v reakci S-tulfonoítný řetězec A, S-sulfonoítný řetězec B a thLol.

Předměte» vynálezu je tedy způsob výroby iozu.ínu vazbou řetězce A inzulínu nebo analogu inzulínu' a řetězce B iozu.ínu nebo analogu inzulínu ža vzniku inzulínu nebo analogu inzulínu, například skotu, vepře nebo člověka, reakcí S-sUH^onátu řetěsce A a S-sulfonátu řetězce B . v poměru 0,1 : 1 až 10 : 1 a thiolu jeko redukčního .činidle ve vodném prostředí, vyzna^Ujcí se tím, že se směs uvede v reakci při pH 8 až

12, s výhodou 9,5 až . 11,0 při konccetraci celkové bílkoviny 0,1 až 50 m/m β výhodou 2 až 20 шш/ш1 siaési, možství thiolu odpovídajícím dosažení poměru' celkem 0,4 až 2,5, s výhodou 0,9 až 1,1, skupin -SH oa každou skupinu -SEO^ v S-sulfonátu řetězce A a řetězce В při tep^té ⁰ a^ž 25 °C, s výhodou 2 a^ž 1⁰ °C, z^{a o}říVoшnovti zdroje tyglíku.

Vynález se tedy týká účinného jednostupňového způsobu výroby. iozuLíou oebo jeho analogu z S-sulf ondaných řetězců A a B.

Pod pojmem iozuLío se rozumí jakýkoliv přírodně se vyskytující druh inzulínu, nappíklad inzulín člověka, skotu, vepře, ovce, ryb, ptáků a podobně, stejně jako hybridní forma, vzniklá ze smmsi řetězce A jednoho druhu a řetězce В jiného druhu.

Pod pojmem analog inzulínu se rozumí bílkovina s obsahem základního řetězce A a В s obsahem všech cystinových zbytků ve sledu,.který je v souladu s přírodními iozulíoy. Analogy - se liší od přírodního inzulínu snubsitucí, . . adicí, vynecháním nebo mooifikací jednoho nebo popřípadě většího počtu zbytků aminoO^ytteio, avšak uspořádání iltulfidových vazeb musí být zachováno stejně jako alespoň část inzulínové účinnost. Příkaddem těchto analogů mohou být:

[М-^гшУ.-О^-а] iozulío iesaιninovA^A-inozú.ín psarkosio¹ -a| iozulío, pL-alaoio¹-^ ^zuUn, [D-^anin¹-^] Iozu!.^ ¹ -A inzULín,

J-eiaííprť^io²¹-^ iozi^o, ^rgioto²¹-^] ⁱna^]^LÍn^{, l}^i^i^í^]ra«^:^iha^jⁱd²¹ -a] ^ziú.¹⁰ F 1 21 _i fearkosin ¹ -A, Asparagio^ ’ -A iozulio,

Oorleucio²-A inzulín,

J^ihreonio^-A ^eucio^-Aj Ш1Шо, ^Še°rlalaoio'⁹-Á] tazulí⁰, iozu!^ ^rosin^-A., aspaar^in^-A, argioio²¹ -a| ⁱoa^].ío^, DesfB^^O-trije^icQ ⁱoz^u.ío^, des^B^-^-tetra^^^ tozulío, des ⁱozul^ío^, des ^^“^-tetre^eptid t^yrosinami²®-á ⁱoz^u.^ío^, “ oeo.iaoe0^i feotlal-onam^ ďes ¾^{26 30}-oenta^oep^oi^i, ^o^alao^nM^ ⁱ^oz^u.^ío^, des des _r_____r-_r—.j--------, [lysio²²^ ina^.^ [ieucin^-Bj ^ziU^o, [leuc^O-B] tozulío, des [feivla.aoio^B ^soz^u.ío^, a ^podobně.

^^-terrope^iA ⁱozιU.ío^, b^-peotawtid] iozulii,

Tyto a jiné sloučeniny jsou popsány v literatuře, například v publikacích Blunddei T. a další, Advancea io Protein Shernissr^y, 26. 330 až 362, Academie Press, NX, H.X (1972), КаЬдеушоО^, P. G, Treatment of Eiurly Diabetes, 319 až 327, Plenům P^t^bishing Corp. (1979), Geiger R., Cherniker Zeituog, Reppiot 100, 111 až ' 129, Dr. A. Huthlg»,. Pubbisher, Heidelberg, W. Germany (1976), Breodenburg, ' D. a dee-jší!, Biochem. J. 1J25. . 51 až 52 (1971). ' '

Přestože je způsob podle vynálezu možno použít pro výrobu různých druhů iozuHou a jeho analogů, nejvýhodnnjŠí je tento způsob pouužt k výrobě přírodně se vyslyšících druhů inzuLínu, zejména inzulínu člověka, skotu nebo vepře, zvláště inzulínu Člověka.

Při provádění způsobu podle vyinálezu je možno dosáhnout vazby mezi řetězcem A a B za vzniku - inzulínu nebo jeho analogů v širokém rozmezí v poměru jednoho typu řetězce ke druhému. Výtěžek je samozřejmě omezen tím typem řetězce, který se pouuíje v menším možísví. Obvyldý poměr řetězce A k řetězci B je 0,1:1 až 10:1, Je vysoce výhodné provádět způsob podle vynálezu při hmotnostním poměru řetězce A k řetězci B v rozmezí 1:1 až 3:1. Bylo také zjištěno, že v tomto rozmezí jsou ještě určité poměry zvláště výhodné pro výrobu určitých druhů inzulínu. Nappíklad při vazbě řetězce A a B na inzulín skotu je výhodné pouuít. . poměru řetězce A a B v rozmezí 1,4:1,0 až 1,8:1,0. V případě inzulínu vepře je.tento výhodný poměr. . 1,0:1,0 až 1,4:1,0. V případě inzulínu člověka se výhodný poměr pohybuje v rozmezí 1,8:1,0 až 2,2:1,0.

Dalším parametrem, významným při provádění způsobu podle '' vynálezu, je koncentrace bílkoviny v reakčním prostředí. Způsob podle vynálezu je možno úspěšně.provádět v širokém rozmezí této koncentrace. ObvyHLe se však koncentrace bílkoviny pohybuje v rozmezí 0,1 . až 50 mgril reakčního Výhodné rozmezí je 2 až 20 m/m.. V tomto rozmezí existší ještě optim lni koncentrace bílkoviny v závislosti na druhu iozuLíou. Pro inzulín vepře je výhodná koncentrace bílkoviny 8 až 16 Щ0п1, pro inzulín člověka nebo skotu je výhodné rozmezí 3 až 8 mgm.

Způsob podle vynálezu se provádí ve vodném prostředí. Toto prostředí má mt pH 8 až 12, výhodné rozmezí je 9,5 až 11,0 a optimální je prostředí v rozmezí 10,4 až 1O',6. Toto pH je možno udržovat v požadovaném rozmezí . přidáním vhodného pdfru. Typickým. pufry jsou například glycio, glycylglycio, u^čitany, tri8(hyrtox;m^et(yrljmι0nomethan, N, N-bia- (2-hydroiy ettyHglycio , pyrof osf á ty, N-tris- (hyr^ym^ thyl)mtthyl-Sαm>0nopr’opanaulfonová kyselina a další látky, které řídí pH ve svrchu uvedeném. rozm^eí. Běžným a výhodným pufrem je glycio.

Koncentrace pufru se obvyldie pohybuje . v . rozmezí 0,001 až 2 M. Výhodná koncentrace je 0,01 až 1 M, nejvýhodnOjší 0,01 až 0,1 M.

^Řet^ězce A a ^B se uváděě^j v reatoi v příslrfotám vodném prostředí za přítomnosti thioiu jato redukčního člo^a» Pod tímto ^pojmem se rozumí sloupni⁰/, ^které obstaší alesjwn jedou skupinu -SH a maaí schopnost redukovat S-suLf^on^it v řetězci A a B. Je možno poi^žt jakékoi sloučeniny a těmito vlastnostmi, výhodnými Látkami jsou však thioly, které byly ve své oxidované formě cylkUzováoy oa stálé sloučeniny. Thiol se poi^je v množstv, které po sty tu je celkem 0,4 až 2,5 skupin -SH na každou skupinu -SSOj v řetězci A i . B, a výhodou 0,9 až 1,1 skupin -SH oa každou skupinu -SSO^ .

Příkladem typických thioLů pro toto poi^žtí jsou dithLothreitol (DTT), dithioeivtlh*rtol (DTE), 2-mer top poet hano, aethylthioglykolát, . 3-morkaaPo-1,2-φropttndot, 3-mer|ca>toprtpitntvá kyselina, Phitglyktltíá kyselina a další thioly. Výhodnými thioLy jsou dithiothroitol a dithioexylthritol, n^výhodn^ší je dithioPtoreepol.

Jednou ' ze zálkLadních podmínek způsobu . podle vynálezu je jeho provádění za příttaotati zdroje kyslíku. Tuto podmínku je možno spl^t snadno tak, že. se reakce provádí oa vzduchu. Je však také nožno zajistit příaější styk, oappíkL.ad prtbžbláíáoím vzduchu nebo kyslíku reakčoí «ašsi, není to však nutné.

Způsob podle vynálezu se tedy provádí tak, že se připraví směs S-sulfonátu řetězce A, S-sulfonátu řetězce B a thiolu Jako redukčního činidla v požadované koncennraci ve vodném prostředí při pH 8 až 12« Směs se opatrně míchá na vzduchu po dobu dostatečnou k vazbě řetězců, obvykle alespoň 30 V průběhu tohoto máchán! se teplota reakční směsi obvykle udržuje na hodnotě 0 a^ž 25 °C, s výtodou se věa^k rea^ní směs mírně cULadí t^ak, ab^y bylo dosaženo s^podní Ciást-i tototo rozmeeí, obvykle ² a^{ž 10} °C.

Po dovrěení reakce je možno izolovat inzulín nebo analog inzulínu jjakýmooiv způsobem, tyto, způsoby jsou známy a běžně prováděny v chemii inzulínů. Nejběžnějším způsobem čištění inzulínu je ctoommaograaie. Tyto způsoby je možno s výhodou použít k izolaci inzulínu z reakční smmsi. Zvláště výhodnými postupy jsou fiiraace na gelu a iontoměničová dhroi^matorraiie.

Výsledný prodUkt je také možno analyzovat na čistotu a účinnost známým způsobem, nappíklad elektrolýzou na po^akryamiidovém gelu, analýzou aminookisein, radiologicky, radioimunologicky, vysokotlakou kapalinovou cltaroiamtografií, spektrem v uLtrafiaovvém světle, dansl-ací, stanovením hladiny glukózy v krvi králíka a podobně.

Druhy inzulínu, které je možno získat způsobem podle vynálezu zawnuuí i hybridy, které sestáwjí z řetězce A i^^ínu jednoho druhu a řetězce B inzulínu jiného druhu. Podstata způsobu podle vynálezu se však týká správné vazby S-sulfonátů řetězce A a £>, a to zejména v tom případě, že jde o skutečně se přírodně vysnít u^cí inzulín - nebo jeho analog.

Přestože analog inzulínu nebo hybrid, tj. inzulín, jehož řetězec A pochází z inzulínu jednoho druhu a řetězce B pochází z inzulínu jiného druhu, je možno tímto způsobem snadno získat, výhod^SÍ je výroba inzulínu strukturně totožného s přírodně se vy sty tu jícím, takže se pouužje S-sulfonát řetězce A a S-siuLfonát řetězce B, přičemž každý z těchto řetězců má sled arninookielin, typický pro tento druh inzulínu. Vysoce. výhodné je pov^žtí způsobu podle vynálezu k získání inz^ínu vepře, skotu nebo člověka, nejvý^á/něží je výroba Xi<e8kého inzulínu. Inzulín nebo analogy inzulínu s obsahem řetězců A a B, tak jak byly svrchu uvedeni, je možno získat ^kombinací DNA- Je také možno je získat~ z přírodního inzulínu nebo klasickou syntézou peptidů, a to v roztoku nebo v pevné fázi.

Řetězce A a B je možno uchovat ve formě S-sulfonátu jako stálé látky. S-si^u.fonáty je možno získat oxidativní sULfitolýzou, při níž se tyto řetězce uvádí v reakci se siřičtaneem sodným za přítomnosti mírného oxidačního činidla, . například tltrathi·iátž sodného.

Vynález bude osvětlen následnicím! příklady.

Přikladl

360 mg S-sulfonátu řetězce A inzulínu vepře se rozp^sí ve 36 ml 0,1 M glycinového pufru o pH 10,5 a pak se pH smmsi upraví na 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného.

300 mg S-eulfonátu řetězce B inzulínu vepře se rozpustí ve , 30 ml 0,1 M glycinového pufru o pH 10,5 a pak se pH směsi upraví na 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného- 123,4 mg ii0hítthrli0tLu se rozpustí ve 4 m 0,1 M glycinového pufru o pH 10,5 a pak se pH smmsi upraví na 10,5 , přidáním 0,2 m 5 N hydroxidu - sodného.

Roztoky řetězců A a B se slijí v nádobě o obsahu 100 ml při teplotě mι^^i(^^eo. přibližně 25 °C a pak se přidá 1,91 m roztoku iiOhitthreLttlž, takže poměr ' skupin -SH ke skupinám -SSO^ je 1,04. Výsledný roztok se opatrně míchá v otevřené nádobě mmagintickým míchadlem 20 hodin při teplotě 4 až 8 °C. Při analýze vysokotlakou kapalinou ctotmmaotraafí je možno prokázat výtěžek inzulínu 193,8 вд, což je 29 % veškerých bílkovin.

ml tohoto výsledného roztoku se upraví na pH 3,15 přidáním kyseliny octové· Směs se filtruje na sloupci o rozměrech 5x200 cm s obsahem Sephadexu G-50 (Superfine) v rovnovážném stavu v 1 M kyselině octové, sloupec se vymývá tímtéž roztokem při teplotě 4 až 6 °C. Inzulínový vrchol je při elučním objemu 2 450 až 2 700 ml, uvedené frakce se slijí a lyofilizují, čímž se získá 95 mg inzulínu, tj· 25 % celkové bílkoviny· Inzulín vepře byl zcela čistý, jak bylo nežne prokázat elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, analýzou aminokyselin, radiologickou analýzou, vysokotlakou chromatografií a snížením hladiny krevního cukru u králíků po podání tohoto inzulínu·

Příklad 2

Roztoky S-sulfonátu řetězce А а В inzulínu skotu při koncentraci 5 mg/ml v glycínovém pufru o koncentraci 0,01 li a o pH 10,5 se upraví na pH 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného· 61,7 mg dithiothreitolu se rozpustí ve 4,0 ml glycinového pufru o koncentraci 0,1 M a o pH 10,5, načež se pH upraví na hodnotu 10,5 přidáním 0,15 · hydroxidu sodného o koncentraci 5 Ν. К 0,5 ml roztoku řetězce В se přidá 0,6 ml roztoku řetězce A a 0,035 ml roztoku dithiothreitolu při teplotě místnosti přibližně 25 °C, takže poměr skupin -SH a -SSO^ je 0,91 · Výsledný roztok se míchá 20 hodin při teplotě 4 až 6 °C v otevřené nádobce o obsahu 3 ml· Sněs se analyzuje vysokotlakou kapalinou chromatografií, čímž je možno prokázat výtěžek inzulínu skotu 1,96 mg, tj· 30 % celkové bílkoviny·

Příklad 3

Roztok S-sulfonátu řetězce А а В inzulínu vepře o koncentraci Ю mg/ml v glycinovém pufru o koncentraci 0,1 И a o pH 10,5 se upraví na pH 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného· 61,7 mg dithithreitolu se rozpustí ve 2,0 ml vody, destilované ve skle· К 0,5 ml roztoku řetězce В se přidá 0,6 ml roztoku řetězce A a 29,25/ul roztoku dithiothreitolu při teplotě místnosti přibližně 25 °C a poměru skupin -SH a -SSO3 přibližně 1,00« Výsledný roztok se míchá v otevřené nádobce o obsahu 3 ml 20 hodin při teplotě 4 až 6 °C. Analýza směsi vysokotlakou kapalinovou chromatografií ukazuje, že výtěžek inzulínu vepře je 3,61 mg a 35 % celkové bílkoviny·

Příklad 4

Lidský (pankreatický) řetězec В ve formě &-sulfonátu a řetězec A ve formě S-sulfonátu člověka (pankreatický a Escherichia coli) a vepře (pankreaticlý) se uvedou do roztoku o koncentraci 5 mg/ml v glycinovém pufru o koncentraci 0,1 M a o pH 10,5· Týto roztoky se upraví na pH 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného· 61,7 mg dithiothreitolu se rozpustí ve 4,0 ml glycinového pufru o koncentraci 0,1 M a pH 10,5 a pH se upraví na Ю,5 přidáním 0,16 ml hydroxidu sodného o koncentraci 5 Ν. К 1,0 ml roztoku každého S-sulfonátu řetězce A se přidá 0,5 ml S-sulfonátu řetězce В a 0,05 ml róztoku dithiothreitolu při teplotě místnosti 25 °C a při poměru skupin -SH a -SSO^ přibližně 1,09. Všechny roztoky se míchají při teplotě 4 až 8 °C v otevřené nádobě 20 až 22 hodin a pak se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií při použití lidského inzulínu ze slinivky břišní jako standardu pre vypeč!tání výtěžku. Výsledky jseu uvedeny v následující tabulce:

236453

Tabulka 1

Zdroj řetězce A	Inzulín člověka výtěžek, mg	Výtěžek v % celkové bílkoviny
vepř (slinivka)	• 2,00	26,7
vepř (slinivka)	2,H	28,1
člověk (slinivka)	' .95	26,0
čiověk (silnivka)	2,03	27,1
člověk (E. cooi)	1,99	26,5

Příklad 5

Roztoky S-sulfonátů řetězce A e B inzulínu člověka se připreví v koncentraci 5 m/ml v 0,1 M giycinevém pufru o pH . 10,5. Pak se roztok upraví ta pH 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného..61,7 -mg dithietreiteiu se rozpustí ve 4,0 ml glycinevého pvrfru n knncentrae ci 0,1 M a o pH Ю,5, načež se pH upraví na 10,5 přidáním 0,16 mi hydroxidu sodného o koncernmc! 5 N. K 0,5 nl roztoku řetězce B se přidá při teplotě místnost 1,0 mi roztoku řetězce A a 50>ul roztoku dithiothreitolu při poměru skupin -SC a -SSO^ 1,09. Výsledný roztok se míchá při teplotě 4 až 8 °C v otevřené nádobě o obsahu 3 mi po dobu 22 hodin, načež je možno prokázat vysokotlakou kapalinovou chromatografií výtěžek inzulínu 2,58 mg a 34 % celkové bílkoviny.

P Píkl a d 6

328 mg S-sulfonátu řetězce A inzulínu člověka se rozpust - v 65,6' mi glycinového puiru o konccetrtci 0,1 M a pH 10,5 a pak se pH směsi upraví na 10,5 přidáním 75jui hydroxidu sodného o koncce^an 5 N. 164 mg S-suLfonátu řetězce B inzulínu člověka se rozpust ve 32,8 mi glycinového puiru o koncce^acH 0,1 M a pH 10,5 . a pak se pH směsi upraví na 10,5 přidáním 15yil hydroxidu sodného o koncern^ci 5 N. 61,7 mg dithiothreitoiu se rozpust ve 4,0 mi glycinového prfru o konccenraci 0,1 M a pH 10,5 a pH roztoku se upraví na 10,5 přidáním 160/U1 hydroxidu sodného . o - ^^βη^^Ι 5 N.

fa)ztoky řetězce A a B se slijí ve skleněné kádince o . obsahu 150 mi při teplotě mstnossi přibližně 25 °C a přidá se 3,28 ml roztoku dithiothreitoiu při poměru skupin -SH a -SSO^j 1,09. Otevřená kádinka se uioží do' ledové vody v chiadné místnosti a energicky se míchá 30 minut. Pak 'se roztok vyjme z lázně a míchá se ještě 24 hodin v chladné místnost o teplotě 4 až 8 °C. Př analýze vysokotlakou kapalinovou chromátograaií po této době je možno prokázat výtěžek lddského inzulínu 148 mg a 30 % celkové bílkoviny·

Ke 100 mi tohoto roztoku se přidá 25 mi ledové kyseliny ectevé de výsiednéhe pH 3,15. Tento vzorek se filtraje na sloupci o - rozměru-5 x 200 cm s obsahem Sephadexu G-50 (Supeefine) v 1 M kyselině octové při teplotě 4 až 8 °C. Sloupec se promývá tímtéž roztokem a veěkerá získaná bílkovina se lyoiilizuje· Vrchol pro inzu.ín byl získán při eiučním- objemu 2 465 až 2 781 m., výtěžek inzuiínu byl 125 mg a 29,4 % celkové bílkoviny.

95,5 mg maaeeiálu z inzuinnového vrcholu - se rozpust v 9 - mi roztoku s obsahem

0,01 M tris, 0,001 M ESTA, 7,5 M močoviny a 0,03 M dhioridu sodného o pH 8,5 při teplotě 4 °C. Směs se pak chromatogrrtilje na sloupci o rozměrech 2,5 x 90 cm s obsahem iontoměniče a to DEAE (dLethyltitoethИl) celulózy v tomtéž p^fru.

θ

Bílkovina ae vymývá při teplotě 4 až Θ °C, přičemž se použije 1 litr 0,03 M chloridu sodného a 1 litr 0,09 M chloridu sodného v tomtéž pufru, pak se sloupec promyje ještě týmtéž pufrem s obsahem 1 M chloridu Rodného· Každý z materiálů se zbaví solí průchodem sloupcem s obsahem Sephadexu d-25 ve kyselině octové a pak se lyofilizuje· Vrchol pro inzulín se získá při elučním objemu 678 až 1 008 ml, výtěžek je 55,73 mg a 84 % celkové bílkoviny.

Krystaly soli inzulínu se zinkem byly získány tak, že es rozpustí 11,90 ng insulinu, získaného z chromatográfie na DEAE-celuláze ve 240 pl kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 N, načež se rychle přidá 2,16 ml roztoku 0,04 % chloridu zinečnatého, 0,05 M citronanu sodného a 15 % acetonu. Reakce se provádí ve zkumavce pro odstředění. Krystalizace probíhá 72 hodin při teplotě místnosti 25 °C, pak se supematant slije a krystaly se dvakrát promyjí chladnou vtfdou o pH 6,1 s odstředěním při 2 000 otáčkách za minutu a teplotě 3 °C po každém promytí. Pro analytické účely se krystaly znovu rozpustí v 0,01 N kyseliny chlorovodíkové.

Výsledný lidský inzulín je zcela čistý při analýze na pólyakrylamidovém gelu, kde je možno pozorovat pouze jediný pás při analýze aminokyselin, radiologické analýzy, radioimunologické analýzy, vysokotlaké kapalinové chromatografli, dansylaci a spektru v ultrafialovém světle. Při pokusu na 144 králících bylo možno prokázat účinnost 86,3 + 1,8 jednotek/mg v bezvodém stavu.

Příklad 7

Roztoky S- sul foné tu řetězce {N-fonnyl-Gly]] A člověka (Escherichia coli) a S-sul fond tu řetězce В Člověka (slinivka) · koncentraci 5 mg/ml v glycinovém pufru · koncentraci 0,1 M o pH 10,5 so upraví na pH 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného. 61,7 mg dithiothreitolu so rozpustí ve 4,0 ml glycinového pufru o koncentraci 0,Ί M a pH 10,5}se upraví na 10,5 přidáním 0,16 ml hydroxidu sodného o koncentraci 5 N. К 0,5 ml roztoku S-sulfonátu řetězce В se přidá 1,0 ml S-sulfonátu [N-formyl-Gly¹] A a 0,05 ml roztoku dithiothreitolu při teplotě 25 *C a poměru skupin -DH a -SSO^ 1,10. Roztok se míchá při teplotě 4 až 8 ^eC po dobu 23 hodiny v otevřené nádobce o obsahu 3 ml, po této době je možno prokásat vysokotlakou kapalinovou chromatografií výtěžek 1,46 mg lidského [N-formyl-01y'-A] insulinu a 19,5 % celkové bílkoviny.

Po okyselení na pH 3,15 ledovou kyselinou octovou se část roztoku zfiltruje na sloupci o rozměrech 1,5 x 90 cm s obsahem Sephadexu G-50 (Superfine) v rovnovážném stavu v 1 M kyselině octové při teplotě 4 až 8 °C. Vrchol pro [N-fomyl-Gly^-A] inzulín Člověka při elučním objemu 87 až 95 ml so lyofilizuje. Tato bílkovina je zcela čistá při průkazu vysokotlakou kapalinovou chromatografií a analýzou aminokyselin. Biologická účinnost pUfor^yl-Gly¹-^} inzulínu člověka je 17 % ve srovnání s účinností inzulínu člověka.

Příklade

Roztoky S-sulfonátu řetězce A vepřového inzulínu a S-sulfonátu řetězce В (E. coli) lidského inzulínu se připraví v koncentraci Ю mg/ml v 0,1 M glycinovém pufru o pH Ю,5. Roztoky řetězců А а В se smísí ták, že oo použijí 2 ml roztoku řetězce A na 1 ml roztoku řetězoe B, pak se pH výsledného ráztoku upraví na 10,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného. 121,2 mg cysteinu se rozpuotí ve 3,0 ml glycinového pufru o koncentraci 0,1 M a o pH 10,5 a pak se pH upraví na 10,5 přidáním 0,35 ml hydroxidu sodného o koncentraci 5 N. 1,4 ml výsledného roztoku se smísí při teplotě místnosti s 52 pl cysteinu, takže poměr -SH a -SSO^ je 0,95. Výsledný roztok se míchá při teplotě 4 až 8 °C v otevřené lékovoe o objemu 3 ml po dobu 20 hodin. Po této době je možno vysokotlakou kapalinovou chromatografií prokázat, že roztok obsahuje 3,25 mg lidského inzulínu, což odpovídá 23,2 % čolkové bílkoviny.

Claims (5)

1. Způsob výroby inzulínu vazbou řetězce A inzulínu nebo analogu insulinu a řetězce B inzulínu nebo analogu, inzulínu sa vzniku inzulínu nebo analogu inzulínu, například skatu, vepře nebo člověka, rakcí S-suLfenátu řetězce A s S-sulfenátu řetězce B v poměru 0,1:1 až 10:1 o thiolu jako redukčního činidla ve vodném prostředí, vyznačující se tím, že se směs uvede v reakci při pH 8 až 12, s výhodou 9,5 až ' 11,0, při koncentraci celkové bílkoviny 0,1 oi 50 m^/mL srněss, s výhodou 2 ož 20 mg/m směsi, mnnoasví thiolu odpovídajícím dosažení poměru celkem 0,4 ož 2,5, s výhodou 0,9 až 1,1, skupin -SH na každou skupinu -SSO~ v S-sufonátu řetězce A a řetězce B při teplotě 0 ož 25 °C, s výhodou 2 ož 10 °C za příoomnosSi zdroje’kyslíku.

2« Způsob podle bodu 1 . pro výrobu inzulínu skotu, vyznačující se tím, Se se používá koncentrace bílkoviny 3 ož 8 mj/m. smes.

3. Způsob podle bodu 1 pro výrobu inzulínu vepře, vyznaOčujcí se tím, že se používá koncentrace bílkoviny 8 ož _ \16 m/m. s^mes.

4. Způsob podle bodu 1, pro výrobu lidalého inzulínu, vyznaCující se tím, že se používá koncentrace bílkoviny 3 až 8 вд/m. srames.

5. Způsob podle bodu 1, vy^nauuící se tím, že se jako thiolu použije díthiothreitolu nebo dithioeirythritolu.