Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny.Mozliwosc wytwarzania produktów bialkowych przez zastosowanie sposobów polegajacych na re¬ kombinacji DNA, a szczególnie zastosowania takich sposobów do wytwarzania lancucha A insuliny i lancucha B insuliny [patrz Goeddel i inni, Proc.Nat 1, Acad. Sci. USA 76, 106—110 (1979)] spowo¬ dowal znaczny wzrost zapotrzebowania na skutecz¬ ny sposób laczenia lancuchów A i B w celu wy¬ tworzenia insuliny.W znanych sposobach wytwarzania insuliny po¬ legajacych na laczeniu lancuchów A i B stosuje sie zwykle jako substancje wyjsciowe lancuchy A i B w postaci ich trwalych S-sulfonianów. Na ogól S-sulfoniany lancuchów A i B poddaje sie, oddziel¬ nie albo razem, redukcji do ich odpowiednich zwiazków —SH, stosujac na ogól duzy nadmiar tiolowego srodka redukujacego.Produkty wyodrebnia sie ze srodowiska redukcji i, w przypadku gdy nie redukuje sie ich razem, laczy w srodowisku utleniajacym, np. powietrzu, w celu osiagniecia polaczenia lancuchów A i B.Przyklady takiego postepowania mozna znalezc w pracach Du i wspólpracowników Scientia Sinica 10, 84—104 (1961), Wilsona i innych, Biochim. Biophys.Acta 62, 483^89 (1962), Du i innych Scientia Sini¬ ca 14, 229—236 (1965), Kung i innych, Scienta Si¬ nica 15, 544—561 (1966), Kexue Tongbao (Chinska Republika Ludowa) 17, 241^277 (1966) i Markus- sen, J. Acta Paediatrica Scandinavica, Suppl. 270, 121—126 (1977).Modyfikacja takich sposobów polega na redukcji S-sulfonianu lancucha A, a nastepnie reakcji zre- 5 dukowanego lancucha A z S-sulfonianem lancucha B w srodowisku utleniajacym (patrz np. Katsonyan- nis i inni, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 55, 1554— 1561 (1966), Katsoyannis, Science 154, 1509—1514 (1966), Katsoyannis i inni, Biochemistry 6,2642—2655 10 (1967), opis patentowy Stanów Zjedn. Am. nr 3420810 oraz.Jentsch, Journal of chromatography 76, 167—174 (1973).Inna modyfikacja polega na czesciowym utlenia¬ niu zwiazku —SH lancucha A w celu wytworze- 15 nia ugrupowania siarczkowego pomiedzy resztami cysternowymi A-6 i A-ll, a nastepnie utlenianiu produktu ze zwiazkiem —SH lancucha B lub S-sul¬ fonianem lancucha B (patrz np. belgijski opis pa¬ tentowy nr 676069 oraz Zahn i inni, Liebigs Ann.Chem. 691, 225—231 (1966).Dixon i inni, Nature 188, 721—724 (1960) oma¬ wiaja warunki, które sugeruja przemiane S-sulfo¬ nianów lancuchów A i B do insuliny w jednym roztworze z zastosowaniem tiolowego srodka re¬ dukujacego i utleniania na powietrzu. Szczególy podano w sposób zupelnie szkicowy, a wydajnosc oparta jedynie na okresleniu czynnosci wyodrebnio¬ nego produktu wynosi 1—2°/o. Jednakze Dixon w Proc. Inter. Congr. Endecrinol. 2 nd London 1964, 30 1207—1215 (1965) sugeruje w tablicy IV na stronie 20 25 1285993 128 509 4 1211, ze sposób opisany we wczesniejszych publi¬ kacjach wymaga stosowania oddzielnych etapów redukcji i utleniania.W kazdych z powyzszych znanych sposobów je¬ den element jest wspólny, a mianowicie insuline wytwarza sie w dwóch niezaleznych, nastepuja¬ cych po sobie etapach, to jest najpierw realizuje sie etap redukcji S-sulfonianu do zwiazku —SH, a nastepnie etap utleniania do ugrupowania —S—S—.W odróznieniu od powyzszych, znanych w stanie techniki sposobów, odkryto obecnie, ze mozliwe jest; przy zastosowaniu okreslonych warunków re¬ akcji, osiagniecie dobrych wydajnosci wytwarzania msulin lub analogów insulin z S-sulfonianów lan¬ cuchów A i B popnzez polaczenie reakcji redukcji *i utleniania w jednoetapowym, jednoroztworowym procesie. Taki* wlasnie sposób jest przedmiotem wynalazku.Umozliwia on uzyskiwanie insuliny prostsza dro¬ ga, przy uzyciu nieskomplikowanej aparatury i w duzych ilosciach. Zbedne staja sie czasochlonne i pracochlonne operacje wyodrebniania produktów posrednich.Tak wiec przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny bydlecej, wieprzowej lub ludzkiej lub analogu insuliny b ogólnym wzorze 1, w którym Y oznacza Ala-Ser-Val w przypadku in¬ suliny bydlecej lub Thr-Ser-Ile w przypadku in¬ suliny wieprzowej lub ludzkiej, a Z oznacza Ala-OH w przypadku insuliny wieprzowej lub bydlecej lub Thr-OH w przypadku insuliny ludzkiej, zgodnie z którym S-sulfonianowa postac lancucha A insu¬ liny lub lancucha A analogu insuliny o ogólnym wzorze 2, w którym Y ma wyzej podane znaczenie, S-sulfonianowa postac lancucha B insuliny lub lancucha B analogu insuliny o ogólnym wzorze 3, w którym Z ma wyzej podane znaczenie oraz tio- lowy srodek redukujacy poddaje sie jednoczesnie reakcji w srodowisku wodnym, przy czym stosu¬ nek wagowy S-sulfonianowej postaci lancucha A do S-sulfonianowej postaci lancucha B wynosi od okolo 0,1 : 1 do okolo 10 : 1.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze mie¬ szanine reakcyjna wytwarza sie przy wartosci pH okolo 8—12, korzystnie okolo 9,5—11,0 i calkowi¬ tym stezeniu bialka okolo 0,1—50 mg/ml, przy czym tiology srodek redukujacy, korzystnie kwas mer- kaptooctowy, cysteine, kwas P-merkaptopropiono- wy, kwas o-markaptobenzoesowy, markaptoetylo- amine, kwas merkaptobursztynowy, dwutiotreitol lub dwutioerytryt stosuje sie w ilosci dostarczaja¬ cej ogólem okolo 0,4—2,5, korzystnie okolo 0,9—1,1 grupy —SH na kazda grupe —SSO|— obecna w calkowitej ilosci S-sulfonianowych postaci lancu¬ chów A i B, po czym mieszanine reakcyjna utrzy¬ muje sie w temperaturze okolo 0—25°C, korzyst¬ nie okolo 2—10°C, w srodowisku bedacym zródlem tlenu.Poprzez okreslenie „insulina" rozumie sie oczy¬ wiscie kazda z naturalnie wystepujacych insulin, taka jak ludzka, bydleca, wieprzowa, owcza, rybia, ptasia itp., a takze hybrydy utworzone w wyniku polaczenia lancucha A jednego gatunku insuliny z lancuchem B innego gatunku.Poprzez okreslenie „analog insuliny" rozumie sie dowolne bialko, które zawiera podstawowy lan¬ cuch A i lancuch B zawierajace wszystkie reszty pólcystynowe w uszeregowaniu sekwencyjnym 5 zgodnym z tym, które wystepuja w naturalnych insulinach. Analogi róznia sie od naturalnych in^ sulin podstawieniem, dodaniem, usunieciem lub modyfikacja jednej lub wiecej reszt aminokwaso- wych, ale z zachowaniem uporzadkowania wiaza¬ li nia dwusiarczkowego oraz co najmniej czesci ugru¬ powan czynnych takich jak w insulinie.Przykladami takich analogów sa [N-formylo- Gly^A]-insulina, Dezamino-AMnsulina, [Sarkozy- no^A] insulina, [L-Alanino^AJ-insulina, [D-Alani- II no^A] insulina, [Izoasparagino21-A]-insulina, [D- Asparagino21-A] insulina, [Asparagino21-A]-insulina, [Asparaginoamido21-A] insulina, [Sarkozyno^A, As- paragino21-A] insulina, [Norleucyno2-A] insulina, [Treonine5-A] insulina, [Leucyno5-A] insulina, [Fe- 10 nyloalanino19-A] insulina, [D-tyrozyno19-A] insulina, [Tyrozyno18-A, Asparagino19-A, Arginino21-A] insu¬ lina, Dez[B23-30-trópeptydo] insulina, Dez[B27-30-czte- ropeptydo] insulina, Dez[B26-30-pieciopeptydo] insu¬ lina, Dez[B27-30-czteropeptydo, Tyrozynoamido26-B]- M insulina, Dez[B2S-30-pieciopeptydo, Fenyloalanino- amido25-B] insulina, DezfB^-czteropeptydo] insu¬ lina, DeztBM-pieciopeptydo] insulina, [Lizyno22-B] insulina, [Leucyno9-B] insulina, [Leucyno10-B] insu¬ lina, Dez[FenyloalaninoX-B] insulina itp. 30 Te oraz inne analogi opisano w literaturze (patrz np. Blundell T. i inni, Advances in Protein Che- mistry 26, 330—362, Academic Press, N.Y., N.Y. (1972), Katsoyannis P. G., Treatment of Early Dia- betes, 319—327, Plenum Publishing Corp. (1979), 35 Geiger R., Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111—129, Dr. Hutnig, Publisher, Heidelberg, RFN (1976), Brandenburg D. i inni, Biochem. J. 125, 51—52 (1971).Jakkolwiek sposób wedlug wynalazku mozna sze- 40 roko stosowac do wytwarzania insulin i analogów insulin, szczególnie korzystnie stosuje sie go do wytwarzania insulin naturalnych, a zwlaszcza in¬ suliny ludzkiej, bydlecej lub wieprzowej, a naj¬ korzystniej insuliny ludzkiej. 45 Realizujac sposób wedlug wynalazku, polaczenia lancuchów A i B w celu utworzenia insuliny lub analogu insuliny mozna dokonac w szerokim zakre¬ sie proporcji jednego lancucha w stosunku do dru¬ giego. Oczywiscie polaczenie jest scisle ograniczone 50 przez ten lancuch, A albo B, który jest obecny w mniejszej ilosci. W kazdym przypadku, chociaz nie ma to zasadniczego znaczenia, stosunek wagowy lancucha A do lancucha B wynosi zazwyczaj od okolo 0,1 : 1 do okolo 10 : 1. Bardzo korzystnie reali- 55 zuje sie sposób wedlug wynalazku stosujac stosu¬ nek wagowy lancucha A do lancucha B od okolo 1:1 do okolo 3:1. Stwierdzono równiez, ze w wy¬ zej wymienionych granicach pewne stosunki sa szczególnie korzystne do wytwarzania poszczegól- •° nych gatunków insuliny. Tak wiec w polaczeniu lancucha A i B w celu wytworzenia insuliny byd¬ lecej korzystny stosunek wagowy lancucha A do lancucha B wynosi od okolo 1,4:1,0 do okolo 1,8 :1,0. 65 W przypadku insuliny wieprzowej korzystny sto-5 128 599 c sunek wagowy wynosi od okolo 1,0:1,0 do okolo 1,4: 1,0. W przypadku insuliny ludzkiej korzystny stosunek wagowy wynosi od okolo 1,8 : 1,0 do oko¬ lo 2,2 : 1,0.Innym parametrem, który ma znaczenie dla rea- • lizacji sposobu wedlug wynalazku na optymalnym poziomie jest stezenie bialka w srodowisku reak¬ cji. Sposób mozna z powodzeniem realizowac przy róznych stezeniach bialka. Jednak na ogól steze¬ nie bialka wynosi okolo 0,1—50 mg/ml srodowiska W reakcji. Korzystnie stezenie bialka wynosi okolo 2—20 mg/ml. I w tym przypadku stwierdzono, ze w wyzej wymienionych granicach optymalne ste¬ zenie bialka rózni sie w zaleznosci od gatunku wy¬ twarzanej insuliny. Tak wiec w przypadku insu- W liny wieprzowej korzystne stezenie bialka wynosi 8—16 mg/ml, podczas gdy w przypadku wytwarza¬ nia insuliny ludzkiej lub bydlecej korzystne ste¬ zenie wynosi 3—8 mg/ml.Sposób wedlug wynalazku realizuje sie w sro- 20 dowisku wodnym. Na ogól wartosc pH srodowiska mierzona w temperaturze pokojowej wynosi oko¬ lo 8—12. Korzj^stnie wynosi ona okolo 9,5—11,0, a optymalnie okolo 10,4^10,6. Wartosc pH srodo¬ wiska mozna utrzymac w wymaganych granicach 2* dodajac odpowiedniego srodka buforujacego.Takimi typowymi srodkami buforujacymi sa np. glicyna, glicyloglicyna, weglan, trójhydroksymetylo- aminometan, N,N-bis/2-hydroksyetylo/glicyna, piro- fosforan, kwas N-trój/hydroksymetylo/metylo-3-ami- 30 nopropanosulfonowy oraz inne podobne srodki, któ¬ re powoduja utrzymanie wartosci pH w poprzed¬ nio opisanych granicach. Popularnym i korzystnym srodkiem buforujacym jest glicyna.Stezenie srodka buforujacego wynosi zwykle oko- 35 lo 0,001—2 m. Korzystne stezenie wynosi okolo 0,01—1 m, a najkorzystniejsze okolo 0,01—0,1 m.Do polaczenia lancuchów A i B doprowadza sie w odpowiednim srodowisku wodnym w obecnosci tiolowego srodka redukujacego.^ 49 Przez okreslenie „tiolowy srodek redukujacy" rozumie sie zwiazek, który zawiera co najmniej jedna grupe —SH oraz wykazuje zdolnosc do sku¬ tecznej redukcji grup S-sulfomanowych lancuchów A i B. Jakkolwiek mozna stosowac kazdy zwiazek 45 wykazujacy powyzsze cechy charakterystyczne, bardzo korzystnym tiolowym srodkiem redukuja¬ cym jest ten, którego postac utleniona poddana cyklizacji tworzy wysoce trwaly zwiazek. Tiolowy srodek redukujacy stosuje sie w ilosci, która do- £0 starcza ogólem okolo 0,4—2,5 grup —SH na kazda grupe ^SSO~i obecna w calkowitej ilosci lancu¬ chów A i B, a korzystnie okolo 0,9—1,1 grup —SH na kazda grupe —SSO-8.Przykladami typowych srodków redukujacych sa M dwutiotreitol (DTT), dwutioerytryt (DTE), 2-mer- kaptoetanol, tioglikolan metylu, 3-merkapto-l, 2- -propanodiol, kwas 3-merkaptopropionowy, kwas tioglikolowy oraz inne podobne zwiazki tiolowe.Korzystnym tiolowym srodkiem redukujacym jest •• dwutiotreitol i dwutioerytryt, przy czym najko¬ rzystniejszym jest dwutiotreitol.Jednym z zasadniczych warunków realizacji spo¬ sobu wedlug wynalazku jest to, ze reakcje nalezy oprowadzic w srodowisku bedacym zródlem tlenu. 65 W celu spelnienia tego warunku wystarczy zapew¬ nic mieszaninie reakcyjnej dostep powietrza. Cho¬ ciaz mozna stosowac sposoby polegajace na bar¬ dziej bezposrednim kontakcie, takie jak np. prze¬ puszczanie pecherzyków powietrza lub tlenu przez mieszanine reakcyjna, nie sa one potrzebne.Tak wiec na ogól sposób wedlug wynalazku rea¬ lizuje sie przygotowujac mieszanine S-sulfonianu lancucha A, S-sulfonianu lancucha B i tiolowego srodka redukujacego o wymaganych stezeniach w srodowisku wodnym przy pH okolo 8—12. Miesza¬ nine miesza sie lagodnie w kontakcie z powietrzem w ciagu co najmniej 30 minut. Podczas tego okre¬ su mieszania, mieszanine utrzymuje sie zwykle w temperaturze okolo ,0—25°C, jednak korzystnie mie¬ szanine poddaje sie umiarkowanemu oziebianiu w celu utrzymania temperatury na dolnym poziomie tego zakresu, zwykle w temperaturze okolo 2— —10°C.Po zakonczeniu reakcji produkt, insuline lub analog insuliny, mozna wyodrebnic stosujac jaki¬ kolwiek ze znanych sposobów stosowanych w tech¬ nologii wytwarzania insuliny. Najpopularniejszymi technikami, które stosuje sie do oczyszczania in¬ suliny, sa techniki chromatograficzne. Naleza do nich chromatografia zelowa oraz chromatografia jonowymienna.Ponadto produkt mozna oceniac pod wzgledem czystosci i czynnosci droga takich znanych sposo¬ bów jak elektroforeza na zelu poliakryloamidowym, analiza aminokwasowa, insulinowa próba radio- receptorowa, insulinowa próba radioimmunologicz- na, cisnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC), widmo w nadfiolecie, dansylacja, próbka glikozo- wa krwi króliczej, itp.Do insulin, które mozna otrzymac stosujac spo¬ sób wedlug wynalazku naleza hybrydy zawiera¬ jace lancuch A insuliny jednego gatunku i lan¬ cuch B insuliny innego gatunku.W sposobie wedlug wynalazku kladzie sie na¬ cisk na prawidlowe polaczenie S-sulfonianów lan¬ cuchów A i B, a konkretna budowa tych lancu¬ chów, o ile faktycznie reprezentuja one soba lan¬ cuchy*A i B insulin lub analogów insulin, jest dla tego sposobu nieistotna.Jakkolwiek sposobem wedlug wynalazku mozna wytworzyc analog insuliny lub hybryde insuliny, czyli polaczenie lancucha A jednego gatunku i lan¬ cucha B innego gatunku, korzystnie wytwarza sie insuline która pod wzgledem strukturalnym jest identyczna jak insulina wystepujaca naturalnie, stosujac S-sulfonian lancucha A oraz S-sulfonian lancucha B, z których kazdy ma skwencje ami¬ nokwasów reprezentowana przez taka insuline. Po¬ nadto bardzo korzystnie sposób wedlug wynalazku stosuje sie do wytwarzania insuliny wieprzowej, wolowej lub ludzkiej, a najkorzystniej do wytwa¬ rzania insuliny ludzkiej.Jak juz stwierdzono, lancuchy A i B insuliny lub analogu insuliny mozna wytworzyc stosujac polegajace na rekombinacji DNA. Mozna je rów¬ niez wytworzyc z insulin naturalnych lub stosujac klasyczne sposoby syntezy bialek, do których na¬ leza techniki reakcji w roztworze lub w fazie sta¬ lej.\ t 1S8 599 8 Lancuchy A i B utrzymuje sie w postaci trwa¬ lej jako S-sulfoniahy, S-sulfonianowe substancje Wyjsciowe mozna wytworzyc stosujac sulfitolize utleniajaca, podczas której lancuchy A i B pod¬ daje sie reakcji z siarczynem sodowym w obecno¬ sci lagodnego srodka utleniajacego, takiego jak Czterótionian sódówy.Ilustracja sposobu wedlug wynalazku sa naste¬ pujace przyklady.Przyklad I. 360 mg S-sulfonianu wieprzowe¬ go lancucha A rozpuszcza sie w 36 ml 0,1 m gli- cynOwego roztworu buforowego o pH 10,5 i odczyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 5n NaOH. 300 mg S-sulfonianu wieprzo^ wego lancucha B rozpuszcza si£ w 30 ml 0,1 m gli- cyrtOwego roztworu buforowego o pH 10,5 i od¬ czyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 10,5 Uzywajac 5n NaOH. 123,4 mg dWutiotreitolu (DTT" rozpuszcza sie w 4 ml 0,1 m glicynowegó roztworu buforowego o pH 10,5 i odczyn miesza¬ niny doprowadza sie do partosci pH 10,5 uzywa¬ jac 0,2 ml 5n NaOH.Roztwory lancuchów A i B laczy sie w 100 ml fiolce w temperaturze okolo 25°C a nastepnie do¬ daje sie 1,91 ml roztworu DTT w celu uzyskania stosunku grup —SM do grup —SSO-f 1,04. Otrzy¬ many roztwór miesza sie lagodnie w otwartej zlew¬ ce z mieszadlem magnetycznym w temperaturze 4—8dC w ciagu 20 godzin. Wydajnosc otrzymanej insuliny okreslona za pomoca cisnieniowej chro¬ matografii cieczowej wynosi 193,8 mg co odpowia¬ da 29*/« calkowitej ilosci bialka.Odczyn 40 ml tego koncowego roztworu dopro¬ wadza sie do wartosci pH 3,15 za pomoca kwasu octowego. Mieszanine poddaje sie chromatografii zelowej na kolumnie Sephadex G-50 (Superfine) o wymiarach 5X200 cm doprowadzonej do stanu równowagi i eluuje 1 m kwasem octowym w tem¬ peraturze 4—8°C. Frakcje insuliny (objetosc eluatu 2450—2700 ml) zbiera sie i liofilizuje odzyskujac 95 mg insuliny co odpowiada 25% calkowitej ilo¬ sci bialka.Insuline wieprzowa uznaje sie za zupelnie czy¬ sta na podstawie wyników elektroforezy w zelu poliakrylóamidowym, analizy aminokwasów, insu¬ linowej próby radioreceptorowej, HPLC oraz pró¬ by na Obnizenie poziomu glikozy we krwi króli¬ czej.Przyklad II. Przygotowuje sie roztwory S-sul- fónianów bydlecych lancuchów A i B o stezeniu 5 mg/nil w 0,01 m glicynowym roztworze buforo¬ wym o pH 10,5. Odczyh kazdego roztworu do¬ prowadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 5n NaÓH. 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 4,0 ml 0,1 m glicyhówego roztworu buforowego o pH 10,5 i od¬ czyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 0,15 ml 5n NaOH. DO 0,5 ml roz- Iwotu lancucha B dodaje sie 0,6 ml roztworu lan¬ cucha A i 0,035 ml roztworu DTT w temperatu¬ rze pokojowej okolo 25°C w celu uzyskania sto¬ sunku grup —SH do grup —SSO", 0,91. Otrzyma¬ ny roztwór miesza sie w temperaturze 4—8°C w Ciagli 20 godzin w Otwartej 3 ml fiolce. Wydajnosc otrzymanej insuliny bydlecej okreslona za pomoca HPLC wynosi 1,96 mg co odpowiada 30% calko¬ witej ilosci bialka.Przyklad III. Przygotowuje sie roztwory S-sulfonianów wieprzowych lancuchów A i B 3 o stezeniu 10 mg/ml w 0,1 m glicynowym roztwo¬ rze buforowym o pH 10,5. Odczyn kazdego roz¬ tworu doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzy¬ wajac 5n NaOH. 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 2,0 ml wody destylowanej w naczyniu szklanym.W Do 0,5 ml roztworu lancucha B dodaje sie 0,6 ml roztworu lancucha A i 29,25 |xl roztworu DTT w temperaturze pokojowej Okolo 25°C w celu uzy¬ skania stosunku grup —SH do grup —SSO^t 1,00.Otrzymany roztwór miesza sie w temperaturze ii 4^8°C w otwartej 3 ml fiolce w ciagu 20 godzin.Wydajnosc otrzymanej insuliny wieprzowej okre¬ slona za pomoca HPLC wynosi 3,81 mg cO odpo¬ wiada 35°/» calkowitej ilosci bialka.Przyklad IV. Przygotowuje sie roztwory * Srsulfonianu ludzkiego (trzustkowego) lancucha B oraz kilka roztworów S-sulfonianu ludzkiego (trzu¬ stkowego i E. Coli) lancucha A 1 S-sulfonianu Wieprzowego (trzustkowego) lancucha A o steze¬ niu 5 mg/ml w 0,1 m glicynowym roztworze bufo- ** rowym o pH 10,5. Odczyn kazdego roztworu do¬ prowadza sie do wartosci pH 10,5 Uzywajac 5n NaOH. 61,7 mg DTT rozpuszcza si£ w 4,0 ml 0,1 m glicynowego roztworu buforowego o pH 10,5 i od¬ czyn roztworu doprowadza sie do Wartosci pH ** 10,5 uzywajac 0,16 ml 5n NaOH. Do 1,0 ml kaz¬ dego z roztworów- S-sulfonianu lancucha A do¬ daje sie 0,5 ml S-sulfonianu lancucha B i 0,05 ml roztworu DTT w temperaturze pokojowej 25ÓC w celu uzyskania stosunku grup -^SH do grup 35 —SSO-* 1,09.Wszystkie roztwory miesza sie w Chlodnym po¬ mieszczeniu w temperaturze 4—"8° C w otwartej fiolce w ciagu 20^22 godzin. Nastepnie w celu okreslenia wydajnosci analizuje sie je za pomoca 40 HPLC stosujac jako odnosnik trzustkowa insuline ludzka. Wyniki podaje tablica 1.Tablica 1 Zródlo lancuchów A Wieprzowy (trzustkowy) 1 Wieprzowy (trzustkowy) 1 Ludzki (trzustkowy) 1 Ludzki (trzustkowy) Ludzki (E. coli) Wydajnosc insuliny ludzkiej 2,00 2,11 1,95 2,03 1,99 Wydajnosc w % calkowitej ilosci bialka 26,7 28,1 ~~ 26,0 27,1 2,5 Przyklad V. Przygotowuje sie roztwory S-sul- 6o fonianów ludzkiego lancucha A i ludzkiego lan¬ cucha B o stezeniu 5 mg/ml w 0,1 m glicynowym roztworze buforowym o pH 10,5. Odczyn kazdego roztworu doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzy¬ wajac 5n NaOH, 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 65 4,0 ml 0,1 m glicynowego roztworu buforowego*128 599 9 10 o pH 10,5 i doprowadza sie odczyn roztworu do wartosci pH 10,5 uzywajac 0,16 ml 5n NaOH. Do 0,5 ml roztworu lancucha B dodaje sie w tempe¬ raturze pokojowej 1,0 ml roztworu lancucha A, a nastepnie 50 [Jil roztworu DTT w celu uzyskania 5 stosunku grup —SH do grup —SSO_8 1,09.Otrzymany roztwór miesza sie w temperaturze 4—8°C w otwartej 3 ml fiolce w ciagu 22 godzin, po którym to czasie wydajnosc otrzymanej insu¬ liny ludzkiej okreslona za pomoca HPLC wynosi 10 2,58 mg co odpowiada 34°/o calkowitej ilosci bialka.Przyklad VI. 328 mg S-sulfonianu ludzkiego lancucha A rozpuszcza sie w 65,6 ml 0,1 m glicy- nowego roztworu buforowego o pH 10,5 i odczyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 10,5 15 uzywajac 75 (xl 5n NaOH. 164 mg S-sulfonianu ludzkiego lancucha B rozpuszcza sie w 32,8 ml 0,1 m glicynowego roztworu buforowego o pH 10,5 i odczyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 15 [xl 5n NaOH, 61,7 mg DTT 20 rozpuszcza sie w 4,0 ml 0,1 m glicynowego roztwo¬ ru buforowego o pH 10,5 i odczyn roztworu dopro¬ wadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 160 [xl 5n NaOH.Roztwory lancuchów A i B laczy sie w 150 ml 25 zlewce szklanej w temperaturze pokojowej okolo 25°C i dodaje sie 3,28 ml roztworu DTT w celu uzyskania stosunku grup —SH do grup —SSO~8 1,05. Otwarta zlewke umieszcza sie w lazni zawie¬ rajacej wode z lodem w chlodnym pomieszczeniu 30 i miesza energicznie w ciagu 30 minut. Nastepnie roztwór miesza sie w ciagu dodatkowych 24 godzin w chlodnym pomieszczeniu w temperaturze 4—8°C.Po uplywie tego czasu wydajnosc otrzymanej in¬ suliny ludzkiej okreslona za pomoca HPLC wy- 35 nosi 148 mg, co odpowiada 30% calkowitej ilosci bialka.Do 100 ml otrzymanego roztworu dodaje ' sie 25 ml lodowatego kwasu octowego do uzyskania koncowego odczynu pH 3,15. Cala próbke poddaje 40 sie chromatografii zelowej na kolumnie Sephadex G-50 (Superfine) o wymiarch 5X200 cm doprowa¬ dzonej do stanu równowagi i eluuje 1 m kwasem octowym w temperaturze 4—8°C. Cala ilosc wy¬ mytego bialka poddaje sie liofilizacji. Otrzymuje « sie frakcje insuliny (objetosc eluatu 2465—2781 ml) o wadze 125 mg co odpowiada 29,4% odzyskanego bialka.Porcje 95,5 mg powyzszej frakcji insuliny roz¬ puszcza sie w okolo 9 ml roztworu buforowego 50 zawierajacego 0,01 m 2-amino-2-hydroksymetylo- propanodiol-1,3, 0,001 m kwas etylenodwuamino- czterooctowy, 7,5 m mocznik i 0,03 m NaCl o pH 8,5 w temperaturze 4°C. Mieszanine chromatogra- fuje sie na DEALE (dwuetyloaminoetylo)-celulozo- 55 wej kolumnie jonowymiennej o wymiarach 2,5 X X90 cm doprowadzonej do stanu równowagi za pomoca tego samego roztworu buforowego.Bialko eluuje sie w temperaturze 4—8°C 1 litro¬ wymi porcjami tego samego buforu o wzrastaja- 60 cym stezeniu NaCl 0,03 m, 0,09 m, a nastepnie 1 m.Kazda porcje odsala sie na kolumnie Sephadex G-25 (course) w 2°/o kwasie octowym i liofilizuje.Otrzymuje sie frakcje insuliny o wadze 55,73 mg co odpowiada 84% odzyskanego bialka. 85 Rozpuszczajac próbke 11,90 mg frakcji insuliny (DEAE) w 240 [xl 0,ln HCl, a nastepnie szybko do¬ dajac 2,16 ml roztworu zawierajacego 0,04% ZnCl2, 0,05 m cytrynian sodowy i 15% aceton w szklanej probówce wirówki wytwarza sie krysztaly insuli¬ ny cynkowej.Produkt poddaje sie krystalizacji w ciagu 72 go¬ dzin w temperaturze pokojowej okolo 25°C, po czym usuwa sie ciecz sklarowana nad osadem i przemywa krysztaly dwukrotnie zimna woda o odczynie pH 6,1, przy czym pomiedzy przemy- waniami produkt wiruje sie z szybkoscia 2000 obro¬ tów/minute w temperaturze 3°C. Krysztaly ponow¬ nie rozpuszcza sie do analizy w 0,01n HCl.Na podstawie wyników elektroforezy w zelu poliakryloamidowym (pojedyncze pasmo), analizy aminokwasów, insulinowej próby radioreceptoro- wej, insulinowej próby radioimmunologicznej, HPLC, dansylacji i analizy widma UV ocenia sie, ze otrzymany preparat insuliny ludzkiej jest zu¬ pelnie czysty. Próba USP na królikach (144 króliki) wykazuje sile dzialania leku 26,3 ± 1,8 jednostek (mg) bezwodny.Przyklad VII. Przygotowuje sie roztwory S-sulfonianu ludzkiego (E. coli) lancucha [N-for- mylo-Gly1] A i S-sulfonianu ludzkiego (trzustko¬ wego) lancucha B o stezeniu 5 mg/ml w 0,01 m gli¬ cynowym roztworze buforowym o pH 10,5. Odczyn kazdego roztworu doprowadza sie do wartosci pH 10,5 uzywajac 5n NaOH. 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 4,0 ml 0,1 m glicynowego roztworu buforo¬ wego o pH 10,5 i odczyn roztworu doprowadza sie do wartosci 10,5 uzywajac 0,16 ml 5n NaOH. Do 0,5 ml roztworu S-sulfonianu lancucha B dodaje sie 1,0 ml S-sulfonianu lancucha [N-formylo-Gly1] A i 0,05 ml roztworu DTT w temperaturze poko¬ jowej 25°C w celu uzyskania stosunku grup —SH do grup —SSO"8 1,10.Roztwór miesza sie w chlodnym pomieszczeniu w temperaturze 4—8°C w otwartej fiolce w ciagu 23 godzin, po którym to czasie wydajnosc ludzkiej [N-formylo-Gly^A] insuliny okreslona za pomoca HPLC wynosi 1,46 mg co odpowiada 19,5% calko¬ witej ilosci bialka.Po zakwaszeniu do wartosci pH 3,15 lodowatym kwasem octowym porcje tego roztworu poddaje sie chromatografii zelowej na kolumnie Sephadex G-50 (Superfine) o wymiarach 1,5X90 cm dopro¬ wadzonej do stanu równowagi i eluuje 1 m kwa¬ sem octowym w temperaturze 4—8°C. Frakcje ludzkiej [N-formylo-Gly^A] insuliny (objetosc eluatu 87—95 ml) zbiera sie, tworzy podwielokrot- na czesc próbki i liofilizuje. Na podstawie wyni¬ ków HPLC i analizy aminokwasów ocenia sie, ze bialko jest zupelnie czyste. Czynnosc biologiczna ludzkiej [N-formylo-Glyx-A] insuliny oceniana na podstawie próby radioreceptorowej wynosi 17% czynnosci standardowej insuliny ludzkiej.Przyklad VIII. Przygotowuje sie roztwory S-sulfonianu wieprzowego lancucha A i S-sulfo¬ nianu' ludzkiego (E. coli) lancucha B o stezeniu 10 mg/ml w 0,1 m glicynowym roztworze buforo¬ wym (pH 10,5). Na kazdy mililitr S-sulfonianu lan¬ cucha B stosuje sie 2 ml S-sulfonianu lancucha A.Odczyn roztworu doprowadza sie do wartosci pH128 ii 10,5 za pomoca 5n NaOH. 121,2 mg cysteiny roz¬ puszcza sie w 3,0 ml 0,1 m buforu glicynowego (pH 10,5), a nastepnie doprowadza sie odczyn roz¬ tworu do wartosci pH 10,5 dodajac 0,35 ml 5n NaOH.Nastepnie do 1,4 ml roztworu lancuchów A i B dodaje sie w temperaturze pokojowej 52 \il roz¬ tworu cysteiny w celu uzyskania stosunku grup —SH do —SSO'g wynoszacego 0,95. Otrzymany roztwór miesza sie w ciagu 20 godzin w otwartej fiolce o pojemnosci 3 ml, w temperaturze 4—8°C.Otrzymuje sie 3,25 mg insuliny ludzkiej (analiza HPLC), co odpowiada 23,2% calkowitej ilosci bialka.Przyklad IX. Sporzadza sie 7 ml roztworu wieprzowego lancucha A (SSO~8)4 o stezeniu 25 mg/ml i 4 ml roztworu E. coli lancucha (fJ-Gly)B (SSO-|)2 o stezeniu 25 mg/ml w 0,1 m glicynowym roztworze buforowym o pH 10,5. 6,0 ml roztworu lancucha A i 3,0 ml roztworu lancucha B laczy sie i roztwór lacznego roztworu doprowadza do wartosci pH 10,5 za pomoca 5n NaOH. Sporzadza sie roztwór 61,7 mg DTT w 4,0 ml 0,1 m glicyno¬ wego roztworu buforowego i odczyn doprowadza do wartosci pH 10,5 za pomoca 140jji1 5n NaOH. 1,64 ml roztworu DTT dodaje sie do lacznego roz¬ tworu A/B. Optymalna wartosc stosunku SH/ /SSO~i = 1,20 okreslona zostala wczesniej przy uzyciu tych samych ilosci DTT i lancuchów A i B przy stezeniu bialka 10 mg/ml. Zmiana stezenia bialka w lacznym roztworze A i B nie powinna w sposób znaczacy zmieniac optymalnego stezenia DTT.Laczny roztwór rozdziela sie natychmiast na 11 podwielokrotnych próbek, które umieszcza sie w probówkach o pojemnosci 3 ml zawierajacych rózne ilosci 0,1 m glicynowego roztworu buforuja¬ cego. Zawartosc kazdej z fiolek miesza sie w cia¬ gu nocy w temperaturze 5°C. W tablicy 2 podano sklad badanych próbek oraz rzeczywiste calkowite stezenie lancuchów w mieszaninie reakcyjnej. War¬ tosc tego stezenia odzwierciedla wplyw dodatku DTT oraz rozcienczenia roztworem buforujacym.Wartosc ta zgodna jest z wynikami analizy ami¬ nokwasów w mieszaninie reakcyjneej (88,8% wa¬ gowych lancucha A, 88% wagowych lancucha B).Po uplywie 22—25 godzin od chwili rozpoczecia reakcji próbki mieszaniny reakcyjnej poddano ana¬ lizie HPLC. Wydajnosc reakcji wyznaczono na podstawie wartosci rzeczywistej zawartosci bialka w poszczególnych próbkach. Wyniki przedstawiono w tablicy 3. Rezultaty próby zilustrowano graficz¬ nie na wykresie (fig. 1 rysunku). Z danych uzy¬ skanych w próbie wynika, ze optymalna calkowita zawartosc bialka wynosi w reakcji laczenie ludz¬ kich lancuchów A i B 8 mg/ml.Przyklad X. Laczy sie 10 ml roztworu lan¬ cucha A i 5 ml roztworu lancucha B w 0,1 m gli¬ cynowym roztworze buforujacym o pH 10,5. Spo¬ rzadza sie roztwór 121,2 mg cysteiny w 3,0 ml gli¬ cynowego roztworu buforujacego, po czym odczyn doprowadza do wartosci pH 10,5 za pomoca 350 \il 5n NaOH.Podwielokrotne próbki lacznego roztworu o ob¬ jetosci 14 ml doprowadza sie do wyjsciowej war- 599 12 * Tablica 2 Numer próbki 1 2 3 4 5 6 7 8 1 9 1 10 11 Ilosc glicynowego roztworu buforuja¬ cego (ml) 1,0 1,0 1,0 0,8 0,75 0,6 0,6 0,45 0,3 0,15 0 Ilosc roztworu lacznego (ml) 0,1 0,2 0,35 0,4 0,5 0,5 0,6 0,7 0,8 1,0 1,3 Rzeczywiste 1 calkowite stezenie lanciuchów w mieszaninie reakcyjnej (mg/ml) 1,70 3,12 4,85 6,24 7,48 8,50 9,36 11,39 13,61 16,27 18,71 Tablica 3 Numer próbki 1 2 3 4 ' 5 6 7 8 9 10 11 Zawar¬ tosc bialka (mg/ml) 1,70 3,12 4,85 6,24 7,48 8,50 9,36 11,39 13,61 16,27 18,71 Zawar¬ tosc insuliny (mg/ml) 0,19 0,69 1,16 1,55 1,91 2,17 2,31 2,62 2,88 3,10 3,28 Wydaj¬ nosc calkowita (%) 17,3 22,1 24,0 24,9 25,5 25,5 Procent najwyzszej wydanjosci (%) 67,9 86,9 94,0 97,5 99,9 100 24,7 | 96,6 23,0 90,1 21,2 19,0 17,5 82,9 74,6 68,8 tosci pH w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 57 fil roztworu cysteiny natychmiast doprowadza m sie odczyn do wyjsciowej wartosci pH. Po umiesz¬ czeniu próbek w temperaturze 6°C miesza sie je w ciagu nocy w otwartych probówkach o pojem¬ nosci 3 ml. Warunki prowadzenia i wyniki próby przedstawia tablica 4.« Po uplywie 24—27 godzin trwania reakcji (w temperaturze 6°C) podwielokrotne próbki miesza¬ niny reakcyjnej rozcienczone lodowatym kwasem octowym (1: 2) poddaje sie analizie HPLC. Oblicza sie rzeczywista wydajnosc reakcji laczenia lancu- «o chów (podano ja w tablicy 4). Z wykresu zalez¬ nosci tej wartosci od wartosci pH (fig. 2 rysunku) wynika, ze optymalna wartosc pH wynosi 10,5.Powyzej pH 11,5 wydajnosc insuliny gwaltownie spada, co wiadome jest takze z literatury (Scientia 65 Sinica 14, 229 (1965)). Tak wiec optymalna war-128 599 13 Tablica 4 14 Numer próbki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Wyjscio¬ wa wartosc pH 7,4 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,1 Roztwór regulujacy wartosc pH 22 [xl 6n HC1 18 [xl 6n HC1 12 (xl 6n HC1 5 [xl 6n HC1 5 [xl In HC1 5 {xl 5n NaOH 10 [xl 5n NaOH 15 y.1 5n NaOH 20 ejlI 5n NaOH Zawar¬ tosc insuliny (mg/ml) 0 0,327 0,813 1,284 1,659 2,113 1,659 1,308 0,048 Rzeczy¬ wista wydaj¬ nosc reakcji laczenia lancu¬ chów (%) 0 4,0 10,0 | . 15,8 20,4 | 26,0 | 20,4 | 16,2 | 0,6 toscia pH w reakcji laczenia lancuchów A i B z udzialem cysteiny wynosi 10,5.Przyklad X. 120 mg wieprzowego lancucha A (SSO_j)4 i 60 mg E. coli ludzkiego lancucha (Trp E) B (SSO-8)2 rozpuszcza sie w odpowiednio 12,0 i 6,0 ml 0,1 m buforu glicynowego o pH 10,5 i odczyn doprowadza do wartosci pH 10,5 za po¬ moca 5n NaOH. 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 4,0 ml 0,1 m buforu glicynowego i odczyn dopro¬ wadza do wartosci pH 10,5 za pomoca 5n NaOH.Roztwory pozostawia sie w skrzyni z lodem pod¬ czas przygotowywania próbek poszczególnych mie¬ szanin reakcyjnych.Nastepnie próbki zaczyna sie przygotowywac po zakonczeniu sporzadzania poprzednich. Próbki 10 15 20 25 30 35 40 przygotowuje sie dodajac reagenty w kolejnosci podanej w tablicy 5 do otwartych probówek o po¬ jemnosci 3 ml, a potem miesza w ciagu nocy w temperaturze 6°C za pomoca mieszadelka magne¬ tycznego. Regulacje wartosci pH prowadzi sie szybko i z duza dokladnoscia.Koncowe wartosci pH odpowiadaja dokladnie wyjsciowym wartosciom pH w temperaturze 6°C, w której reakcje rozpoczyna sie i kontynuuje. Po uplywie 4—6 godzin próbki niektórych mieszanin reakcyjnych poddaje sie analizie HPLC, a po uplywie 1 dnia analizuje sie w ten sposób próbki wszystkich mieszanin reakcyjnych. Wyniki anali¬ zy HPLC porównuje sie z wynikami dla standar¬ dowej insuliny wieprzowej (rezultaty przedstawio¬ no w tablicy 6).Tablica 6 Numer próbki 0 1 2 3 4 5 6 7 Zawar¬ tosc insuliny po 4—6 godzinach mg/ml 0,62 — 1,63 — 1,89 — 1,61 0,91 Wydaj¬ nosc PP uplywie 4—6 godzin (%) 6,5 — 17,5 — 20,2 __ 17,3 9,8 Zawar¬ tosc insuliny / PO 1 dniu (mg/ml) 0,81 1,22 1,74 2,02 "2,17 — 2,01 __1,72 1,18 Procentowa wydajnosc calkowita po 1 dniu % 9,2 13,1 18,7 21,6 • 23,1 21,5 18,4 12,7 Z powyzszych danych jednoznacznie wynika, ze wartosc pH 10,5 jest optymalna dla poczatku reak¬ cji laczenia lancuchów A i B. Przebieg wykresu (fig. 3 rysunku) potwierdza rezultaty poprzednich badan, wskazujac na fakt, ze wartosc pH ma de¬ cydujace znaczenie dla otrzymywania insuliny z duza wydajnoscia. Tak wiec ustalenie odpowied¬ niej poczatkowej wartosci pH przy danej tempe¬ raturze reakcji jest bardzo wazne. Dla otrzymania insuliny z maksymalna wydajnoscia nie trzeba utrzymywac pH 10,5.W procesie laczenia wieprzowego lancucha A (SSO-|)4 i ludzkiego lancucha B (SSO-3)2 uzyska- Tablica 5 Numer próbki ° 1 2 3 4 5 6 7 A (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 B (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 DTT (txl) 100 100 100 100 100 100 100 100 Koncowa wartosc pH 9,0 9,5 10,0 10,3 10,5 10,7 11,0 11,5 Roztwór regulujacy wartosc pH 100 [n In HC1 | 50 fil In HC1 | 16 (xl In HC1 | 2 [xl In HC1 | 1 fxl 5n NaOH | 3 \n 5n NaOH | 10 (xl 5n NaOH | 25 {xl 5n NaOH |128 599 15 16 no 6 zaskakujaco powtarzalnych wartosci wydaj¬ nosci calkowitej, to jest 23,6%, 24,7%, 23,5°/©, 23,0%, 23% i 23,1% (srednia wartosc 23,5%). Otrzymane rezultaty potwierdzaja, ze optymalna wartoscia pH jest 10,5 a wyjsciowa wartosc pH ma decydujace znaczenie dla reakcji laczenia A i B. Graficzna ilustracja próby jest wykres stanowiacy fig. 3 ry¬ sunku.Przyklad XI.A. Z wieprzowego lancucha A (SSO_8)4 i E. coli lancucha B (SSO-32 sporzadza sie laczny roztwór A/B o stezeniu 10 mg/ml w buforze glicynowym o pH 10,5. 121,2 mg L-cysteiny rozpuszcza sie w 3,0 ml 0,1 m buforu glicynowego, po czym odczyn doprowadza sie do wartosci pH 10,5 za pomoca 350 \il 5n NaOH. Do podwielokrotnych próbek lacz¬ nego roztworu A/B (1,4 ml) dodaje sie rózne ilosci L-cysteiny. Pouplywie 17—21 godzin w tempera¬ turze 6°C reakcja dobiega do konca (HPLC). Uzy¬ skane wyniki przedstawia tablica 7.Tablica 7 Numer próbki 1 * 1 2 3 1 4 1 5 | 6 1 7 8 I""9 10 Ilosc cysteiny (al) 26 47 57 62 67 72 88 104 129 155 SH/SSO3 0,5 0,9 U 1,2 1,3 1,4 1,7 2,0 2,5 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,640 1,520 1,917 1,975 1,917 1,750 1,479 1,192 0,849 0,515 Wydaj¬ nosc calkowi¬ ta (%) 7,4 17,7 22,5 | 23,5 ~ 22,7 _ 20,8 17,7 14,5 10,5 | 6,5 Zmiany wartosci stosunku SH/SSO-3 odpowia¬ daja zmianom wartosci dla DTT (patrz wykres fig. 4 rysunku). Wydajnosc optymalna 23,3% jest dobrze porównywalna z wydajnoscia 24—27% otrzymana przy uzyciu DTT, obliczona jak na wy¬ kresie z fig. 1 rysunku. Optymalne wydajnosci w przypadku cysteiny i DTT otrzymuje sie przy tej samej wartosci stosunku SH/SSO~3, wynoszacej 1,2. Cysteina dziala w sposobie wedlug wynalazku równie dobrze jak DTT.B. Z wieprzowego lancucha A (SSO~3)4 i E. coli lancucha B (SSO-«)2 sporzadza sie laczny roztwór A/B buforze glicynowym o pH 10,5. Kazda z poda¬ nych próbek to 1,4 ml roztworu lacznego. 87 ^1 kwasu (3-merkaptopropionowego (MPA) rozpuszcza sie w 4,0 ml buforu glicynowego, po czym odczyn doprowadza sie do wartosci pH 10,5 za pomoca 200 |xl 5n NaOH. 150,1 mg kwasu mer- kaptobursztynowego (MSA) rozpuszcza sie w 3,5 ml buforu glicynowego i odczyn doprowadza do war¬ tosci pH 10,5 za pomoca 700 \il 5n NaOH. Próbki mieszanin reakcyjnych miesza sie w ciagu nocy w temperaturze 6°C. Analiza HPLC wykazuje, ze uzyskano wydajnosci przedstawione w tablicy 8 i 9.Tablica 8 Numer próbki 1 2 3 4 Ilosc MPA (fil) 34,4 83 97 138 SH/SSO-3 0,5 1,2 1,4 2,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,272 1,179 1,376 0,952 Wydaj¬ nosc calko¬ wita (%) 3,2 14,2 16,6 11,9 Tablica 9 Numer próbki 6 7 8 9 10 Ilosc MSA 34,5 83 97 138 207 SH/SSO-3 0,5 1,2 1,4 2,0 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0 0,038 0,083 0,136 0,053 Wydaj¬ nosc calko¬ wita (%) 0 0,4 1,0 1,7 0,7 Przy uzyciu MPA uzyskuje sie insuline z dobra wydajnoscia, natomiast MSA daje slabe rezultaty.Wartosc stosunku SH/SSO"8 = 1,40 (optimum dla MPA) jest wyzsza od wartosci tego stosunku dla innych srodków redukujacych.C. Stosuje sie laczny roztwór A/B jak w czesci A i B przykladu. Kwas merkaptooctowy (MAA) w ilosci 71 ^1 rozpuszcza sie w 3,9 ml buforu gli¬ cynowego i wartosc pH doprowadza do 10,5 za pomoca 300 \il 5n NaOH. 154,2 mg kwasu o-mer- kaptobenzoesowego (MBA) rozpuszcza sie w 3,8 ml buforu glicynowego i wartosc pH doprowadza do 10,5 za pomoca 400 ^1 5n NaOH.Kazda mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu nocy w temperaturze 6°C, a nastepnie poddaje analizie HPLC. Wyniki próby podano w tablicach 10 i 11.Tablica 10 Numer próbki 1 2 3 4 5 Ilosc MAA W 34,5 83 _97 138 207 SH/SSO-3 0,5 1,2 1,4 2,0 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,615 1,638 1,738 1,646 0,469 Wydaj¬ nosc calko¬ wita (%) 7,2 19,7 21,1 20,5 6,1 | 10 15 20 25 90 35 40 45 50 55 601T 128 590 1* Tablica 11 Numer próbki 6 7 8 9 1 10 Ilosc MBA (ml) 34,5 83 97 138 207 SH/SSO-3 0,5 1,2 1,4 2,0 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,169 0,662 0,692 0,669 0,662 Wydaj¬ nosc calko¬ wita (%) 2,0 8,0 8,4 1 8,4 8,6 Przy uzyciu MAA uzyskuje sie insuline z dobra wydajnoscia calkowita, porównywalna do uzyski¬ wanej przy uzyciu DTT i cysteiny, jakkolwiek zakres optymalnych wartosci stosunku SH/SSO-3 jest bardzo szeroki. Zastosowanie MBA prowadzi do niskich wydajnosci.D. Stosuje sie laczny roztwór jak w czesciach A, Bi C przykladu. 70 \il p-merkaptoetanolu (|3- -ME) rozpuszcza sie w 4,0 ml buforu glicynowego i wartosc pH doprowadza do 10,5 za pomoca 200 ul 5n NaOH. 113,6 mg merkaptoetyloaminy MEA) rozpuszcza sie w 4,0 ml buforu glicynowego i wartosc pH doprowadza do 10,5 za pomoca 200 \il 5n NaOH.Kazda mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu nocy w temperaturze 6°C, a nastepnie poddaje analizie HPLC. Wyniki próby podano w tablicach 12 i 13.Tablica 12 Numer próbki 1 2 3 4 | 5 Ilosc p-ME ([xl) 34,5 83 97 138 207 SH/SSCK, 0,5 1,2 1,4 2,0 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,515 0,770 0,718 0,470 0,274 Wydaj¬ nosc calko¬ wita (%) 6,0 9,2 3,7 5,8 3,6 | Tablica 13 próbki ¦:¦¦¦ 6 -'!¦¦ 8 ¦ 9 10 Ilosc MEA W 34,5 83 97 138 207 SH/SSO3 0,5 1,2 1,4 2,0 3,0 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,529 0,672 0,629 0,457 0,261 Wydaj¬ nosc 1 calko¬ wita (%) 6,1 8,1 7,6 5,7 3,4 | 10 15 25 40 45 50 55 i MEA znacznie nizsza (8—9%), a wiec nie sa to korzystne srodki redukujace.Wyniki prób opisanych w punktach A^-D przed¬ stawia wykres (fig. 4 rysunku).Przyklad XII. Sporzadza sie roztwory lan¬ cucha A i lancucha B, laczny roztwór A/B w 0,1 m buforze glicynowym o pH 10,5 oraz roztwór 121,2 mg cysteiny w 3,35 ml tego buforu i 61,7 mg DTT w 4,14 ml tego buforu. Do podwielokrotnycb próbek roztworu lacznego A/B (1,4 ml) dodaje sie rózne ilosci roztworów DTT lub cysteiny i miesza¬ niny reakcyjne miesza w ciagu nocy w otwartych fiolkach o pojemnosci 3 ml, w temperaturze 6°C, Wyniki prób przedstawiaja tablice 14 i 15.Tablica 14 Numer próbki 1 2 3 4 5 6 Ilosc DTT W 75 100 1Z9 117 134 159 SH/SSO-3 0,90 1,20 1,30 1,40 1,60 1,90 Zawartosc insuliny (mg/ml) 0,684 1,645 1,783 1,237 1,131 0,500 Rzeczy¬ wista wydaj¬ nosc realizacji laczenia lancu¬ chów (%) 9,0 22,0 24,0 16,8 15,5 7,0 Numer próbki 7 8 9 • 10 11 12 13 Ilosc cysteiny W) 43,5 54 60 65 71 81,5 103 rablica SH/SSO-3 0,80 1,00 1,10 1,20 1,30 1,50 1,90 15 Zawartosc insuliny (mg/ml) 1,184 1,493 1,711 1,658 1,711 1,467 1,112 Rzeczy¬ wista wydaj¬ nosc reakcji laczenia lan¬ cuchów (%) | 15,2 19,4 22,3 21,7 22,5 19,4 13,9 Optymalna wartosc stosunku SH/SSO-3 dla |3-ME . i MEA (1,25) jest identyczna jak dla DTT i cystei¬ ny, jednak maksymalna wydajnosc jest dla |3-ME 65 Maksymalna wydajnosc insuliny w procesie z uzyciem cysteiny stanowi 94% najlepszej wydaj¬ nosci insuliny otrzymanej przy uzyciu DTT. Za¬ kres wartosci stosunku SH/SSO-3 jest szerszy dla cysteiny niz dla DTT, co ma duze znaczenie ze wzgledów praktycznych.Przyklad XIII. 149 mg wieprzowego lancu¬ cha A (SSO-3)4 i 70 mg E. coli lancucha (Trp E/B (SSO-3)2 rozpuszcza sie odpowiednio W 14,9 i 7,0 ml 0,1 m buforu glicynowego i odczyn doprowadza sie do wartosci pH 10,5 za pomoca 5n NaOH;128 599 19 20 61,7 mg DTT rozpuszcza sie w 4,0 ml buforu i od¬ czyn doprowadza do wartosci pH 10,5 za pomoca 140 |jl1 5n NaOH. W fiolkach o pojemnosci 15 ml sporzadza sie trzy próbki w róznych temperatu¬ rach podanych w tablicy 16.Tablica 16 Numer . próbki 1 2 3 Lancuch A (ml) 4,0 - ¦ ¦ ¦-¦ 4,0 4,0 Lancuch B (ml) 2,0 2,0 2,0 DTT m 390 390 390 Temperaturra (°C) 0°C (laz¬ nia lodo¬ wa) 6°C (chlodnia) 22°C (temperatura pokojowa W róznych odstepach czasowych, po rozciencze¬ niu próbek kwasem octowym (1 :2) sprawdza sie zawartosc insuliny ludzkiej prowadzac analize HPLC. Wyniki podano w tablicy 17. 10 15 20 25 Wykres (fig. 5 rysunku) przedstawia zaleznosc wydajnosci insuliny od czasu reakcji dla poszcze¬ gólnych wartosci temperatury.W temperaturze pokojowej reakcja laczenia lan¬ cuchów zaczyna sie bardzo szybko, ale jej szyb¬ kosc predko ulega zmniejszeniu (t = 3 godziny) przy. niskiej wartosci wydajnosci insuliny (9,8°/o) a nastepnie zawartosc insuliny powoli spada (t = = 22 godziny, wydajnosc 4,8%).W temperaturze 6°C insulina powstaje nieco szybciej niz w temperaturze 0°C, ale wydajnosc ostateczna (24,4 i 24,7°/o po 23 godzinach) jest w zasadzie identyczna. W przeciwienstwie do reakcji w temperaturze pokojowej, nie obserwuje sie za¬ chodzacego w znaczacym stopniu rozkladu insuli¬ ny zwiazanego z wymiana dwusiarczkowa (do 24 godzin).Na podstawie krzywych z wykresu wyznacza sie czas, po którym uzyskuje sie polowe maksymalnej wydajnosci insuliny, ti/2 (max). Wartosci tego cza¬ su podano w tablicy 19.Wykres zaleznosci tm (max) od temperatury re¬ akcji jest linia prosta, a wiec temperatura jest odwrotnie proporcjonalna do ti/2 (max), a nie ma bezposredniego wplywu na ostateczna wydajnosc insuliny. Proces laczenia lancuchów A i B w tem¬ peraturze 0°C jest zatem wolniejszy niz w tempe¬ raturze 6°C, ale ostateczna wydajnosc insuliny jest Tablica 17 1 Próbka 1 1 Czas I (minuty) 35 87 145 183 240 352 Ilosc insuliny (mg) 3,08 4,94 6,23 8,02 8,88 10,60 Wydaj¬ nosc calkowita (%) 5,1 8,2 10,4 13,4 14,8 17,7 Czas (minuty) 30 60 100 160 197 330 Próbka 2 Ilosc insuliny (mg) 3,80 5,01 6,09 8,31 10,17 10,89 Wydajnosc calkowita (%) 6,3 8,4 10,2 13,9 17,0 18,2 ] Czas (minuty) 4 20 40 120 194 307 Próbka 3 Ilosc insuliny (mg) 1,79 3,08 3.44 5,16 5,87 5,33 Wydajnosc calkowita (%) 3,0 5,1 5,7 8,6 9,8 8,9 Po uplywie 1 dnia próbki poddaje sie ponownej analizie, dla stwierdzenia ostatecznej wartosci wy¬ dajnosci insuliny. Wyniki analizy zawiera tablica 18. taka sama (24—25%). W temperaturze pokojowej uzyskuje sie niskie wydajnosci. Reakcje laczenia lancuchów A i B nalezy zatem prowadzic w tem¬ peraturze 0—6°C, w ciagu 24 godzin.Tablica 18 Numer próbki 1 2 3 Czas (minuty) 1407 1383 1350 HPLC 1351 1350 1349 Calko¬ wita ilosc insuliny (mg) 14,83 14,61 2,87 Calkowita zawartosc bialka (%) 24,7 24,4 4,8 55 60 Tablica 19 Numer próbki 1 2 3 Temperatura (°C) 0 6 22 Maksymalna wydajnosc insuliny (%) 24,7 24,4 9,8 ti/z (max) (minuty) 171 126 1812S 599 21 Zastrzezenia patentowe 22 1. Sposób wytwarzania insuliny bydlecej, wie¬ przowej lub ludzkiej lub analogu insuliny o ogól¬ nym wzorze 1, w którym Y oznacza Ala-Ser-Val w przypadku insuliny bydlecej lub Thr-Ser-Ile w przypadku insuliny wieprzowej lub ludzkiej, a Z oznacza Ala-OH w przypadku insuliny wieprzowej lub bydlecej lub Thr-OH w przypadku insuliny ludzkiej, zgodnie z którym S-sulfonianowa postac lancucha A insuliny lub lancucha A analogu in¬ suliny o ogólnym wzorze 2, w którym Y ma wy¬ zej podane znaczenie, S-sulfonianowa postac lancu¬ cha B insuliny lub lancucha B analogu insuliny o ogólnym wzorze 3, w którym Z ma wyzej poda¬ ne znaczenie oraz tiolowy srodek redukujacy pod¬ daje sie jednoczesnie reakcji w srodowisku wod¬ nym, przy czym stosunek wagowy S-sulfonianowej postaci lancucha A do S-sulfoniowej postaci lan¬ cucha B wynosi od okolo 0,1 : 1 do okolo 10: 1, znamienny tym, ze mieszanine reakcyjna wytwa¬ rza sie przy wartosci pH okolo 8—12, korzystnie okolo 9,5—11,0 i calkowitym stezeniu bialka okolo 0,1—50 mg/ml, przy czym tiolowy srodek reduku¬ jacy, korzystnie kwas merkaptooctowy, cysteine, 10 15 20 25 kwas (3-merkaptopropionowy, kwas o-merkaptoben- zoesowy, markaptoetyloamine, kwas merkaptobur- sztynowy, dwutiotreitol lub dwutioerytryt stosuje sie w ilosci dostarczajacej ogólem okolo 0,4—2,5, korzystnie okolo 0,9—1,1 grupy —SH na kazda gru¬ pe —SSO-3 i obecna w calkowitej ilosci S-sulfo- nianowych postaci lancuchów A i B, po czym mie¬ szanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze okolo 0—25°C, korzystnie okolo 2—10°C, w srodo¬ wisku bedacym zródlem tlenu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytwarza sie insulina bydleca, stosunek wagowy S-sulfonianu lancucha A do S-sulfonianu lancucha B wynosi od okolo 1,4 : 1,0 do okolo 1,8 : 1,0, a ste¬ zenie bialka wynosi okolo 3—8 mg/ml. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytwarza sie insuline wieprzowa, stosunek wago¬ wy S-sulfonianu lancucha A do S sulfonianu lan¬ cucha B wynosi od okolo 1,0 : 1,0 do okolo 1,4 : 1,0, a stezenie bialka wynosi okolo 8—16 mg/ml. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytwarza sie insuline ludzka, stosunek wagowy S-sulfonianu lancucha A do S-sulfonianii lancucha B wynosi od okolo 1,8 : 1,0 do okolo 2,2 : 1,0, a ste¬ zenie biilka wynosi okolo 3—8 mg/ml.H2N Ile Glu Cys-Cys-Y-Cys-Ser-Leu-TyrLeu Asn-Tyr-Cys-Asn-OH \/ \/ \ / 1 \/ \/ Gly Val Gin | Gin Glu S H2N Val Gin Leu-Cys-Gly His Val Ala Tyr Val-Cys-Gly Ara Phe Tyr Rno Z V \/ \/ v N / \/ \ / \/ \ / \ / \ / \ / \ / Phe Asn His Ser Leu Glu Leu Leu Glu Gly Phe Thr Lys Wzór 1128 59» sso; sso; H.N Ile Glu-Gln-Cys-Cys -Y-Cys-Ser- Lec-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn \/\/ i | \ ayW ssoj s:o; 0H Wzór 2 SSOJ sso; HUN Val Gin Leu-Cys-Gly His Val Ala Tyr Vbl-Cys-Gly Arg Phe Tyr Pro-Lys-2 \/\/\/ \/\/\/\/\/ \/\/\/\/ Phe Asn His Ser Usu Glu Leu Leu Glu Gly Phe Thr Wzór 3 :ig. 1 10 12 14 16 ^8 Gaikowite stezenie lancuchów w koncowym roztworze tacznym (nag/ml)128 599 ;°i25 1 2 3 Fig. 5 u 5 6 7 8 9 10 "12 \U Czas reakcji ( WZGraf. Z-d 2, w- 712/83 — 801+15 16 18 20 22 Uena 10U zl PL PL PL PL PL PL PL