DK149756B - Fremgangsmaade til fremstilling af insulin i form af okseinsulin, svineinsulin eller humant insulin, et hybrid heraf eller en insulin-analog - Google Patents

Description

i 149756

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art til fremstilling af insulin i form af okseinsulin, svineinsulin eller humant insulin eller et hybrid deraf i form af A-kæden af en af dis-5 se insulintyper i kombination med B-kæden af en anden af disse insulintyper, f.eks. A-kæden af svineinsulin og B-kæden af humant insulin, eller en insulin-analog, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

10 Efterhånden som det er blevet muligt at fremstille protein- produkter ved rekombinant-ONA-metoder, specielt insulin-A og insulin-B-kæder [se Goeddel et al., Proc. Nat'l. Acad.

Sci. USA 76^, 106-110 (1979)], er der opstået et stærkt forøget behov for en effektiv metode til kombination af A- og 15 B-kæderne til dannelse af insulin.

De hidtil kendte metoder til fremstilling af insulin ved kombination af A- og B-kæden gør typisk brug af udgangsmaterialer såsom A- og B-kæder i form af disses stabile S-sulfonater. Generelt reduceres S-sulfonaterne i A- og B-20 kæderne enten separat eller samlet til deres tilsvarende -SH-forbindelser, hvilket almindeligvis kræver et stort overskud af et reduktionsmiddel i form af en thiol. Produkterne isoleres fra reduktionsmediet, og hvis de ikke reduceres sammen, bringes de sammen i et oxiderende medium, ek-25 sempelvis luft, til opnåelse af en kombination af A- og B- kæderne under samtidig produktion af insulin. Eksempler på denne metodik kan findes i Du et al., Scienta Sinica 10, 84-104 (1961); Wilson et al., Biochim. Biophys. Acta 62, 483-489 (1962); Du et al., Scientia Sinica )A, 229-236 30 (1965); Kung et al., Scientia Sinica 15^, 544-561 (1966);

Kexue Tongbao (Kina) 17, 241-277 (1966) og Markussen, J.

Acta Paediatrica Scandinavica, Suppl. 270, 121-126 (1977).

En modifikation af denne fremgangsmåde omfatter en reduktion af A-kædens S-sulfonat efterfulgt af en omsætning af 149756 2 den reducerede A-kæde med B-kædens S-sulfonat i en oxiderende atmosfære. Se f.eks. Katsoyannis et al., Proc. Nat.

Acad. Sci. (U.S.A.) 55, 1554-1561 (1966); Katsoyannis,

Sciense 154, 1509-1514, (1966); Katsoyannis et al., Bio-5 chemstry 6^, 2642-2655 (1967); U.S.A. patent nr. 3 420 810 og Jentsch, Journal of Chromatography 76., 167-174 (1973).

En anden modifikation omfatter en partiel oxidation af -SH-forbindelsen i A-kæden til fremkaldelse af en disul-fid-dannelse imellem cystein-resterne i A-6 og A-ll efter-10 fulgt af en oxidation af produktet med B-kædens -SH-grup-pe eller S-sulfonat. Se f.eks. belgisk patentskrift nr.

676 069 og Zahn et al., Liebigs Ann. Chem. 691, 225-231 (1966).

Huer af de ovenfor nævnte kendte metoder har et enkelt 15 træk fælles, idet fremstillingen af insulin sker ved to uafhængige, på hinanden følgende trin, nemlig en reduktion af S-sulfonatet til -SH efterfulgt af en oxidation til -S-S-.

Dixon et al., Nature 188, 721-724 (1960), beskriver betin-20 gelser, som foreslår en omdannelse i en enkelt opløsning af A- og B-kædernes S-sulfonater til insulin ved anvendelse af et reduktionsmiddel i form af en thiol kombineret med en oxidation ved hjælp af luft. Detaljerne er temmelig overfladiske, og udbyttet, som udelukkende er baseret på ak-25 tiviteten af det udvundne produkt, andrager kun 1-2¾.

Imidlertid foreslår Dixon, i Proc. Intern. Congr. Endecri-nol. 2nd London 1964, 1207-1215 (1965), på en mere uddybende måde (i tabel 11/ på side 1211), at de betingelser, som er angivet i den tidligere publikation, omfatter adskilte 30 reduktions- og oxidationstrin.

Til forskel fra de hidtil kendte metoder har det nu overraskende vist sig, at det er muligt under nærmere definerede reaktionsbetingelser at opnå attraktive niveauer t49756 3 ved fremstilling af insulin eller insulin-analoge udfra S-sulfonerede A- og B-kæder ved at udføre såvel reduktions-som oxidationsreaktionerne i en proces, som forløber i et enkelt trin og i en enkelt opløsning. Den foreliggende op-5 findelse angår en sådan fremgangsmåde.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af okseinsulin, svineinsulin eller humant insulin eller et hybrid deraf i form af A-kæden af en af disse insulintyper i kombination med B-kæden af en anden af disse insulintyper eller en insulin-analog valgt blandt de i krav 1 angivne.

Ved fremgangsmåden foretager man en omdannelse i en enkelt opløsning af A- og B-kædernes S-sulfonater til det ønskede insulin ved anvendelse af et reduktionsmiddel i form af en thiol kombineret med en oxidation, og fremgangsmåden iføl-15 ge opfindelsen er ejendommelig ved, at man omsætter den S-

sulfonerede form af A-kæden, den S-sulfonerede form af B-kæden samt reduktionsmidlet i form af en thiol i et vandigt medium under betingelser, som tilvejebringer en blanding, der (1) har en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 12, idet der 20 anvendes en puffer i en koncentration på mellem ca. 0,001 M

og ca. 2 M, (2) har en total proteinkoncentration på mellem ca. 0,1 og ca. 50 mg per ml reaktionsmedium, idet vægtforholdet mellem A-kæde- og B-kæde-sulfonatet ligger mellem ca. 0,1:1 og ca. 10:1, og (3) indeholder en mængde reduk-25 t ionsmiddel i form af en thiol, som tilvejebringer en total mængde på mellem ca. 0,4 og ca. 2,5 -SH-grupper for hver -SS0^~-gruppe, som er til stede i den totale mængde S-sul^ fonater af A- og B-kæderne, hvorhos man holder blandingen ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 25 °C i omgivel-30 ser, som tilvejebringer oxygen.

Hed den foreliggende opfindelse tilvejebringes en effektiv fremgangsmåde som foregår i et trin og i en enkelt opløsning, til fremstilling af insulin eller insulin-analoge udfra de tilsvarende S-sulfonerede A- og B-kæder.

14975$ 4

Ved betegnelsen "insulin" menes i nærværende beskrivelse et naturligt forekommende insulin valgt blandt humant insulin, okseinsulin og svineinsulin, såvel som hybrider dannet udfra en kombination af A-kæden af en af disse in-5 sulintyper og B-kæden af en anden af disse insulintyper.

Ued betegnelsen "insulin-analog" menes et protein, som indeholder den grundlæggende A-kæde og B-kæde med samtlige de halve cystein-rester, der indgår i den sekvensvise række, som stemmer overens med de naturlige insuliner. De insulin-10 analoge afviger fra de naturlige insuliner ved, at en eller flere aminosyrerester er substitueret, adderet udeladt eller modificeret, idet dog arrangementet af disulfid-bindinger samt mindst en del af den insulin-lignende aktivitet er opretholdt. De insulin-analoge, der kan fremstilles ved 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er (N-formyl-gly -A)in- sulin, desamino-A^-insulin, (sarcosin^-Ajinsulin, (L-ala- 11 21 nin- -A)insulin, (D-alanin -A)insulin, (isoasparagin -A)- 21 21 insulin, (D-asparagin -A)insulin, (asparaginamid -A)in- 121 2 sulin, (sarcosin -A, asparagin -A)insulin, (norleucin -A)- 5 5 20 insulin, (threonin -A)insulin, (leucin -A)insulin, (phenyl- 19 19 18 alanin -A)insulin, (D-tyrosin -A)insulin, (tyrosin -A, 19 21 28—30 asparagin A, arginin -A)insulin, des(B -tripeptid)in sulin, des(B^^-^^-tetrapeptid)insulin, des(B^~^-pentapep- tid)insulin, des(B -tetrapeptid, tyrosinamid -B)insu- 26—30 23 25 lin, des(B -pentapeptid, phenylalaninaroid -B)insulin, des(B·*· ^-tetrapeptid)insulin, des(B^”^-pentapeptid)insulin, (lysin -B)insulin, (leucin -B)insulin, (leucin -B)insu-lin og des(phenylalanin^-B)insulin. Disse og andre forbindelser er beskrevet i litteraturen, og der kan f.eks. hen-30 vises til Blundell, T., et al. Advances in Protein Chemi stry, 2330-362, Academic Press, N.Y., N.Y. (1972);

Katsoyannis, P.G., Treatment af Early Diabetes, 319-327,

Plenum Publishing Corp. (1979); Geiger, R., Chemiker Zei-tung, Reprint 100, 111-129, udgivet af Dr. A. Hiithig, Hei-35 delberg, Vesttyskland (1976) og Brandenburg, D. et al.,

Biochem. J. 125, 51-52 (1971).

149756 5

Ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan kombinationen af A- og B-kæderne til dannelse af insulin eller en insulin-analog foretages indenfor et stort områ-5 de med hensyn til forholdet imellem de to kæder. Kombinationen er naturligvis begrænset af den kæde, enten A eller B, som er tilstede i den mindste mængde. Under alle omstændigheder er forholdet imellem A-kæden og B-kæden på vægtbasis mellem ca. 0,1:1 og ca. 10:1. Det fore-10 trækkes i særdeleshed at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af et vægtforhold imellem A-kæden og B-kæden på mellem ca. 1:1 og ca. 3:1. Det har endvidere vist sig, at der indenfor dette foretrukne område findes visse forhold, som er særligt fordelagtige 15 ved fremstillingen af bestemte insulin-typer. Når man således kombinerer A- og B-kæden til fremstilling af okseinsulin foretrækkes det, at forholdet mellem A-kæden og B-kæden ligger mellem ca. 1,4:1,0 og ca. 1,8:1,0. Med hensyn til svineinsulin ligger det foretrukne område imellem 20 ca. 1,0:1,0 og ca. 1,4:1,0. Med hensyn til humant insulin ligger det foretrukne område imellem ca. 1,8:1,0 og ca.

2,2:1,0.

En anden parameter, som er signifikant ved gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen på et optimalt niveau, 25 er proteinkoncentrationen i reaktionsmediet. Processen kan med godt udbytte gennemføres ved en række forskellige proteinkoncentrationer, idet proteinkoncentrationen generelt ligger på mellem 0,1 og 50 mg per ml reaktions-medium. Fortrinsvis ligger proteinkoncentrationen på 30 mellem ca. 2 og ca. 20 mg per ml reaktionsmedium. Også her har det vist sig, at den optimale proteinkoncentration inden for det sidstnævnte område varierer i afhængighed af de insulin-typer, som skal fremstilles. Hvis det således drejer sig om svineinsulin, foretrækkes det, at 149756 6 proteinkoncentrationen ligger mellem Ca. 8 og ca. 16 mg per ml, hvorimod man ved fremstilling af humant insulin eller okseinsulin foretrækker, at proteinkoncentrationen ligger på mellem ca. 3 og ca. 8 mg per ml.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres i et vandigt medium. Mediets pH-værdi målt ved stuetemperatur ligger på mellem ca. 8 og ca. 12. Fortrinsvis ligger pH-værdien på mellem ca. 9,5 og ca. 11,0, og værdien opretholdes optimalt på mellem ca. 10,4 og ca. 10,6. Mediets pH-værdi kan holdes 10 inden for det ønskede område ved tilsætning af en passende puffer. Som eksempler på typiske puffere kan nævnes glycin, glycylglycin, tris(hydroxymethyl)aminomethan, N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin, pyrophosphat 0g N-tris(hydroxymethyl)-methyl-3-aminopropansulfonsyre , som bevirker en 15 kontrol af pH indenfor det oven for beskrevne in terval. Den hyppigst anvendte og foretrukne puffer er glycin.

Koncentrationen af pufferen ligger på mellem ca. 0,001 M og ca. 2 M. Fortrinsvis er koncentrationen mellem ca. 0,01 M 20 og ca. 1 M, idet det mest foretrukne koncentrationsområde ligger mellem ca. 0,01 M og ca. 0,1 M.

A- og B-kæderne bringes sammen i et passende vandigt medium i nærværelse af et reduktionsmiddel i form af en thiol. Ved "et reduktionsmiddel i form af en thiol" menes en forbin-25 delse, som indeholder mindst en -SH-gruppe, og som er i stand til at bevirke en reduktion af S-sulfonatgrupperne i A- og B-kæderne.Selvom man kan anvende et hvilket som helst middel, som har disse karakteristika, er en særligt fore-trukken reducerende thiol en forbindelse, som på sin oxide-30 rede form er cycliseret til en særdeles stabil forbindelse.

Den reducerende thiol er tilstede i en mængde, som i alt tilvejebringer mellem ca. 0,4 og ca. 2,5 -SH-grupper for hver -SS0^--gruppe som er tilstede i de samlede A- og B- 14975« 7 kæder, idet der fortrinsvis tilvejebringes mellem ca. 0,9 og ca. 1,1 -SH-grupper for hver -SSO^’-gruppe.

Som eksempler på typiske reducerende thioler kan anføres dithiothreitol (DDT), dithioerythritol (DTE), 2-mercap-5 toethanol, methylthioglycolat, 3-mercapto-l,2-propandiol, 3-mercaptopropionsyre, thioglycolsyre og 2-amino-3-mar-captopropionsyre (cystein). Blandt de foretrukne reducerende thioler kan nævnes dithiothreitol og dithioerythritol, idet dithiothreitol er den mest foretrukne 10 forbindelse.

En af de væsentlige betingelser ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at den skal gennemføres i omgivelser, som tilvejebringer oxygen. Denne betingelse kan opfyldes på simpel måde ved at lade reaktionsblandingen være tilgænge-15 lig for luft. Selvom man kan anvende en mere direkte kontaktmetode, f.eks. ved at blæse luft eller oxygen igennem reaktionsmediet, er dette ikke nødvendigt.

Generelt gennemføres fremgangsmåden ifølge opfindelsen derfor ved, at man fremstiller en blanding af A-kædens S-sul-20 fonat, B-kædens S-sulfonat og det reducerende middel i form af en thiol i de ønskede koncentrationer i et vandigt medium ved en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 12, idet der tillige er en puffer til stede. Blandingen, som er i kontakt med luften, omrøres forsigtigt i en peri-25 ode, som er tilstrækkelig til, at kæderne kan indgå en indbyrdes kombination, hvilket generelt varer mindst '30 minutter. Under denne omrøringsperiode holdes blandingen generelt ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 25°C.

Man foretrækker imidlertid at underkaste blandingen en 30 moderat afkøling med henblik på at holde temperaturen i den lave ende af dette interval, generelt på mellem ca.

2 og ca. 10°C.

Når reaktionen er afsluttet, kan insulinet eller den insu- 8 145756 lin-analoge isoleres ved en lang række forskellige metoder, som alle er velkendte indenfor insulin-teknologien. De hyppigst anvendte metoder til rensning af insulin er chromato-grafiske metoder. Disse kan let anvendes til udvinding af 5 insulin, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge op findelsen. Sådanne metoder kan omfatte gelfiltrering og ion-bytterchromatografi.

Produkterne kan endvidere undersøges for renhed og aktivitet ved velkendte metoder, såsom polyacrylamidgel-elektro-10 forese, aminosyreanalyse, radioreceptortest, radioimmuno- test, højtryksvæskechromatografi (HPLC), UV-spektroskopi, dansylation, glucosetest på kaninblod og lignende.

Insulinerne, som opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter blandt andet hybrider bestående af A-kæden af 15 eri insulinart og B-kæden af en anden insulinart. Det cen trale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i en passende kombination af A- og B-kædernes S-sulfonater, og den bestemte struktur af disse kæder er uden betydning for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, så længe kæderne rent faktisk 20 repræsenterer insulin eller insulin-analoge A- og B-kæder.

Selv om man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstille en insulin-analog eller et insulin-hybrid, dvs. et insulin, der består af en A-kæde af en insulintype og en B-kæde af en anden insulintype, foretrækker man naturligvis 25 at fremstille et insulin, som er strukturelt identisk med naturligt forekommende insulin ved anvendelse af et S-sulfo-nat af en A-kæde og et S-sulfonat af en B-kæde, som har ami-nosyresekvenser, som begge forekommer i et sådant insulin.

A- og B-kæderne i insulinet eller den insulin-analoge kan, 30 som allerede anført, opnås ved rekombinant-DNA-metodik. De kan også fremstilles ud fra naturligt forekommende insuliner eller ved klassiske peptidsyntesemetoder, som enten kan 9 1497 56 forløbe i opløsning eller i fast fase.

A- og B-kæderne opretholdes på stabil form som S-sulfonater. Disse S-sulfonater, som anvendes som udgangsmaterialer, kan opnås ved oxidativ sulfitolyse, som er en behandling, ved 5 hvilken A- og B-kæderne omsættes med natriumsulfit i nærvæ relse af et mildt oxidationsmiddel såsom natriumtetrathio-nat.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

10 EKSEMPEL 1 360 mg S-sulfonat af A-kæden i svineinsulin blev opløst i 36 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), og blandingens pH-værdi blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid.

300 mg S-sulfonat af B-kæden af svineinsulin blev opløst i 15 30 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), og blandingens pH-værdi blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. Derefter opløstes 123,4 mg dithiothreitol (DTT) i 4 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), og blandingens pH-værdi blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 0,2 ml 5 N natriumhydroxid.

20 Opløsningerne af A- og B-kæden blev kombineret i en 100 ml hætteflaske ved stuetemperatur (ca. 25 °C), og der tilsattes 1,91 ml af DTT-opløsningen med henblik på at opnå et forhold mellem -SH og -SSO^ på 1,04. Den resulterende opløsning blev forsigtigt blandet i et åbent bægerglas ved 25 hjælp af magnetisk omrøring ved 4 - 8 “C i 20 timer. En analyse ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) viste et insulinudbytte på 153,8 mg svarende til 29¾ af den totale proteinmængde. 1 ml af denne færdige opløsning blev justeret til pH 3,15 149756 ίο ved hjælp af eddikesyre. Blandingen blev gelfiltreret på en 5 x 200 cm kolonne af Sephade^ G-50 (Superfine), som var ækvilibreret og elueret med 1 M eddikesyre ved 4 - 8°C.

De insulinholdige fraktioner (elueringsvolumen ca. 2450 -5 2700 ml) blev kombineret og lyophiliseret til opnåelse af 95 mg insulin svarende til 25¾ af den totale proteinmængde. Syineinsulinet viste sig ved polyacrylamidgel-electro-forese, aminosyreanalyse, radioreceptortest, HPLC samt glucosereduktionstest på kaninblod at være praktisk talt 10 rent.

EKSEMPEL 2

Der fremstilledes opløsninger af S-sulfonater af A- og B-kæderne af okseinsulin med en koncentration på 5 mg/ml i 0,01 M glycinpuffer (pH 10,5). I hver af opløsningerne 15 indstilledes pH til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. 61,7 mg DTT opløstes i 4,0 ml 0,1 M glycinpuffer (pH

10,5), og pH indstilledes til 10,5 ved hjælp af 0,15 ml 5 N natriumhydroxyd. Til 0,5 ml af B-kæde-opløsningen sattes 0,8 ml af A-kæde-opløsningen samt 0,035 ml af DTT-op-20 løsningen ved stuetemperatur (ca. 25°C) til opnåelse af et forhold imellem -SH og -SSOj” på 0,91. Den resulterende opløsning blev omrørt ved 4 - 8 “C i 20 timer i en åben kolbe med volumen 3 ml. En HPLC-analyse af blandingen viste et udbytte af okseinsulin på 1,96 mg svarende til 30¾ 25 af den totale proteinmængde.

EKSEMPEL 3

Der fremstilledes opløsninger af S-sulfonater af A- og B-kæderne i svineinsulin med koncentrationer på 10 mg/ml i 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5). I hver af opløsningerne 30 indstilledes pH til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. 61,7 mg DTT opløstes i 2,0 ml glasdestilleret vand.

Til 0,5 ml af B-kæde-opløsningen sattes 0,6 ml af A-kæde-opløsningen samt 29,25 mi-kroliter af DTT-opløsningen ved stuetemperatur (ca. 25°C) til opnåelse af et forhold imel 149756 11 lem -SH og SSO^- på 1,00. Den resulterende opløsning blev omrørt ved 4-8°C i en åben 3 ml kolbe i 20 timer. En HPLC-analyse af blandingen viste et udbytte af svineinsulin på 3,81 mg svarende til 35¾ af det totale proteinindhold.

5 EKSEMPEL 4

Der fremstilledes opløsninger af S-sulfonater af B-kæderne i humant (pancreatisk) insulin og forskellige humane (pancreatiske ogE. coli) insuliner samt opløsninger af

S-sulfonater af A-kæden i pancreatisk svineinsulin, idet 10 opløsningerne havde en koncentration på 5 mg/ml i 0,1 M

glycinpuffer (pH 10,5). I hver opløsning justeredes pH til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. 61,7 mg DTT blev opløst i 4,0 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), og pH indstilledes til 10,5 ved hjælp af 0,16 ml 5 N na-15 triumhydroxid. Til 1,0 ml af hver af A-kæde-S-sulfonat- opløsningerne blev sat 0,5 ml af B-kæde-S-sulfonat-op-løsningen og 0,05 ml af DTT-opløsningen ved stuetemperatur (25°C) til opnåelse af et forhold imellem -SH og -SSOj- på 1,09. Alle opløsningerne blev omrørt i et af-20 kølet rum (4 - 8°C) i åbne kolber i 20 - 22 timer. Derefter blev opløsningerne analyseret ved HPLC ved anvendelse af et pancreatisk humant insulin som standard ved udbytteberegningerne. Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel: 25 TABEL 1 A-kæde humant in- % udbytte i oprindelse sulin udbyt- i forhold til te, mg den totale pro- ___teinmænqde_ 30 svineinsulin (pancreatisk) 2,00 26,7 svineinsulin (pancreatisk) 2,11 28,1 humant insulin (pancreatisk) 1,95 26,0 humant insulin (pancreatisk) 2,03 27,1 humant insulin (E. coli) 1,99 26,5 149756 12 EKSEMPEL 5

Der fremstilledes en opløsning af henholdsvis A- og B-kæde- S-sulfonater af humant insulin i koncentrationer på 5 mg/ml i en 0,1 N glycinpuffer (pH 10,5). I hver af opløsningerne 5 justeredes pH til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid.

61,7 mg DTT blev opløst i 4,0 ml 0,1 M glycinpuffer (pH

10.5) , og pH blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 0,16 ml 5 N natriumhydroxid. Til 0,5 ml af B-kæde-opløsningen sattes ved stuetemperatur 1,0 ml af A-kæde-opløsningen ef- 10 terfulgt af 60 mikroliter af DTT-opløsningen med henblik på at opnå et forhold imellem -SH og -SSO^” på 1,09. Den resulterende opløsning blev omrørt ved 4 - 8°C i en åben 3 ml kolbe i 22 timer, hvorefter en HPLC-analyse viste et udbytte af humant insulin på 2,58 mg svarende til 34S 15 af det totale proteinindhold.

EKSEMPEL 6

328 mg S-sulfonat fra A-kæden i humant insulin blev opløst i 65,6 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), og blandinges pH blev justeret til 10,5 ved hjælp af 75 mikroliter 5 N 20 natriumhydroxid. 164 mg S-sulfonat fra B-kæden i humant insulin blev opløst i 32,8 ml 0,1 N glycinpuffer (pH

10.5) , og pH i blandingen blev justeret til 10,5 ved hjælp af 15 mikroliter 5 N natriumhydroxid. Derpå opløstes 61,7 mg DTT i 4,0 ml 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5), 25 og opløsningens pH blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 160 mikroliter 5 N natriumhydroxid.

A- og B-kæde-opløsningerne blev kombineret i et 150 ml bægerglas ved stuetemperatur (ca. 25°C), og der tilsattes 3,28 ml af DTT-opløsningen med henblik på at opnå et forhold 30 imellem -SH og -SSO^ på 1,09. Det åbne bægerglas blev anbragt i et bad med isvand i et afkølet rum og omrørt kraftigt i 30 minutter. Opløsningen blev omrørt i yderligere 24 timer i det afkølede rum (4 - 8°C). Herefter 149756 13 viste en HPLC-analyse et udbytte af humant insulin på 148 mg svarende til 30¾ af det totale proteinindhold.

Til 100 ml af denne opløsning sattes 25 ml iseddikesyre til en afsluttende pH-værdi på 3,15. Den samlede prøve 5 blev gelfiltreret på en 5 x 200 cm kolonne af Sephadex® G-50 (Superfine), som var ækvilibreret og elueret med 1 M eddikesyre ved 4 - 8°C. Hele den eluerede mængde protein blev lyophiliseret. Den udvundne mængde insulin (elu-eringsvolumen 2465 - 2781 ml) vejede 125 mg og repræsen-10 terede 29,4¾ af det udvundne protein.

En portion af det ovenfor udvundne insulin (95,5 mg) blev opløst i omkring 9 ml 0,01 M tris-0,001 M EDT A - 7,5 M urinstof-0,03 M NaCl puffer (pH 8,5 ved 4°C). Blandingen blev chromatograferet igennem en 2,5 x 90 cm DEAE 15 (diethylaminoethyl)-cellulose-ionbytterkolonne ækvilibre ret ved hjælp af den samme puffer. Proteinet blev elueret ved 4 - 8°C med en gradient på 1 liter af henholdsvis 0,03 M og 0,09 M natriumchlorid i den samme puffer efterfulgt af 1 liter puffer indeholdende 1 M natriumchlorid.

20 Hver af de udvundne portioner blev afsaltet på grovkor- φ nede Sephade>r G-25-kolonner i 2¾ eddikesyre og derefter lyophiliseret. Insulinportionen (elueringsvolumen 878 -1008 ml) vejede 55,73 mg og repræsenterede 84¾ af det udvundne protein.

25 Man fremstillede zinkinsulinkrystaller ved at opløse 11,90 mg af insulinportionen (DEAE) i 240 mikroliter 0,1 N saltsyre hurtigt efterfulgt af 2,16 ml af en 0,04¾ opløsning af ZnCl2~0,05 M natriumcitrat-15?0 acetone i et centrifugerør af glas. Krystallisationen forløb i 72 timer ved 30 stuetemperatur (ca. 25°C), hvorefter supernatanten blev fjernet. Krystallerne blev vasket to gange med koldt vand (pH 6,1), idet der centrifugeredes ved 2000 omdrejninger per minut ved 3°C imellem hver vask. Krystallerne blev genopløst i 0,01 N saltsyre med henblik på analyse.

» 14 149756

Det resulterende humane insulin blev ved polyacrylamidgel-elektroforese (et enkelt bånd), aminosyreanalyse, radioreceptortest, radioimmunotest, HPLC, dansylation og UV-spektroskopi bedømt til at være praktisk talt rent. Et 5 USP-kaninforsøg (United States Pharmacopia) omfattende 144 kaniner viste en styrke på 26,3 - 1,8 enheder per mg (vandfrit).

EKSEMPEL 7

Der fremstilledes opløsninger af S-sulfonatet af A-kæden 10 i humant insulin (E. coli) [N-formyl-Gly^] og af S-sulfonatet af B-kæden i humant (pancreatisk) insulin med en koncentration på 5 mg/ml i 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5). I hver opløsning blev pH indstillet til 10,5 ved hjælp af 5 N natriumhydroxid. 61,7 mg DTT blev opløst i 4,0 ml 0,1 M gly-15 cinpuffer (pH 10,5), og pH blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 0,16 ml 5 N natriumhydroxid. Til 0,5 ml af B-kæde-S-sulfonat-opløsningen sattes 1,0 ml af [[N-formyl-Gly^]-A-kæde-opløsningen og 0,05 ml af DTT-opløsningen ved stuetemperatur (25°C) med henblik på at opnå et for-20 hold imellem -SH og -SS03* på 1,10. Opløsningen blev om-rørt i et afkølet rum (4 - 8°C) i en åben 3 ml kolbe i 23 timer, hvorefter en HPLC-analyse viste et udbytte af humant [N-formyl-Gly^Aj-insulin på 1,46 mg svarende til 19,555 af det totale proteinindhold.

25 Opløsningen blev gjort sur til pH 3,15 ved hjælp af iseddikesyre, hvorefter en del af denne opløsning blev gel- CB) filtreret på en 1,5 x 90 cm kolonne af Sephadex0' G-50 (Superfine), som var ækvilibreret og elueret med 1 N eddikesyre ved 4 - 8°C. Portionerne svarende til humant 30 [N-formyl-Gly^A3-insulin (elueringsvolumen 87 - 96 ml) blev kombineret og lyophiliseret. Ved HPLC- og aminosyreanalyse viste dette protein sig at være praktisk talt rent. Bioaktiviteten af det humane [N-formyl-Gly -A]-insulin vurderet ved en radioreseptortest var 17% i relation til en 149756 15 standard (humant insulin).

EKSEMPEL 8

Der fremstilledes opløsninger af S-sulfonaterne af A-kæ-den i svineinsulin og af B-kæden i humant insulin (E. coli) 5 i koncentrationer på 10 mg/ml i en 0,1 M glycinpuffer (pH 10,5). En blanding af A- og B-portionen opnåedes ved at tage 2 ml af A-kæde-opløsningen for hver ml af B-kæde-opløsningen. Blandingens pH justeredes til 10,5 ved hjælp af 5 N NaOH. Derpå opløstes 121,2 mg cystein i 3,0 ml 0,1 10 M glycin-puffer (pH 10,5), og pH blev indstillet til 10,5 ved hjælp af 0,35 ml 5 N NaOH. Til 1,4 ml af A-B-blandin-gen sattes ved stuetemperatur 52yul af cystein-opløsningen til opnåelse af et forhold imellem -SH og -SSO^- på 0,95.

Den resulterende opløsning blev omrørt ved 4 - 8°C i en 15 åben 3 ml kolbe i 20 timer, hvorefter en HPLC-analyse viste et udbytte af humant insulin på 3,25 mg svarende til 23,2?ό af det totale proteinindhold.

Claims (8)

149756

1. Fremgangsmåde til fremstilling af insulin i form af okseinsulin» suineinsulin eller humant insulin» et hybrid heraf i form af A-kæden af en af disse insulintyper i kombination med B-kæden af en anden af disse insulintyper el-5 ler en insulin-analog valgt blandt (N-formyl-gly^-AHnsulin, desamino-A^-insulin, (sarcosin^-A)insulin, (L-alanin^-A)in-1 21 sulin, (D-alanin -A)insulin, (isoasparagin -A)insulin, (D- 21 21 asparagin -A)insulin, (asparaginamid -A)insulin, (sarco- 1 21 2 sin -As asparagin -A)insulin, (norleucin -A)insulin, 5 5 19 10 (threonin -A)insulin, (leucin -A)insulin, (phenylalanin 19 18 19 A)insulin, (D-tyros.in -A)insulin, (tyrosin -A, asparagin 21 28—30 A»arginin -A)insulin, des(B ~ -tripeptid)insulin, des- (B te trapep tid) insulin, des (B^~^-pent apep tid) insul in, des(B^~^-tetrapeptid, tyrosinamid^-B)insulin, des(B^ ^ 15 -pentapeptid, phenylalaninamid^-B) insulin, des(B^”^-tetra- peptid)insulin, des(B -pentapeptid)insulin, (lysin -B)-9 10 insulin, (leucin -B)insulin, (leucin -B)insulin og des(phe-nylalanin^-B)insulin ved omdannelse i en enkelt opløsning af A- og B-kædernes S-sulfonater til insulinet ved anven-20 delse af et reduktionsmiddel i form af en thiol kombineret med en oxidation, kendetegnet ved, at man omsætter den S-sulfonerede form af A-kæden, den S-sulfonerede form af B-kæden samt reduktionsmidlet i form af en thiol i et vandigt medium under betingelser, som tilvejebringer en 25 blanding, der (1) har en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 12, idet der anvendes en puffer i en koncentration på mellem ca. 0,001 M og ca. 2 M, (2) har en total proteinkoncentration på mellem ca. 0,1 og ca. 50 mg per ml reaktionsmedium, idet vægtforholdet mellem A-kæde- og B-kæde-sulfonatet ligger 30 mellem ca. 0,1:1 og ca. 10:1, og (3) indeholder en mængde af den reducerende thiol, som tilvejebringer en total mængde på mellem ca. 0,4 og ca. 2,5 -SH-grupper for hver -SS0^~-gruppe, som er til stede i den totale mængde S-sulfonater af 143756 A- og B-kæden, hvorhos man holder blandingen ved en temperatur på mellem ca. 0 og ca. 25 °C i omgivelser, som tilvejebringer oxygen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at S-sulfonatet af A-kæden og S-sulfonatet af B-kæden indeholder aminosyresekvenser, som repræsenteres ved A- og B-kæderne i okse-, svine- eller humant insulin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vægtforholdet imellem S-sulfonatet af A-kæden og

10 S-sulfonatet af B-kæden ligger imellem ca. 1:1 og ca. 3:1.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 3, k e n-detegnet ved, at proteinkoncentrationen ligger mellem ca. 2 og ca. 20 mg per ml.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, k e n- 15 detegnet ved, at pH i reaktionsblandingen ligger mellem ca. 9,5 og ca. 11,0.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at pH i reaktionsblandingen ligger mellem ca. 10,4 og ca. 10,6.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 6, k e n- detegnet ved, at den reducerende thiol er tilstede i en mængde , som tilvejebringer et total på mellem ca. 0,9 og ca. 1,1 -SH-grupper for hver -SSO^ -gruppe, som er til stede i den totale mængde S-sulfonater af A- og B-kæderne.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den reducerende thiol er dithiothreitol eller di-thioerythritol.