JPH02233698A - インスリン前駆体の正しくない構成体を再生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インスリンは、互いにジスルフイド橋を介して結合して
いる２個のポリペプチド鎖から構成される分子である。

Ａ鎖は２１個のアミノ酸、Ｂ鎖は３０ｆ’ｌｉのアミノ
酸からなる。これらの２つの鎖は、前駆体分子、プロイ
ンスリンでは互いにペプチド、Ｃ−ペブチドによって結
合している。

ヒトプロインスリンのＣ−ベプチドは３５個のアミノ酸
からなる。このホルモンの成熟過程でＣ−ペプチドは特
異的なプロテアーゼによって切断され、このようにして
プロインスリンはインスリンに変換される（Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎら：　Ｎａｔｕｒｅ，３３３二９３〜９６．　１
９８８）。天然のＣ−ペプチドのほかに、八！１ＩとＢ
Ｍの結合については多くの可能性が文献に記載されてい
る（Ｙａｎａｉｈａｒａら：Ｄｉａｂｅｔｅｓ，　　２
７：　　１４９〜ｌ６０，　　１９７８；　　Ｂｕｓｓ
ｅら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　１５：　１６４９
〜ｌ６５７，　１９７１；およびＧｅｉｇｅｒら：　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　　Ｒｅｓ．　Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，５５：　６０〜６６．　１９７３）。

遺伝子工学によれば、現在では遺伝子工学で修飾した微
生物からインスリンを製造することが可能である。大腸
菌を微生物として使用すれば、生成物は多くの場合、融
合夕冫パク質として発現され、すなわち生成物は細菌の
内因性タンパク質Ｉ；とえばβ−ガラクトシダーゼと連
結している。この融合タンパク質は細胞内で析出し、し
たがってタンパク分解酵素による分解から保護される。

細胞を破壊したのち、融合タンパク質の構成要素を化学
的にまたは酵素的に切断分離し、インスリン前駆体の６
個のりシステインを酸化的加サルファイト分解によって
Ｓ一スルホネート（−Ｓ−Ｓｏ，−）に変換する。次の
（「再生Ｊ　　（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ）または「再構
成」（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）　）工程において
、天然のプレグロインスリンは、このいわゆるプレプロ
インスリンーＳ−スルホネートから３個の正しいジスル
７イド橋、すなわち相当するインスリンペブチド配列中
に八〇とＡｌｌ，Ａ７とＢ７およびＡ２０とＢｌ９の間
のーＳ−Ｓ一橋を生成させて製造しなければならない。

ＥＰ−Ｂ−０　．０３７　．　２５５に記載された方法
によれば、この工程はたとえば出発のＳ−スルホネート
を、ＳＳＯｓ一基１個あたり１〜５個のＳＨ基になるよ
うな量のメルカプタンと、ｐＨ７〜１１．５の水性メジ
ウム中、水性メジウムｌｉ＋４あたりＳ−スルホネート
ｌＯＩＩ１９までの濃度で、好ましくは酸化剤の不存在
下に反応させることによって行われる。

場合によってはこの場合８０％以上の収率が得られると
いわれる。

正しいジスルフイド橋をもつ所望の再生生成物のほかに
、多かれ少なかれ、望ましくない、「正しくない」構成
体（“ｉｎｃｏｒｒｅｃｔ”　ｒｅｃｏｍ一ｂｉｎａｎ
ｔｓ）、すなわちジスルフイド橋が一部しか正しくない
またはすべて正しくないインスリン生成物および分子間
ジスルフイド橋をもつ生成物のかなりの量も，反応条件
とくに濃度環境に依存して、この場合を含めジスルフイ
ド橋が開裂したインスリン前駆体を適切にジスルフイド
橋が閉じた生成物に変換する実際的なすべての他の公知
の再生まｔ；は再構成過程で常に生成する。

既知の再生過程で得られたインスリン前駆体生成物を、
「正しくない」構成体を除去することなくインスリンへ
の変換処理を行っても（この処理は公知技術により、化
学的にまたは酵素的に行われる）、「正しくない」構成
体からは（天然の）インスリンは生成しない。

したがって、相当する再生生成物を処理してインスリン
を得る前に、正しいジスル７イド橋をもつ再生生成物か
ら「正しくない」構成体を除去することは有利であり、
必須である。これはたとえば公知のクロマトグラフイー
法で行われる。他のとくに有利な方法では、除去は反応
混合物を、好ましくは少量の生理学的に許容される界面
活性物質の存在下、ｐＨ４〜６に調整することによって
行われる。「正しい」構成体は事実上完全に溶液中に残
り、「正しくない」構成体は沈澱する（ＤＥ−Ａ−３５
　０１　６４１参照）。

分離された「正しくない」構成体は、ついで加サルファ
イト分解によって相当するＳ−スルホネートへ有利に復
元される。これを再度折りたたみに付すが、再生前に、
加サルファイト分解時に生成した副生成物を除去するこ
とが多くの場合、必要である。「正しくない」構成体は
このようにして大部分、「有用な」生成物に戻すことが
できる。

「正しくない」構成体の加サルファイト分解、ついでク
ロマトグラフイーおよび再度の折りたたみは、もちろん
、少なからざる消費を伴うものである。

この消費を回避するかまたは少なくとも低減することを
検討中に、これは、インスリン前駆体の「正しくない」
構成体を過剰のメルカプタンと水性メジウム中、有機レ
ドツクス系または反応条件下にこのような有機レドツク
ス系を形成する少なくとも１種の有機化合物の存在下に
反応させることによって可能であることを発見した。

『正しくない』構成体はこの方法によれば「正しい」再
生生成物または「正しい」構成体へ、加サルファイト分
解を行うことなく、直接、高収率で変換することができ
る。これは従来技術に比較して著しい利点である。

加サルファイト分解とそれに続く折りたたみ工程が単な
る過剰のメルカプタンとの反応および有機レドツクス系
の添加によって回避できることを何らかの方法で自明と
するような従来技術は全くない。

本発明の方法におけるインスリン前駆体の「正し《ない
」構成体は、以下の式Ｉ （Ｂ−７）　　　　　　　　（Ｂ−１９）　　　　　　
（Ｂ−３０）（式中、 Ｒ１はＨまたは化学的もしくは酵素的に切断除去できる
アミノ酸もしくはペブチド残基であり、 Ｒ！はＯＨまたはアミノ酸もし′くはペプチド残基、好
ましくはＯＨであり、 Ｒ，はＨまたはＣｙｓ−Ｓ保護基好ましくは−５０３−
または三級ブチル基であり、 ＸはインスリンＡおよびＢ鎖を連結する残基、好ましく
はアミノ酸またはペプチド残基であり、 Ｙは遺伝子でコード可能なアミノ酸好ましくはＴｈｒ、
ＡｌａまたはＳｅｒ、とくにＴｈｒの残基であり、 ２は遺伝子でコード可能なアミノ酸、好ましくはＡｓｎ
，Ｇｉｎ％Ａｓｐ％Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，
ＡｌａまたはＭｅｔ，とくにＡｓｎの残基であり、ＡＩ
−Ａ２０および８１〜Ｂ２９は、突然変異のないまたは
１個もしくは２個以上のアミノ酸残基の置換による突然
変異があるインスリンのベプチド配列であり、好ましく
は突然変異のないヒト、ブタまたはウシインスリンとく
にヒトまたはブタインスリンである）で示されるーＳ−
Ｓ一橋の開裂したインスリン前駆体の再構成に際して副
生成物として生成される生成物が好ましい。

式ＩにおけるＲｌがＨであれば、この生成物はプロイン
スリンから誘導される生成物であり、Ｒ’が化学的また
は酵素的に切断諏去できるアミノ酸またはペプチド残基
である場合には、この生成物はプレプロインスリンから
誘導される生成物である。

化学的に切断除去できるアミノ酸残基は、たとえばＢｒ
ＣＮまたはＮ−プロモスクシンイミドによって切断除去
できるアミノ酸残基、たとえばメチオニン（Ｍｅｔ）ま
たはトリプト７アン（Ｔｒｐ）である。

酵素的に切断除去できるアミノ酸残基は、たとえばトリ
プシンによって切断除去できるアミノ酸残基たとえばＡ
ｒｇまたはＬｙｓである。

化学的または酵素的に切断除去できるペブチド残基は少
なくとも２個のアミノ酸残基を有するペプチド残基であ
る。

Ｒ，として可能なすべてのアミノ酸は、好ましくは天然
のアミノ酸、すなわち主としてｃｔｙ，Ａｌａ，　Ｓｅ
ｒ，　Ｔｈｒ，　Ｖａｌ，　Ｌｅｕ，　Ｉｌｅ，　Ａｓ
ｎ，　Ｇｉｎ，Ｃｙｓ，　Ｍｅｔ，　Ｔｙｒ，　Ｐｈｅ
，　Ｐｒｏ、Ｈ’ｌｐｓ　Ａｒｇ％ＬＶＳ１Ｈｙｌ，　
Ｏｒｎ，　Ｃｉｔおよび旧Ｓに含まれる。

Ｒ！はＯＨまたは、Ｒｌと類似して、同様のアミノ酸も
しくはペプチド残基であり、ＯＨであることが好ましい
。アミノ酸（少なくとも２個のアミノ酸残基からなるペ
プチド残基を形成したアミノ酸を包含する）は、Ｒ．の
場合と同様、天然のアミノ酸群に由来するものが好まし
い。

Ｒ，は水素またはシステインの硫黄保護基であり，　−
ＳＯ．−または三級ブチル基が好ましいシステインの硫
黄保護基である。

ＸはインスリンＡおよびＢ鎖を連結する残基で、アミノ
酸またはペプチド残基であることが好ましい。

Ｘがアミノ酸残基の場合はＡｒｇまＩ；はＬｙｓ残基が
好ましい。Ｘがペプチド残基の場合は、天然のＣ−ペプ
チドの残基、とくにヒト、ブタまたはウシインスリンＣ
−ペプチ下の残基であることが好ましい。

Ｙについての遺伝子でコード可能なアミノ酸は、Ｇｌｙ
ＳＡｌａ％Ｓｅｒ、Ｔｈｒ％Ｖａｌ％Ｌｅｕ，　Ｉｌｅ
，　Ａｓｐ１Ａｓｎ，　　Ｇｌｕ％　ＧＩｎ，　　ＣＹ
Ｓ％　　Ｍｅｔ，　　Ａｒｇｔ　　Ｌｙｓ，　　Ｈｉｓ
，Ｔｒｙｓ　Ｐｈｅｓ　ＴｒｐおよびＰｒｏ　（いずれ
もＬ型）である。

遺伝子でコード可能な好ましいアミノ酸はＴｈｒ，　Ａ
ｌａおよびＳｅｒ，とくにＴｈｒである。

ＺはＹと同じく、遺伝子でコード可能なアミノ酸の残基
を同様に意味するが、この場合は、Ａｓｎ，　Ｇｌｎ，
　Ａｓｐｑ　Ｇｌｕ，　Ｇｌｙ，　Ｓａｒ、Ｔｈｒ％Ａ
ｌａおよびＭｅ５　とくにＡｓｎが好ましい。

ＡＩ−Ａ２０およびＢｌ−Ｂ２９は原則として、すべて
の可能なインスリンに由来する突然変異がないまたは１
個もしくは２個以上のアミノ酸の置換による突然変異の
あるペプチド配列である。突然変異体は遺伝子工学によ
る公知の方法（部位特異的突然変異）で製造できる。し
かしながら、ヒト、ブタまたはウシインスリン、とくに
ヒトまたはブタインスリンの突然変異のないペプチド配
列（ヒトおよびブタインスリンのＡｔ−Ａ２０およびＢ
ｌ−Ｂ２９配列は同一である）が好ましい。

式ｌの開裂したーＳ−Ｓ一橋をもつインスリン前駆体再
構成時に副生成物として生成する「正しくない」構成体
は「正しい」構成体から公知の方法によ、り、好ましく
は上述のＤＥ−Ａ−３５　０１　６４１の方法に従って
ｐＨ４〜６で沈澱させ、ついでそのまま、または凍結乾
燥したのちに水または水性溶液に溶解して本発明の方法
に使用する。

出発水溶液中における「正しくない」構成体の濃度は広
範囲に変動させることができるが、好ましい濃度は約０
．１〜約１００！１９、とくに約０．１〜約１０＋ｉｇ
／ｇＱである。ｍｇ値は「正しくない」構成体の乾燥固
体としての重量である。

本発明の反応に適当なメルカプタンは原則として、ＳＨ
基を有するすべての可能な有機化合物、たとえばメルカ
プトエタノール、チオグリコ−ル酸、ジチオエリスリト
ール、グルタチオンおよびシステインであり、とくにメ
ルカプトエタノールおよびシステインが好ましい。メル
カメタンは単独でまたは混合物として使用できる。

使用するメルカプタンの量は広い範囲内で変動させるこ
とができるが、メルカプタンＳＨ基／システイン−Ｓ単
位（「正しくない」構成体中）の比が少なくとも約５に
なるようにメルカプタンを過剰用いることが好ましい。

この比の上限は、実際上経済的理由によってのみ設けら
れるものである。上限は約１００とするのが有利である
。

過剰のメルカプタン量は広い範囲内で変動させることが
できるので、使用する「正しくない」構成体中のシステ
イン−Ｓ単位の数を完全に正確に測定する必要はない。

好ましい可能な有機レドツクス系は一対の化合物であり
、その一成分は式■ の構造要素を有する有機化合物または芳香族０ーもしく
はｐ−ジヒドロキシ化合物であり、他方の成分は式■′ の構造要素、すなわち式■の酸化型の構造要素を有する
有機化合物または０−もしくはｐ−キノンである。

式■および■′の構造要素の自由原子価は、水素または
、たとえばＣ，〜Ｃ．−アルキル基のような有機基によ
って満たされる。しかしながら、この構造要素は、好ま
しくは４、５または６個の炭素環原子および所望により
１個もしくは２個のたとえばＯのようなペテロ原子を有
する環で、反応条件下に不活性な基たとえばアルキルも
しくはヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい環
の部分であってもよい。

式■の構造要素を有する化合物の例としては、 レダクトン レダクト酸 Ｈ！ メチルレダクト酸 しｆｉｓ アスコルビン酸 （ビタミンＣ） がある。上述の式はいずれも互変異性聖のひとつとして
のみ記載されている。

すべての化合物は還元性である。酸化型では、弐■の構
造要素は弐■′の構造要素となる。

適当な芳香族〇一およびｐ−ジヒドロキシ化合物は、原
則として０−またはｐ一位に２個のＯＨ基を有するすべ
ての可能な芳香族であるが、０−およびｐ−ジヒドロキ
シ化合物からの。−またはｐ−キノンの形成が特定の置
換基等によって妨害されないことだけは必要である。〇
一およびｐ−ジヒドロキシ化合物の例としては、１．２
−’；ヒドロキシベンゼンーピロ力テコール、 １．４−シヒＦ口キシベンゼンーヒドロキノン、メチル
ーヒドロキノン、ナフトー１，４−ヒドロキノンおよび
アントラヒドロキノンがある。相当するキノンはそれら
から酸化で生成する。

本発明の反応では、例えば、アスコルビン酸＋デヒドロ
アスコルビン酸、ピロカテコール＋０−キノン、ヒドロ
キノン＋ｐ−キノン、ナフトヒドロキノン＋ナフトキノ
ン等のような化合物対からなる特定の有機レドツクス系
を事実上任意の所望の比率（好ましくはほぼ等モル比）
で使用することができる。しかしながら、これらの化合
物対の特定の各成分については、すなわちたとえばアス
コルビン酸のみもしくはデヒドロアスコルビン酸のみ、
またはヒドロキノンのみ等、を添加することが可能であ
る。それぞれの場合、レドツクス化合物対に属する他の
成分（デヒドロアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸
またはｐ−キノン等）が反応メジウム中に生成するから
である。

好ましい有機レドツクス系は、アスコルビン酸＋デヒド
ロアスコルビン酸、ビロカテコール＋０−キノンおよび
パラ力テコール＋ｐ−キノ６ンの化合物対からなる配合
物であり、反応条件下にこのようなレドツクス系を形成
する好ましい個々の化合物はこれらの化合物の個々の成
分である。

アスコルビン酸および／またはデヒドロアスコルビン酸
はとくに好ましい。

有機レドツクス系を形成する化合物の使用量は広範囲の
限界内で変動させることができる。

存機レドツクス系を形成する化合物のモル数は、メルカ
プタンｌｇ当量（使用するメルカプタンの分子量の９数
／メルカプタン分子中のＳＲ基の数）に対して約１／１
０．０００〜１０，０００、好ましくは約１７ｌＯ〜ｌ
Ｏになるように選択できる。

反応溶液には、約０．１−ＩＭ（Ｍ−モル濃度）、とく
に好ましくはＯ．１〜０．５Ｍに相当する濃度の尿素を
加えることも有利である。

本発明の反応は、アルカリ性のｐＨ範囲、好ましくは約
７〜ｌ２、とくに約９．５〜１１で実施するのが有利で
ある。所望のｐＨを維持するには、緩衝物質の添加が有
利である。緩衝剤の性質およ＼ びイオン強度は折りたたみ収率にある影響を与える。イ
オン強度を低く、約１　ｍＭ　（．ｍＭ−ミリモル）か
らＩＭ（Ｍ一モル）の範囲に保持することが有利であり
、とくに約５１ｌＩＭ〜５０ｗ＋Ｍの間が好ましい。使
用できる緩衝剤はホウ酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤または
グリシン緩衝剤であり、後者がとくに好ましい。

反応温度については約Ｏ〜４５℃の範囲を一般的な範囲
ということができるが、約４〜８℃の範囲が好ましい。

再生溶液をある種の気体、ｔ；とえば酸素、窒素または
ヘリウムで被覆することは再生収率に見るべき影響を与
えない。

反応時間は一般的には約２〜２４時間、好ましくは約６
〜１６時間である。

本発明の反応の再生生成物は、「正しくない」出発構成
体が上述の式■のーＳ−Ｓ一橋が開裂しＩ；インスリン
前駆体の再構成に由来するものであれば、弐■ ＣＢ−７）　　　　　　　　（Ｂ−１９）　　　　　　
（Ｂ−３０）（式中、Ｒ，１Ｒ！、Ｘ，ＹおよびＺは式
１（７）場合と同じ意味である）で示される正しいジス
ル７イド結合を有するインスリン前駆体（「正しい」構
成体）である。

反応が終結したならば（これはたとえば高速液体クロマ
トグ５７イーで確認できる）、混合物の公知の方法で、
たとえば上述のＥＰ−Ｂ−０．０３７．２５５に記載さ
れているように後処理する。

弐■の「正しい」折りだＩ；み生成物をついで、公知技
術により、酵素的または化学的に相当するインスリンに
変換できる。

以下の例は本発明をさらに詳細に例示することを意図す
るものである。（発明）例に先立って、出発物質の製造
も例として記述する。

Ａ）出発物質の製造 ｌ）「ミニプロインスリン」の折りたたみ「ミニプロイ
ンスリンーＳ−ＳＯ３−Ｊ　、すなわちインスリンＡ鎖
とＢ鎖がアルギニンを介して連結され、Ｂ鎖がＮ末端で
延長されているインスリン前駆体を使用する。凍結乾燥
物質（６０％純度）を、５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ
ｌ０．７中に固体濃度０．５９／　Ｑ溶解する。

これは前駆体濃度０−３ｇ／ｆｆに相当する。このパッ
チ（１００Ｑ）にＩＭメルカプトエタノール６３０ｔＱ
およびＩＭアスフルビン酸６３０ｍＱを加え、ついで混
合物を冷室中８℃で１６時間ゆっくりと撹拌する。標準
に対して高速液体クロマトグラフイーで測定した折りｔ
；たみ収率は０　．　２　２　８　９　／　（ｌである
（理論量の７６％）。

２）＠集体（「正しくない」構成体）の沈澱ポリエチレ
ンーポリプロピレングリコールｌ９を折りたたみバッチ
に加え、全バッチを各２０ｍｌ２の５バッチに分け、ｐ
Ｈ５　．　０からｐＨ７．０までｐＨ０．５間隔で一連
のｐｉ沈澱を行う。

ｐＨ値が確立したのち、混合物を室温に１５分間放置し
、ついで沈澱を遠心分離する。上溝は高速液体クロマト
グラフイーで定量して沈澱ロスを測定し、沈澱は合して
凍結乾燥する（！量：固体１５９、純度４０％）。

正しく折りたｔ；まれた生成物のロスはｐＨの関数であ
る。

ｐＨ　　　　ロス ５．０　　　　　０％ ５．５　　　　６％ ６．０　　　　　１０％ ６．５　　　　９％ ７．０　　　　４％ この一連の実験で、至適ｐＨは５．０であることが明ら
かである。

Ｂ）発明例：再生 凍結乾燥しｊ；沈澱１５９を４Ｍ尿素５ａに取る。

メルカプトエタノール１３．２＋ａｌ２（１４．３５Ｍ
　）を加え（最終濃度約３５ｍＭ）　、混合物を室温で
ｌＯ分間放置する。この５Ｑの溶液を５０ｍＭグリシン
緩衝液２５Ｑ中に導入し、ｌＭアスコルビン酸１８８ｍ
（１を加え、ｐＨを１０．７に調整する。このバツチを
８゜Ｃで５時間穏やかに撹拌する。折りたたみ収率は０
．１４６９／ＱＣ理論量の７３％）である。反応の経過
は高速液体クロマトグラフイーで監視する。

「ミニプロインスリン」折りたたみの総収率は（Ａｔ参
照）理論量の約７６％から約８５％に上昇させることが
できる。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）インスリン前駆体の「正しくない」構成体を再生す
   るにあたり、「正しくない」構成体を水性メジウム中、
   有機レドックス系または反応条件下にこのような有機レ
   ドックス系を生成する少なくとも１種の有機化合物の存
   在下に、過剰のメルカプタンと反応させることを特徴と
   する方法。 ２）使用するインスリン前駆体の「正しくない」構成体
   は、式 I ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、 Ｒ＿１はＨまたは化学的もしくは酵素的に切断除去でき
   るアミノ酸もしくはペプチド残基であり、 Ｒ＿２はＯＨまたはアミノ酸もしくはペプチド残基、好
   ましくはＯＨであり、 Ｒ＿３はＨまたはＣｙｓ−Ｓ保護基、好ましくは−ＳＯ
   ＿３＾−または三級ブチル基であり、ＸはインスリンＡ
   およびＢ鎖を連結する残 基、好ましくはアミノ酸またはペプチド残基であり、 Ｙは遺伝子でコード可能なアミノ酸好まし くはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ、とくにＴｈｒの残基
   であり、 Ｚは遺伝子でコード可能なアミノ酸好まし くはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ
   、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔ、とくにＡｓｎの残基で
   あり、Ａ１〜Ａ２０およびＢ１〜Ｂ２９は、突然変異の
   ないまたは１個もしくは２個以上のアミノ酸残基の置換
   による突然変異があるインスリンのペプチド配列であり
   、好ましくは突然変異のないヒト、ブタまたはウシイン
   スリンとくにヒトまたはブタインスリンである） で示される−Ｓ−Ｓ−橋の開裂したインスリン前駆体の
   再構成に際して副生成物として形成される生成物である
   請求項１記載の方法。 ３）反応は、「正しくない」構成体の濃度約０．１〜約
   １００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／
   ｍｌで行われる請求項１および２のいずれかに記載の方
   法。 ４）メルカプタンとしてメルカプトエタノールおよび／
   またはシステインを使用する請求項１〜３のいずれかに
   記載の方法。 ５）反応は、メルカプタンＳＨ基／システイン−Ｓ単位
   （「正しくない」構成体中の）の比が少なくとも約５、
   好ましくは約５〜１００に相当する過剰のメルカプタン
   とともに行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６）使用する有機レドックス系は一対の化合物でその一
   方の成分は式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） の構造要素を有する有機化合物または芳香族ｏ−もしく
   はｐ−ジヒドロキシ化合物であり、その他方の成分は式
   IIの構造要素の酸化型である式II′ ▲数式、化学式、表等があります▼（II′） の構造要素を有する有機化合物またはｏ−もしくはｐ−
   キノンである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７）反応条件下で有機レドックス系を生成する使用され
   る有機化合物は請求項６に挙げた個個の化合物１種また
   は２種以上である請求項１〜５のいずれかに記載の方法
   。 ８）使用する有機レドックス系は一対の化合物、アスコ
   ルビン酸＋デヒドロアスコルビン酸、ピロカテコール＋
   ｏ−キノンまたはヒドロキノン＋ｐ−キノンであり、反
   応条件下にこのようなレドックス系を生成する使用され
   る有機化合物はそれぞれこの化合物対の一方の成分のみ
   である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９）反応はアスコルビン酸および／またはデヒドロアス
   コルビン酸の存在下に行われる請求項１〜７のいずれか
   に記載の方法。 １０）メルカプタンと有機レドックス系を生成する化合
   物は、メルカプタン１ｇ当量に対し有機レドックス系を
   生成する化合物が１／１０，０００〜１０，０００、好
   ましくは１／１０〜１０モルの割合で使用される請求項
   １〜９のいずれかに記載の方法。 １１）水性反応メジウムは溶解した尿素、好ましくは約
   ０．１〜１、とくに約０．１〜０．５モル濃度を含有す
   る請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 １２）反応は約７〜１２、好ましくは約９．５〜１１の
   ｐＨで行う請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。