PT92906A - Processo para a renaturacao de falsos recombinantes de precursores de insulina - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de in venção de HOECHST AKTIENGESELLS-CHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt em Main 80, República Federal Alemã, (inventor* Dr. Michael D8rschug, residente na Alemanha Ocidental), para: "PROCESSO PARA A RENATURACÃO DE FALSOS RBCOMBINANTES DE PRECURSORES DE INSULINA".

Descrição A insulina e uma molécula constituída por duas cadeias polipeptídicas que estão ligadas entre si através de pontes de dissulfureto, A cadeia A contém 21 aminoácidos e a cadeia B con. siste em 30 aminoácidos* Estas duas cadeias estão acopladas entre si na molécula precursora, a proinsulina, por um peptídeo, o peptídeo C. 0 peptídeo C na proinsulina humana consiste em 35 aminoácidos. 0 peptídeo C, no quadro do processo de maturação da hormona, é dissociado por proteases específicas e a próinsulina I dissociada deste modo em insulina (Davidson et al, Natu-re 333. 93-96, 1988)· Alem do peptídeo C de ocorrência natural estão descritas na literatura um certo número de possibilidades de ligação entre a cadeia A e a cadeia B (Yanaihara et al., Dia betes 2£, lk^-l60 (1978), Busse et al., Biochemistry 1£, 16^9--1657 (1971), Geiger et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 55. 60-66 (1973)).

No âmbito da tecnologia genética é hoje possível preps. rar insulina a partir de microorganismos modificados por tecno- logia genética* Se se utilizar como microorganismo E* coli, o produto é frequentemente expresso como proteína de fusão, isto é, o produto é acoplado a uma proteína própria da bactéria, por exemplo com a ^-galactosidase. Esta proteína de fusão separa--se na célula em forma cristalina e está assim protegida da dis sociação proteolítica. Depois da abertura da célula o constituir te proteina de fusão é dissociado química ou enzimaticamente e as 6 cisteinas do precursor de insulina são transformadas por sulfitólise oxidante nos seus S-sulfonatos (-S-SO^")· A partir deste chamado S-sulfonato de préproinsulina tem que ser produzi da, num passo subsequente (de "renaturação ou recombinação") a prépróinsulina nativa mediante a constituição das 3 pontes de dissulfureto correctas - isto é, pontes -S-S- de Aó para All, de A7 para B7 e de A20 para B19 nas correspondentes sequências peptídicas da insulina.

Este passo e realizado por exemplo de acordo com o processo descrito na Especificação EP-B-0 037 255 por reacção do S-sulfonato de partida com um mercaptano numa quantidade que produza 1 a 5 radicais SH por radical SSO^-* em meio aquoso, a um valor de pH de 7 a 11,5 © oom uma concentração de S-sulfona-to de até 10 mg por ml do meio aquoso, de preferência na ausência de um oxidante*

Neste caso costumam ser obtidos rendimentos por vezes superiores a 80$.

Neste processo, assim como praticamente também em todos os outros processos conhecidos de renaturação ou recombinação, nos quais os precursores de insulina com pontes de dissulfureto abertas são convertidos em produtos com as correspondentes pontes de dissulfureto fechadas, consoante as condições da reacção e especialmente as proporçães de concentração, além dos produtos de renaturação (pretendidos) com pontes de dissulfureto correctas, formam-se sempre também quantidades maiores ou me nores de "falsos” recombinantes (indesejáveis) isto é, produtos de insulina com pontes de dissulfureto apenas parcialmente correctas ou mesmo totalmente incorrectas, bem como também com pon tes de dissulfureto intermoleculares.

Se os produtos precursores de insulina, obtidos de 2

acorde com processos conhecidos de renaturação, forem recuperados sem a separação dos "falsos" recombinantes da insulina, o que pode suceder de acorde com técnicas conhecidas (químicas ou enzimáticas) a partir dos "falsos" recombinantes, não se forma qualquer insulina (nativa)« Ê pois conveniente ou mesmo necessário, separar os "falsos" recombinantes, antes da recuperação dos correspondentes produtos de renaturação de insulina dos produtos de renaturação com as pontes de dissulfureto correctas. Isto pode ser rea lizado por exemplo segundo processos cromatográficos conhecidos. De acordo com um outro processo particularmente vantajoso reali-za-se a separação por ajustamento da mistura reactiva a um valor de pH de h a 6 - de preferência na presença de uma pequena quantidade de uma substância tensioactiva fisiologicamente inócua - permanecendo os recombinantes "correctos" praticamente totalmente em solução e separando-se por precipitação os "falsos" recombinantes (ver DE-A-3 501 6kl).

Os "falsos" recombinantes assim separados são depois convenientemente transformados de novo, por sulfitólise, no correspondente S-sulfonato, o qual é submetido a um novo desdobra-mente, sendo frequentemente necessário separar por cromatogra-fia produtos secundários que se formam na sulfitólise, antes da renaturação. Deste modo os "falsos" recombinantes podem ser de novo transformados na sua maioria num produto "reutilisável". A sulfitólise dos "falsos" recombinantes com a subsequente cromatografia e novo desdobramento significa naturalmente um custo adicional não desprezível.

Com o objectivo de eliminar este custo, ou pelo menos de o minimizar, descobriu-se agora que isto pode ser realizado por reacção dos "falsos" recombinantes de precursores de insulina em meio aquoso, com um excesso de mercaptano na presença de um sistema redox orgânico, ou pelo menos de um composto orgânico que nas condiçSes da reacção forme um sistema redox orgânico deste tipo.

Deste modo os "falsos" recombinantes podem ser conver tidos sem sulfitólise, com altos rendimentos, directamente nos = 3 =

produtos "correctos" de renaturação, ou recombinantes "correctos", o que, relativamente ao estado da técinca, representa uma vantagem considerável. Não há de resto qualquer estado da técnica que sugerisse de alguma forma a exclusão da sulfitolise' com o subsequen te passo de desdobramento, substituindo-o apenas pela reacção com excesso de mercaptano e a adição de um sistema redox orgânico.

Como "falsos" recombinantes de precursores de insulina interessam para o processo de acordo com a invenção de prefe rência os produtos que se formam como produtos secundários na recombinação de precursores de insulina com pontes -S-S- abertas com a formula I (A-l) Gly-NH - (A-6) Cys-S-R^ S-R3 (A-7) Cys-------Cys- (A-ll) (A-20)(A-2l) -Cys - Z - R2

X (I) s-r3 (B-l)

Rj-HN-HB-Cys-------------------Cys----------------------Y (B-7) (B-19) (B-30) na qual R^ representa hidrogénio, um radical de aminoácido ou de um peptídeo dissociável química ou enzimatioamente,

Rg representa hidroxilo ou um radical de aminoácido ou de peptí deo, de preferencia hidroxilo, R^ representa hidrogénio ou um grupo de bloqueio de Cys-S, de preferencia o grupo ou o grupo t-butilo, X representa um radical ligado às cadeias A e B da insulina, de preferencia um radical de aminoácido ou de peptídeo, Y representa um radical de um aminoácido codifieável geneticamente, de preferência Thr, Ala, Ser, especialmente Thr,

Z representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala ou Met, especialmente Asn, A1-A20 e B1-B29 representam sequências peptídicas da insulina, não modificadas ou modificadas por permuta de um ou mais aminoá eidos, de preferência as sequências peptídicas não modificadas de insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente da insulina humana ou de porco.

Se na fórmula I representar hidrogénio, trata-se de produtos derivados da próinsulina; se R^ representar radicais de aminoácidos ou peptídeos dissociáveis química ou enzi-maticamente, trata-se de produtos que derivam de préproinsuli-na.

Os radicais de aminoácidos dissociáveis quimicamente são aqueles que podem ser dissociados por exemplo por meio de bromóciano ou N-bromossuccinimida; estes são por exemplo metio-nina (Met) ou triptofano (Trp).

Os radicais de aminoácido dissociáveis enzimaticamen-te são aqueles que são dissociáveis por exemplo por meio de tripsina (como por exemplo Arg ou Lys).

Os radicais peptídicos dissociáveis química ou enzima ticamente são radicais peptídicos com pelo menos 2 aminoácidos.

Todos os aminoácidos que interessam para R^ são de preferência os do grupo dos aminàácidos naturais, isto é, principalmente Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, lie, Asn, Gin,

Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Oit e His.

Rg representa hidroxilo ou - analogamente a R^ - representa igualmente um radical de aminoácido ou peptídeo, sendo preferido o significado de hidroxilo. Os aminoácidos (e também aqueles que formam um radical peptídico - constituído por pelo menos 2 radicais de aminoácido) derivam preferivelmente, tal como R^, do grupo dos aminoácidos naturais. representa hidrogénio ou um grupo de bloqueio de cisteína-enxofre, sendo -S0 ”- ou o grupo t-butilo os grupos de • j • bloqueio preferidos de cisteína-enxofre. « 5 *

X representa um radical que liga as cadeias A e B da insulina, de preferência um radical de aminoácido ou peptídeo.

Se X representar um radical de aminoácido, é preferido o radical de Arg ou Lys; se X representar um radical peptí-dico é preferido o radical de um peptídeo C de ocorrência natural - especialmente o peptídeo C da insulina humana, de porco ou de vitelo.

Os aminoácidos codificáveis geneticamente - para Y são (todos na forma l)í Gly, Ala, Ser, Thr, Yal, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.

Os aminoácidos codificáveis geneticamente preferidos são Thr, Ala e Ser, especialmente Thr. Z, tal como Y, pode também representar um radical de um aminoácido codificável geneticamente, sendo neste caso, preferidos no entanto Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala e Met, especialmente Asn. A1-A20 e B1-B29 podem ser em princípio as sequências peptídicas não modificadas, ou modificadas por permuta de um ou mais aminoácidos, de todas as possíveis insulinas; os mutantes podem ser produzidos segundo precessos conhecidos da tecnologia genetica (site directed mutagenesis)· São no entanto preferidas as sequências peptídicas não modificadas da insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente da insulina humana ou de porco (as sequências A1-A20 e B1-B29 das insulinas humana e de por co sã· idênticas).

Os "falsos" recombinantes, formados como produtos secundários na recombinaçãe de precursores de insulina com pontes -S-S- abertas, de fórmula 1, são obtidos de forma conhecida a partir dos recombinantes "correctos" - de preferência por preei pitação a valores de pH de 4 a 6, de acordo com o processo da especificação já referida DE-A- 3 501 6k1 - e depois são dissol vidos directamente em água ou numa solução aquosa, ou também do pois da prévia liofilisação, para utilização no processo de acordo com a invenção. A concentração dos "falsos” recombinantes na solução = 6 = Λ *

aquosa inicial pode variar dentro de um amplo intervalo; as con centraçães preferidas situam-se entre valores de aproximadamen-te 0,1 a 100 mg, especialmente de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/ml, referindo-se os valores em mg aos nfalsostt recombinantes como substancia sólida seca.

Interessam como mercaptanos para a reacção de acordo com a invenção, em princípio, todos os possíveis compostos orgânicos com grupos SH; são preferidos mercaptoetanol, ácido tio glicólico, ditioeritrite, ditioeritritol, glutationa e cisteína especialmente mercaptoetanol e cisteina· Os mercaptanos podem ser utilizados individualmente ou em mistura.

As quantidades de mercaptanos a utilizar podem oscilar dentro de amplos limites; e preferido um excesso de mercap-tano correspondente a uma proporção de grupos SH de mercapta-no/unidades cisteina-S (nos "falsos" recombinantes) de pelo menos aproximadamente 5* Superiormente esta proporção é limitada praticamente apenas por consideraçães económicas. Ê conveniente um limite superior de cerca de 100.

Devido ao amplo intervalo de oscilação dos valores do excesso de mercaptano, nos "falsos" recombinantes utilizados o número de unidades cisteina-S não precisa ser determinada muito exac tamente·

Como sistemas redox orgânicos interessam de preferencia pares de compostos nos quais um dos componentes ó um compos, to orgânico com o elemento de estrutura de fórmula II 0H 0H 0 1 f il - c = G - 0 II lt 0H I 0H I II - c - L 1 c - ou um composto aromático de o- ou p-dihidroxi, e o outro dos componentes e um composto orgânico com o elemento de estrutura de fórmula II na forma oxidada = elemento de estrutura de fórmu la II»

= 7 = (II*) ou tuna o- ou p-quinona.

As valências livres dos elementos de estrutura de for mulas II ou II* podem ser preenchidas por hidrogénio ou por gru pos orgânicos, como por exemplo grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. 0 elemento de estrutura pode também, no entanto, fa zer parte de um anel tendo de preferência 4,5 ou 6 átomos de carbono de anel, bem come eventualmente ainda 1 ou 2 heteroáto-mos, tais como por exemplo oxigénio, podendo também o anel, por sua vez, estar ainda substituído por grupos inertes nas condi-ções da reacçâo, como por exemplo grupos alquilo ou hidroxial-quilo.

Os exemplos de compostos com o elemento de estrutura de formula II são

reductona OH OH Q

I I II

H-C = C- C- H ácido reductínico

OH OH

I I

HC — CH

OH OH I I HC ~ CH ácido ascérbico (Vitamina C) H0C . C . 0

2 \ / \ C / \ H CH„ ácido ascérbico (Vitamina C)

OH

OH HCI I HOCH2 - CH- CH \/ OH I CHI C =

O

As fórmulas são aqui representadas, cada uma, apenas

numa das formas tautoméricas.

Todos os compostos estão na forma reduzida. Na forma oxidada obtém-se, a partir do elemento de estrutura de formula 11, o de formula II*.

Como compostos aromáticos de o- e p-dihidroxi interes sam em princípio todos os possíveis compostos aromáticos com dois grupos hidroxilo em posição o- ou p-, sendo apenas necessário ainda que a ligação da o- ou p-quinona a partir dos compostos de o- e p-dihidroxi não seja impedida estereoquimicamen-te por substituintes especiais ou semelhantes, quaisquer que eles sejam. Cemo exemplos de compostos aromáticos de o- e p-dihidroxi mencionam-se 1,2-dihidroxibenzeno * pirocatequina, 1,4-dihidroxibenzeno = hidroquinona, metil-hidroquinona, nafto-hidroquinona-1,e antra-hidroquino-na; na oxidação formam-se a partir destes as correspondentes quinonas.

Na reacção de acordo com a invenção podem então ser utilizados cada um dos sistemas redox orgânicos, constituídos por exemplo pelos pares de compostos ácido ascórbico + ácido desidroascórbico, pirocatequina + o-quinona, hidroquinona + p--quinona, naftohidroquinona + naftoquinona, etc, em praticamen-te qualquer proporção (de preferência numa proporção equimole-cular)· Mas também é possível utilizar apenas em cada caso um componente individual destes pares de compostos - e por conseguinte, por exemplo, apenas ácido ascórbico ou apenas ácido desidroascórbico, ou apenas hidroquinona, etc - porque se forma no meio reactivo o outro componente que em cada caso pertence ao par de compostos redox (ácido desidroascórbico ou ácido ascórbico ou p-quinona, etc).

Os sistemas redox orgânicos preferidos são as combi-nações constituídas pelos pares de compostos ácido ascórbico + ácido desidroascórbico, pirocatequina + o-quinona e hidroquinona + p-quinona, e os compostos individuais preferidos que nas condições da reaç = 9 =

ção formam um tal sistema redox, são os componentes Individuais destes pares de compostos. A maior preferência recai no ácido ascérbico e/ou ácido desidroascérbico. A quantidade utilizada do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico pode variar dentro de amplos limites. Tomando como referência 1 equivalente-grama de mercap-tano (= peso molecular do mercaptano utilizado em grama/número de grupos SH na molécula de mercaptano) o número de moles do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico pode ser escolhido entre cerca de l/lO 000 e 10 000, de preferencia entre cerca de l/lO e 10. É vantajoso adicionar também ureia à solução reacti-va, sendo preferidas concentraçães correspondentes a cerca de 0,1 até 1 M (Ms molar) especialmente de cerca de 0,1 a 0,5 M. A reacçâo de acordo com a invenção é convenientemente realizada em gamas alcalinas de pH, de preferência entre cerca de 7 e 12, especialmente entre cerca de 9» 5 e 11. Para a manutenção do valor de pH pretendido é conveniente a adição de uma substância tampão, tendo a natureza e força iénica do tampão uma determinada influência sobre o rendimento de desdobramento. !§ conveniente manter baixa a força iénica do tampão, sendo preferido um intervalo de cerca de 1 mM (mM s milimolar) até 1 M (M « molar), especialmente um intervalo de cerca de 5 mM a 50 mM* Como substâncias tampão podem ser utilizados por exemplo tampão de borato, tampão de carbonato ou tampão de glicina, sen do preferido este último.

Como intervalo genérico da temperatura da reacção pode ser indicado um intervalo entre cerca de 0 e ^5° Cj é preferido um intervalo de cerca de k a 8° C# A protecção da solução de renaturação com determinados gases, como por exemplo oxigénio, azoto ou hélio, não tem qualquer influência marcada sobre o rendimento da renaturação. A duração da reacção situa-se em geral entre cerca de • 2 e 2k horas, de preferência entre cerca de 6 e 16 horas. 10 *

ν'. '’Ν 0 produto de renaturação da reacção de acordo com a invenção - se o "falso" reeombinante de partida for obtido a partir de recombinação de um precursor de insulina com pontes S-S abertas com a fórmula I anteriormente descrita - I um precursor de insulina com pontes de dissulfureto correctas (recom binante "correcto") de formula III (A-l) (a—6)(A-7) (B-l) R-j-HN-Phe na qual R^, R^» X, Y e Z têm os mesmos significados que na fórmula I. Depois do termo da reacção (o que pode ser determinado por exemplo por HPLC) procede-se ao tratamento pós-reactivo de forma corrente. 0 preduto "correctamente" desdobrado, preferivelmente de fórmula III, pode seguidamente ser transformado na correspoij dente insulina de acordo com técnicas conhecidas, química ou enzimaticamente. 0 exemplo que se segue permite elucidar melhor a presente invenção. Antes do exemplo (da invenção) descreve-se ainda a preparação do produto de partida a título de exemplo. A) Preparação do produto de partida 1. Desdobramento de "miniproinsulina" Interessa para utilização "miniproinsulina-S-SO^”"» isto ó, um precursor de insulina no qual as cadeias A e B da ijj

Gly-NH - I Cys-S-S

Cys---Cys—-—-. (A-ll) S I s —Gys— ———(B-7) (A-20) (A-21) —Gys - Z - R2 —Gys———(B-19) (III) (b-30) 11 =

X

_______

}) .-.«Λ» ^ sulina estão acopladas entre si por uma arginina e a cadeia B está prolongada no términus azoto* 0 produto liofilizado (a 60$) ó dissolvido em tampão de glioina 50 mM, pH 10,7, com uma concentração de sólidos de 0,5 g/litro, o que corresponde a uma concentração de precursor de 0,3 g/litro* Adicionam-se ao preparado (100 litros) 63Q ml de mercaptoetanol 1 M e 630 ml do ácido ascórbice 1 M e agitam-se em seguida lentamente durante l6 horas em frigorífico a 8° C* 0 rendimento de desdobramento determinado por HPLC contra um padrão, é de 0,228 g/litro (76# do valor teóriee). 2, Precipitação de agregados ("falsos" recombinantes)

Adiciona-se ao preparado do desdobramento 1 g de po-lietileno-polipropileno-glicol e o preparado global e dividido em 5 preparados de 20 ml cada, com os quais se prepara uma série de pH de precipitação entre pH 5»0 e pH 7,0, intervalados de 0,5 unidades de pH* Para o ajustamento do pH deixa-se repousar 15 minutos à temperatura ambiente e centrifuga-se em seguida para remover o sedimento* Os sobrenadantes são quantificados; por meio de HPLC para determinação da perda de precipitação, os sedimentos são reunidos e liofilizados (pesagem: 15 g de sólidos, teor 40$).

Perda do produto correctamente desdobrado em função do pH: pH 5,0 0 # pH 5,5 6 $ pH 6,0 10 # pH 6,5 9 $> pH 7,0 k $ A partir desta série deduz-se que o pH óptimo de precipitação se situa em 5,0. B) Exemplo da invenção : renaturação 15 g do sedimento liofilizado são tomados em 5 litros de ureia AM. Adicionam-se 13,2 ml de mercaptoetanol (l^,35 M) (concentração final cerca de 35 mM) e deixa-se repousar 10 minutos à temperatura ambiente* Os 5 litros da solução são adicio | nados a 25 litros de tampão de glicina 50 mM, adicionam-se-lhes 12 =

Claims (1)

1. ainda 188 ml de ácido ascórbico 1 M e o pH é depois ajustado a 10,7· 0 preparado e em seguida agitado moderadamente durante 5 horas a 8° C« 0 rendimento de desdobramento e de 0,l46 g/litro (73# do valor teórico)· A marcha da reacçâo é acompanhada por meio de HPLC· 0 rendimento global de desdobramento de "miniproinsulina” (ver Al) sobe deste modo de 76# do valor teórico para cer ca de 85$ do valor teórico· REIVINDICAÇÕES - 1* - Processo para a renaturação de ••falsos" recombinantes de precursores de insulina, caracterizado pelo facto de se fazerem reagir os "falsos" recom binantes em meio aquoso com um excesso de mercaptano, na presença de um sistema redox orgânico, ou de pelo menos um composto orgânico que nas condições da reacçâo forme um sistema redox orgânico referido· - 2* - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se utilizarem como "falsos" recombinantes de precursores de insulina os produtos que se formam como produtos secundários na recombinaçãe de precursores de insulina com ponte; -S-S- abertas, de fórmula I = 13 = * > r ΐ\

   (A-l) Gly-NH- (A-é) Cys-S-R (A-7) Cys—— S-R^ S-R3 (A-ll) (A-20) (A-21) . Cys - Z - R2 s-r3 S-R„ (I) (B-l) R^-HN-Phe——Cys— (B-7) —Cys------- (B-19) (B-30) na qual R^ representa hidrogénio, um radical de um aminoácido ou de um peptídeo dissoeiável quimica ou enzimaticamente, Rg representa hidroxilo ou um radical de aminoácido ou de peptí deo, de preferência hidroxilo, R^ representa hidrogénio ou um grupo de bloqueio de Cys-S, de preferência o grupo -SO^”- ou o grupo t-butilo, X representa um radical ligado às cadeias A e B da insulina, de preferência um radical de aminoácido ou de peptxdeo, Y representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Thr, Ala, Ser, especialmente, Thr, Z representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala ou Met, especialmente Asn, A1-A20 e B1-B29 representam sequências peptídicas da insulina, não modificadas ou modificadas por permuta de um ou mais anino-áoidos, de preferência as sequências peptídicas não modificadas da insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente da insulina humana ou de porco* - 3» - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 cara_c terizado pelo facto de se trabalhar a concentrações de "falsos" recombinantes de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg, de preferência de cerca de 0,1 até cerca de 10 mg/ml* = 14 = * 3

   Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3» caracterizado pelo facto de se utilizar como mercaptano mercaptoetanol e/ou cisteina. - 5* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindica» ções 1 a 4, caracterizado pelo facto de se trabalhar com um ex cesso de mercaptano correspondente a uma relação de grupos Sã de mercaptano/unidaâes S de cisteina (nos "falsos" recombinan-tes) de pelo menos eerca de 5» de preferência de cerca de 5 até Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações I a 5» caracterizado pelo facto de se utilizar como sistemas redox orgânicos pares de compostos dos quais um dos componentes e um composto orgânico com o elemento de estrutura de fórmula II OH OH 0 I t I» - C = C - C - (II) 0 OH OH n t t - C - C = G - ou um composto de o» ou p-hidroxi aromático, e como outro compo nente um composto orgânico com o elemento de estrutura de fórmula II1 0 0 0 n ti ii - C - C - C - (II·) ou uma o- ou p-quinona· - 7§ - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo facto de se utilizar como compostos or ganicos que formam, nas condições de reacção, um sistema redox orgânico, um ou mais dos componentes individuais mencionados na reivindicação 6. = 15 *

   - 8* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7 caracterizado pelo facto de se utilizar como sistema redox orgânico os pares de compostos ácido ascórbico + ácido desidroascórbioo, pirocatequina + o-quinona e hidroquinona + p-quinona e se utilizarem como compostos orgânicos que nas condições da reacção podem formar um sistema redox referido, apenas, em cada caso, um componente destes pares de compostos· - 9* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7 caracterizado pelo facto de se trabalhar na presença de ácido ascórbico e/ou de ácido desidroascórbico· - 10* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 9 caracterizado pelo facto de se utilizar o mercaptano e o composta ou compostos que formam o sistema redox orgânico, numa proporção de um equivalente grama de mercaptano para l/lO 000 até 10 000, mas de preferência l/lO até 10 mol, do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico. - 11* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo facto de o meio reactivo aquoso conter ureia dissolvida, de preferência numa concentração aproximadamen te de 0,1 a 1 molar, especialmente de cerca de 0,1 a 0,5 molar. - 12* - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 11 caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a um valor de pH compreendido entre cerca de 7 e 12, de preferência entre cerca de 9»5 a 11. Λ requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 21 de Janeiro de 1939» sob · N*. P 39 01 718.4. = 16 = » i Lisboa, 19 de Janeiro de 1990 o} tmsm ©ficiAiL ia imMmmmiijm esssti Jj

   = 17 =