FR2947818A1 - Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf. Ce coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. La présente invention concerne également un procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir dudit coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de l'obtention de protéines, et en particulier de l'extraction et de la purification de protéines. L'invention concerne plus précisément l'utilisation d'un produit dérivé du blanc d'oeuf, pour l'obtention, avantageusement par extraction et par purification, des protéines basiques de blanc d'oeuf, en particulier l'avidine.

ART ANTERIEUR Le blanc d'oeuf, ou albumen, est un mélange d'origine naturel qui 1 o comprend généralement environ 88 % en poids d'eau et une teneur en matière sèche d'environ 12 % en poids. La matière sèche est constituée majoritairement de protéines (plus de 90 % en poids, par rapport au poids total de matière sèche). Certaines protéines de blanc d'oeuf sont couramment employées en 15 raison de leur activité biologique. C'est notamment le cas des protéines de blanc d'oeuf dites basiques , présentant un point isoélectrique (ou pl ) supérieur à 7. On peut citer en particulier le lysozyme (dont le pl est de l'ordre de 10,7) et l'avidine (dont le pl est de l'ordre de 10), qui font l'objet de 20 nombreuses études et d'une exploitation à l'échelle industrielle. A titre indicatif, le blanc d'oeuf présente une teneur en avidine proche de 0,05 g par litre, et une teneur en lysozyme proche de 3,5 et 4 g par litre. Le rapport massique de l'ensemble lysozyme plus avidine , par rapport aux protéines totales de blanc d'oeuf, est d'environ 0,04. 25 Le lysozyme est une enzyme naturelle qui a été découverte et caractérisée dans les années 1920. Le lysozyme est utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour son activité antibactérienne contre les bactéries gram-positives. Il altère la paroi cellulaire des bactéries gram-positives, ce qui entraîne la lyse et la mort des 30 cellules. Le lysozyme est efficace contre un certain nombre de bactéries responsables d'infections de l'organisme humain. Les activités anti-bactériennes du lysozyme sont également utilisées pour réduire ou bloquer la détérioration de certains aliments. L'une des applications commerciales les plus importantes du lysozyme concerne 35 l'affinage de certains fromages, par exemple les fromages de type pâte pressée cuite. Le lysozyme inhibe la croissance de Clostridium tyrobutyricum, une bactérie qui peut contaminer le lait. La présence de cette bactérie dans le fromage en formation se traduit notamment par, d'une part, la production d'acide butyrique, qui provoque une flaveur anormale, et d'autre part, la génération d'une concentration excessive d'hydrogène et de dioxyde de carbone, qui entraîne des pressions de gaz dans la masse de la pâte de fromage provoquant des fissures et des fendillements dans ladite masse. On utilise aujourd'hui le lysozyme également pour remplacer les sulfites dans les procédés de vinification. Le lysozyme inhibe les bactéries lactiques et permet de contrôler la fermentation malo-lactique. Il améliore les propriétés organoleptiques (couleur et goût) du vin final. De plus, le vin final qui est exempt de sulfite est mieux toléré par les consommateurs. L'avidine, qui est également retrouvée dans le blanc d'oeuf, est connue principalement pour sa capacité à former un complexe avec la biotine. Ce complexe avidine-biotine a été largement utilisé dans des applications de biotechnologie, notamment pour le diagnostic médical. Il résulte de ce qui précède que les industriels dans le domaine pharmaceutique et alimentaire ont des besoins croissants en protéines basiques de blanc d'oeuf, notamment le lysozyme et l'avidine. L'accessibilité et la composition du blanc d'oeuf, et en particulier celui issu d'oeuf de poule, en font une matière première de choix pour la préparation et l'obtention de telles protéines basiques. Cependant, l'extraction de telles protéines basiques directement à partir du blanc d'oeuf présente certaines limites et inconvénients. C'est en particulier le cas des procédés pour l'extraction et la purification de l'avidine à partir de blanc d'oeuf. En effet, cette approche ne permet pas aujourd'hui une production de cette protéine en quantité, qualité ou prix de revient suffisants, pour satisfaire la demande des industriels.

Plus généralement, en partant de blanc d'oeuf comme matière première, les procédés de purification d'avidine sont souvent complexes et onéreux à mettre en oeuvre, et génèrent des volumes importants de déchets. A titre d'exemple, on connaît des procédés de purification d'avidine basés sur des techniques de chromatographie d'échange de cations, pour l'extraction et la purification d'avidine à partir de blanc d'oeuf.

Le document de brevet canadien n° CA-1 283 072 décrit un procédé pour l'isolement et la séparation, par chromatographie, de lysozyme et d'avidine à partir de blanc d'oeuf. Ce procédé consiste à répéter jusqu'à vingt fois un cycle comprenant les étapes de (i) mise en contact du blanc d'oeuf avec une résine échangeur de cations faiblement acide, de sorte que le lysozyme et l'avidine soient adsorbés sur ladite résine, puis (ii) de mise en contact de la résine avec un tampon d'élution à faible force ionique, ce qui provoque l'élution du lysozyme à partir de la résine, tandis que l'avidine reste adsorbée. Ce procédé se termine par la mise en contact de la résine 1 o comportant l'avidine, avec un tampon d'élution à forte force ionique provoquant l'élution de cette avidine accumulée par adsorption. L'un des inconvénients du procédé ci-dessus est qu'il nécessite le traitement d'un volume important de blanc d'oeuf, et qu'il comprend la mise en oeuvre d'un grand nombre d'étapes (correspondant à la répétition des 15 cycles de chargement du blanc d'oeuf sur la résine), pour l'obtention d'une quantité significative de protéines d'intérêt. De plus, le degré de pureté de l'avidine ainsi produite n'est pas très élevé. Le document de brevet n° CA-2 431 773 décrit également un procédé pour la préparation d'avidine à partir de blanc d'oeuf. Ce procédé comprend 20 (i) une étape de lyophilisation d'un blanc d'oeuf homogénéisé avec un tampon, suivie (ii) d'une étape de solubilisation du blanc d'oeuf lyophilisé dans un tampon, suivie (iii) d'une étape d'incubation du produit lyophilisé resolubilisé avec un matériau de résine échangeur de cations, puis (iv) une étape de filtration pour séparer le matériau de résine du milieu d'incubation, 25 puis (v) une étape d'élution sélective de l'avidine en utilisant une molécule colorée pour laquelle l'avidine présente une forte affinité. Pour l'obtention d'une préparation finale d'avidine purifiée, le procédé ci-dessus, qui comprend un grand nombre d'étapes, requiert la mise en oeuvre d'une étape finale d'élimination du colorant ajouté pour la réalisation 30 de l'étape d'élution. Une alternative consiste en l'extraction de l'avidine par chromatographie d'affinité à partir du blanc d'oeuf (Heney et Orr, Anal Biochem, 114 :92-96, 1981 ; Airenne et al., Gene, 144 : 75-80, 1997 ; Kusnadi et al., Biotechnol Prog, 14 : 149-155, 1998 ; Hood et al., Adv Exp 35 Med Biol, 464: 127-147, 1999).

Mais l'extraction d'avidine à grande échelle nécessiterait l'utilisation de grands volumes de support de chromatographie d'affinité ; or ces supports ont un coût très élevé, et cette technique est plutôt utilisée à l'échelle du laboratoire.

Les procédés connus requièrent l'utilisation d'un volume important de blanc d'oeuf pour obtenir les quantités désirées de protéines d'intérêt. De plus, l'utilisation de blanc d'oeuf génère des volumes importants de déchets dérivés du blanc d'oeuf, qu'il serait économiquement important de valoriser. Ainsi, avec les procédés connus, l'emploi de blanc d'oeuf comme 1 o matière de départ pour l'obtention de certaines protéines basiques comme l'avidine, entraîne la mise en oeuvre d'étapes nombreuses, complexes et/ou onéreuses. Il existe ainsi un besoin pour de nouveaux procédés d'obtention, notamment par extraction et par purification, de certaines protéines de blanc 15 d'oeuf, notamment de protéines basiques comme l'avidine, qui soient alternatifs ou améliorés par rapport aux procédés connus, avantageusement avec un coût de revient plus faible qu'avec les procédés connus.

RESUME DE L'INVENTION 20 Il est fourni selon l'invention de nouveaux procédés d'obtention de protéines de blanc d'oeuf purifiées, y compris de protéines basiques de blanc d'oeuf purifiées, telles que l'avidine purifiée, qui sont avantageux par rapport aux procédés connus. La présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'un 25 coproduit d'extraction de lysozyme du blanc d'oeuf, pour l'obtention (de préférence encore pour l'extraction et la purification) des protéines basiques de blanc d'oeuf, lequel coproduit est une solution (avantageusement sous forme d'une saumure) obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant 30 la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. De préférence, ce coproduit consiste en un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration de l'éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant adaptée pour purifier, dans le rétentat de filtration, le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique. La présente invention concerne aussi l'utilisation du coproduit sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée, qui vérifie les caractéristiques suivantes : - une conductivité inférieure à 50 mS/cm, - une concentration d'avidine supérieure à 1g/L, - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, supérieure à 0,1 et - un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1. Un autre objet de la présente invention concerne le procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. Le coproduit est avantageusement un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant adaptée pour purifier le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique dans le rétentat de filtration. Ce coproduit, employé dans le procédé, est obtenu avantageusement par la succession d'étapes suivantes : (a) passage du blanc d'oeuf sur un support de chromatographie échangeur de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'oeuf contenant le lysozyme, (b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure, (c) récupération de l'éluat enrichie en lysozyme, issu de l'étape (b), (d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c), (e) filtration dudit éluat pour purifier dans le rétentat le lysozyme cristallisé, et (f) récupération du filtrat issu de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt. De préférence encore, ce coproduit possède les caractéristiques suivantes : - une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm, - une concentration en avidine comprise entre 0,05 et 0,8g/L, - un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et - un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1. Encore de préférence, le coproduit utilisé dans le procédé se présente 1 o sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée. Dans ce cas, le coproduit concentré et déminéralisé vérifie avantageusement les caractéristiques suivantes : - une conductivité inférieure à 50 mS/cm, - une concentration en avidine supérieure à 1g/L, 15 - un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et - un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1. La présente invention fournit également une composition pour l'extraction et la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, 20 consistant en un coproduit issu d'un procédé d'extraction de lysozyme se présentant sous une forme concentrée et dessalée, lequel coproduit est un filtrat obtenu à l'issue d'un procédé d'extraction du lysozyme, sous une forme concentrée et dessalée, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique 25 à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. Ce coproduit consiste avantageusement en un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant 30 adaptée pour purifier le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique dans le rétentat de filtration. La présente invention concerne également un procédé pour la purification d'avidine, comprenant une opération d'extraction et de purification de l'avidine à partir d'une composition contenant notamment de 35 l'avidine et du lysozyme (avantageusement du blanc d'oeuf ou un produit dérivé de blanc d'oeuf), laquelle opération d'extraction et de purification de l'avidine comprenant les étapes suivantes : (a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite composition, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme (avantageusement tout ou au moins approximativement tout le lysozyme), et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme, (b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de 1 o cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine (avantageusement tous ces sites), (c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée, retenue sur ledit support au cours de l'étape (b). 15 DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 montre le profil HPLC gel filtration (chromatogramme avec valeur de la densité optique à 280nm fonction du temps en minutes), pour évaluer le degré de pureté de l'avidine extrait par le procédé selon 20 l'invention. La figure 2 montre des profils électrophorétiques répartis sur cinq pistes, pour évaluer le degré de pureté de l'avidine extrait par le procédé selon l'invention : (1) coproduit issu d'un procédé d'extraction de lysozyme se présentant sous une forme concentrée et dessalée, (2) lysozyme étalon, (3) 25 avidine purifiée par le procédé selon l'invention, (4) avidine étalon, (5) lysozyme étalon. Les bandes désignées par les repères A à D correspondent respectivement à : (A) ovotransferrine, (B) ovalbumine, (C) avidine et (D) lysozyme.

30 DESCRIPTION DE L'INVENTION La demanderesse s'est attachée à la recherche de nouveaux procédés d'obtention de protéines basiques de blanc d'oeuf, avantageusement purifiées, dont le coût de revient est modéré. Dans ce contexte, la demanderesse a montré qu'un produit dérivé du 35 blanc d'oeuf, qui est susceptible d'être obtenu en tant que coproduit dépourvu de valeur marchande et qui est généré au cours de procédés de purification protéique à partir de blanc d'oeuf, peut être employé dans des procédés industriels pour l'obtention, et notamment l'extraction et la purification, de protéines basiques de blanc d'oeuf.

La demanderesse a en effet montré qu'un des coproduits ou sous-produits issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, peut constituer un produit de départ utilisable pour l'obtention (avantageusement par extraction et purification) des protéines basiques de blanc d'oeuf, principalement l'avidine ou un mélange avidine / lysozyme. 1 o On a ainsi identifié selon l'invention un produit de départ ayant un grand intérêt pour l'obtention (avantageusement l'obtention par extraction et purification) d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, principalement l'avidine ou un mélange avidine / lysozyme. Seront successivement détaillés ci-dessous (i) le procédé d'obtention 15 du coproduit d'extraction du lysozyme qui est utilisé comme produit de départ pour l'obtention de protéines de blanc d'oeuf, puis (ii) le procédé d'obtention de protéines de blanc d'oeuf, en particulier l'avidine, dans lequel on utilise le coproduit ci-dessus comme produit de départ.

20 Procédé d'obtention du coproduit utilisé comme produit de départ Ce produit de départ d'intérêt consiste en un sous-produit ou un coproduit qui est généré lors de la mise en oeuvre d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf liquide, ledit procédé d'extraction du lysozyme comprenant : 25 (i) l'utilisation de blanc d'oeuf qui est soumis à une étape de chromatographie d'échange de cations au cours de laquelle une fraction protéique enrichie en lysozyme est retenue sur le support chromatographique, (ii) une étape d'élution (avantageusement au moyen d'une solution de 30 saumure) et de récupération de la fraction protéique enrichie en lysozyme, et (iii) une étape d'extraction du lysozyme par cristallisation à pH basique, entraînant en parallèle la production d'un sous-produit ou coproduit appauvri en lysozyme, ledit sous-produit ou coproduit correspondant au produit d'intérêt qui a été identifié selon l'invention comme produit de départ pour l'obtention d'une protéine basique, avantageusement purifiée, de blanc d'oeuf. Le coproduit d'intérêt, qui est utilisé selon l'invention comme produit de départ dans un procédé d'obtention d'une protéine basique provenant de blanc d'oeuf, se présente sous la forme d'une solution obtenue à l'issue de l'étape (iii) ci-dessus d'extraction du lysozyme cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. 1 o Le coproduit d'intérêt consiste avantageusement en une solution de saumure (une solution aqueuse d'un sel) présentant un pH basique, dont la composition protéique est différente de celle du blanc d'oeuf : il s'agit d'une solution enrichie en protéines basiques, autre que le lysozyme, retenues sur support chromatographique échangeur de cations. 15 La demanderesse a constaté que ce coproduit, aujourd'hui non valorisé et considéré comme un déchet, est particulièrement riche en certaines protéines basiques de blanc d'oeuf, et tout particulièrement en avidine. On a montré selon l'invention que ce coproduit constitue une matière première de départ très intéressante pour l'extraction et la purification de ces 20 protéines d'intérêt. Plus précisément, le coproduit d'intérêt, qui est utilisé selon l'invention comme produit de départ pour l'obtention (et en particulier la purification) de protéines basiques de blanc d'oeuf, est susceptible d'être obtenu par un procédé d'extraction de lysozyme comprenant la succession d'étapes 25 suivantes : (a) passage du blanc d'oeuf liquide sur un support de chromatographie échangeur de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'oeuf contenant le lysozyme (et aussi l'avidine), (b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit 30 support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure, (c) récupération de l'éluat enrichi en lysozyme, issu de l'étape (b), (d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c), 35 (e) extraction du lysozyme cristallisé à partir dudit éluat, et (f) récupération de la solution issue de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt. On a constaté selon l'invention que la fraction protéique enrichie en lysozyme qui est récupérée dans l'éluat à l'étape (c) comprend aussi d'autres protéines de blanc d'oeuf, et notamment de l'avidine. On a aussi montré que le coproduit d'intérêt récupéré à l'étape (f), qui est appauvri en lysozyme, n'a pas été simultanément appauvri en autres protéines de blanc d'oeuf. En particulier, ledit coproduit d'intérêt n'a pas été simultanément appauvri en avidine. 1 o Le produit de départ du procédé d'extraction du lysozyme décrit ci- dessus est le blanc d'oeuf, encore couramment dénommé albumen. Le blanc d'oeuf provient préférentiellement d'un oeuf d'oiseau, avantageusement d'un oeuf d'oiseau choisi parmi la poule, la dinde, la pintade, l'oie, la cane, la caille, la faisane, le pigeon et l'autruche. 15 Le blanc d'oeuf utilisé comme produit de départ du procédé ci-dessus est de préférence issu d'un oeuf de poule. Pour la mise en oeuvre du procédé d'extraction du lysozyme ci-dessus, le support de chromatographie échangeur de cations est choisi parmi un support échangeur de cations du type acide faible et un support 20 échangeur de cations de type acide fort. Selon un mode de réalisation préféré, on effectue l'étape d'échange de cations sur un support chromatographique constitué d'un gel rigide, ou semi-rigide, à base de polymères hydrophiles, tels qu'un gel d'agarose réticulé ou non réticulé, un gel de polymère vinylique hydrophile, ou un gel de 25 silice enrobée avec un polymère hydrophile, ou un support polystyrène divinyl benzène, sur le(s)quel(s) polymère(s) hydrophile(s) sont greffés des groupements lui(leur) conférant des propriétés d'échangeur(s) de cations. Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le greffage du(des) polymère(s), on peut citer (i) les groupements 30 carboxyméthyl du type CM-polyoside pour un revêtement échangeur de cations faible, et (ii) les groupements sulfonate ou méthyl sulfonate (S) ou sulfopropyl (SP) du type SP-polyoside pour un revêtement échangeur de cations fort, qui est apte à adsorber des molécules faiblement ionisées. Le support de chromatographie d'échange de cations utilisé dans le 35 procédé d'extraction de lysozyme ci-dessus est avantageusement conditionné dans un conteneur équipé d'au moins un moyen d'alimentation en blanc d'oeuf de départ, d'au moins un moyen d'évacuation des liquides et d'au moins un moyen pour agiter les particules de support chromatographique dans le liquide à traiter. Il s'agit d'un conditionnement par lot ( batch ) du support chromatographique. Le conteneur dans lequel est disposé le support de chromatographie d'échange de cations peut aussi être équipé d'un ou plusieurs moyen(s) d'alimentation en solution tampon, en solution de lavage, ou bien encore en solution pour régénérer le support chromatographique. 1 o De façon préférentielle, préalablement à l'étape (a) de passage sur support de chromatographie, le blanc d'oeuf liquide est ajusté à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence de l'ordre de 8,5. Le support de chromatographie d'échange de cations est avantageusement équilibré à une valeur de pH identique, ou 15 approximativement identique, à la valeur ajustée de pH du blanc d'oeuf. A l'étape (a), le lysozyme contenu dans le blanc d'oeuf liquide départ est retenu sur le support de chromatographie d'échange de cations, et la fraction exclue (non retenue sur le support) qui est appauvrie en lysozyme est évacuée du conteneur ou de la colonne de chromatographie. 20 Après l'étape (a), et préalablement à l'étape (b) d'élution, le support de chromatographie d'échange de cations est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage, préférentiellement avec de l'eau déminéralisée, afin d'éliminer les composants protéiques ou non protéiques de blanc d'oeuf non retenus spécifiquement sur le support chromatographique. 25 La solution de saumure utilisée à l'étape (b) consiste avantageusement en une solution d'élution contenant au moins un contre-ion choisi parmi les cations monovalents suivants Na ou NH4, et/ou les cations bivalents suivants Mg ou Ca. La concentration en sel de cette solution de saumure est 30 avantageusement ajustée de sorte à obtenir une conductivité comprise entre 70 et 80 mS/cm ; elle est par exemple ajustée à 5 % en NaCl. A l'étape (d), la cristallisation du lysozyme est sélective. Elle peut être réalisée par ajout de soude (NaOH), sous agitation, jusqu'à ajustement à une valeur de pH comprise entre 8 et 11, et de préférence de l'ordre de 10.

Cette étape peut être mise en oeuvre dans un réacteur ou tank de cristallisation, bien connu de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation préférentiel des étapes (e) et (f), la séparation entre (i) le lysozyme cristallisé et (ii) le coproduit d'intérêt, est réalisée par filtration de l'éluat issu de l'étape (c) : le lysozyme cristallisé est retrouvé dans le rétentat (dénommé encore pâte de lysozyme ), et le filtrat issu de l'étape (e) constitue le coproduit d'intérêt appauvri en lysozyme et enrichi en avidine (aussi désigné saumure sortie de filtre dans la présente description). 1 o L'opération de filtration ci-dessus, pour la réalisation des étapes (e) et (f) du procédé d'extraction de lysozyme ci-dessus, est par exemple mise en oeuvre au moyen d'un filtre presse. Préférentiellement, le filtre-presse consiste en un filtre presse à bande pressante dont la membrane est avantageusement une membrane de 15 microfiltration avec une taille des pores comprise entre 0,1 et 10 m. D'autres méthodes et techniques connues de l'homme du métier, peuvent encore être envisagées pour réaliser la séparation entre le lysozyme cristallisé et les autres composants de l'éluat obtenu à l'issue de l'étape (c) du procédé ci-dessus. 20 On peut par exemple citer une méthode classique de séparation par centrifugation. Dans ce mode de réalisation des étapes (e) et (f) du procédé ci-dessus, le coproduit d'intérêt constitue le surnageant ou centrifugat ; le lysozyme cristallisé est collecté dans le culot de centrifugation. A l'étape (f) du procédé ci-dessus, on obtient le coproduit d'extraction 25 du lysozyme, utile pour les procédés d'obtention (avantageusement d'extraction et de purification) de protéines basiques de blanc d'oeuf selon l'invention, ledit coproduit d'intérêt possédant avantageusement les caractéristiques suivantes : - une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm, 30 - une concentration d'avidine comprise entre 0,05 et 0,8 g/L (cette concentration en avidine dépend principalement du nombre de recyclages de la solution de saumure au niveau de l'étape (b) d'élution du lysozyme), - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1, (généralement entre 0,1 et 2), et - un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1 (généralement entre 2 et 25).

Procédé d'obtention d'une protéine basique provenant de blanc d'ceuf En utilisant ledit coproduit, qui est enrichi en particulier en avidine, comme matière première de départ, on peut obtenir (et avantageusement extraire et purifier) au moins une protéine basique de blanc d'oeuf par un procédé adapté, qui peut aussi être désigné procédé d'obtention (avantageusement de purification) d'une protéine basique de blanc d'oeuf , 1 o est détaillé ci-après dans la présente description. Les protéines basiques de blanc d'oeuf, qui sont obtenues en réalisant ledit procédé d'obtention d'une protéine basique de blanc d'oeuf décrit ci-après, peuvent être utilisées en tant que telles dans toutes applications industrielles appropriées. 15 Par obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf , on désigne principalement un procédé de purification, et encore principalement : (i) la séparation entre un mélange de lysozyme et d'avidine, et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ; (ii) la séparation entre l'avidine et les autres constituants protéiques dudit 20 coproduit d'intérêt ; (iii) la séparation entre le lysozyme et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ; et (iv) la séparation entre une protéine basique de blanc d'oeuf, autre que l'avidine ou le lysozyme, et les autres constituants protéiques dudit 25 coproduit d'intérêt. La purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf peut englober, outre la séparation entre la protéine basique d'intérêt et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt, également la séparation entre la protéine basique d'intérêt et des constituants non protéiques dudit 30 coproduit, tels que des sucres, des sels minéraux, des acides aminés, des vitamines, etc. La purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf est dite sélective parce qu'on récupère avantageusement (i) soit un mélange purifié d'une ou plusieurs protéines basiques de blanc d'oeuf d'intérêt, (ii) soit 35 une protéine basique de blanc d'oeuf d'intérêt sous forme purifiée. Dans la pratique, on récupère sélectivement de préférence soit l'avidine purifiée, soit le lysozyme purifié, soit un mélange purifié d'avidine et de lysozyme. Par obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf , on désigne encore notamment un procédé dit d'enrichissement pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf sous une forme enrichie. Ce procédé vise en particulier à modifier le ratio d'au moins une protéine basique d'intérêt contenue dans ledit coproduit d'intérêt, par rapport à ses autres constituants. Dans ce cas, on désigne principalement : (i) l'enrichissement en lysozyme et en avidine, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ; (ii) l'enrichissement en avidine, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ; (iii) l'enrichissement en une protéine basique de blanc d'oeuf, autre que l'avidine ou le lysozyme, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt. L'enrichissement en au moins une protéine basique de blanc d'oeuf permet en particulier de récupérer le coproduit enrichi en une ou plusieurs protéines basiques, en comparaison audit coproduit avant enrichissement.

Tout protocole adapté peut être utilisé à cet effet, selon des méthodes employées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement par précipitation et/ou filtration, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.

Pour l'obtention des protéines basiques de blanc d'oeuf, et en particulier pour l'extraction et la purification, le coproduit d'extraction du lysozyme est avantageusement utilisé sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée, pour obtenir un produit enrichi en protéines basiques d'intérêt.

Ce coproduit concentré et dessalé est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a) éventuelle débactérisation préalable du coproduit d'extraction du lysozyme, avantageusement par microfiltration, (b) ajustement du pH dudit coproduit, au moyen d'un acide minéral ou organique, (c) concentration du coproduit acidifié à l'étape (b), de préférence par filtration (par exemple par ultrafiltration, nanofiltration ou osmose inverse), jusqu'à obtenir un coproduit concentré contenant avantageusement au moins 1 g/L d'avidine, (d) déminéralisation/dessalage du coproduit concentré issu de l'étape (c), de façon à obtenir un coproduit concentré dont la teneur en sel est réduite à une conductivité préférentiellement inférieure à 50 mS/cm. A l'étape (b), le pH est ajusté à une valeur inférieure à 7,5, de préférence à une valeur allant de 7,5 à 2,5. 1 o Dans certains modes de réalisation, la valeur du pH est avantageusement ajustée à l'étape (b), de sorte à atteindre une valeur proche de la neutralité (de préférence encore entre 6,5 et 7,5), avant d'être concentré par l'étape de filtration (c). La demanderesse a par ailleurs montré que l'ajustement à pH acide du 15 coproduit d'extraction du lysozyme, à l'étape (b) du procédé, de préférence à une valeur de pH allant de 2,5 à 4,5 (avantageusement de l'ordre de 3), permet d'optimiser significativement l'efficacité de l'étape (c) de concentration en avidine dans le coproduit concentré, en particulier dans le cas d'une technique de filtration, et de préférence encore dans le cadre d'une 20 technique d'ultrafiltration ; et cela permet d'obtenir des niveaux de concentration élevés en avidine. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la valeur du pH est avantageusement ajustée à l'étape (b), à une valeur de pH allant de 2,5 à 4,5 (avantageusement de l'ordre de 3), avant d'être concentré par l'étape de 25 filtration (c). A l'étape (c) lorsque la concentration du coproduit acidifié est réalisée par ultrafiltration, la membrane d'ultrafiltration possède préférentiellement un seuil de coupure supérieur à 10 000 Da. La demanderesse a découvert qu'une membrane dont le seuil de coupure 30 est de 100 000 Da, permet d'augmenter d'un facteur 10 à 50 le ratio avidine/lysozyme de la fraction rétentat. Comme cela est décrit ci-après, l'ajustement du rapport avidine/lysozyme dépend avantageusement de la protéine d'intérêt à obtenir ensuite. L'étape (d) de déminéralisation/dessalage peut être effectuée par 35 toute technique connue de l'homme de l'art, par exemple par nanofiltration ou ultrafiltration avec diafiltration, en utilisant des membranes de nanofiltration ou ultrafiltration. L'étape (d) de déminéralisation/dessalage peut encore être effectuée par électrodialyse ou par passage sur une résine échangeuse d'ions.

De manière à optimiser les opérations suivantes d'extraction et de purification, le coproduit concentré et déminéralisé/dessalé qui est obtenu à l'étape (d) vérifie avantageusement les caractéristiques suivantes : - une conductivité inférieure à 50 mS/cm (et de préférence 2 à 15 mS/cm), - une concentration d'avidine supérieure à 1 g/L (et de préférence de 3 à g/L), - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales supérieur à 0,1 (et de préférence supérieur à 1), et - un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1 (et de préférence 15 supérieur à 2). La valeur de conductivité est mesurée préférentiellement à l'aide d'un conductimètre. La concentration en avidine est de préférence déterminée par la méthode colorimétrique au HABA (4-Hydroxyazobenzene-2-Carboxylic Acid) selon Green et al (Biochem J, 94: 23-24, 1965) modifiée par Durance et al (J Food Sci, 56(3): 707-709, 1991). L'avidine est détectée avantageusement soit par le test HABA, soit par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le lysozyme est par exemple détecté soit par HPLC en gel de filtration selon la méthode de Thapon et al (Sci Alim 2 : 251-260, 1982), soit par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. La concentration en lysozyme est déterminée par exemple par mesure de son activité lytique sur des cellules de Micrococcus lysodeikticus selon la méthode de Litwack (froc Soc Exp Biol & Med, 89 : 104, 1955) et Prockop et al (New Eng J Med, 240 : 269,1964). La concentration en protéines totales est déterminée, à titre d'exemple, par la méthode de Kjeldhal. Le rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales est calculé à partir des données analytiques décrites ci-dessus.

L'utilisation ultérieure du coproduit concentré et dessalé/déminéralisé obtenu à la fin de l'étape (d) dépend avantageusement de son ratio avidine/lysozyme. En pratique, les fractions dont le ratio massique avidine/lysozyme est élevé (c'est-à-dire de préférence supérieure à 5), seront privilégiées pour la purification et l'extraction ultérieure de l'avidine. A l'inverse, les fractions dont le ratio massique avidine/lysozyme est plus faible (c'est-à-dire avantageusement inférieur à 5), seront avantageusement utilisées en vue de l'exploitation ultérieure des propriétés 1 o du mélange enrichi en avidine / lysozyme. Le produit concentré et dessalé obtenu à la fin de l'étape (d) peut aussi être traité de manière à permettre sa conservation dans le temps. Le traitement de conservation, connu de l'homme du métier, peut être du type séchage, lyophilisation ou conditionnement et stabilisation par 15 réfrigération (température allant entre -5°C et +4°C) ou congélation (température inférieure à -5°C, mieux inférieure à -20°C, avantageusement inférieure à -80°C). La présente invention concerne aussi un procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, qui est particulièrement 20 adapté à l'utilisation du coproduit d'extraction de lysozyme décrit ci-dessus comme produit de départ, ledit coproduit d'extraction de lysozyme étant avantageusement sous forme concentrée et déminéralisée. La demanderesse a en particulier mis au point un procédé d'extraction d'une protéine basique provenant de blanc d'oeuf dans lequel on a recours à 25 une technique de chromatographie dite en mode frontal . Par chromatographie en mode frontal , on entend une méthode de séparation d'un composé d'intérêt par chromatographie selon laquelle : (i) on fournit un support de chromatographie conditionné dans une colonne comprenant (i) au moins un moyen d'alimentation en continu de ladite 30 colonne en solution de départ contenant ledit composé d'intérêt, destiné à être mis en contact avec ledit support de chromatographie et (ii) au moins un moyen d'évacuation du liquide ayant été mis en contact avec ledit support de chromatographie, (ii) on alimente ladite colonne de chromatographie avec un flux continu 35 d'une solution contenant un composé d'intérêt à extraire ou purifier, afin que ladite solution soit mise en contact en continu avec le support de chromatographie conditionné dans la colonne, la partie de ladite solution ayant été en contact avec le support de chromatographie étant évacué de la colonne également en continu, et l'alimentation de la colonne de chromatographie avec ladite solution étant poursuivie jusqu'à ce que les molécules dudit composé d'intérêt saturent ledit support de chromatographie et que ledit composé d'intérêt soit détecté dans le flux de sortie de la colonne. En d'autres termes, lorsqu'on réalise une étape de chromatographie en mode frontal , on poursuit l'alimentation de la colonne de chromatographie avec la solution contenant le composé d'intérêt à extraire ou purifier, jusqu'à dépasser la capacité de fixation dudit support pour ledit composé d'intérêt. Le support de chromatographie étant saturé et une fois qu'une molécule commence à être éluée du support, elle est présente continuellement dans la fraction exclue. Les molécules ayant peu ou pas d'affinité pour le support de chromatographie sont récupérées dans la fraction exclue avant les molécules ayant une plus grande aptitude à être retenues par le support de chromatographie.

La demanderesse a en particulier mis au point une méthode de chromatographie, en mode frontal, permettant d'atteindre des niveaux de pureté en avidine très élevés (avantageusement supérieurs à 99 %) en seulement deux étapes, et avec des rendements satisfaisants (avantageusement 30 à 60 % de l'avidine présente dans le coproduit concentré/déminéralisé, fonction en particulier de son ratio massique avidine/lysozyme : plus le ratio avidine/lysozyme est élevé, plus le rendement d'extraction est élevé). Le procédé d'extraction ou de purification d'une protéine basique provenant du blanc d'oeuf selon l'invention consiste en un procédé à trois étapes dans lequel on réalise deux étapes successives de chromatographie, ledit procédé d'extraction comprenant les étapes suivantes : (a) dans une première étape, charger un support chromatographique au-delà de ses capacités de fixation (ou d'adsorption) avec un flux continu de coproduit d'extraction de lysozyme décrit précédemment, de telle sorte que le lysozyme retenu sur ledit support empêche la rétention de l'avidine, ce qui permet d'obtenir une fraction exclue appauvrie, voir dépourvue, en lysozyme ( délysozymée ) et contenant une grande partie ou la totalité de l'avidine initialement présente dans le volume de coproduit mis en contact avec le support chromatographique, et (b) dans une seconde étape, charger un support chromatographique avec la fraction exclue délysozymée obtenue à l'étape (a), le cas échéant au-delà de la capacité de fixation (ou adsorption) dudit support chromatographique, de telle sorte que les sites de fixation (ou adsorption) soient occupés par l'avidine, (c) éluer l'avidine retenue sur le support chromatographique à l'étape (b). On a montré dans les exemples que le procédé d'extraction ci-dessus, qui a été mis au point par la demanderesse, permet l'obtention d'une avidine très pure, et avec un rendement important. Selon un mode préféré de réalisation du procédé d'extraction ou de purification d'une protéine basique de blanc d'oeuf de l'invention, les étapes suivantes peuvent être mises en oeuvre : (a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec le coproduit d'extraction de lysozyme sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la partie de la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme, (b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite partie de fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation (le cas échéant tous ses sites) soient occupés par l'avidine, (c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b). Le support chromatographique échangeur de cations utilisé à l'étape (a) et à l'étape (b) est choisi parmi un support chromatographique échangeur de cations du type faible ou un support chromatographique échangeur de cations du type fort. Selon un mode de réalisation préféré, on effectue l'étape d'échange cationique sur un support chromatographique constitué d'un gel rigide, ou semi-rigide, à base de polymères hydrophiles, tels qu'un gel agarose éventuellement réticulé, un gel de polymère vinylique hydrophile, ou un gel de silice enrobée avec un polymère hydrophile, ou un support polystyrène divinyl benzène, sur lequel polymère hydrophile sont greffés des groupements conférant audit polymère et audit gel des propriétés d'échangeur de cations. Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le greffage du(des) polymère(s), on peut citer (i) les groupements carboxyméthyl du type CM-polyoside pour un revêtement échangeur de cations faible, et (ii) les groupements sulfonate ou méthyl sulfonate (S) ou 1 o sulfopropyl (SP) du type SP-polyoside pour un revêtement échangeur de cations fort, qui est apte à adsorber des molécules faiblement ionisées. Par exemple, le support chromatographique échangeur de cations est sélectionné parmi le groupe suivant : S Hyper DF, S Ceramic Hyper DF, SP Spherodex LS, Streamline SPXL, CM Hyper DF, CM Sepharose, Biorex 70, 15 Duolite C464, Amberlite IRC 50, CG-50, DP-1, IRC-72 et 64, Rexyn 102, Merck IV, Zeocarb 226, Diaion WK 10 et WK 11, IMAC Z-5, CP-3050, et Wofafit CP300. Selon un mode préférentiel de réalisation, le support de chromatographie échangeur de cations utilisé à l'étape (a) est identique à 20 celui utilisé à l'étape (b) ; il suffit par exemple de régénérer le support entre les étapes (a) et (b). De façon préférentielle, préalablement à l'étape (a), le coproduit concentré et dessalé est ajusté, d'une part, à une valeur de conductivité comprise entre 5 et 60 mS/cm, de préférence entre 5 et 10 mS/cm, et d'autre 25 part, à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence encore de l'ordre de 8,5. Cette opération permet de maximiser la capacité de fixation du support et de privilégier l'adsorption des protéines basiques, et notamment le lysozyme, et d'exclure les autres protéines contenues dans le coproduit concentré et dessalé. 30 De préférence, le support de chromatographie est équilibré à des valeurs de conductivité et de pH identiques, ou au moins proches, aux valeurs de conductivité et de pH du produit appliqué. A la suite de cette étape d'ajustement de la conductivité et du pH, le coproduit concentré et dessalé est avantageusement soumis à une étape de 35 décantation, centrifugation ou filtration, afin d'éliminer les éventuels constituants insolubles pouvant gêner les étapes de chromatographie suivantes. L'avidine et/ou le lysozyme sont détectés et/ou quantifiés dans le fluide de sortie de chromatographie.

Cette opération peut être mise en oeuvre par toute technique connue de l'homme du métier, et citée précédemment. Au cours du premier passage selon l'étape (a), l'avidine et le lysozyme sont détectés et/ou quantifiés dans le fluide de sortie de chromatographie (selon par exemple une technique décrite ci-dessus, directement ou dans 1 o une fraction exclue), de sorte à récupérer exclusivement la fraction exclue contenant l'avidine (et éventuellement d'autres protéines basiques de blanc d'oeuf) et dépourvue de lysozyme (tenant compte de la sensibilité du test de détection / quantification). De préférence, les fractions exclues récupérées sont celles ne 15 contenant aucune trace de lysozyme détectable. Ces fractions exclues récupérées sont regroupées pour former la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme. Selon d'autres modes de réalisation préférentiels de réalisation du procédé d'extraction, préalablement à l'étape (b), la fraction exclue et 20 collectée à la fin de l'étape (a), qui est enrichie en avidine, est ajustée à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence de l'ordre de 8,5. Cette opération permet de maximiser la capacité de fixation du support et de privilégier l'adsorption de l'avidine, et de favoriser l'exclusion des autres protéines contenues dans le milieu. 25 Préférentiellement, préalablement à l'étape (b) dudit procédé, le support de chromatographie est équilibré à des valeurs de conductivité et de pH identiques, ou au moins proches, de celles du produit appliqué. Au cours de l'étape (b), l'avidine est avantageusement détectée et/ou quantifiée dans le fluide de sortie de chromatographie (directement ou dans 30 une fraction exclue), de sorte à interrompre ou arrêter le passage dès qu'une certaine concentration d'avidine est détectée (correspondant à la saturation des sites de fixation du support de chromatographie par l'avidine). De préférence encore, on procède à l'arrêt du passage de la fraction exclue à l'étape (b), lorsque de l'avidine est détectée en sortie de colonne 35 chromatographique.

Avant l'étape (c) d'élution et de collecte de la fraction d'éluat comprenant l'avidine purifiée, le support de chromatographie peut être rincé, par exemple au moyen d'eau ou d'un tampon (par exemple un tampon acétate).

L'étape (c) d'élution et de collecte de la fraction d'éluat comprenant l'avidine purifiée est mise en oeuvre selon une technique connue de l'homme du métier, avantageusement en augmentant le pH vers des valeurs proches de 10 avec un tampon glycine-NaOH ou carbonate-bicarbonate par exemple, ou en augmentant la force ionique du tampon d'élution avec une solution 1 o saline (par exemple 0,5 M en NaCI). Lorsque l'étape (c) d'élution est réalisée par augmentation de la force ionique, la solution utilisée consiste avantageusement en une solution d'élution contenant au moins un contre-ion choisi parmi les cations monovalents suivants Na ou NH4, et/ou les cations bivalents suivants Mg ou 15 Ca. Par exemple, la solution utilisée pour l'élution peut consister en une solution à 0,5 M d'un sel de NaCl ou KCI. L'utilisation du coproduit d'extraction du lysozyme identifié par la demanderesse (et décrit avec son procédé d'obtention précédemment dans 20 la présente description), comme matière première de départ dans le présent procédé d'extraction en mode frontal selon la présente invention, s'avère en pratique d'un très grand intérêt industriel, du fait qu'il permet l'obtention d'une grande quantité d'avidine, de haute pureté (avantageusement supérieure à 99 % de pureté, selon une technique de chromatographie de gel filtration). Le 25 rendement global du procédé d'extraction d'avidine ci-dessus et la perte matière ne constituent pas un aspect critique du procédé, puisque le coproduit d'extraction du lysozyme qui est employé comme matière première de départ était dépourvu, jusqu'à la présente invention, de valeur marchande. 30 Plus généralement, la conduite de l'étape (a) de chromatographie en mode frontal , et le cas échéant aussi de l'étape (b), permet également d'éviter les problèmes de changement d'échelle qui sont classiquement rencontrés pour les procédés chromatographiques, puisqu'il n'y a pas ici de gradient d'élution qu'il serait nécessaire d'optimiser. On peut donc très 35 simplement passer d'un support chromatographique de quelques millilitres, à un support chromatographique de plusieurs litres, selon les quantités d'avidine à purifier, sans adaptation ou modification substantielle des caractéristiques générales du procédé. La réalisation de l'étape (a), et le cas échéant aussi de l'étape (b), selon une technique de chromatographie en mode frontal , permet également de travailler avec des volumes réduits de support de chromatographie. A titre indicatif, on peut obtenir jusqu'à environ 25 à 30 g d'avidine purifiée, en utilisant un litre de support de chromatographie. On ajoute que le procédé chromatographique frontal en deux étapes 1 o peut également être mis en oeuvre pour extraire et purifier le lysozyme résiduel contenu dans le coproduit d'extraction du lysozyme concentré et dessalé. Pour purifier le lysozyme résiduel, on met en oeuvre un procédé comprenant les étapes suivantes : 15 (a) chargement d'un support de chromatographie échangeur de cations avec un coproduit d'extraction de lysozyme sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de 20 lysozyme, (b) lavage du support de chromatographie sur lequel est retenu le lysozyme, avec une solution de lavage appropriée, telle qu'un tampon de phosphate de sodium 20 mM à pH 8,5, (c) élution du lysozyme retenu sur le support de chromatographie au 25 moyen d'une solution d'élution adaptée, par exemple par modification du pH (par exemple par fixation du pH à une valeur comprise entre 10 et 11) ou modification de la force ionique (par exemple au moyen d'une solution de NaCl 1M), et (d) collecte de la fraction d'éluat contenant le lysozyme purifié, retenu sur 30 ledit support au cours du premier passage selon l'étape (a) du coproduit d'extraction du lysozyme concentré et dessalé. Plus généralement, ce procédé de chromatographie frontal en deux étapes peut être mis en oeuvre à partir de toute autre solution contenant un mélange d'avidine et de lysozyme, à savoir en particulier du blanc d'oeuf ou tout autre produit dérivé de blanc d'oeuf. Cette solution contient avantageusement un rapport avidine/lysozyme supérieur à 1,5. On englobe aussi comme produit de départ du procédé d'extraction d'avidine selon l'invention toute solution d'origine recombinante issue d'un système bactérien ou eucaryote.

EXEMPLES

1 o Exemple 1 : procédé de concentration et de déminéralisation d'un coproduit d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf Matériau de départ 129,8 kg d'un coproduit d'extraction de lysozyme fourni par la société OVONOR (62232 ANNEZIN, France), présentant les caractéristiques 15 suivantes : - une conductivité de l'ordre de 67 mS/cm, - une concentration d'avidine de 0,296 g/L, - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 0,1, 20 - un rapport massique avidine/lysozyme de l'ordre de 2, - une valeur de pH de l'ordre de 10. Ce coproduit a été obtenu par la succession d'étapes suivantes : - ajustement d'un blanc d'oeuf de poule à une valeur de pH de 8,5, - passage de ce blanc d'oeuf de poule acidifié sur un support de 25 chromatographie d'échange de cations Purolite C106 EP (support acrylique greffé au divinyl benzène et aux groupements fonctionnels COOH), en batch, - rinçage du support chromatographique avec de l'eau déminéralisée, - élution au moyen d'une solution de NaCl à 5%, - cristallisation du lysozyme contenu dans la solution d'élution, au moyen 30 d'une solution de NaOH avec ajustement du pH à une valeur de 10, - filtration de la solution saline de lysozyme cristallisé sur un filtre presse, utilisant une membrane de microfiltration. 35 Concentration et déminéralisation du matériau de départ Le coproduit obtenu est tout d'abord acidifié au moyen d'une solution d'acide chlorhydrique 5 M, jusqu'à ajuster son pH à une valeur de l'ordre de 3,15.

Le coproduit acidifié est ensuite concentré par ultrafiltration, au moyen d'une membrane dont le seuil de coupure est de 10 kDa ( Molecular Weight Cut Off ou MWCO 10 kDa), et la surface est de 2,5 m2. Cette opération d'ultrafiltration est effectuée avec un débit de rétentat de 965 L/h, une pression d'entrée de 1,85 bar et un débit moyen de perméat de 20 1 o L/h. Le coproduit acidifié et concentré est ensuite soumis à une opération de diafiltration sur membrane d'ultrafiltration, avec un débit moyen de perméat de l'ordre de 40 L/h. Le rétentat obtenu, enrichi en protéines basiques, présente un poids 15 de 11,84 kg, et comporte les caractéristiques suivantes : - une conductivité de 7,5 mS/cm, - une concentration en avidine de 3,24 g/L, - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 0,1, et 20 - un rapport massique avidine/lysozyme, de l'ordre de 2.

Exemple 2 : Extraction de l'avidine à partir du coproduit concentré et déminéralisé d'extraction du lysozyme Matériau de départ 25 Le coproduit d'extraction utilisé présente les caractéristiques suivantes : - un pH initial de 6,55 - une conductivité de 2,54 mS/cm, - une concentration d'avidine de 7,48 g/L, 30 - un ratio avidine /lysozyme de 3, - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 1.

Procédé d'extraction et de purification de l'avidine La première chromatographie a été réalisée sur 200 mL d'une colonne 35 de résine S Ceramic Hyper DF équilibré à pH 8,43.

Un volume de 2009 mL de coproduit concentré et dessalé (soit 15,02 g d'avidine) est chargé sur cette colonne de chromatographie. Les résultats des dosages en avidine et lysozyme sur les fractions exclues, en sortie de colonne, sont représentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Concentration d'avidine et détection du lysozyme, dans la fraction exclue Volume des Fractions Concentration Absence (-) ou fractions sortie colonne en avidine présence (+) de regroupées (mg/L) lysozyme détectée par gel filtration F5 28 - Fractions 1 à 35 F10 93 - (1075 mL) F15 1881 - conservée en vue F20 5869 - de la 2ème étape F25 7375 - chromatographique F30 9267 - F35 9577 - F40 8792 + F45 8475 + Fractions 40 à 85 F50 8005 + (1510 mL) F55 7060 + non conservée en F60 8162 + vue de la 2ème F65 7375 + étape F70 1461 + chromatographique F75 1098 + F80 704 + F85 555 + io En sortie de support, un volume de 1075 mL de la fraction exclue est récupéré, contenant les protéines du coproduit concentré-dessalé, notamment l'avidine, à l'exception du lysozyme.5 Cette fraction exclue contient 4,38 g/L d'avidine, soit 4,71 g d'avidine au total. Le rendement d'extraction en avidine de cette première chromatographie est de 32 %. Cette fraction enrichie en avidine est ensuite encore chargée sur 200 mL de résine S Ceramic Hyper DF, équilibrée maintenant à pH 8. Après le chargement du support, la résine est rincée avec un tampon acétate 20 mM de pH 5. L'avidine retenue sur le support de chromatographie est ensuite éluée au moyen d'une solution de NaCl 0,5 M.

Le volume de la fraction éluée enrichie en avidine est de 473 mL. Sa concentration d'avidine est de 9,1 g/L, soit 4,31 g d'avidine au total. Le rendement de cette deuxième chromatographie est de 91,6 %. Le rendement global d'extraction du procédé est de 28,7 %.

Evaluation du degré de pureté de l'avidine Le degré de pureté de l'avidine extraite est évalué par gel filtration HPLC (Colonne TSK SW XL G3000, tampon phosphate 50 mM + 200 mM de NaCl, pH 7, débit 0,7 mL/min, détection 280 nm). Le degré de pureté mesuré est de 100 % (figure 1).

La pureté de l'avidine ainsi produite est également estimée par électrophorèse sur gel polyacrylamide en présence de SDS. On observe alors une unique bande (figure 2, piste 3).

Claims (1)

1. REVENDICATIONS1.- Utilisation d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.

   2.- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit coproduit est obtenu par la succession d'étapes suivantes : (a) passage du blanc d'oeuf sur un support de chromatographie échangeur 1 o de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'oeuf contenant le lysozyme, (b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure, 15 (c) récupération de l'éluat enrichie en lysozyme, issu de l'étape (b), (d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c), (e) filtration dudit éluat pour purifier dans le rétentat le lysozyme cristallisé, et (f) récupération du filtrat issu de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt. 20

   3.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit coproduit possède les caractéristiques suivantes : - une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm, - une concentration en avidine comprise entre 0,05 et 0,8g/L, 25 - un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et - un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.

   4.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le coproduit est utilisé sous une forme concentrée et 30 dessalée/déminéralisée.

   5.- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le coproduit concentré et déminéralisé vérifie les caractéristiques suivantes : - une conductivité inférieure à 50 mS/cm,- une concentration en avidine supérieure à 1 g/L, - un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et - un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.

   6.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le coproduit est utilisé pour l'obtention d'avidine purifiée.

   7.- Procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.

   8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, préalablement à l'opération d'extraction et de purification de la protéine basique d'intérêt, ledit coproduit est soumis à une opération de préparation comprenant une étape de concentration et une étape de dessalage/déminéralisation.

   9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape de concentration est réalisée par ultrafiltration, et en ce que, préalablement à ladite étape de concentration, ledit coproduit est acidifié afin d'ajuster son pH à une valeur inférieure à 7,5, de préférence à une valeur allant de 7,5 à 2,5.

   10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'opération d'extraction et de purification permet la purification d'avidine.

   11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite opération d'extraction et de purification de l'avidine comprend les étapes suivantes : (a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ledit coproduit sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixationde sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme, (b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine, (c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).

   12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le 1 o support de chromatographie échangeur de cations utilisé à l'étape (a) est identique à celui utilisé à l'étape (b).

   13.- Composition pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, caractérisée en ce qu'elle consiste en un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme, sous une forme concentrée et dessalée, 15 lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.

   14.- Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle 20 vérifie les caractéristiques suivantes : - une conductivité inférieure à 50 mS/cm, - une concentration en avidine supérieure à 1g/L, - un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et 25 - un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.

   15.- Procédé pour la purification d'avidine, comprenant une opération d'extraction et de purification de l'avidine à partir d'une composition contenant de l'avidine et du lysozyme, laquelle opération d'extraction et de purification de l'avidine comprend les étapes suivantes : 30 (a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite composition, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme,(b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine, (c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).