DK149201B - Fremgangsmaade til rensning af insulin, dets analoge og derivater - Google Patents

Description

149201

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til rensning af insulin, dets analoge og derivater af den i indledningen til kravet angivne art.

Det er allerede kendt, at peptider med samme eller lignende molekylvægt, der adskiller sig fra hinanden ved deres basicitet eller aciditet, kan skilles på ionbyttere.

Denne metode svigter imidlertid, når de forskellige peptider danner komplekser med hverandre, som fremkommer ved ionbytter-chromatografien. Til undgåelse af disse vanskeligheder har man i elueringsmidlet måttet vælge dissocierende betingelser.

Hidtil har man til dette formål i de til elueringen anvendte puffere opløst f.eks. enten urinstof eller urinstofderivater i høje koncentrationer (5 M - 9 M), eller man har arbejdet i med vand blandbare organiske opløsningsmidler. Således er 2 149201 f.eks. insulin blevet chromatograferet på ionbytteren Amberlite IRC 50 i phosphatpuffer med 5 M - 8 M urinstof (R.D. Cole, J. Biol. Chem., 235, 2294 (1960)). Fra GB-patentskrift nr.

881.855 er anvendelsen af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. ethanol, kendt. Ekstreme pH-værdier, der ligeledes virker dissocierende, er på grund af peptidernes følsomhed overfor sådanne betingelser ikke anvendelige. De hidtil kendte metoder har imidlertid forskellige ulemper. Isoleringen af stofferne fra urinstofholdige puffere er således besværlig og tidskrævende. Endvidere kan der i urinstoffet være indeholdt forureninger, som reagerer med peptider såsom insulin. Ved anvendelsen af ethanol som organisk opløsningsmiddel volder genanvendeligheden af ionbytteren vanskeligheder, og desuden er ionbytterchromatografien forbundet med et stort tab af peptid, f.eks. insulin. Endelig er der risiko for denaturering af de højeremolekylære peptider i organiske opløsningsmidler, således som det er kendt i forbindelse med insulin i 60%'s alkohol ved en pH-værdi på 7.

Det har nu ifølge opfindelsen overraskende vist sig, at disse vanskeligheder ved en fremgangsmåde til rensning af insulin, dets analoge og derivater ved ionbytterchromatografi i vandige, pufrede opløsningsmidler kan undgås, når der chromatograferes i opløsningsmidler, som indeholder ikke-ioniske detergenter og en elektrolyt, ved 0-50°C og pH-værdier fra 5,5 til 10 på en basisk ionbytter.

Genanvendeligheden af ionbytterne bereder ingen vanskeligheder. En denaturering af insulinerne kan ikke iagttages, og isoleringen er enkel og sker ved fældning af insulinerne med egnede fældningsmidler og eventuelt påfølgende krystallisation. Udbytterne er tydeligt højere end ved anvendelsen af organiske opløsningsmidler som dissocierende midler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes i forbindelse med insuliner af alle arter, også humaninsulin, insulinanaloge, f.eks. des-phe-Bl-insulin, og insulinderivater, f.eks. insulin-B-kædesulfonat.

Disse forbindelser kan anvendes såvel i forholdsvis uren tilstand som på for-renset form, f.eks. ved gelchromatografi.

Insulin er efter flere ganges krystallisation og også efter gel- 3 149201 chromatografi endnu forurenet med insulin-lignende ledsages toffer med meget nær samme molekylvægt, som ved passene valgt pH-værdi ved deres ladningstilstand adskiller sig fra hverandre og fra insulin, men danner komplekser med insulin.

Eksempler på sådanne stoffer er desamidoinsuliner, arginin- og diarginininsulin og insulinethylester. De kan hverken ved gel-chromatografi eller ved ionbytterchromatografi i ikke-disssocie-rende virkende elueringsmidler skilles fra insulin.

Egnede ionbytteretil rensning af de ovennævnte forbindelser er f.eks. Dowex®l, QAE-Sephadex ® , Biogel® DM, DEAE-Sephadex ® , Amberlyst ®A 21 og A 29, DEAE-Sepharose ® CL-6B og DEAE-Cellulose. Særligt godt egner sig til rensningen af insulin, insulinanaloge og insulinderivater basiske ionbyttere på dextranbasis, f.eks. DEAE-Sephadex ® eller QAE-Sephadex®.

Ionbytningsprocessen udføres i et pufret, vandigt opløsningsmiddel, i hvilket ikke-ioniske detergenter er opløst.

Som sådanne kan f.eks. nævnes palmitylsorbitanpoly-ethylenglycolether, stearylsorbitanpolyethylenglycolether, oleylsorbitanpolyethylenglycolether, nonylphenolglycolether (10-30 mol ethylenoxid pr. mol nonylphenyl), polymerisationsprodukter af propylenoxid og ethylenoxid (10-80% ethylenoxidan-del), fedtalkoholpolyglycolethere og polyglycolethere af syntetiske fedtalkoholer.

Af særlig fordel er fedtalkoholpolyglycolethere, da de er godt virksomme, er lette at håndtere og ikke udviser nogen UV--absorption i absorptionsområdet for aromatiske peptider, hvilket letter erkendelsen af peptiderne i eluatet. Desuden er disse forbindelser biologisk fuldstændigt nedbrydelige, hvilket gør deres anvendelse problemfri med henblik på miljøbelastningen.

Elueringsmidlerne indeholder altid et pufferstof til regulering af elueringsmidlets pH-værdi. Der arbejdes fortrinsvis ved en konstant pH-værdi, og fortrinsvis ved pH-værdier mellem 6 og 9.

Egnede pufferstoffer er kendt fra litteraturen. Temperaturen ved ionbytterchromatografien skal holdes konstant og ligger mellem 0 og 50°C, fortrinsvis mellem 15 og 30°C. De til elueringen anvendte opløsninger indeholder foruden pufferstofferne og detergenterne også en elektrolyt, fortrinsvis et neutralsalt såsom NaCl i koncentrationer mellem 0,01 M og 0,5 M, fortrinsvis mellem 0,05 M og 0,3 M, eller man eluerer med en elektrolytgradient 4 149201 ved kontinuerlig tilblanding af en elektrolytholdig puffer til eluejringspufferen uden elektrolyt, der ellers har samme sammensætning, på den måde, at koncentrationen af den anvendte elektrolyt stiger i afhængighed af elueringsrumfanget og fortrinsvis i lineær afhængighed. Slutkoncentrationen af elektrolyt ligger mellem 0,1 M og 1 M, fortrinsvis mellem 0,3 M og 0,8 M.

Den her omhandlede rensning af insuliner illustreres nærmere i de følgende udførelseseksempler. I eksemplerne sker renhedskontrollen af udgangsmaterialet samt af insulinerne efter rensningen ved hjælp af polyacrylamidgel-elektroforese og/eller ved højtryksvæskechromatografi.

Eksemgel_l

Der fremstilles en puffer med følgende sammensætning: 0,1 M tris-Oiydroxymethyl)-aminomethan og 1% GenapolSE 150 (fedtalkoholpolyglycolether). pH-Værdien indstilles med HC1 på 7,0.

Til en del af den ovennævnte puffer sættes der 0,5 mol NaCl pr. liter. 450 g DEAE-SephadejPA 25 opkvældes i den ovennævnte puffer, og suspensionen fyldes derpå i en søjle med 5 cm diameter og en længde på 100 cm. Søjlen bringes i ligevægt med pufferen.

5 g Insulin, der er krystalliseret fra citratpuffer, opløses i 75 ml af den ovennævnte puffer (uden NaCl). pH-Slutværdien er 8,3. Den klare opløsning tilføres søjlen, og der elueres ved 25°C med en hastighed på 320 ml pr. time med den ovennævnte puffer (pH 7,0), hvorved der anlægges en lineær NaCl-gradient på den måde, at NaCl-kon-centrationen i eluatet ved gennemløb af 5,5 liter puffer stiger fra 0 til 0,33 M. Der opsamles fraktioner på 22 ml. I eluatet måles UV-ekstinktionen kontinuerligt ved 278 nm og optegnes. Den centrale del af insulin-toppen (fra 0,1 M til 0,24 M NaCl) (1540 ml) opsamles, og der tilsættes 70 ml 1%'s ZnCl2-opløsning. Det amorft udfældede insulin skilles fra ved centrifugering og krystalliseres derpå på i og for sig kendt måde fra en acetoneholdig citratpuffer.

Udbyttet af rent insulin andrager 3,76g(75,2%).

5 149201

Eksemgel_2

Der fremstilles en puffer med følgende sammensætning: 0,1 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,12 M NaCl og 1% Genapol ® ZDM 110 (polyglycolether af ligekædede, syntetiske fedtalkoholer, gennemsnitlig molekylvægt 190, med 11 mol ethylenoxid pr. mol fedtalkohol .

pH-Værdien indstilles på 7,0 med HCl.

13 g QAE-Sephadex^A 25 opkvældes i den nævnte puffer, og suspensionen fyldes i en søjle med diameter 1,5 cm og længde 30 cm.

Søjlen bringes i ligevægt med pufferen. 300 mg insulin, der efter krystallisationen yderligere ved gelchromatografi på Sephadex G 50 på i og for sig kendt måde er blevet befriet for højeremolekylære bestanddele i vidt omfang, opløses i 15 ml af den nævnte puffer (pH-slut-værdi 8,2). Den klare opløsning hældes på søjlen og elueres ved 25°C med en hastighed på 48 ml pr. time med den nævnte puffer (pH 7). Der opsamles fraktioner på 7 ml. I eluatet måles og optegnes UV-ekstink-tionen ved 278 nm kontinuerligt. Den centrale del af insulin-toppen (620 ml) opsamles, og der tilsættes 28 ml 1%'s ZnC^-opløsning. Det amorft udfældede insulin skilles fra ved centrifugering og krystalliseres derpå på i og for sig kendt måde fra en acetoneholdig citratpuffer. Udbyttet af rent insulin andrager 185 mg (61,6%).

Eksempel_3

Der fremstilles en puffer med følgende sammensætning: 0,1 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan og 2% Genapol® SE 150 (jf. eksempel 1).

pH-værdien indstilles på 7,0 med HCl.

Dele af denne puffer tilføres NaCl i mængder på 0,05 mol pr. liter, 0,1 mol pr. liter,^,2 mol pr. liter og 0,3 mol pr. liter.

450 g DEAE-Sephadex A 25 opkvældes i den nævnte puffer med 0,05 M NaCl, og suspensionen fyldes derpå på en søjle med diameter 5 cm og længde 100 cm. Søjlen bringes i ligevægt med pufferen.

5 g Insulin,jfr. eksempel 2, opløses i 100 ml af den nævnte puffer (0,05 M NaCl) (pH-slutværdi 8,4), hældes på søjlen, og der elueres ved 25°C méd en hastighed på 290 ml pr. time. Der opsamles 6 149201 fraktioner på 28 ml. Efter gennemløb af 1,82 liter af pufferen med 0,05 M NaCl elueres der med 4,76 liter puffer med 0,1 M NaCl, 2,24 liter med 0,2 M NaCl og endelig 5,3 liter med 0,3 M NaCl.

Eluatets UV-ekstinktion måles kontinuerligt og optegnes.

Hovedmængden af insulinet elueres her efter tilsætning af pufferen med 0,3 M NaCl. Den centrale del af insulin-toppen opsamles (820 ml), og der tilsættes 37 ml 1%'s ZnCl2-opløsning. Den amorfe fældning skilles fra ved centrifugering,og insulinet krystalliseres derpå på i og for sig kendt måde fra en acetoneholdig cetratpuffer.

Udbyttet af rent insulin andrager 2,84 g (56,8%).

Eksempel_4

Der fremstilles en puffer med følgende sammensætning: 0,1 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan og 5% Genapol® SE 100 (fedtalkoholpolyglycolether).

pH-Værdien indstilles med HC1. på 7,0.

En del af denne puffer tilføjes 0,5 mol NaCl pr. liter.

13 g DEAE-Sephadex0 A 25 opkvældes i den nævnte puffer .(uden NaCl), og suspensionen fyldes derpå i en søjle med diameter 1,5 cm og længde 30 cm. Søjlen bringes i ligevægt med pufferen.

300 mg insulin, jfr. eksempel 2, opløses i 15 ml af den nævnte puffer (uden NaCl) (pH-slutværdi 8,3). Den klare opløsning hældes på søjlen, og der elueres ved 25°C med en hastighed på 48 ml pr. time, hvorved der anlægges en lineær NaCl-gradient på den måde, at NaCl-koncentra-tionen i eluatet ved gennemløb af 500 ml puffer stiger fra O til 0,5 M. Der opsamles fraktioner på 7 ml. I eluatet måles og optegnes, kontinuerligt UV-ekstinktionen ved 278 nm. Den centrale del af insulin-toppen (fra 0,09 M til 0,22 M NaCl) (100 ml) opsamles, og der tilsættes 4,6 ml 1%'s ZnCl2-opløsning. Det amorft udfældede insulin skilles fra ved centrifugering og krystalliseres derpå på i og for sig kendt måde fra en acetoneholdig citratpuffer.

Udbyttet af rent insulin andrager 160 mg (53,3%).

Eksempel-5

Der gås frem som i eksempel 4, men blot under anvendelse af 1% Arkopal ™ N 100 (nonylphenolpolyglycolether med 10 mol ethylenoxid pr. mol nonylphenol) som detergent.

149201 " 7

Den kontinuerlige UV-måling må på grund af egenabsorptionen for Arkopal'S'N 100 udføres som differensmåling.

Udbyttet af rent insulin andrager 214 mg (71f3%).

_Eksempel_6__

Der gås frem som i eksempel 4, men blot under anvendelse af 2% Arkopal^ N 300 (nonylphenolpolyglycolether med 30 mol ethylenoxid pr. mol nony^phenol) som detergent og under anvendelse af QAE-Sephadex^ A 25 som ionbytter. Udbyttet af rent insulin andrager 156 mg (52%).

Den kontinuerlige UV-måling må på grund af egenabsorptionen af Arkopal N 300 gennemføres som differensmåling.

De i eksemplerne anvendte detergenter er handelsprodukter fra firma Hoechst AG.

De i eksemplerne anvendte ionbyttere er handelsprodukter fra firma Pharmacia Fine Chemicals.