DE2629568B2 - Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten - Google Patents

Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an Ionenaustauschern das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Chromatographie an basischen Ionenaustauschern mit gepufferten Lösungsmitteln durchführt, in denen nichtionische Detergentien gelöst sind
Es ist bereits bekannt, daß Peptide gleichen oder ähnlichen Molekulargewichts, die sick in ihrer Basizität oder Azidität unterscheiden, an Ionenaustauschern getrennt werden können. Diese Methode versagt jedoch, wenn die unterschiedlichen Peptide miteinander Komplexe bilden, die während der Ionenaustauscherchromatographie erhalten bleiben. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, hat man im Elutionsmittel dissoziierende Bedingungen zu wählen. Bisher hat man zu(r>esem Zweck in den zur Elution verwandten Puffern z. B. entweder Harnstoff oder Harnstoffderivate in hohen Konzentrationen (5 M—9 M) aufgelöst oder man hat in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln gearbeitet So wurde z.B. Insulin an dem Ionenaustauscher Amberlite* IRC in Phosphatpuffer mit 5 M -8 M Harnstoff Chromatographien (R. D. CoIe, J. BioL Chem. 235,2294 [I960]). Aus der GB-PS 8 81 855 und auch aus Diabetes 21, Suppl. 2 (1972), S. 649 - 656 ist die Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äthanol, bekannt Extreme pH-Werte, die ebenfalls dissoziierend wirken, sind wegen der Empfindlichkeit der Peptide gegen solche Bedingungen nicht anwendbar. Die bisher bekannten Verfahren hatten aber verschiedene Nachteile. So ist die Isolierung der Substanzen aus harnstoffhaltigen Puffern schwierig und zeitraubend; ferner können im Harnstoff Verunreinigungen enthalten sein, die mit Peptiden wie Insulin reagieren. Bei der Verwendung von Äthanol als organisches Lösungsmittel bereitet die Wiederverwendbarkeit des Ionenaustauschers Schwierigkeiten, zum anderen ist die lonenaustauscherchromatographie mit einem hohen Verlust an Peptid, z. B. Insulin verbunden. Schließlich besteht die Gefahr des Denaturieren« der höhermolekularen Peptide in organischen Lösungsmitteln wie das für Insulin in 60%igem Alkohol bei pH 7 bekannt ist
Überraschenderweise wurden nun gefunden, daß diese Schwierigkeiten durch die Verwendung von nichtionischen Detergentien zur Dissoziation der Peptide umgangen werden können.
Die Wiederverwendbarkeit der Austauscher bereitet keine Schwierigkeiten. Eine Denaturierung der Peptide ist nicht zu beobachten, die Isolierung ist einfach und erfolgt durch Fällung der Peptide mit geeigneten Fällungsmitteln und eventueller anschließender Kristallisation, Die Ausbeuten sind deutlich größer als bei der Verwendung von organischen Lösungsmitteln als dissoziierendes Agens,
Das erfindiragsgemlße Verfahren bezieht sich auf Insuline aller Spezies, auch Humaninsulin, Insulinanaloge z.B. Des-Phe-Bl-Insulin und Insulinderivate z.B. Insulin-B-Kettensulfonat
Diese Verbindungen können sowohl in verhältnismäßig unreinem Zustand als auch in vorgereinigter Form
ίο (z.B. durch Gelchromatographie) eingesetzt werden. Insulin ist nach mehrfacher Kristallisation und auch nach Gelchromatographie noch mit Insulin-ähnlichen Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichtes verunreinigt, die sich bei passend gewähltem pH in ihrem
is Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden, aber mit Insulin Komplexe bilden. Beispiele solcher Substanzen sind: Desamidoinsuli&e. Arginin- und Diarginininsulin, Insulin-äthylester. Sie sind weder durch Gelchromatographie, noch durch Ionenaustauscherchromatographie in nicht dissoziierend wirkenden Elutionsmittein von Insulin abtrennbar.
Geeignete Ionenaustauscher für die Reinigung von Insulin und Insulinanalogen sind die Handelsprodukte Dowex 1, QAE-Sephadex, Biogel DM, DEAE-Sephadex, Amberlyst A 21 und A 29, DEAE-Sepharose CL 6B, DEAE-Cellulose. Besonders gut eignen sich für die Reinigung von Insulin, Insulinanalogen und Insulinderivaten basische Ionenaustauscher auf Dextranbasis wie DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex.
Der Ionenaustauscherprozeß wird in einem gepufferten, wäßrigen Lösungsmittel durchgeführt, in dem nichtionische Detergentien aufgelöst sind
Als solche seien beispielsweise genannt:
Palmitylsorbitanpolyäthytenglykoläther,
Stearylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Oleylsorbitani_dyäthylenglykoläther,
NonylphenolpoIyglykoläKher
(10-30 MOL Athylenoxid/Mol Nonylphenol),
Polymerisationsprodukte aus Propylenoxid und
Äthylenoxid (10-80% Äthylenoxidanteil),
Fettalkoholpolyglykoläther und Polyglykol-
äther von synthetischen Fettalkoholen.
Von besonderem Vorteil sind Fettalkoholpolyglykol-
äther, da sie gut wirksam sind, leicht zu handhaben sind und keine UV-Absorption im Bereich der Absorption von aromatische Gruppen enthaltenden Peptiden zeigen, was die Erkennung der Peptide im Eluat erleichtert. Außerdem sind diese Verbindungen biologisch voll abbaubar, was ihre Verwendung im Hinblick auf die Umweltbelastung problemlos erscheinen läßt
Die Elutionsn.ittel enthatten immer eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Elutionsmittels zu regeln. Vorzugsweise wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet Bei Verwendung eines Anionenaustauschers kann man pH-Werte zwischen 53 und 10 vorzugsweise zwischen 6 und 9 verwenden. Geeignete Puffersubstanzen sind literaturbekannt
Die Temperatur der lonenaustauscherchromatographie muß konstant gehalten werden und liegt zwischen 0 und 50°C vorzugsweise zwischen 15 und 300C.
Die zur Elution verwandten Lösungen enthalten außer den Puffersubstanzen und nichtionischen Detergentien noch einen Elektrolyten, vorzugsweise ein
« Neutralsalz wie NaCI in Konzentrationen zwischen 0,01 M und 0,5 M vorzugsweise zwischen 0,05 M und 0,3 M oder man eluiert mit einem Elektrolytgradienten durch kontinuierliches Zumischen eines elektrolythaltigen
Puffers zu dem EJutionspuffer ohne Elektrolyt, der ansonsten die gleiche Zusammensetzung hat, in der Weise, daß die Konzentration des verwendeten Elektrolyten in Abhängigkeit des Elqtionsvolumens steigt, und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit Die Endkonzentration an Elektrolyt liegt zwischen 0,1 M und 1 M, vorzugsweise zwischen 03 M und 0,8 M.
Die erfindungsgemäße Reinigung von Peptiden wird an den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht
Beispiel 1
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 MTris-(hydroxyinethyl)-aminomethan
l%Genapor»SE150
(Fetialkoholpolyglykoläther)
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt
Ein Teil des obigen Puffers wird mit 0,5 Mol/l NaCI versetzt 450 g [JEAE-Sephadex· A 25 werden in obigem Puffer gequollen und die Suspension anschließend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gelfüllt Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht 5 g Insulin, das aus Citratpuffer kristallisiert wurde, werden in 75 ml des obigen Puffers (ohne NaCl) gellöst Der End-pH beträgt 83. Die klare Lösung wird auli die Säule gegeben und bei 25° C mit einer Geschwindigkeit von 320 ml/Std. mit obigem Puffer (pH 7,0) eluiert wobei ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei Durchlau.' von 5,51 Puffer von 0 auf 033 M steigt Fraktionen von 22ml werdn gesammelt Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet Der z> ntrale Teil des Insiulinpeaks (von 0,1 M-0,24 M NaCl) (1540 ml) wird gesammelt und mit 70 ml l%iger ZnCIrLösung versetzt. Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 3,76 g (75,2%).
Beispiel 2
IEs wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
0,12MNaCI
1 % Genapol· ZDM 110 (Polyglykoläther von
geradkettigen, synthetischen Fettalkoholen
(durchschnittliches Molekulargewicht 190)
mit 11 Mol Äthylenoxid/Mol Fettalkohol)
Der pH-Wert wird mit HCI auf 7,0 eingestellt.
13 g QAE-Sephadex* A 25 werden in obigen Puffer gequollen und die Suspension wird in eine Säule von 0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht 300 mg Insulin, das nach der Kristallisation noch durch Gelchromatographie an Sephadex G 50 in an sich bekannter Weise von höhermolekularen Bestandteilen weitgehend befreit worden war, werden in 15 ml des obigen Puffers gelöst (End-pH: 8,2). Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 250C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. mit dem obigen Puffer (pH 7) eluiert. Fraktionen von 7 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Her zentrale Teil des Insulinpeaks (620 ml) wird gesammelt und mit 28 ml l%iger ZnCIrLösung versetzt Des amorph ausgefallene Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 185 mg (61,6%).
Beispiel 3
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung ίο hergestellt:
0,1 MTris-(hydroxymethyl)-aminomethan
2% Genapol· SE 150 (siehe Beispiel 1)
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt
Anteile dieses Puffers werden mit 0,05 Mol/l, 0,1 Mol/l, 0,2 Mol/I und 03 Mol/l NaCl versetzt
450 g DEAE-Sephadex* A 25 werden im obigen Puffer mit 0,05 M NaCl gequollen und die Suspension
anschließend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht
5 g Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 100 ml des obigen Puffers (0,05 M NaCl) gelöst (End-pH: 8,4), auf
die Säule aufgetragen und bei 25° C mit einer Geschwindigkeit von 290 ml/Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 28 ml gesammelt Nach Durchlauf von 1,821 des Puffers mit 0,05 M NaQ werden 4,761 Puffer mit 0,1 M NaCl, 2^41 mit 0,2 M NaCl und schließlich 531 mit 03MNaCI aufgegeben. Die UV-Extinktion des
Eluats wird kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet Die Hauptmenge des Insulins wird hier nach Aufgabe
des Puffers mit 03 M NaQ eluiert. Der zentrale Teil des
Insulinpeaks wird gesammelt (820 ml) und mit 37 ml
l%iger ZnCk-Lösung versetzt Der amorphe Niederschlag wird abzentrifugiert und das Insulin sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltendem Citratpuffer kristallisiert
Die Ausbeute an reinem insulin beträgt 234 g
(56,8%).
Beispiel 4
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung « hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
5% Genapol· SE 100(Fettalkohol-
polyglykoläther)
so Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein Teil dieses Puffers wird mit 0,5 Mol/l NaCI versetzt
13 g DEAE Sephadex· A 25 werden im obigen Puffer gequollen (ohne NaCI) und die Suspension anschließend in eine Säule von 0 13 cm und der Länge 30 cm gefüllt Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht 300 mg Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 15 ml des obigen Puffers (ohne NaCI) gelöst (End-pH:
83). Die klare Lösung wird auf die Säule aufgetragen und bei 25° C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei Durchlauf von 500 ml Puffer von 0 auf 03 M ansteigt. Es
ό5 werden Fraktionen von 7 ml gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (von 0,09 M-0,22 M NaCl) (100 ml) wird gesammelt
und rait 4,6 mt 1%iger ZnClj-Lösung versetzt Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 160 mg (533%).
Beispiel 5
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 1% Arkopal* N 100 (Nonylphenolpolyglykoläther mit 10 Mol Athylenoxid/Mol Nonylphenol) als Detergent
üie kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 100 als Differenzmessung durchgeführt werden.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 214 mg (713%).
Beispiel 6
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 2% Arkopal· N 300 (Nonylphenolpolyglykoläther mit 30MoI Äthylenoxid/Mol Nonylphenol) als Detergent und von QAE-Sephadex* A 25 als Ionenaustauscher.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 156 reg (52%).
Die kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 300 als Differenzmessung durchgeführt werden.
Die in den Beispielen verwandten Detergentien sind Handelswaren der Firma Hoechst AG.
Die in den Beispielen verwandten Ionenaustauscher sind Handelswaren der Firma Pharmacia Fine Chemicals.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie an basischen Ionenaustauschern mit gepufferten Lösungsmitteln durchführt, in denen nichtionische Detergentien gelöst sind
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