AT201233B

AT201233B - Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adrenocorticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit

Info

Publication number: AT201233B
Authority: AT
Inventors: Jan Daniel Herman Dr Homan; Jacobus Petrus Jose Neutelings
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 1953-01-17
Filing date: 1954-01-15
Publication date: 1958-12-10

Description

Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adreno- corticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstel- lung von neuen Präparaten des adrenocorticotropen Hormons (ACTH), welche die bisher bekannten Präparate um ein Vielfaches an Wirksamkeit und Wirkungsdauer übertreffen.

Die günstigen therapeutischen Wirkungen dieses, aus den Hypophysen-Vorderlappen der Wirbeltiere gewonnenen Hormons sind allgemein bekannt und es hat daher in den letzten Jahren nicht an Versuchen gefehlt, zu Präparaten mit lang anhaltender Wirkung zu gelangen.

Es ist bekannt, dass man zur Erzielung von Präparaten mit verzögerter Resorption das Hormon mit einem oder mehreren Trägerstoffen, wie Aluminiumphosphat, gegebenenfalls in Verbindung mit Vehikeln wie Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, kombinieren kann (s. Univ.

Michigan Med. Bull. 16,152, 1950). In diesen Präparaten befindet sich der Trägerstoff meist in kolloidalem Zustand oder in Form einer Suspension. Die Viskosität dieser Dispersionen ist oft so gross, dass sie nur nach vorheriger Erwärmung zur Injektion geeignet sind. Manche dieser Präparate verursachen nach der Injektion lokale Reizwirkungen.

Demgegenüber sind die erfindungsgemäss herstellbaren ACTH-Präparate nicht nur von längerer Wirkungsdauer, sondern sie besitzen auch eine wesentlich höhere Aktivität (bestimmt nach dem Sayer-Test, s. Endocrinology 42,379, 1948), als auf Grund des ACTH-Gehaltes zu erwarten wäre, ohne die oben erwähnten, den bisher bekannten Präparaten mit verlängerter Wirksamkeit anhaftenden Nachteile aufzuweisen. Die Herstellung der neuen Präparate erfolgt in der Weise, dass das Hormon in einem zur Injektion geeigneten wässerigen Lösungsmittel mit einem oder mehreren Salzen, Hydroxyden oder Oxyden der Metalle Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer oder Eisen versetzt und hierauf auf einen zwischen 6 und 8 liegenden pH-Wert. bei dem sich ein schwerlöslicher Komplex zwischen dem ACTH und der bei diesem pH anwesenden schwerlöslichen Metallverbindung bildet, eingestellt wird.

Dieser so erhaltene Komplex besteht aus einem schwerlöslichen Salz bzw. Hydroxyd oder Oxyd eines oder mehrerer der genannten Metalle als Träger und dem daran adsorbierten ACTH als aktiver Komponente und kann als "Adsorptionskomplex" bezeichnet werden. Die als Trägersubstanz dienende schwerlösliche Metallverbindung bildet sich entweder durch Einstellen des gewünschten pH-Wertes durch Zusetzen eines Puffers zur wässerigen Lösung von ACTH und einer löslichen Metallverbindung oder sie wird als solche der ACTH-Lösung zugesetzt, z. B. in Form einer Suspension.

Von den für den vorliegenden Zweck geeigneten Metallen, nämlich Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen, ist das Zink zu bevorzugen.

Es zeigt sich, dass die Anwesenheit einer Metallsalzmenge entsprechend 5 bis 15 mg Metall/100 Einh. ACTH einen optimalen Einfluss auf die Aktivität des ACTH ausübt.

Die erfindungsgemäss hergestellten Präparate sind bei den im Körper herrschenden Reaktionsbedingungen (pH = ungef. 7) schwerer löslich als normales ACTH, welches leicht löslich ist und daher rascher resorbiert und abgebaut wird. Aus dem Eosinophilen-Test (s. Fig. I und die zugehörige Beschreibung) geht z. B. hervor, dassnormales ACTH etwa 8 Stunden nach der Injektion praktisch seine ganze Wirksamkeit verloren hat, dass hingegen die erfindungsgemäss hergestellten Präparate. erst nach etwa 24 Stunden oder noch später unwirksam werden.

Vorzugsweise wird das wässerige Lösungsmittel mit einem Konservierungsmittel, z. B.

Phenol, versetzt und mit Glycerin oder Natriumchlorid isotonisch gemacht. Zur Einstellung des gewünschten pH-Wertes kann eine Puffersubstanz, z. B. ein Citrat-, Acetat- oder Phosphatpuffer oder ein Alkalihydroxyd, insbesondere Natriumhydroxyd, angewendet werden. Vor-

zugsweise enthält das als Lösungsmittel verwen- dete Wasser etwa 0, 5% Phenol, 2, 5% Glycerin und so viel tert. Natriumphosphat, um das pH des Präparates auf 6 bis 8 einzustellen.

Die Reihenfolge, in der ACTH, die Metall- verbindungen und das Lösungsmittel zusammen- gebracht werden, ist ohne wesentliche Bedeu- tung. Meist mischt man eine Lösung von ACTH in einem Lösungsmittel, welches bereits z. B.

Phenol und Glycerin enthält, mit einer Lösung eines oder mehrerer Metallsalze bzw. mit einer Suspension eines Metallhydroxyds oder-oxyds in dem gleichen Lösungsmittel, worauf das pH der Mischung mit Hilfe eines Puffers oder von Natronlauge auf pH 6-8 eingestellt wird, wobei sich der schwerlösliche ACTH enthaltende
Komplex bildet. Schliesslich wird die erhaltene
Suspension auf den gewünschten Gehalt an
ACTH, z. B. 20 Einh./cm3 eingestellt.

Die erfindungsgemäss hergestellten Präparate wurden nach drei verschiedenen Testmethoden auf ihre Aktivität geprüft, die nachstehend kurz erläutert werden :
1. Der Glykogenablagerungstest wird an hun- gernden, hypophysektomierten Ratten durchgeführt, die während einer 8 Stunden dauernden
Versuchsperiode Glukoseinjektionen erhalten.

Der ersten Gruppe wird noch zusätzlich zur Kontrolle das Lösungsmittel injiziert. Die zweite Gruppe von Versuchstieren erhält eine einzige subkutane Injektion einer bestimmten Menge von normalem ACTH. Die dritte Gruppe erhält die gleiche Menge an normalem ACTH, jedoch nach je einer Stunde eine Injektion mit je einem Achtel der Gesamtmenge. Die vierte Gruppe schliesslich erhält eine einzige Injektion mit dem auf verlängerte Wirksamkeit zu untersuchenden Präparat, welches der gleichen Menge an ACTHEinh. entspricht, die der zweiten und dritten Gruppe zugeführt wurden. Nach Ablauf der Versuchszeit werden die Tiere getötet und der Gehalt an Leberglykogen bestimmt. Die Verabreichung von ACTH bewirkt eine Erhöhung dieses Gehaltes.

Werden statt einer Injektion der Gesamtmenge acht Injektionen mit je einem Achtel dieser Menge gegeben, so wird eine stärkere Erhöhung des Glykogengehaltes beobachtet. Durch Vergleich der Ergebnisse ist es möglich festzustellen, ob das untersuchte Präparat eine verlängerte Wirksamkeit besitzt.

2. Der Eosinophilen-Test wird an normal er- n. ährten Tieren, z. B. Hunden, durchgeführt, wobei einer Gruppe von Versuchstieren normales ACTH, einer anderen das zu untersuchende Präparat injiziert wird. In regelmässigen Zeitabständen (z. B. alle 3 Stunden) wird das Blut- bild untersucht. Wie bekannt, bewirkt die Injektion von etwa 50 Einh. ACTH eine Abnahme der Eosinophilen. Nach 8 Stunden ist das Blutbild wieder normal. Dagegen zeigen einige der erfindungsgemäss herstellbaren Präparate bei diesem Test eine mindestens 40 Stunden anhaltende Wirkung.
3.

Der Thymus-Verkleinerungs-Test wird zweckmässig an Ratten-Nestlingen durchgeführt.
Eine intramuskuläre Injektion von ACTH be- wirkt eine Gewichtsabnahme der Thymus und Gewichtszunahme des Nebennierenmarks, jedoch ist bei Verwendung von normalem ACTH die
Gewichtsabnahme der Thymus kaum feststellbar und die Gewichtszunahme des Nebennieren- marks nur sehr gering. Dagegen ist nach Injektion einer entsprechenden Menge eines erfin- dungsgemäss hergestellten Präparates eine äusserst starke Gewichtsabnahme der Thymus und eine sehr starke Gewichtserhöhung des Nebennierenmarks zu beobachten. Die Präparate weisen im Vergleich mit der gleichen Menge normalem ACTH eine mindestens 10- bis 20fache Wirksamkeit auf.

Eingehende Versuche über die Zusammensetzung der flüssigen Phase der erfindungsgemäss herstellbaren Suspensionen zeigten, dass bei einem pH von ungefähr 7 und Zinkphosphat sowie Zinkoxyd als Träger zirka 99% der gesamten wirksamen Substanz des Präparates in dem Adsorptionskomplex niedergeschlagen sind, somit in schwerlöslicher Form vorliegen.

Einen Vergleich der biologischen und klinischen Wirksamkeit der erfindungsgemäss herstellbaren Präparate mit normalen ACTH-Präparaten zeigen die Fig. 1 und 2. In Fig. 1 ist auf der Abszisse der Prozentsatz von Eosinophilen und auf der Ordinate die Zeit in Stunden aufgetragen. Im Zeitpunkt 0, zu dem die Zahl der eosinophilen Leukozyten mit 100% angenommen wird, wurde eine intramuskuläre Injektion von 20 Einh.

ACTH eines Präparates folgender Zusammensetzung verabreicht :
EMI2.1

<tb>
<tb> ACTH <SEP> 7, <SEP> 70 <SEP> mg <SEP> (= <SEP> 20 <SEP> USP-Einh.)/cm3 <SEP>
<tb> ZnCl2 <SEP> 1, <SEP> 50 <SEP> mg <SEP> Zink/cm3 <SEP>
<tb> NagPO <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> mg/cmS <SEP>
<tb> NaOH <SEP> bis <SEP> zur <SEP> Erreichung <SEP> von <SEP> pH <SEP> = <SEP> 6,0
<tb>
Lösungsmittel : Wasser mit einem Gehalt von 0, 26% Phenol und 2, 0% Glycerin.

Die Kurve gibt die Mittelwerte von 22 Versuchen an 18 Patienten wieder. Man ersieht, dass unmittelbar nach der Injektion ein starker Abfall der Anzahl von Eosinophilen mit einem Minimum unterhalb 20% nach etwa 8-14 Stunden eintrat und dass die Wirksamkeit des Präparates auch nach 48 Stunden noch nicht völlig aufgehört hatte.

Fig. 2 gibt einen Vergleich der Ergebnisse verschiedener Injektionen von normalem ACTH und einem erfindungsgemäss herstellbaren Präparat mit der oben angegebenen Zusammenset-. zung, alle mit ACTH gleicher Herkunft hergestellt, wieder.

Kurve 1, voll ausgezogene Linie, zeigt das Ergebnis von 80 Einh. normalem ACTH, in einer einzigen Injektion verabreicht.

Kurve 2, strichlierte Linie, zeigt das Ergebnis einer Injektion mit 20 Einh. normalem ACTH.

Kurve 3, punktierte Linie, zeigt das Ergebnis 1 einer Injektion mit 20 Einh. eines erfindungs-

gemäss hergestellten Präparates.

Kurve 4, durchstrichene Linie, zeigt das Ergebnis von 4 aufeinanderfolgenden Injektionen mit je 20 Einh. normalem ACTH.

Es ist besonders zu beachten, dass auch die Behandlung nach Kurve 4 kein besseres Resultat ergibt als das mit einer einzigen Injektion von 20 Einh. des neuen Präparates erzielte (Kurve 2).

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparate. Die Aktivität der Ausgangsprodukte wird in diesen Beispielen in USP-Einheiten angegeben. Unter 1 USP-Einheit wird die Menge an ACTH verstanden, die im Test von Sayers (Endocrinology 42, 379- 393, 1948) die gleiche Wirkung zeigt wie 1 mg des "Provisional USP-standard", wie z. B. in Recent Progress in Hormone Research Vol. X, 266 (1954) beschrieben.

Beispiel 1 : 73, 5 mg aus Schweinehypophysen gewonnenes ACTH mit einer Aktivität von 1. 36 USP-Einh./mg werden in 8 cm3 0, 5% Phenol und 2, 5% Glycerin enthaltendem Wasser gelöst. Hiezu werden 0, 7 cm3 einer Zinksulfatlösung in dem gleichen Lösungsmittel, welches 10 mg Zink/cm3 enthält, zugesetzt und die Mischung schliesslich mit 0, 54cm einer 4%igenNagPOt-Lösung in dem gleichen Lö- sungsmittel vermischt. Der pH-Wert beträgt nunmehr 7, 02. Nach Verdünnen der gebildeten
Suspension mit dem Lösungsmittel auf 10 cm3 wird ein Präparat mit 10 Einh. ACTH/cm3 er- halten. Dieses Präparat erweist sich sowohl nach dem Thymus-Verkleinerungstest als auch nach dem Glykogenablagerungstest als hochaktiv.

Beispiel 2 : 41, 6mg aus Schweinehypophysen stammendes ACTH mit einer Aktivität von
2, 4 USP-Einh. /mg werden in 4 cm3 des in Bei- spiel 1 genannten Lösungsmittels gelöst. Hiezu werden 0, 8 cm3 einer Kobaltsulfatlösung in dem gleichen Lösungmittel, welche 10 mg Kobalt/cm3 enthält, zugesetzt. Die Mischung wird auf 9 cm3 verdünnt, worauf des pH mit Hilfe einer 4%igen Na : POrLösung auf 6, 0 ein- gestellt wird. Schliesslich wird das Volumen auf
10 cm3 ergänzt, so dass das Präparat 10 Einh. ACTH/cmS enthält. Es erwies sich im Eosinophilen-Test während mindestens 40 Stunden aktiv.

Beispiel 3 : 83, 2 mg ACTH mit einem Gehalt an 2,4 USP-Einh./mg werden in 8 cm3 des vorerwähnten Lösungsmittels gelöst. Hiezu werden 0, 32 cm3 einer Zinkchloridlösung mit einer Konzentration von 37, 5 mg Zink/cm3 zugefügt. Hierauf setzt man der Mischung 0, 5 cm3 einer 4%igen Na3PO1-Lösung und schliesslich 0, 5 cm3 0. 23 n Natronlauge zu, worauf das pH den Wert 7. 0 erreicht. Nach Auffüllen auf 10 cm3 enthält dieses Präparat 20 Einh. ACTH/cm3 und zeigt im Thymus-Test ungefähr die 16fache Wirksamkeit des normalen ACTH.

Beispiel 4 : 83. 2 mg ACTH mit einer Aktivität von 2, 4 USP-Einh. pro mg werden in 12 cms
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Lösungsmittelsdem Lösungsmittel auf 17, 5 cm3 aufgefüllt und mit 4%iger Na3PO4-Lösung auf pH = 6, 0 ein-
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20 cm3 verdünnt, so dass es 10 Einh. ACTH/cm3 enthält. Im Glykogenablagerungs-Test ist dieses
Präparat hochaktiv.

Beispiel 5 : 77, 1 mg ACTH mit einer Aktivi- tät von 2, 59 USP-Einh./mg werden in 6 cm3 Lösungsmittel gemäss Beispiel 1 gelöst. Hiezu werden 1, 5 cm3 einer ZnCIg-Lösung in dem gleichen Lösungsmittel, welche 10 mg Zink/cm3 enthält, zugefügt. Schliesslich wird 1. 0 cm3 0, 5 n Natronlauge zugesetzt, so dass das pH den Wert 7, 5 erreicht und das Volumen mit Lösungsmittel auf 10 cm3 ergänzt. Die erhaltene Suspension hat eine verlängerte bzw. erhöhte Wirksamkeit im Glykogenablagerungs-Test und Thymus-Test. Im Eosinophilen-Test sank die Zahl der eosinophilen Leukozyten während mindestens 20 Stunden stark ab.

Beispiel 6 : 55, 5 mg ACTH mit einer Aktivität von 36 USP-Einh./mg werden in 60 cm3 des in Beispiel 1 erwähnten Lösungsmittels gelöst. Hiezu werden 10 cm3 ZnCI -Lösung mit einem Gehalt von 10mg Z'nk/cm3 und schliesslich soviel 0, 5 n Natronlauge zugegeben, dass das pH den Wert 7, 5 erreicht. Hierauf wird mit. Lösungsmittel auf 100 cm3 aufgefüllt. Diese Suspension zeigt im Glykogenablagerungs-Test eine verlängerte Wirksamkeit.
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hypophysen mit einer Aktivität von 2, 59 USP-.

Einh. /mg werden in 6 cm3 0, 5% Phenol und 2 Glycerin enthaltendem Wasser gelöst. Hierauf werden 2,46 cm3 einer Zinkhydroxyd-Suspension zugesetzt, die durch Mischen von 1, 5 cm3 10 mg Zink/cm3 enthaltender Zinkchloridlösung. mit 0.96 cm3 0,47 n Natronlauge erhalten wurde.

Das pH der so erhaltenen Mischung wird mittels Natronlauge auf 7, 5 eingestellt. Schliesslich wird mit dem erwähnten Lösungsmittel auf 10 cm3 aufgefüllt, so dass die ACTH-Konzentration 20 USP-Einh./cm3 beträgt. Das Präparat erweist sich im Eosinophilen-Test während mehr als 24 Stunden aktiv und ist auch im Glykogen- ablagerungs-Test hochwirksam.

Beispiel 8 : 55, 4 mg ACTH mit einer Aktivität von 3, 61 USP-Einh. /mg werden in 6 cm3 des Lösungsmittels nach Beispiel 7 gelöst. Hiezu wird eine Zinkhydroxyd-Suspension zugesetzt, die durch Mischen von 2 cm3 einer 10 mg Zink/em3 enthaltenden Zinkchloridlösung mit
EMI3.4

25 cm3 0, 48stellt : Gegebenenfalls wird die erhaltene Suspension auf 10 cm3 verdünnt. Dieses Präparat ist im Glykogenablagerungs-Test hochaktiv.

Beispiel 9 : 73, 5mg ACTH mit einer Aktivität von 1, 36 USP-Einh. /mg werden in 7, 5 cm3 1 des oben genannten Lösungsmittels gelöst. Hiezu

wird eine Zinkhydroxyd-Suspension zugesetzt, die durch Mischen, von 1, 06 cm3 10 mg Zink/cm3 enthaltender Zinksulfatlösung mit 0, 5 cm3 1 n
Natronlauge erhalten wurde. Das Volumen der i erhaltenen Mischung wird auf 10 cm3 gebracht ; das pH beträgt 7, 4. Die Suspension enthält
10 USP-Einh. jcm3. Im Glykogenablagerungs-
Test bewirkt eine einzige Injektion mit diesem
Präparat den gleichen Effekt wie die entspre- chende Menge von normalem ACTH auf
8 gleiche, stündlich verabreichte Injektionen verteilt, so dass die verlängerte Wirksamkeit dieses Präparates deutlich erkennbar ist.

Beispiel 10 : 73, 5 mg ACTH mit einer Aktivi- tät von 1, 36 USP-Einh./mg werden in 4 cm3 des oben genannten Lösungsmittels gelöst. Das pH der Lösung wird mit Natronlauge auf 7, 5 ein- gestellt. Hierauf werden 4 cm3 einer Nickel- hydroxyd-Suspension mit einem pH von 7, 5 und einem Gesamtgehalt von 30 mg Nickel zuge- fügt. Nach Auffüllen auf 10 cm3 enthält die
Suspension 10 USP-Einh. jcm3. Das Präparat ist aktiv im Glykogenablagerungs-Test.

Beispiel 11 : 5, 55 mg eines hochgereinigten
ACTH-Präparates mit einer Aktivität von
36 USP-Einh./mg werden in 8 cm3 eines 0,5to
Phenol und 0, 9% Natriumchlorid enthaltenden
Lösungsmittels gelöst und mit 18, 7 mg Zink- oxyd versetzt. Dann wird das pH auf 7, 5 einge- stellt und das Volumen auf 10 cm3 ergänzt, wodurch ein Präparat mit einem Gehalt von 20 USP-Einh. ACTHjcm3 erhalten wird. Es erweist sich im Thymus-Test als hochaktiv.

Beispiel 12 : 83, 2 mg ACTH mit einer Aktivität von 2, 4 USP-Einh./mg werden in 5, 5 cm3 des in Beispiel 11 angegebenen Lösungsmittels gelöst und mit einer Kobalthydroxyd-Suspension versetzt, die durch Mischen von 2, 5 cm3 Kobaltsulfatlösung mit einem Gehalt von 10 mg Kobaltjcm3 mit einer solchen Menge 0, 5 n Natronlauge entsteht, dass das pH der fertigen
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dieses Präparates zu erkennen.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten des adrenocorticotropen Hormons mit erhöhter und verlängerter Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung des normalen Hormons (ACTH) in einem wässerigen Lösungsmittel mit einer oder mehreren Verbindungen der Metalle Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer oder Eisen versetzt und hierauf auf einen zwischen 6 und 8 liegenden pH-Wert, bei dem sich ein schwerlöslicher Komplex zwischen dem ACTH und der bei diesem pH anwesenden schwerlöslichen Metallverbindung bildet, eingestellt wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Metallverbindungen Salze der genannten Metalle verwendet werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zinksalz, z. B.

Zinkphosphat, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Metallverbindung ein Hydroxyd oder Oxyd der genannten Metalle, z. B. Zinkoxyd oder Zinkhydroxyd, verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallverbindung in einer Menge angewendet wird, die etwa. 5 bis 15 mg Metall pro 100 Einheiten ACTH entspricht. EMI4.2