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Verfahren zur Behandlung von Insulinkristallen und zur Herstellung von Insulinpräparaten aus diesen Kristallen
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Kadmium,wirkung, welche sich nicht wesentlich von der Kurzwirkung von aufgelöstem Insulin unterscheidet.
Während vieler Jahre war die Meinung vorherrschend, dass es, um eine prolongierte Insulinwirkung von praktisch bedeutendem Ausmass zu erreichen. notwendig sei, das Insulin zusammen mit dem mensch - lichen Körper fremden Hilfssubstanzen zu injizieren, wie beispielsweise Protamin, Globin, Surfen usw., welche die Resorption von Insulin verzögern.
Später erkannte man, dass die Verwendung von derartigen Fremdsubstanzen nicht notwendig ist. Es ist möglich, eine prolongierte Insulinwirkung mit wässerigen Insulinkristallsuspensionen zu erzielen, welchen man eine derartige Zusammensetzung gegeben hat,'dass bei Einstellung des Suspensionsmediums auf pH 7, die suspendierten Insulinkristalle einen besonders hohen Gehalt der oben erwähnten Metalle von über 0,25
Milliäquivalent pro Gramm, vorzugsweise mindestens 0, 35 Milliäquivalent pro Gramm aufweisen, wo- durch erreicht wird, dass die Kristalle bei diesem pH-Wert praktisch ungelöst bleiben.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Insulinkristallen, nach welchem esmöglich ist, den Kristallen derartige Eigenschaften zu erteilen, dass sie bei parenteraler Injektion nach der Suspen- dierung in einem wässerigen Medium eine prolongierte Insulinwirkung ergeben, ohne dass hiebei die Not- wendigkeit besteht, dem wässerigen Medium vorher einen bestimmten Mindestgehalt von die Kristallisation fördernden Metallen und eine derartige Zusammensetzung zu erteilen, dass die Kristalle Metalle aus dem Medium bei neutraler Reaktion aufnehmen oder ohne den Insulinkristallen vorher einenerhöhtenMe- tallgehalt zu geben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass aus Rinderpankreas- drusen gewonnene Insulinkristalle als solche unter Aufrechterhaltung eines Wassergehaltes von mehr als 81a oder in Suspension, vorzugsweise wässeriger Suspension bei einem pH-Wert unter 7, bei einer Temperatur von mehr als 200C, vorzugsweise 40 - 700C, während einer derartigen Zeitspanne aufbewahrt werden, dass sie nach der Suspendierung in einem wässerigen injizierbaren Medium und nach darauffolgender subkutaner Injektion eine Insulinwirkung zeigen, welche verglichen mit der Wirkung unbehandelter Kristalle, unter sonst gleichen Bedingungen, protrahiert ist.
Die Insulinwirkung der aufbewahrten Kristalle ist umso mehr verlängert, je höher die Temperatur und je länger die Aufbewahrungszeit gehalten wird. Wenn als Ausgangsmaterial Insulinkristalle aus Ochsenpankreasdrüsen verwendet werden, kann man eine aussergewöhnlich prolongierte Insulinwirkung erhalten, wenn die Kristalle 3 Wochen lang bei 450C oder 24 h lang bei 700C gelagert werden.
Bei Temperaturen in der Nähe von 200C sind viel längere Aufbewahrungszeiten bis zu 1 Jahr erforderlich. Hiedurch erfolgt keine wesentliche Abnahme der Wirksamkeit der Kristalle. Bei Aufbewahrung von Insulinkristallen in wässeriger Suspension in einem Jahr bei 200C kann man mit einem Aktivitätsrückgang von weniger als 5% rechnen. Solche lange Aufbewahrungszeiten sind aber unwirtschaftlich, weshalb es bevorzugt ist, die Kristalle bei höheren Temperaturen aufzubewahren.
Wenn man die Insulinkristalle in wässeriger Suspension aufbewahrt, dürfen Temperaturen von höher als ungefähr 700C nicht verwendet werden, denn sonst zeigen die Kristalle eine Neigung zum Zusammenbacken. Ferner ist dem wässerigen Suspensionsmedium ein pH-Wert von weniger als 7 zu geben, indem es sich gezeigt hat, dass die Aufbewahrung der Kristalle bei erhöhter Temperatur praktisch keinen Einfluss auf die Insulinwirkung der Kristalle hat, wenn das wässerige Suspensionsmedium neutrale Reaktion aufweist. Je niedriger der pH-Wert des Suspensionsmediums ist, um so grössere Verlängerung der Insulinwirkung der aufbewahrten Kristalle kann erreicht werden. Natürlich ist ein solcher pH-Wert zu wählen, dass die Insulinkristalle nicht in Lösung gehen.
Bekanntlich ist Insulin bei seinem isoelektrischen Punkt (pHWert ungefähr 5,3) am schwersten löslich, doch können pH-Werte unten bis 4,5 verwendet werden.
Zweckmässige pH-Werte sind 5,5 und 6.
Wenn man nach der Erfindung die Insulinkristalle als solche bei erhöhter Temperatur aufbewahrt, können höhere Temperaturen als 700C verwendet werden, man muss aber dafür Sorge tragen, dass der Wassergehalt der Kristalle während der Aufbewahrung auf mehr als 80/0 aufrechterhalten wird. Gewöhnliches kristallines Trockeninsulin, welches etwa 2-8% Wasser enthält, wird durch die Aufbewahrung bei erhöhter Temperatur praktisch nicht beeinflusst. Mit steigendem Wassergehalt der Kristalle erhöht sich die erfinderische Wirkung der Aufbewahrung der Kristalle bei erhöhter Temperatur.
Wenn während der Aufbewahrung der Wassergehalt der Kristalle ungefähr 201o beträgt, so ist ungefähr die doppelte Aufbewahrungszeit notwendig, um dieselbe prolongierte Wirkung zu erhalten, wie bei der Aufbewahrung von nicht-getrockneten Kristallen mit einem Wassergehalt von 401o unter sonst gleichen Bedingungen.
Durch Einstellung der Temperatur, der Behandlungszeit und des Wassergehaltes der Kristalle kann jeder gewünschte Grad der Verlängerung der Insulinwirkung der aufbewahrten Kristalle erzielt werden, und durch Mischung von Kristallsuspensionen mit verschiedenen Wirkungsgraden wird es möglich, eine sehr
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grosse Anzahl verschiedener Kombinationswirkungen zu erzielen.
Wenn man die Irtsulinkristalle in Suspension bei erhöhter Temperatur aufbewahrt, ist es nach der Er- findung zweckmässig, ein wässeriges Medium mit einer für Injektionszwecke geeigneten Zusammensetzung zu verwenden. Dieses Medium kann beispielsweise die Mutterlauge der Kristallisation darstellen. Wenn man dann unter sterilen Bedingungen arbeitet, kann man einfach nach der Aufbewahrung bei erhöhter
Temperatur die Suspension auf die praktisch verwendeten Insulinkonzentrationen einstellen und damit di- rekt zu einem therapeutisch brauchbaren Präparat kommen.
Zur Fixierung des pH-Wertes des wässerigen Mediums für die zu behandelnden Insulinkristalle, wer- den zweckmässig Puffersubstanzen verwendet. Es ist in dieser Verbindung zu erwähnen, dass Puffersubstan- zen, wie z. B. Zitratpuffer, welche die verlängerte Wirkung der bekannten wässerigen zinkhaltigen Insu- linkristallsuspensionen verhindern, die erfinderische Wirkung der Aufbewahrung bei erhöhter Temperatur nicht verhindern. DasMedium kann auch mit Wasser mischbare Lösungsmittel wie z. B. Aceton enthalten, welches beispielsweise in der Mutterlauge aus der Kristallisation nach der Zitratmethode enthalten ist.
Gemäss der Erfindung hergestellte Insulinkristalle unterscheiden sich von den Kristallen vor der Aufbewahrung weder in ihrem Aussehen, noch in der Aminosäurezusammensetzung, sie haben aber eine etwas geringere Löslichkeit in einer salzsauren Lösung von Natriumchlorid und in einem neutralen Phosphatpuffer. Die Kristallisationsfähigkeit der Insulins wird, wie dies durch Umkristallisieren der behandelten Kristalle leicht festgestellt werden kann, während der Aufbewahrung bei erhöhter Temperatur vermindert.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können Insulinkristalle verwendet werden, welche nach irgendeinem Kristallisationsverfahren hergestellt wurden. Besonders geeignet ist das Kristallisationsverfahren nach der österr. Patentschrift Nr. 191545.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch auf Insulinkristalle angewendet werden, welche einen besonders hohen Metallgehalt, d. h. mehr als 0,25 Milliäquivalent pro Gramm der Kristalle, aufweisen, da diesen hiedurch in wässeriger Suspension eine gesteigerte protrahierte Wirkung gegeben werden kann, als dies ohne die erfindungsgemässe Aufbewahrung der Fall ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Insulinpräparaten mit protrahierter Wirkung, u. zw. auf ein Verfahren von derjenigen Art, bei welchem sterile Insulinkristalle unter sterilen Bedingungen in einem sterilen, für Injektionszwecke geeigneten, wässerigen Medium zum Suspendieren gebracht werden und dieses Verfahren besteht darin, dass nach der Erfindung behandelte Insulinkristalle verwendet werden und dass das wässerige Medium einen pH-Wert von ungefähr 7 (6, 5 - 7, 5) aufweist, oder dieses Medium auf einen derartigen pH-Wert eingestellt wird. Wie aus den obigen Ausführungen zu entnehmen ist, sind derartige neutrale Präparate vollkommen stabil, u. zw. auch dann, wenn sie längere Zeit aufbewahrt werden.
Diese Stabilität beruht darauf, dass das wässerige Medium einen pH-Wert von ungefähr 7 aufweist.
Ohne Verwendung von den bekannten Hilfssubstanzen, wie z. B. Protamin, Zink usw., welche nunmehr überflüssig sind, sind die erfindungsgemässen Präparate mit gewöhnlichen schnellwirkenden Insulinlösungen mischbar, wobei die schnelle Wirkung des gewöhnlichen Insulins und die prolongierte Wirkung der Kristalle beibehalten bleibt. Es ist sogar möglich, bei der Herstellung der Präparate diesen einen Gehalt von gelöstem, schnellwirkendem Insulin zu geben, um eine starke Initialwirkung zu erzielen. In einem derartigen Fall kann in dem gelösten Anteil Schweinepankreasinsulin, welches eine verhältnismä- ssig hohe Löslichkeit bei neutraler Reaktion aufweist, verwendet werden.
Schliesslich können auch zusammengesetzte Präparate hergestellt werden, welche Kristalle mit ver- s0hiedenen Wirkungsbreiten enthalten, so dass praktisch eine unbegrenzte Anzahl von Möglichkeiten zur Erzielung geeigneter polyphasischer Wirkungen möglich ist. Es stellen somit die Erfindung und die gemäss der Erfindung entwickelten Herstellungsverfahren nicht nur eine neuartige Methode zur Erzielung einer prolongierten Insulinwirkung dar, sondern es hat die Erfindung auch die Grundlage für eine Insulintherapie geschaffen, welche flexibler gestaltet werden kann und in einem viel grösserem Ausmass individualisiert werden kann, als dies bisher möglich war, u. zw.-und dies ist besonders zu bemerken-ohne die Verwendung von Hilfssubstanzen.
Es kann selbstverständlich diesen Suspensionen auch ein Gehalt an, beispielsweise Zinkionen gegeben werden, wodurch eine noch gesteigerte prolongierte Insulinwirkung erzielt werden kann. Dies ist aber gar nicht notwendig, da es im Rahmen der Erfindung möglich ist, Insulinkristallsuspensionen zu erhalten, welche eine prolongiertere Insulinwirkung aufweisen als die bisher bekannten zinkhaltigen Insulinkristallsuspensionen für therapeutische Zwecke.
An Hand der untenstehenden Beispiele wird das erfindungsgemässe Verfahren näher erläutert.
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In diesen Beispielen wurde eine Stammsuspension (S verwendet, welche die folgende Zusammensetzung auftvies :
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<tb> 40 <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> cm <SEP> Insulinkristallen <SEP> aus
<tb> Ochsenpankreasdrüsen
<tb> 1,4 <SEP> mg <SEP> Zn++ <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> cm3 <SEP> (als <SEP> Chlorid)
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> m-Natriumacetat
<tb> 0, <SEP> 7% <SEP> NaCl
<tb> 0, <SEP> 10/0 <SEP> p-Oxybenzoesäuremethylestet <SEP> und
<tb> Hd <SEP> bis <SEP> zur <SEP> Erreichung <SEP> eines <SEP> pH-Wertes <SEP> von <SEP> 5, <SEP> 5.
<tb>
Die Suspension wird durch Verdünnen von 1 Vol.-Teil konzentrierter Kristallsuspension mit 9 Vol.-
Teilen einer 0,11%igen p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung hergestellt. Die konzentrierte Kristallsuspension wird durch Vermischen der im folgenden beschriebenen Lösungen A und B und durch nachfolgendes Rühren während der Kristallisation des Insulins erhalten :
A) 3,48 g Ochseninsulinkristalle mit einem Gehalt von 0, 78% Zink werden in 100 cm3 Wasser suspendiert und durch Zugabe von 4 cm in-cl zur Lösung gebracht. Die Lösung wird steril filtriert und auf
150 cms verdünnt.
B) 1/50 Mol Natriumacetat und 14 g NaCl werden in 50 cm ? Wasser gelöst, das so viel NaOH enthält, dass das Gemisch von A + B einen pH-Wert von 5,5 aufweist.
Beispiel I : Die Suspension S wird zwei Wochen lang bei 450C gelagert. Nach der an Kaninchen ausgeführten Injektion, zeigte sich eine protrahierte Wirkung, welche der von Zink-Protamin-Insulin ähnelte. Die Kristalle werden abgenutscht und getrocknet.
Beispiel 2 : Die aus dem vorstehenden Beispiel stammenden getrockneten Kristalle werden in einem sterilen injizierbaren Medium suspendiert, welches dieselbe Zusammensetzung aufweist wie diejenige Suspension, in welcher die Kristalle der Aufbewahrung bei erhöhter Temperatur unterworfen wurden, Nach der Suspendierung der Kristalle wird der pH-Wert mit In-NaOH auf 7, 0 eingestellt. Das Präparat hat fast dieselbe Wirkung wie Zink-Protamin-Insulin. Die prolongierte Wirkung des Präparates ändert sich unter den für die Lagerung von Insulinpräparaten üblichen Bedingungen nicht.
Beispiel 3 : Die Suspension SI wird vier Wochen lang bei 45 C gelagert. Hiedurch wird die Wirksamkeit der Kristalle so protrahiert, dass nach Injektion der Suspension an Kaninchen während der ersten 8 h nach der Injektion kaum eine Wirkung beobachtet wird. Die biologische Wirkung des Insulins ist aber intakt, was durch Auflösen der Kristalle in Salzsäure und Durchführung einer üblichen Bestimmung für die biologische Wirksamkeit festgestellt werden kann.
Beispiel 4s Zur Suspension S1 werden 1,8 mg Zn++ pro 1000 Einheiten in Form von Zinkchlorid zugegeben und der PH-Wert wird mit in-cl auf 5,0 eingestellt, ohne dass hiebei das Volumen wesentlich vergrössert wird. Nach einjährigem Stehenlassen bei 250C ist die protrahierte Wirkung der Suspension sehr gross. Die Suspension weist eine wesentlich langsamere Wirkung auf, als Zink-Protamin-Insulin.
Beispiel 5s Zur Suspension S.. werden Natriumphosphat und Salzsäure zugesetzt, ohne dass das Volumen wesentlich vergrössert wird, wodurch die Suspension einen Gehalt von 0,01 Mol Phosphat erhält und einen PH-Wert von 5 aufweist. Nach zweiwöchigem Stehen bei 45 C, haben die Kristalle eine hohe protrahierte Wirkung erreicht und können, falls gewünscht, isoliert und getrocknet werden.
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6 :protrahierte Wirkung aufweist.
Beispiel 7: Es wird ein Kristallisationsgemisch mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt :
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<tb>
<tb> 0, <SEP> 8% <SEP> Ochseninsulin <SEP>
<tb> 0, <SEP> 040% <SEP> Zn <SEP> (als <SEP> Chlorid)
<tb> 0,05 <SEP> m-Natriumzitrat
<tb> 150 <SEP> Aceton <SEP> und
<tb> HCl <SEP> bis <SEP> zur <SEP> Erreichung <SEP> eines <SEP> pH-Wertes <SEP> von <SEP> 6, <SEP> 0.
<tb>
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Die Kristallisation findet während des mehrstündigen Rührens statt, worauf das Aceton unter weiterem Rühren durch 24h bei 450C abgedampft wird. Dann wird die Suspension mit einer Lösung von Natriumchlorid und p-Oxybenzoesäuremethylester verdünnt, wodurch sie die folgende Zusammensetzung erhält :
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<tb>
<tb> 40 <SEP> Einheiten <SEP> Insulinkristalle <SEP> pro <SEP> ems
<tb> 97 <SEP> y <SEP> zn++ <SEP> pro <SEP> cm' <SEP>
<tb> 0,01 <SEP> m-Natriumzitrat
<tb> 0, <SEP> 70/0 <SEP> NaCl <SEP>
<tb> 0,1% <SEP> p-Oxybenzoesäuremethylester <SEP> .
<tb>
Dann wird der pH-Wert mit In-HCl auf 5,5 eingestellt. Nach zweiwöchigem Stehen bei 450C zeigt die Suspension eine stark protrahierte Insulinwirkung und die Kristalle werden abgetrennt.
Beispiel 8 : Die Kristallisation wird gemäss dem vorstehenden Beispiel durchgeführt, die Kristalle werden aber abgenutscht, mit 600/0 Aceton gewaschen und getrocknet. Die getrockneten Kristalle werden in einem derartigen Suspensionsmedium suspendiert, dass eine Suspension von derselben chemischen Zusammensetzung wie die der Suspension S-, erhalten wird. Nach zweiwöchigem Stehen bei 45 C, zeigt die Suspension eine stark protrahierte Wirkung. Die Kristalle werden abgetrennt, oder die Suspension wird auf PH 7 eingestellt, wodurch direkt ein Insulinpräparat erhalten wird, welches eine protrahierte Wirkung aufweist.
Beispiel 9 : Es wird eine Suspension (S2) hergestellt, wobei in gleicher Weise verfahren wird wie bei der Herstellung der Suspension Si, nur mit der Ausnahme, dass der Zusatz von NaCl wegfällt. Nach zweiwöchigen Stehen bei 450C zeigt die Suspension S2 eine stark protrahierte Insulinwirkung.
Beispiel 10 : Die Kristallisation wird wie bei der Herstellung der Suspension S, beschrieben durchgeführt, nur dass an Stelle der Verdünnung der Kristallsuspension die Kristalle abgetrennt und getrocknet werden. Dann werden die getrockneten Kristalle in einem wässerigen Medium suspendiert, so dass eine Suspension erhalten wird, welche die gleiche chemische Zusammensetzung aufweist wie die Suspension S1. Nach zweiwöchigem Stehen bei 45 C, zeigt die Suspension eine stark protrahierte Wirkung, und die Kristalle können hierauf abgetrennt werden.
Bei den oben angegebenen Beispielen wurden Zinkinsulinkristalle verwendet. Das erfindungsgemässe Verfahren kann aber auch auf Insulinkristalle angewendet werden, welche andere Metalle, wie beispielsweise Kobalt, Kadmium, Nickel oder Kupfer enthalten. Zur Veranschaulichung eines derartigen Falles
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<tb>
<tb> 11 <SEP> : <SEP> Es <SEP> wird <SEP> eine <SEP> Kristallisationsmischung <SEP> mit <SEP> der <SEP> folgenden <SEP> Zusammensetzung <SEP> hergestellt <SEP> :0, <SEP> ze <SEP> zinkfi <SEP> : <SEP> eies <SEP> Ochsen <SEP> insulin <SEP>
<tb> 0, <SEP> 040go <SEP> Cu++ <SEP> (als <SEP> Chlorid)
<tb> 0,05 <SEP> m-Natriumzitrat
<tb> 15% <SEP> Aceton <SEP> und
<tb> HCI <SEP> bis <SEP> zur <SEP> Erreichung <SEP> eines <SEP> pH-Wertes <SEP> von <SEP> 6, <SEP> 0.
<tb>
Die Kristallisation findet statt, während bis zum nächsten Tag gerührt wird, worauf das Aceton abgedampft und die Suspension wie in Beispiel 7 beschrieben, verdünnt wird. Hiedurch erhält die Suspension die folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> 40 <SEP> Einheiten <SEP> Insulinkristalle <SEP> pro <SEP> cms
<tb> 87 <SEP> Jlg <SEP> Cu <SEP> pro <SEP> cm3 <SEP>
<tb> 0, <SEP> m-Natriumzitrat
<tb> 0, <SEP> 7% <SEP> NaCl
<tb> 0,1% <SEP> p-Oxybenzoesäuremethylester <SEP> .
<tb>
Hierauf wird der pH-Wert mittels In-HCl auf 5,5 eingestellt. Nach zweiwöchigem Stehen bei 45 C, zeigt die Suspension eine stark protrahierte Insulinwirkung.
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Anstatt die Insulinkristalle in Suspension der Aufbewahrung bei erhöhter Temperatur zu unterziehen, können die Kristalle auch als solche behandelt werden, wobei man Sorge tragen muss, dass die Kristalle während der Behandlung nicht austrocknen. Dies kann dadurch verhindert werden, dass die abgetrennten Kristalle in einem Behälter z. B. in einem Exsikkator aufbewahrt werden, in welchem beispielsweise mit einer wässerigen Salzlösung ein derartiger Dampfdruck aufrecht erhalten wird, dass der Wassergehalt der Kristalle beispielsweise im Intervall von 20 bis 40% konstant gehalten wird.
Bei einer solchen Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann man beispielsweise wie folgt vorgehen.
Beispiel 12 : Kristalle aus der Suspension S.. werden abgenutscht und auf einem tarierten Glasfilter gewogen, worauf sie unter Vakuum (1 - 2 mm Quecksilber) in einem Exsikkator aufbewahrt werden, welcher eine 5% ige Natriumchloridlösung enthält. Nach dreitägigem Stehen bei Raumtemperatur ist das Gleichgewicht erreicht und der Exsikkator wird während zwei Wochen auf einer Temperatur von 450C gehalten. Hiedurch wird das Gleichgewicht nur wenig verschoben und die Kristalle enthalten ungefähr 201o Wasser.
Die Kristalle werden dann in ein Suspensionsmedium suspendiert, so dass die Suspension dieselbe Zusammensetzung aufweist wie die Suspension S Diese Suspension zeigt eine etwas prolongiertere Wir- kung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von aus Rinderpankreasdrüsen gewonnenen Insulinkristallen mit verzögerter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass die Kristalle als solche unter Aufrechterhaltung eines Was- sergehaltes von mehr als 81o oder in Suspension, vorzugsweise wässeriger Suspension, bei einem pH-Wert unter 7, bei einer Temperatur von mehr als 20 C, vorzugsweise 40-70 C, während einer derartigen Zeitspanne aufbewahrt werden, dass sie nach Suspendierung in einem wässerigen, injizierbaren Medium und darauffolgender subkutane Injektion eine Insulinwirkung zeigen, welche, verglichen mit der Wirkung unbehandelter Kristalle unter sonst gleichen Bedingungen, protrahiert ist.