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Verfahren zur Herstellung injizierbarer, wässeriger
Suspensionen von amorphem Insulin
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung injizierbarer wässeriger Suspensionen von amorphem Insulin nit protrahierter Wirkung.
Die Anwesenheit von Zink in verschiedenen Insulinpräparaten für subkutane und intramuskuläre Injektion ist bekannt.
So ist es bekannt, dass eine protrahierte therapeutische Wirkung erzielt werden kann, wenn einer Insulinlösung grosse Mengen Zinkionen (etwa 10-200 y Zink pro Insulineinheit) zugesetzt werden. Wegen des grossen Zinkgehaltes haben unterdessen solche zinkreiche Insulinlösungen keine praktische klinische Verwendung gefunden.
Auch ist es bekannt, dass Protamin-Insulinpräparate mit Zinkzusatz einen bedeutend grösseren protrahierten Effekt haben, als solche Präparate ohne Zinkzusatz.
Ferner ist es bekannt, dass verschiedene Metalle proteinfällend wirken ; z. B. kann präzipitiertes Zinkhydroxyd zur Proteinfällung benützt werden.
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Das zinkfreie Insulin wurde aus gewöhnlichem, handelsüblichem Insulin durch eine Reihe aufeinanderfolgender Lösungs-und Fällungsoperationen hergestellt, unter Verwendung z. B. von Ammoniumhydroxyd und Ammoniumacetat als Puffer in den Fällungsvorgängen und von Milchsäure in den Lösungsgängen. Es wurde dann festgestellt, wieviel zinkfreies Insulin bei verschiedenen pH-Werten in Gegenwart von 9,5 y Zink je Insulineinheit und wieviel zinkfreies Insulin bei einem pH-Wert von 7 in Gegenwart verschiedener Mengen Zink gefällt wird.
Es wurde festgestellt, dass bei einem pH-Wert von 7 etwa 10 y Zink je Insulineinheit nötig sind, um eine vollständige Fällung des Insulins zu erreichen und eben bei diesem Zinkgehalt wurden bei pH-Werten unter 7 - 4, 5 ungefähr 5 - 150/0 des Insulins in Lösung gefunden.
Bei Versuchen mit kristallinem Insulin wurde dieses unter Zusatz verschiedener Mengen Zinkchlorid in Salzsäure gelöst, dann mit Natriumhydroxyd auf einen PH-Wert von 6,5 gebracht und der Zinkgehalt des erhaltenen Niederschlages festgestellt. Die Versuche ergeben, dass das amorphe Insulin, welches bei einem pH-Wert von 6, 5 gefällt wurde, mit steigender Zinkkonzentration steigende Zinkmengen enthielt.
Keine der zinkhaltigen Suspensionen von amorphem, durch die erwähnten chemischen Vorgänge erzeugtem Insulin wurde biologisch oder klinisch erprobt und keine dieser Suspensionen ist für eine praktische klinische Anwendung geeignet.
Schliesslich ist es bekannt, Insulin aus einer sauren Lösung durch Zusatz von Zinkhydroxyd, welches aus einer wässerigen Zinksulfatlösung durch Zusatz von kohlensäurehaltigem Natriumhydroxyd gefällt wurde, quantitativ in amorphem Zustand auszufällen. Die dadurch erhaltenen Suspensionen, welche einen PHwert von 5, 25 bis 6, 35 hatten und 2 - 14 r Zink je Insulineinheit enthielten, wurden biologisch und teilweise klinisch untersucht und es wurde eine intensivere und andauerndere Insulinwirkung als bei Verwendung von gewöhnlichen Insulinlösungen gefunden. Mit steigendem Zinkgehalt der Suspensionen scheint jedoch das Zink die Insulinwirkung aufzuheben.
Diese Suspensionen sind indessen-infolge ihrer Instabi-
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lität während der in der Praxis vorkommenden Aufbewahrungszeiten - praktisch nicht brauchbar.
Die vorliegende Erfindung beruht auf folgenden-chemischen Beobachtungen :
1. Amorphes, präzipitiertes Insulin kann nicht nur Zink, sondern auch Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan oder Eisen binden.
2. Durch Einstellung einer sauren Lösung von kristallinem oder gewöhnlichem amorphem Insulin auf einen pH-Wert von etwa 7 ist es möglich, das Insulin praktisch quantitativ in amorphem Zustande auszu- fällen, wenn eine oder mehrere der erwähnten Metallionen in solcher Menge anwesend sind, dass die erhaltene Suspension von amorphem Insulin mehr als etwa 2A. 10-5 Milliäquivalente Metall je cm3 enthält, wobei A die Zahl der internationalen Einheiten Insulin je cm3 Suspension angibt. Dies entspricht für Zink etwa 0. 6 y pro Insulineinheit.
3. Die erstrebte protrahierte Wirkung tritt bei zinkhaltigen wässerigen Suspensionen von amorphem Insulin nicht ein, wenn vom Phosphatpuffer oder Citratpuffer Gebrauch gemacht wird. Bei nickelhaltigen Suspensionen hat jedoch der Phosphatpuffer nicht diese Wirkung.
Nur durch Verwendung von Zusatzstoffen, deren Anionen eine Bindung zwischen Insulin und den Metallionen nicht verhindern, ist die praktisch quantitative Fällung des Insulins in amorphem Zustand bei PH 7 erreichbar.
4. Niederschläge von amorphem Insulin in Gegenwart der erwähnten Metallionen sind nur stabil, wenn sehr wenig Insulin (weniger als 20/0) in Lösung ist, und der pH-Wert auf etwa 7 gehalten wird. Sonst besteht die Gefahr, dass sich das amorphe Insulin beim Stehen in das kristalline Produkt verwandelt, was eine grundsätzliche Abänderung der protrahierten Wirkung verursacht.
In Übereinstimmung mit den geschilderten Beobachtungen ist das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass man die sterile Suspension auf einen pH-Wert von etwa 7, einen Insulingehalt je cm3 von ungefähr 40 internationalen Einheiten oder darüber und einen Gehalt an einem oder mehreren der Metallionen Zink, Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan und Eisen von etwa 2A. 10-5 bis etwa 12A. 10-5 Milliäquivalenten je cms einstellt (wobei A die Anzahl der internationalen Einheiten Insulin je cm3 Suspension angibt) unter Verwendung von Zusatzstoffen, insbesondere Pufferstoffen, deren Anionen bei neutraler Reaktion eine Bindung zwischen Insulin und den Metallionen nicht verhindern.
Auf diese Weise wird eine praktisch quantitative Fällung des Insulins in amorphem Zustand aufrechterhalten und das Entstehen von Insulin in kristallinem Zustand verhindert.
Die erfindungsgemäss herstellbaren Insulinpräparate haben mit relativ geringem Metallionengehalt eine mässig protrahierte Wirkung und können klinische Verwendung finden in Fällen, wo Insulinlösungen zu schnell wirken, und die bekannten Präparate mit protrahierter Wirkung zu langsam wirken. Ferner sind sie ohne Gefahr einer Kristallisation des amorphen Insulins mit Insulinkristallsuspensionen ähnlicher Zusammensetzung weitgehend vermischbar, wodurch eine schnellere Anfangswirkung solcher Kristallsuspensionen erreicht werden kann.
Mit dem gemäss der Erfindung für das wässerige Suspensionsmittel einzuhaltenden pH-Wert von etwa 7 erhalten die Präparate den gleichen Aciditätsgrad wie Blut und die GewebeflUssigkeiten des menschlichen Organismus. Bei diesem pH-Wert ist das amorphe Insulin sehr schwer löslich und demzufolge die erzeugte Suspension am stabilsten.
FUr den klinischen Gebrauch werden isotone Suspensionsmittel bevorzugt. Zu diesem Zweck werden dem wässerigen Medium z. B. Glukose, Kochsalz oder Glyzerin zugesetzt. Andere hiefür verwendbare Stoffe sind aus der einschlägigen Literatur zu entnehmen.
Um die Insulinpräparate haltbarer zu machen, ist es ferner vorteilhaft, ein oder mehrere Konservierungsmittel, wie p-Oxybenzoesäuremethylester (Nipagin), p-Oxybenzoesäurepropylester und Phenylmercuriacetat zuzusetzen. Konservierungsmittel, wie Phenol und Kresol, sind zu vermeiden, weil sie eine Kristallisation des Insulins befördern.
Nach einer bevorzugten AusfUhrungsform des erfindungsgemässen Verfahrens verfährt man derart, dass eine saure Insulinlösung mit einer, die andern Ausgangsstoffe ausser der Puffersubstanz enthaltenden Lösung gemischt und nach einer Keimfiltration eine sterilisierte Lösung einer Puffersubstanz unter aseptischen Bedingungen zugesetzt, sowie der pH-Wert erforderlichenfalls auf etwa 7 eingestellt wird. Durch Ausfällung des Insulins während des Verfahrensganges werden Insulinniederschläge mit günstigsten physikalischen Eigenschaften erhalten.
Als Metallionen liefernde Stoffe können anorganische oder organische Salze der genannten Metalle, wie Chloride, Sulfate, Nitrate und Acetate, verwendet werden. Hydroxyde und Oxyde sind auch verwendbar, wenn sie während der Präparation in Lösung gebracht werden, so dass die Metallionen für das Insulin zur Verfügung stehen. Als Ausgangsmaterial kann amorphes Insulin oder kristallines Insulin verwendet werden ; letzteres muss jedoch im Verlaufe des Verfahrens in Lösung gebracht werden.
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Als Puffersubstanzen können Acetat-, Borat-, Diäthylbarbiturat und Maleatpuffer verwendet werden.
Wie bereits erwähnt wurde, ist amorphes Insulin imstande, verschiedene Mengen der angeführten Metalle aufzunehmen. Es ist daher nach dem Verfahren gemäss der Erfindung auch möglich, amorphes Insulin mit einem solchen Metallgehalt zu verwenden, dass der Metallgehalt der endgültigen Suspension zumindest teilweise aus dem angewendeten amorphen Insulin stammt. In diesem Falle soll das amorphe Insulin etwa über 0, 4 Milliäquivalente Metall je Gramm enthalten.
Man kann aber auch kristallines Insulin mit einem entsprechenden Metallgehalt verwenden, dieses muss jedoch im gelösten Zustande angewendet oder während des Verfahrensganges in Lösung gebracht werden, um es darauffolgend im amorphen Zustande ausfällen zu können.
Die im folgenden gegebenen Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung.
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Stammlösung II. 20 cm3 einer wässerigen Zinkchloridlösung mit einem Gehalt von 1% Zink werden mit destilliertem Wasser auf 125 cm aufgefüllt.
Stammlösung III. 10 cm einer wässerigen Kupferchloridlösung mit 1% Kupfergehalt werden mit de- stilliertem Wasser auf 100 cm aufgefüllt.
Stammlösung IV. 10 cms einer wässerigen Nickelchloridlösung mit 1% Nickel werden mit destilliertem Wasser auf 100 cm3 aufgefüllt.
Stammlösung V. 1, 36g Natriumacetat (mit 3 Mol Kristallwasser) werden in destilliertem Wasser gelöst und damit auf 100 cm3 aufgefüllt.
Stammlösung VI. 3, 58 g sek. Natriumphosphat mit 12 Molen Kristallwasser werden in destilliertem Wasser gelöst und damit auf 100 ems aufgefüllt.
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Das Insulin wird durch das zugesetzte Natriumhydroxyd amorph ausgefüllt. Die erzeugte Suspension hat einen pH-Wert von 7, ihr Zinkgehalt beträgt etwa 1 y je Insulineinheit.
Beispiel 2 : 1, 3 cm3 Glyzerin werden mit 0, 5 cm3 einer 25"igen Lösung von Nipagin in Äthanol gemischt und mit 50 ems destilliertem Wasser versetzt.
10 cm3 Stammlösung I, 10 cms Stammlösung III und 10 cm3 einer Stammlösung, die durch Lösen von 2,06 g des Natriumsalzes der Diäthylbarbitursäure in 100 cm3 destilliertem Wasser hergestellt ist, werden der erzeugten Mischung nach steriler Filtration zugesetzt. Dann werden 3, 4 ems sterile, 0, InSalzsäure zugegeben und die Mischung mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 cm3 verdünnt.
Die erzeugte Suspension von amorphem Insulin hat einen pH-Wert von 7 und enthält etwa 2, 5 y Kupfer pro Insulineinheit.
Beispiel3 :1,3cm3Glyzerinwerdenmit0,5cm3einer25%igenLösungvonNipagininÄthanol gemischt und die Mischung mit 50 cms destilliertem Wasser versetzt. Nach Behandlung der Mischung im Autoklaven werden 10 cms Stammlösung I, 10 cms Stammlösung IV und 10 ems Stammlösung VI zugesetzt. Nach Zugabe von 0,5cm3 steriler 0, ln-Salzsäure wird die Mischung schliesslich mit sterilem destilliertem Wasser auf 100 cms verdünnt.
Die erzeugte Suspension von amorphem Insulin hat einen pH-Wert von 7 und enthält rund 2, 5 y Nickel pro Insulineinheit.
Beis. piel 4 : 174 mg kristallines Insulin werden in 10 cms 0, 02n-Salzsäure gelöst. Dann wird eine Lösung folgender Zusammensetzung zugesetzt : 1, 3 cm3 Glyzerin, 0, 5 ems 250/oige alkoholische Nipaginlösung, 8 mg Zink (als Chlorid) und Wasser auf 80 cm.
Die Mischung wird steril filtriert und dann mit 10 cm3 einer im Autoklaven behandelten Mischung aus 3,0 cm3 0, ln-Natriumhydroxydlösung, 136 mg krist. Natriumacetat und 7 cm Wasser versetzt.
Die erzeugte Suspension von amorphem Insulin hat einen pH-Wert von 7 und einen Zinkgehalt von etwa 2 y je Insulineinheit.
Beispiel 5 : 4000 internationale Einheiten amorphes Insulin werden in 5 cm 3 einer Zinkchloridlösung mit 0, 16% Zinkgehalt suspendiert und dann mit 3 cm3 0, 02n-Salzsäure und 10 cm3 l, 16' iger
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Maleinsäurelösung gelost. Dann werden 1, 3 cm3 Glyzerin, 0,5 cm3 250/oige alkoholische Nipaginlösung und Wasser auf 80 cams zugegeben. Die Lösung wird steril filtriert und dann der pH-Wert mit 20 cm3 steriler, 0, In-Natronlauge auf 7 eingestellt.
Das erzeugte Präparat enthält rund 2 y Zink je Insulineinheit.
Beispiel 6 : 4000 internationale Einheiten steriles, amorphes Insulin werden in einem steril filtrierten Medium aus 8 mg Zink (als Chlorid), 95 mg Borax, 1, 3 cm3 Glyzerin. 0, 5 cm3 25% tiger alkoholischer Nipaginlösung, 2,9 cm3 0, ln-Salzsäure und Wasser auf 100 cm3 suspendiert.
Das erzeugte Präparat hat einen pH-Wert von 7 und einen Zinkgehalt von rund 2 y je Insulineinheit.
Beispiel 7 : 200 mg amorphes Insulin (20 internationale Einheiten je mg) mit einem Zinkgehalt von 2, 30/0 werden mit folgender Lösung gemischt: 2,5 cm3 Zinkchloridlösung mit 0, 16% Zinkgehalt,
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02a-Salzsäure, 1,Die Lösung wird steril filtriert und der pH-Wert mit 20 cm3 steriler 0, In-Natronlauge auf 7 eingestellt.
Das Präparat hat dieselbe Zusammensetzung wie das nach Beispiel 5.
Beispiel 8 : 174 mg kristallines Insulin mit einem Zinkgehalt von 2, 7% werden zusammen mit 10 cm3 1,16%iger Maleinsäure, 1,3 cm3 Glyzerin, 0,5 cm3 25%iger alkoholischer Nipaginlösung, 0, 8 cm3 0, ln-Salzsäure und Wasser auf 80 cm3 in Lösung gebracht.
Die Lösung wird steril filtriert und der pH-Wert mit 20 cm3 steriler, 0, ln-Natronlauge auf 7 erhöht.
Die so erzeugte Insulinsuspension hat einen pH-Wert von 7 und enthält etwa l y Zink je Insulineinheit.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung injizierbarer, wässeriger Suspensionen von amorphem Insulin mit protrahierter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man die sterile Suspension auf einen pH-Wert von etwa 7, einen Insulingehalt je cm3 von ungefähr 40 internationalen Einheiten oder darüber und einen Gehalt an einem oder mehreren der Ionen Zink, Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan und Eisen von etwa 2A. 10-5 bis etwa 12A. 10-5 Milliäquivalenten je cm einstellt (wobei A die Anzahl der internationalen Einheiten Insulin je cm3 Suspension angibt), unter Verwendung von Zusatzstoffen, insbesondere Pufferstoffen, deren Anionen bei neutraler Reaktion eine Bindung zwischen Insulin und den Metallionen nicht verhindern.