DE950595C

DE950595C - Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Insulinpraeparates mit verzoegerter Wirkung

Info

Publication number: DE950595C
Application number: DEN5679A
Authority: DE
Inventors: Dr Phil Knud Hallas-Moller; Karl Petersen; Jorgen Schlichtkrull
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1951-06-26
Filing date: 1952-06-21
Publication date: 1956-10-11

Description

Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Insulinpräparates mit verzögerter Wirkung Die Bedeutung der Anwesenheit von Zink in zahlreichen Insulinpräparaten, die der subkutanen und intramuskulären Injektion dienen, wurde zum Gegenstand einer Anzahl chemischer, biologischer und klinischer Tests gemacht.
So ist es bekannt, daß bei Kaninchen eine verzögerte therapeutische Wirkung durch subkutane Injektion von gelöstem Insulin erreicht werden kann, wenn die Insulinlösung große Mengen. Zink enthält. Deshalb ist es zur Erzielung einer Depotwirkung notwendig, so hohe Mengen Zink zu verwenden (annähernd 10 bis 200 Gamma je Insulineinheit, was etwa 40 bis 800 mg Zink pro 100 ml mit 40 internationalen Insulineinheiten je ml entspricht), daß bei Menschen durch die Injektion an der Injektionsstelle schwere Entzündungen auftreten. Es ist außerdem auch sehr zweifelhaft, ob es für den menschlichen Organismus zuträglich ist, ihm täglich derartig große Mengen Zink zuzuführen. Insulinpräparate, die aus gelöstem Insulin und unter Zusatz von Zink hergestellt sind, konnten infolgedessen klinisch praktisch überhaupt nicht verwendet werden.
Es ist ferner bekannt, daß Protamin-Insulin-Präparate mit einer Zinkbeimengung eine erheblich größere Depotwirkung als solche ohne Zink- beimengung besitzen. Diese Erfahrung hat sich als sehr bedeutsam erwiesen, denn Protamin-Insulin-Präparate mit Zinkbeimengung werden in der klinischen Praxis in umfangreichem Maße verwendet.
Weiterhin ist es bekannt, daß eine Anzahl von Metallen Eigenschaften besitzen, welche das Ausfällen von Protein bewirken. So kann beispielsweise gefälltes Zinkhydrnxyd zum Ausfällen von Proteinen verwandt werden.
Insulin wurde, wie bekannt, quantitativ dadurch ausgefällt, daß ein Zinkhydroxydniederschlag, der aus Zinksulfat und mehr oder weniger karbonathaltigem Ätznatron gewonnen wurde, einer saueren Insulinlösung zugesetzt wurde. Der Niederschlag von Insulin und basischem Zinksalz wurde experimentell Tieren injiziert mit dem Ergebnis, daß die Depotwirkung des Insulins intensiver und nachhaltiger war als bei der Anwendung gewöhnlichen Insulins. Bei größeren Zinkmengen scheint jedoch das Metall die Wirkung des Insulins zu neutraler sieren. Die klinische Wirkung dieser Niederschläge wurde jedoch nicht erprobt, und es wurden auf der Grundlage der durchgeführten biologischen Tests keine Präparate hergestellt, die für den klinischen Gebrauch geeignet gewesen wären.
Schließlich wurden chemische Tests durchgeführt über die Fähigkeit des amorph niedergeschlagenen Insulin, Zink aufzunehmen im Hinblick auf das Verhältnis von Zink zu Insulin in den Pankreasdrüsen. Als Ausgangsmaterial für diese Versuche wurde zum Teil zinkfreies Insulin, zum Teil zinkhaltiges kristallines Insulin verwendet.
Das zinkfreie Insulin wurde aus gewöhnlichem, handelsüblichem Insulin über eine Anzahl aufeinanderfolgender Lösungs- und Niederschlagsprozesse hergestellt, wobei beispielsweise Ammoniumhydroxvd und Ammoniumazetat als Puffer beim Auffällen sowie beispielsweise Milchsäure beim Lösen verwendet wurden. Es wurde dann durch Versuche festgestellt, wieviel zinkfreies Insulin bei den verschiedenen pn-Werten beim Vorhandensein von 9,5 Gamma Zink pro Insulineinheit ausgefällt wird und wieviel zinkfreies Insulin bei einem pn-Wert von 7, beim Vorhandensein unterschiedlicher Zinkmengen ausgefällt wird. Es wurde festgestellt, daß bei PH7 annähernd IO Gamma Zink pro Insulineinheit erforderlich waren, um eine vollständige Ausfällung des Insulins zu erreichen. Bei dem gleichen Zinkgehalt und bei pH-Werten unter 7 bis herunter auf 4,5 blieben annähernd 5 bis I5 Ozon des Insulins in Lösung.
Bei den mit kristallinem Insulin durchgeführten Versuchen wurde das kristalline Insulin in Salzsäure unter Hinzufügung von Zinkchlorid in unterschiedlichen Mengen gelöst und dann mit Natronlauge auf p, 6,5 gebracht. Danach wurde der Zinkgehalt des erhaltenen Niederschlages geprüft. Die Untersuchungen. ergaben, daß das amorphe Insulin, das durch Einstellung auf pn 6,5 ausgefällt worden war, zunehmende Mengen an Zink bei steigender Zinkkonzentration des Füllungsmediums enthielten.
Keine der zinkhaltigen Suspensionen von amorphem Insulin, die durch die erwähnten chemischen Versuche hergestellt worden waren, wurde biologisch oder klinisch erprobt. Keine der bekannten Suspensionen ist für den praktischen klinischen Gebrauch verwendbar.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung injizierbarer Insulinpräparate mit Depotwirkung, die auf amorph niedergeschlagenem Insulin beruhen. Die Erfindung gründet sich auf die folgenden chemischen Beobachtungen: I. Amorph ausgefälltes Insulin kann nicht nur Zink, sondern auch andere Metalle binden. Wird Zink durch Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan oder Eisen ersetzt, so wird man feststellen, daß diese Metalle in entsprechender Weise wie Zink von dem amorphen Insulin aufgenommen werden, wobei sich entsprechende Veränderungen in der Löslichkeit des Insulins und eine abgeänderte biologische Wirkung ergeben.
2. Beim Einstellen einer saueren Lösung von kristallinem oder amorphem Insulin auf annähernd PH7 wird es möglich sein, das Insulin praktisch quantitativ in amorphem Zustand in Anwesenheit von beträchtlich weniger Zink als bei den obenerwähnten biologischen Versuchen und bei den chemischen Versuchen, bei denen zinkfreies Insulin als Ausgangsmaterial verwendet wurde, auszufällen. Nach der Erfindung hat es sich herausgestellt daß die quantitative Ausfällung schon erreicht werden kann, wenn über annähernd o,6 Gamma Zink pro Insulineinheit vorhanden ist. Entsprechende Ausfällungen können auch erreicht werden durch Verwendung der obenerwähnten Metalle in einer Menge von der gleichen - Größenordnung wie derwenigen der speziell erwähnten Zinkmenge. Mit anderen Worten, Tatsache ist, daß es möglich sein wird, durch Einstellen auf etwa PH 7 das Insulin fast quantitativ in amorphem Zustand abzuscheiden, wenn eines oder mehrere der erwähnten Metalle in einer solchen Menge vorhanden sind, daß die resultierende Suspension amorphen Insulins mehr als annähernd 2 X A X Io-5 Milliäquivalente der erwähnten Metalle pro ml der Suspension enthält, wobei »A« die Anzahl der internationalen Insulin einheiten pro ml der Suspension bedeutet.
3. Außerdem haben die chemischen Versuche überraschenderweise ergeben, daß es nicht möglich ist, eine Zink-Insulin-Suspension nach der Erfindung mittels der gewöhnlichen, bekannten Verfahren zur Herstellung neutraler Insulinpräparate mit Depotwirkung herzustellen. Versuchspräparate, die Zink und Insulin enthalten und nach den bekannten Verfahren hergestellt wurden (Zufügung von isotonischen und konservierenden Agenzien und Puffern unter aseptischen Bedingungen), haben nahezu die gleiche Wirkung wie gewöhnliches Insulin und sind außerdem unbeständig. Weitere Versuche haben ergeben, daß die Ursache hierfür den normal erweise verwendeten Puffersubstanzen zuzuschreiben ist, die auf den chemischen Prozeß zwischen Metall und Insulin störend einwirken. Da es für die verzögerte biologische Wirkung erforderlich ist, daß das Insulin bei neutraler Reaktion des Blutes schwer löslich ist, ist es infolgedessen notwendig, daß es mit möglichen Faktoren in Verbindung steht, die die Bildung des schwer löslichen amorphen Insulins beeinflussen oder sie vollkommen neutralisieren können. Der gebräuchlichste Puffer, Phosphat, kann infolgedessen nicht verwendet werden außer bei Präparaten, die auf Nickel basieren, Citratpuffer sind mit jedem der Metalle zusammen unbrauchbar. Als brauchbare Puffersubstanzen seien beispielsweise erwähnt: Azetate, borsaure Salze (borate) Diäthylbarbituratpuffer und Maleatpuffer (maleate) sowie Phosphatpuffer, der jedoch nur dann verwendet werden darf, wenn die Depotwirkung des Präparates auf dem Vorhandensein von Nickel beruht. Der chemische Prozeß zwischen Insulin und Metall, der die verzögerte biologische Wirkung verursacht, ist mit anderen Worten sehr empfindlich gegenüber selbst kleinen Beimengungen anderer Stoffe.
Bei der Auswahl von Beimengungen, wie z. B.
Puffersubstanzen, isotonischen und konservierenden Agenzien, muß deshalb eine Gewähr dafür gegeben sein, daß die fraglichen Substanzen in den gewünschten Konzentrationen keine größere Affinität zu dem verwendeten Metall aufweisen als das Insulin, da sonst die Bindung zwischen Insulin und Metallion, die Vorbedingung für die verzögerte biologische Wirkung ist, verhindert wird.
4. Gemäß der Erfindung hat es sich weiterhin herausgestellt, daß Niederschläge von amorphem Insulin in Gegenwart der erwähnten Metalle nur innerhalb eines ganz bestimmten p-Bereiches und abhängig davon, wieviel Insulin in gelöstem Zustand vorhanden ist, stabil sind. Wenn der pn-Wert nicht innerhalb eines ganz bestimmten, eng begrenzten Bereiches gehalten wird und wenn nicht Vorkehrungen getroffen werden, die es gewährleisten, daß nur eine sehr geringe Menge Insulin in gelöstem Zustand vorhanden ist, geht das amorph ausgefällte Insulin durch Stehen in kristallines Insulin über. Um diese Umwandlung zu vermeiden, muß der pH-Wert zwischen 6 und 6,5 und etwa 8,5 liegen. Innerhalb dieses pBerelches sind auf jeden Fall weniger als 20/0 des vorhandenen Insulins in Lösung.
Wenn die untere Grenze für den pH-Wert mit etwa 6 bis 6,5 angegeben ist, so liegt der Grund hierfür darin, daß sich diese Grenze aus der Menge der vorhandenen erwähnten Metalle ergibt, so daß ein niedrigerer pn-Wert mit einer zunehmenden Menge Metall verwendet werden kann. Wenn beispielsweise der Zinkgehalt 5 Gamma pro Insulineinheit oder mehr beträgt, so ist es möglich, auf etwa PH = 6 herunterzugehen, ohne daß die Gefahr der Kristallisation besteht, während es bei 2 Gamma Zink pro Insulineinheit nur möglich ist, auf annähernd PH = 6,5 herunterzugehen.
Um den pn-Wert innerhalb des erwähnten Bereiches zu halten, können Puffersubstanzen verwandt werden. Dies muß besonders beachtet werden, wenn ein p-Wert nahe der obenerwähnten unteren Grenze von annähernd 6 bis 6,5 verwendet wird, wo ein geringes Abnehmen des pn-Wertes die Gefahr der Kristallisation des amorphen Insulins nach sich zieht.
In Übereinstimmung mit den oben aufgeführten Erkenntnissen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension von amorphem Insulin in einem wäßrigen Suspensionsmittel hergestellt wird, in dem eines oder mehrere der Metalle, wie Zink, Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan und Eisen, in einer solchen Konzentration vorhanden ist, daß die fertige Suspension mehr als annähernd 2 X A X io-5 Milliäquivalente der genannten Metalle pro ml der Suspension enthält, wobei »A« die Anzahl der internationalen Insulineinheiten pro ml der Suspension angibt, und daß die Suspension auf einen PH Wert von etwa 6 bis etwa 8,5 gebracht wird, wobei gleichzeitig vermieden wird, daß solche Ionen vorhanden sind, die bei neutraler Reaktion eine größere Affinität gegenüber den erwähnten Metallen aufweisen als Insulin, wodurch sich weniger als 20/a des in der Suspension vorhandenen Insulins in gelöstem Zustand befinden.
Klinische Versuche haben gezeigt, daß es möglich ist, auf diese Weise zu injizierbaren Insulinpräparaten zu gelangen, die eine Depotwirkung von 24 Stunden und mehr aufweisen und bei denen in den meisten Fällen das injizierte Insulin besser ausgenutzt wird, als es bei den bekannten Insulinpräparaten mit einer entsprechenden Depotwirkung der Fall ist. Dadurch wird Insulin eingespart.
Die klinische Wirkung ist reproduzierbar, selbst wenn die hergestellten Präparate lange Zeit aufbewahrt worden sind. Der Grund hierfür hängt mit dem pn-Wert der Präparate und der geringen Menge gelösten Insulins zusammen, wodurch es verhindert wird, daß das amorphe Insulin durch Stehen in kristallines Insulin übergeht. Eine derartige Umwandlung des amorphen Insulins in kristallines Insulin hätte tatsächlich eine erhebliche Änderung der Depotwirkung der Präparate zur Folge.
In der praktischen Diabetestherapie ist es von großer Wichtigkeit, Insulinipräparate bereitzuhalten, die eine solche therapeutische Wirkung haben, daß in der großen Mehrzahl der Fälle eine einzige Injektion pro Tag ausreicht. Es hat sich erwiesen, daß der Bedarf an solchen Präparaten mit den erfindungsgemäß hergestellten Insulinpräparaten gedeckt werden kann, die einen Metallgehalt von annähernd 3XAXIo-5 bis annähernd I8XAXIo-: Milliäquivalenten pro ml aufweisen, im Falle von Zink entsprechend einer Menge von rund I bis rund 6 Gamma pro Insulineinheit. Mit Präparaten dieser Zusammensetzung ist es durch eine Injektion pro Tag möglich, in den Vormittags- und Mittagsstunden einen geeigneten Insulinvorrat zu erhalten, wobei gleichzeitig genügend Insulin vorhanden ist, um den Insulinbedarf auch für den Abend und die Nacht zu decken.
In Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden ist das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Suspension des amorphen Insulins ein Gehalt eines oder mehrerer der erwähnten Metalle von annähernd 3 X A X IO5 bis annähernd I8 X A X Io-5 Milliäquivalenten je ml gegeben wird, wobei »A« die Anzahl der internationalen Insulineinheiten pro ml der Suspension darstellt.
Dies ermöglicht es, ohne Verwendung organismusfrenider Stoffe zu Insulinpräparaten zu gelangen, die eine besonders günstige Depotwirkung aufweisen und die den bekannten Insulinpräparaten überlegen sind, was die Verwertung der injizierten Insulinmenge anbelangt und was infolgedessen auch die Anpassung des Patienten an das Präparat be trifft.
Enthält das als Ausgangsmaterial verwendete In. sulin nur eine geringe Menge Metall, so wird ein wäßriges Suspensionsmittel verwendet, das selbst eines oder mehrere der in Frage kommenden Me talle in einem Gesamtbetrag von über annähernd 2 X A X Io-5 Milliäquivalenten pro ml enthält.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist es zweckmäßig, wenn das wäßrige Suspensionsmittel einen pn-Wert von 7 besitzt oder auf einen solchen gebracht wird. Dadurch erhalten die resultierenden Präparate den gleichen pn-Wert wie das Blut und die Gewebeflüssigkeiten im menschlichen Körper. Auch ist bei diesem p-Wert das amorphe Insulin äußerst schwer löslich, und infolgedessen sind die hergestellten Suspensionen sehr beständig.
Aus klinischen Gründen ist die Verwendung isotonischer Suspensionsmittel vorzuziehen. Um wäßrige Medien isotonisch zu machen, können Stoffe wie Glukose, Chlornatrium oder Glyzerin verwendet werden. Diese Stoffe sind jedoch nur als Beispiele anzusehen. Andere Beispiele können der Litze ratur auf diesem Gebiet entnommen werden.
Um die Insulinpräparate beständig zu machen, ist es weiterhin zweckmäßig, eines oder mehrere der gewöhnlich bei Injektionsflüssigkeiten verwendeten Konservierungsmittel beizumengen. p-Oxybenzoesäuremethyl- oder propylester soyae Phenyl-Quecksilber-Azetat sind Beispiele für solche Schutzstoffe.
Das Verfahren nach der Erfindung kann. derart ausgeführt werden, daß die verwendeten Ausgangsmaterialien (amorphes Insulin, Metallverbindung, destilliertes Wasser und gegebenenfalls Puffersubstanz, isotonisches und konservierendes Agens) in beliebiger Reihenfolge zusammengemischt werden. Der pH-Wert der so hergestellten Mischung wird dabei, falls nötig, auf rund 6 bis 8,5 gebracht.
Falls die Ausgangsstoffe steril sind, z. B. in Form von sterilen Lösungen, muß unter aseptischen Bedingungen gearbeitet werden. Sollte die Durchführung des Verfahrens eine nicht sterile insulinhaltige Mischung ergeben, so ist dafür zu sorgen, daß das Insulin in gelöstem Zustand vorhanden ist, und es ist dann vor der Ausfällung des Insulins unter aseptischen Bedingungen eine Sterilisation, beispielsweise eine Keimfiltration, einzuschalten.
Werden noch weitere Zusätze benötigt, so müssen diese ebenfalls steril verwendet werden.
Als Metallverbindung kann ein anorganisches oder organisches Salz, beispielsweise ein Chlorid, Sulfat, Nitrat oder Azetat, ein Hydroxyd oder ein Oxyd, das bei der Präparation in Lösung geht, Anwendung finden. Auch Metallkomplexverbindungen, die bei der Präparation in eine ionogene Form umgewandelt werden, in der das Metall vom Insulin aufgenommen werden kann, sind verwendbar. Beispiele solcher Metallkomplexverbindungen sind Diammin- und Tetramminzinksalze, komplexe Salze von organischen Aminen und Aminosäuren und anorganischen Zinksalzen, Ammoniakate von Kobalt(II)-salzen und Nickelsalzen und komplexe Salze von organischen Aminen und Kobalt(II)-salzen.
Als Ausgangsmaterial kann an, Stelle von amorphem Insulin auch kristallines Insulin verwendet werden. In diesem Falle ist es bei der Durchführung des Verfahrens unbedingt erforderlich, das kristalline Insulin zunächst in Lösung zu bringen.
Weiterhin ist es von größtem Vorteil, das Insulin in Form einer saueren Lösung von amorphem oder kristallinem Insulin zu verwenden, so daß das Ausfällen des amorphen Insulins während der Präparation selbst erfolgt. Dadurch werden die günstigsten therapeutischen Eigenschaften des Niederschlages erreicht.
Bei einem vorzugsweise gewählten Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird eine sauer Insulinlösung mit einer Lösung der anderen Ausgangsstoffe außer den Puffersubstanzen gemischt. Danach wird eine Keimfiltration durchgeführt. Anschließend werden eine sterilisierte Lösung von. Puffersubstanzen sowie gegebenenfalls den pn-Wert einstellende Substanzen unter aseptischen Bedingungen zugesetzt, um einen pH-Wert zwischen rund 6 und rund 8,5 zu erhalten.
Wie schon oben erwähnt wurde, ist amorphes Insulin in der Lage, unterschiedliche Mengen der genannten Metalle aufzunehmen. Deshalb kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch so vorgegangen werden, daß amorphes Insulin mit einem solchen Gehalt der in Frage kommenden Metalle verwendet wird, daß der Metallgehalt der fertigen Suspensionen ganz oder teilweise von dem verwendeten amorphen Insulin herrührt. In diesem Fall hat das amorphe Insulin zweckmäßigerweise einen Metallgehalt von über annähernd o,4Milliäquivalenten pro Gramm.
An Stelle von amorphem Insulin, das einen solchen Metallgehalt aufweist, daß der Metallgehalt der fertigen Suspensionen ganz oder teilweise aus dem verwendeten amorphen Insulin stammt, kann auch von kristallinem Insulin mit einem entsprechenden Metallgehalt ausgegangen werden. In diesem Fall muß es während der Zubereitung in Lösung gebracht werden, damit es sich anschließend im amorphen Zustand niederschlägt.
Zur weiteren Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf die nachstehend aufgeführten Beispiele verwiesen, die verschiedene Ausführungsformen zeigen.
Wenn bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Lösungen der verschiedenen Ausgangsstoffe verwendet werden, so ist es auch möglich, so vorzugehen, daß man eine Änzahl steriler Stammlösungen herstellt, die als Grund- lage für die Herstellung verschiedener Präparate durch Beimischung der Grundlösung unter aseptischen Bedingungen verwendet -werden. Es kann beispielsweise folgende Grundlösung hergestellt werden: Stammlösung 1: 2,I8 g rekristallisiertes Insulin (23 IE pro mg) werden in 25 ml 0,I n-Salzsäure gelöst und mit destilliertem Wasser auf I25 ml aufgefüllt.
Stammlösung II: 20 ml wäßriger Zinkchloridlösung mit I °/0 Zink wird mit destilliertem Wasser auf I25 ml aufgefüllt.
Stammlösung III: IO ml einer I°/oigen wäßrigen Kupferchloridlösung wird mit destilliertem Wasser auf IOO ml aufgefüllt.
Stammlösung IV: IO ml einer I°/oigen wäßrigen Nickelchloridlösung wird mit destilliertem Wasser auf IOO ml aufgefüllt.
Stammlösung V: 1,36 g Natriumazetat mit 3 Mol Kristallwasser werden in destilliertem Wasser zu 100 ml gelöst.
Stammlösung VI: I,I6 g Maleinsäure werden in destilliertem Wasser zu IOO ml gelöst.
Stammlösung VII: 2,06 g Natrium-Diäthyl-Barbiturat werden in destilliertem Wasser zu IOO ml gelöst.
Stammlösung VIII: o,g5 g Borax werden in destilliertem Wasser zu 100 ml gelöst.
Stammlösung IX: 3,58 g sekundäres Natriumphosphat mit 12 Mol Kristallwasser werden in destilliertem Wasser zu 100 ml gelöst.
Beispiel I I,3 ml Glyzerin averden mit 0,5 ml einer 250/oigen Lösung von p-Oxybenzoesäuremethylester in Äthanol gemischt, und 50 ml destilliertes Wasser werden hinzugefügt. Nach steriler Filtration werden der Mischung Ioml der Stammlösung I, 2,5 ml der Stammlösung II und IO ml der Stammlösung V zugesetzt; anschließend werden 3 ml steriles 0,I n-Natriumhydroxyd hinzugefügt, und die Mischung wird mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml aufgefüllt.
Durch die Beimengung des Natriumhydroxyds wird das Insulin amorph ausgefällt, und die gewonnene Suspension erhält den pn-Wert 7. Sie enthält annähernd I Gamma Zink je Insulineinheit.
Beispiel II Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel I, jedoch wird die doppelte Menge der Stammlösung II verwendet mit dem Ergebnis, daß die hergestellte Suspension von amorphem Insulin annähernd 2 Gamma Zink je Insulineinheit enthält.
Beispiel III Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel I, jedoch werden 10 mol der Stammlösung II und 3,4 ml steriles 0,1 n-Natriumhydroxyd verwendet.
Die so gewonnene Suspension von amorphem Insulin hat auch den pn-Wert 7, enthält jedoch annähernd 4 Gamma Zink je Insulineinheit.
Beispiel IV Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel III, jedoch wird eine Beimengung von 2,7 ml steriles 0,I n-Natriumhydroxyd mit dem Ergebnis verwendet, daß die gewonnene Suspension von amorphem Insulin den p-Wert6 aufweist.
Beispiel V I,3 ml Glyzerin werden mit 0,5 ml einer 250/oigen Lösung von p-Oxybenzoesäuremethylester in Athylalkohol gemischt, und es werden 50 ml destilliertes Wasser zugefügt. Nach steriler Filtration werden der Mischung IO ml der Stammlösung I, 5 ml der Stammlösung II und 10 mol der Stammlösung IV zugesetzt. Danach werden 2I,4 ml steriles 0,I n-Natriumhydroxyd hinzugefügt, und die Mischung wird sodann mit sterilem destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt. Die Suspension aus amorphem Insulin weist einen pH-Wert von 7 auf und enthält annähernd 2 Gamma Zink je Insulineinheit.
Beispiel VI Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel V, jedoch werden an Stelle von 10 mol der Stammlösung VI 10 mol der Stammlösung VII und an Stelle von 2I,4 ml Natriumhydroxyd 4,5 ml sterile 0,I n-Salzsäure verwendet.
Die erhaltene Suspension von amorphem Insulin hat den pE-Wert 7 und enthält annähernd 2 Gamma Zink je Insulineinheit.
Beispiel VII Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel V, jedoch werden an Stelle von 10 mol der Stammlösung VI IO ml der Stammlösung VIII und an Stelle von 2I,4 ml Natriumhydroxyd o,g ml sterile o,I n-Salzsäure verwendet. Die erzielte Suspension von amorphem Insulin hat den pn-Wert 7 und einen Zinkgehalt von annähernd 2 Gamma je Insulineinheit.
Beispiel VIII 1,3 ml Glyzerin werden mit 0,5 ml einer 250/oigen Lösung von p-Oxybenzoesäuremethylester in Athylalkohol gemischt, und es werden sodann 50ml destilliertes Wasser hinzugefügt.
10 mol der Stammlösung 1, 10 mol der Stammlösung III und 10 mol der Stammlösung VII werden nach steriler Filtration dem Gemisch zugesetzt.
Hiernach werden 3,4 ml steriler 0,1 n-Salzsäure zugegeben, und die Mischung wird mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt. Die so hergestellte Suspension von amorphem Insulin hat den p-Wert 7 und enthält annähernd 2,5 Gamma Kupfer je Insulineinheit.
Beispiel IX I,3 ml Glyzerin werden mit 0,5 ml einer 25%igen Lösung von p-Oxybenzoesäuremethylester in Athylalkohol vermischt, und es werden sodann 50 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. 10 mol der Stammlösung I, 10 mol der Stammlösung IV und Ioml der StammlösungIX werden, nachdem die Mischung im Autoklav erhitzt wurde, dieser zugesetzt. Hierauf werden 0,5 ml steriler 0,I n-Salzsäure hinzugefügt, und die Mischung wird mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt.
Die erzielte Suspension von amorphem Insulin hat den pE-Wert 7 und enthält annähernd 2,5 Gamma Nickel je Insulineinheit.
Beispiel X I74 mg kristallines Insulin (I mg = 23 IE) werden in 2,5 ml einer Zinkchloridlösung, die 0,160/0 Zn++ enthält, suspendiert und durch Beimischung von 10 tal 0,02 n-HCl gelöst. 1,3 ml GJyzerin als isotonisches Agens und 0,5 ml 25%iger alkoholischer Nipaginlösung als konservierendes Agens werden dann hinzugefügt. Darauf findet eine Verdünnung mit Wasser auf ein Volumen von 87 mol statt. Die Lösung wird anschließend steril filtriert. Dann werden IO ml eines im Autoklav behandelten Puffers, der 1,36% Na-Azetat, 3 H20, enthält, hinzugefügt. Danach wird der pBWert mit 3 ml steriler 0,I n-NaOH auf 7 gebracht. Das sich ergebende Produkt ist eine Suspension von amorphem Insulin von der gleichen Zusammen setzung wie die Suspension nach Beispiel I.
Beispiel XI I74 mg kristallines Insulin (I mg = 23 IE) werden in IO ml 0,02 n-HC1 gelöst. Der Lösung werden dann hinzugefügt: I,3 ml Glyzerin, 0,5 ml 25%ige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, 8 mg Zn (als Chlorid) und so viel destilliertes Wasser, daß sich ein Volumen von 80 ml ergibt.
Die Mischung wird steril filtriert. Hierauf wird eine im Autoklav behandelte Mischung aus 3 ml 0,1 n-NaOH, I36 mg Na-Azetat, 3 H20 und so viel Wasser, daß sich In mol ergeben, hinzugefügt.
Die so hergestellte Suspension von amorphem Insulin hat die gleiche Zusammensetzung wie die Suspension nach Beispiel II.
Beispiel XII I74 mg kristallines Insulin (I mg = 23 IE) werden in 10 mol 0,02 n-HCl, die 16 mg Zn als Chlorid enthält, aufgelöst, und die Lösung wird dann steril filtriert. Darauf wird eine Lösung hergestellt, die I36 mg Na-Azetat, 3 H2O, I,3 ml Glyzerin, 0,5 ml 250/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, 3,4 ml o,I n-NaOH und so viel Wasser, daß sich 90 ml ergeben, enthält.
Diese Lösung wird ebenfalls steril filtriert. Danach werden die beiden steril filtrierten Lösungen unter aseptischen Bedingungen gemischt.
Das so hergestellte Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige nach Beispiel III.
Beispiel XIII 4000 internationale Einheiten amorphes Insulin (I74 mg) werden in IO ml einer Zinkchloridlösung suspendiert, die 0,I6°/0 Zn++ enthält. Es wird dann durch Beimischung von 10 ml 0,I n-HCl in Lösung gebracht. Als isotonisches Agens werden 1,3 mol Glyzerin und als Konservierungsmittel o,5 ml 250/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung hinzugefügt. Darauf wird mit Wasser auf 90 ml verdünnt und steril filtriert. Anschließend werden 10 ml im Autoklav behandelte 0,I n-Na O die I36 mg Na-Azetat, 3 H2 0, enthält, hinzugefügt. Schließlich wird der pH-Wert mit 0,07 steriler I n-NaOH auf 6 eingestellt.
Durch dieses Verfahren erhält man ein Präparat von der gleichen Zusammensetzung wie dasjenige nach Beispiel IV.
Beispiel XIV 3000 internationale Einheiten amorphen Insulin (I74 mg) werden in 5 ml einer Zinkchloridlösung, die 0,I6°/o Zink enthält, suspendiert und mit 3 ml 0,02 n-HCl und 10 mol I,I6°/oiger Maleinsäurelösung gelöst. Dann werden I,3 ml Glycerol, 0,5 ml 25%ige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung sowie so viel Wasser hinzugefügt, daß sich 80 ml ergeben. Die Lösung wird steril filtriert. Hierauf wird der pn-Wert mit 20 ml steriler 0,I NaOH auf 7 eingestellt.
Das so hergestellte Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige nach Beispiel V.
Beispiel XV 4000 internationale Einheiten (174 mg) steriles amorphes Insulin werden in dem nachstehend genannten steril filtrierten Suspensionsmittel suspendiert: 8 mg Zink (als Chlorid), 206 mg Natriumdiäthylbarbiturat, I,3 ml Glyzerin, 0,5 ml 250/&ige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, 6,5 ml 0,I n-H Cl und so viel Wasser, daß sich Ion mol ergeben.
Die so hergestellte Suspension von amorphem Insulin hat den p11-Wert 7 und enthält annähernd 2 Gamma Zink je Insulineinheit.
Beispiel XVI 4000 internationale Einheiten steriles amorphes Insulin (I74mg) werden in dem nachstehend genannten steril filtrierten Suspensionsmittel suspendiert: 8 mg Zink (als Chlorid), 95 mg Borax, 1,3 ml Glyzerin, 0,5 ml 25°/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, 2,9 ml 0,I n-H Cl und so viel Wasser, daß sich 100 ml ergeben.
Das so erzielte Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige nach Beispiel VII.
Beispiel XVII 4000 internationale Einheiten amorphen Insulin (174 mg) werden in einer Lösung aus 10 mg Kupfer (als Chlorid), 5,4 mol 0,I n-HCI, 1,3 mol Glyzerin, 0,5 ml 25°/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung und so viel Wasser, daß sich go ml ergeben, gelöst.
Die Lösung wird steril filtriert. Danach werden 10 ml steriler 2,o6°/oiger Natriumdiäthylbarbituratlösung zugesetzt.
Die sich hierbei ergebende Suspension von amorphem Insulin hat die gleiche Zusammensetzung wie nach Beispiel VIII.
Beispiel XVIII I74 mg kristallines Insulin (I mg = 23 IE) werden in 10 mol einer Nickelchloridlösung, die O,I°/e Nickel enthält, suspendiert und mit 2,5 ml 0,I n-H Cl gelöst. Darauf werden I,3 ml Glyzerin und 0,5 ml 250/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung hinzugegeben und mit Wasser auf 95 ml verdünnt. Die Lösung wird steril filtriert. Danach werden 5 ml eines im Autoklav behandelten Puffers, der 358 mg Na2 HP O,, I2 H2 ° enthält, hinzugefügt. Das so hergestellte Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige nach Beispiel IX.
Beispiel XIX 200 mg amorphes Insulin (20 internationale Einheiten/mg), das 2,30/o Zink enthält, werden vermischt mit 2,5 ml einer ZnCl2-Lösung, die o,i601o Zink enthält, 3 ml 0,02 n-H Cl, I,3 ml Glyzerin, o,5 ml 250/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, 10 mol 1,1 60/oiger Maleinsäure und so viel Wasser, daß sich 80 ml ergeben.
Die Lösung wird steril filtriert. Danach wird der pn-Wert mit 20 ml steriler 0,I n-Na OH auf 7 eingestellt.
Das Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie in den Beispielen XIV und V.
Beispiel XX 200 mg amorphes Insulin (20 internationale Einheiten/mg), das 5 0/o Cu++ enthält, werden gemischt mit 5,4 ml 0,1 n-HCl, I,3 ml Glyzerin, 0,5 ml alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung und so viel Wasser, daß sich go ml ergeben.
Die so hergestellte Insulinlösung wird- steril filtriert. Danach wird der pn-Wert mit 10 mol einer sterilen 2,o60/oigen Natriumdiäthylbarbituratlösung auf 7 gebracht, wodurch das Insulin amorph ausgefällt wird. Das Präparat hat die gleiche Zusammensetzung wie in den Beispielen XVII und VIII.
Beispiel XXI I74 mg kristallines Insulin (1 mg = 23 IE), das 2,70/o Zu enthält, werden in 10 mol I,I60/oiger Maleinsäure, I,3 ml Glyzerin, 0,5 ml 250/oige alkoholische p-Oxybenzoesäuremethylesterlösung, o,8 ml o,I n-H Cl und so viel Wasser, daß sich 80 ml ergeben, in Lösung gebracht.
Die Lösung wird steril filtriert Danach wird der p-Wert auf 7 mit 20 ml steriler 0,I n-NaOH erhöht, wodurch das Insulin amorph ausgefällt wird. Die gewonnene Insulinsuspension hat pH 7 und enthält annähernd I Gamma Zink je Insulineinheit.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Herstellung inj izierbarer Insulinpräparate mit Depotwirkung, dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension von amorphem Insulin in einem wäßrigen Suspensionsmitttl hergestellt wird, in dem eines oder mehrere Metalle, wie Zink, Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan und Eisen, in einer solchen Konzentration vorhanden sind, daß die fertige Suspension über annähernd 2 X A X Io-5 Milliäquivalente der erwähnten Metalle je Milliliter der Suspension enthält, wobei »A« die Anzahl der internationalen Insulineinheiten je Milliliter der Suspension bezeichnet, und daß die Suspension auf einen pH-Wert von annähernd 6 bis annähernd 8,5, vorzugsweise 7 eingestellt wird, wobei gleichzeitig die Anwesenheit solcher Ionen vermieden wird, die bei neutraler Reaktion eine größere Affinität zu den erwähnten Metallen haben als das Insulin, so daß weniger als 20/0 °/@ des in der Suspension vorhandenen Insulins in gelöstem Zustand vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Suspension ein Gehalt eines oder mehrerer der erwähnten Metalle von annähernd 3 x A X Io-5 bis annähernd I8 X A X IO5 Milliäquivalenten je Milliliter gegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein isotonisches Suspensionsmittel verwendet wird, dem gegebenenfalls ein Konservierungsmittel, vorzugsweise p-Oxybenzoesäuremethyl- oder Propylester, zugesetzt wurde.
4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß amorphes Insulin mit einem solchen Gehalt der in Frage kommenden Metalle verwendet wird, daß der Metallgehalt der fertigen Suspension ganz oder teilweise von dem amorphen Insulin abgeleitet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß amorphes Insulin mit einem Metallgehalt von über annähernd 0,4 Milliäquivalenten je Gramm verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle von amorphem Insulin kristallines Insulin verwendet wird, welches durch Lösen und anschließendes Ausfällen in amorphen Zustand übergeführt wird.