Verfahren zur Herstellung eines Insulinpräparates mit verlängerter Wirkung. Es sind bereits verschiedene Insulinprä- parate mit verlängerter Wirkung bekannt. und es wurden insbesondere auch Protamin- Insulin-Suspensionen mit und ohne Zink ver wendet. Die charakteristische Eigenschaft solcher Präparate ist ihre geringe Wasserlös- liebkeit beim pfj des Blutes.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung ähnlicher Prä parate, die jedocb im Gegensatz zu den bisher bekannten in kristalliner Form erhalten wer den. Der li:ristall'ine Zustand ist ein Kriterium für die Reinheii, da die vollständige Kristal lisation gut gereinigte Ausgangsmaterialien verlangt. Überdies haben die Kristalle keine Neigung, sich ztLsammenzuballen oder am (Aas anzuhaften und bilden beim Schütteln eine gleichmässige Suspension. Die Kristalle sind ge-en verschiedene Einwirkungen ziem lich bestä ndig und können z.
B. ohne Scha den von cler 3Iutterlauge getrennt werden, wonach man sie in einem Medium anderer Zusammensetzung suspendieren kann. In reinem Wasser kann man sie z. B. bei 2 bis 4" C unverändert monatelang aufbewahren. Bei ihrer Anwendung für die Behandlung der Zuckerkrankheit sichern die gemäss der Er findung hergestellten Präparate eine gleich mässige und verlängerte Wirkung. Ausserdem werden bei dem Verfahren minimale Mengen von alkalischen Proteinen bzw. Proteinspalt produkten und Zink benötigt.
Während die handelsüblichen Zink-Protamin-Insulin-Sus- pensionen in der Regel 4-5 I Zink, berech- net auf das Insulin, enthalten, können nach dem erfindungsgemässen Verfahren kristalline Präparate erhalten werden, -die z. B. 0,2' Zink enthalten.
Da die kristallinen Präparate praktisch kein freies alkalisches Protein ent halten, kann man sie mit gewöhnlichen In sulinlösungen mischen, ohne dass letzteres in beträchtlichen Mengen ausfällt. Ferner wird das freie Insulin von den Kristallen nicht in dem Masse adsorbiert wie von einem amor phen Sediment, so dass eine Injektion einer solchen Mischung gleich wirkt, wie wenn man beide Lösungen getrennt an verschiede nen Stellen des Körpers einspritzen würde.
Es ist bekannt, Insulinpräparate mit ver längerter Wirkung dadurch herzustellen, dass man in einem wässrigen Medium Insulin und ein Zinksalz mit einem alkalischen Protein oder Proteinspaltprodukt und Phenol zu sammenbringt. Dabei wurden jedoch bisher keine kristallinen Produkte erhalten. Das Phenol wurde zwecks Verhinderung des Bak terienwachstums im Präparat zugesetzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Insulinpräparates mit ver längerter 'Wirkung, bei welchem Insulin, ein Zinksalz und ein alkalisches Protein bzw. Proteinspaltprodukt in Gegenwart eines Phe nols in wässrigem Medium miteinander um gesetzt werden, ist nun dadurch gekenn zeichnet, da,ss zwecks Erzielung eines kri stallinen Produktes die Umsetzung bei einem PH zwischen 6 und 8 durchgeführt und ein solches Verhältnis von Protein bzw. Protein- spaltprodukt zu Insulin gewählt wird, dass ungefähr isophane Bedingungen vorliegen.
Isophane Bedingungen. herrschen im vor liegenden Fall dann vor, wenn folgende Be dingungen erfüllt sind: Wenn der gemäss obigen Angaben er zeugte Niederschlag abzentrifugiert ist und die klare überstehende Flüssigkeit in zwei Teile getrennt ist, so mu.ss,der Zusatz von In sulin zum einen Teil und eines alkalischen Proteins oder Proteinspaltproduktes zum an dern Teil in beiden Teilen die gleiche Trü bung hervorrufen. Wenn z.
B. der erste Teil trüber wird als der zweite, so enthält das Präparat zu viel alkalisches Protein oder Proteinspaltprodukt und es bestehen deshalb keine isophanen Bedingungen.
Durch die Zu sätze dürfen auch keine Änderungen des pH-Wertes eintreten und sie müssen -eine voll ständige Fällung und infolgedessen maximale Trübung garantieren (Schweiz. 1bled. 'v#rschr. 68 [1938] pp. 37-41, insbesondere p. 38, Spalte 2 und p. 39, Spalte 1).
Für die Ausstellung der Ausgangslösung verwendet man vorzugsweise kristallines, zinkhaltiges Insulin. In diesem Produkt ist das Zink chemisch an das Insulin gebunden. Die Verbindung ist jedoch in wässriger Lösung nieht existenzfähig, so dass an sich in der Ausgangslösung dieselben Stoffe anlie gen, wie bei Herstellung derselben aus In sulin und einem Zinksalz. Gute Resultate werden aber auch erzielt, wenn man z. B. ZnCl= und amorphes, zinkfreies Insulin ver wendet.
Die Insulinkonzentration im Kri- stal'lisationsmedium kann ziemlich willkürlich gewählt werden. Vorzugsweise verwendet man weniger als<B>0,5%</B> Zink, berechnet auf die Insulinmenge, doch kann man auch mit-bei- spielsweise 5 % Zink arbeiten.
Als alkalische Proteine und Proteinspalt produkte, die für das vorliegende Verfahren geeignet sind, seien beispielsweise genannt Histone und Protamine sowie verschiedene Spaltprodukte derselben. Das Verfahren wurde z. B. mit Salmiridin, Clupein, Scombrin, Sturin, Thynnin, Cyprinin, Cy- klöpterin, iait einem Spaltprodukt des Sal- miridin und mit Thymushiston durchgeführt.
Das Verhältnis von Protein bzw. Protein spaltprodukt zu Insulin sei im folgenden mit P/I bezeichnet. Bei den meisten Protaminen liegen isophane Bedingungen dann vor, wenn P/I ungefähr '/1o beträgt. Der Faktor P/I für isophane Bedingungen ist allerdings auch etwas von dem pH-Wert, der Salzkonzentra tion, der Temperatur usw. abhängig. Es ist nicht unbedingt erforderlich, bei genau iso- phanen Bedingungen zu arbeiten. Wenn z. B.
für ein bestimmtes Protein bei bestimmten Bedingungen (pH, Temperatur, Salzkonzen tration usw.) der Faktor P/I für isophane Be dingungen '/", ist, so werden bei sonst glei chen Bedingungen auch noch z. B. bei P/I = etwa '/$ oder etwa 1/,, gute Resultate erzielt. In ersterem Falle bilden sich die Kri stalle sehr rasch und :sind deshalb verhältnis mässig klein und besitzen eine gewisse Ten denz zu Deformationen, so dass es schwierig sein kann, die Kristallform zu bestimmen.
In letzterem Falle geht die Kristallisation lang oamer vor sich, und die Kristalle sind dann ausgeprägter, dick und kurz. Wenn die Ab weichung vom Faktor P/I zu gross ist, wird das Produkt nicht oder mindestens nicht vor wiegend kristallin. Grosse Zinkmengen erfor dern verhältnismässig mehr alkalisches Pro tein oder Proteinspaltprodukte.
Die Anwesenheit von Phenolen ist eine Bedingung für ,die Kristallbildung. Die Kon zentration dieser Substanzen im Kristallisa- tionsmedium kann ziemlich willkürlich ge wählt werden. Vorzugsweise setzt man 0,1 bis 1 %, berechnet auf das Volumen der Lö sung zu, unter Umständen aber auch mehr, je nach den Ausgangsstoffen.
Am besten eig nen sich im allgemeinen in meta-Stellung substituierte Phenole. Unter anderem ergaben ortho-meta- und para-Kresol, meta- und para- Chl'or-phenol, meta- und para-Nitro-phenol und Resorcine befriedigende Ergebnisse, während z. B. ortho-Chlor-phenol, ortho- Nitro-phenol und Natriumsalicylat ungeeig net sind.
Der pH-Wert der Lösung liegt erfin dungsgemäss zwischen 6 und B. Ein höherer pn-Wc i-t. würde die Beständigkeit des Pro- diikte s beeinträchtigen.
Der pH-Wert kann auf beliebige Weise eingestellt werden, je doch vorzugsweise mittels eines Puffer geniisches, z. B. mit einem Natriumphosphat- puffer oder Natriumacetatpuffer. Der Faktor l'/'t für isophane Bedingungen nimmt mit zu nehmendem PH-Wert zu, wobei gleichzeitig die Kritall'isationsgeschwindigkeit erhöht wird.
Bei niedrigem pH-Wert kann die Kri stallisation so langsam vor sich gehen, dass sie nilvollständig wird und man deformierte Kristalle erhält.
Bei Verwendung grosser Zinkmengen ist es zweckmässig, auch einen verhältnismässig rohen pH-Wert innerhalb der genannten Grenzen zu wählen.
Es kann erwünscht sein, bei einer Salz konzentration zu arbeiten, die grösser ist, als man sie durch Mischen der Substanzen, An passung des PH-ZVertes usw. normalerweise erhält. In einem solchen Fall setzt man der Lö:snnng vorzugsweise noch Natriumchlorid zu. In gleicher Weise kann eine hohe Puf ferkonzentration den gewünschten Effekt be wirken. Bereits eine geringe Erhöhung der Salzkonzentration begünstigt die Kristalli- sat-ion, die dann schneller verläuft.
Im allgemeinen empfiehlt es sich, bei Zimmertemperatur zu arbeiten, doch kann der Kristallisationsverlauf, die Kristall'isations- geschwindigkeit usw. durch Einhalten einer geeigneten Temperatur sehr gut etwas be- cinflusst: tverden, sei es, dass man kühlt oder erwärmt. Eine Temperaturerhöhung erfordert jedoch den Zusatz von mehr Protein oder Proteinspaltprodukt, um die isophanen Be- ciingungen aufrechtzuerhalten.
Die genannten Substanzen können in willkürlicher Reihenfolge miteinander ver mischt werden. Es kann jedoch vorteilhaft sein, vorerst einen Teil der Substanzen oder auch jede für sich bei einem geeigneten p11-Wert zu lösen, bevor man die End mischung herstellt. Der pH-Wert von 6-8 kann z. B. eingestellt werden, nachdem die einzelnen Ausgangsstoffe, beispielsweise bei verhältnismässig saurer Reaktion vermischt wurden. Man kann auch einzelne Lösungen solcher PH-Werte, herstellen, dass sich beim Vermischen gerade der gewünschte pH-Wert ergibt.
Die Kristallisation kann im Verlauf weniger Minuten beinahe beendigt :sein, beson ders wenn Präparate mit kleinen Kristallen hergestellt werden. In einigen andern Fällen jedoch kann sie mehrere Tage dauern.
Die Kristalle können, wenn sie einmal gebildet sind, leicht von der Mutterlauge ab getrennt werden. Es ist vorteilhaft, das Ver fahren unter sterilen Bedingungen durchzu führen. Unter geeigneten Bedingungen kann man in diesem Fall die erhaltenen sterilen Suspensionen direkt für Injektionen ver wenden.
Die Form der Kristalle ist deutlich ver schieden von derjenigen der Insulinkristalle. Letztere sind meist Rhomboeder oder Pris men. In der Literatur sind jedoch auch dop- pel'spindelförmige Kristalle beschrieben. Die gemäss vorliegender Erfindung erhältlichen Kristalle zeigen am häufigsten eine ausge sprochene Längenentwicklung. Senkrecht zur längsten Achse besitzen sie einen quadrati schen oder rechtwinkligen Querschnitt und an beiden Enden eine charakteristische py ra- midale Form.
Ausser dieser Form können alle möglichen Zwischenformen zwischen langen. dünnen, bipyramidalen Kristallen und kur zen, dicken, oft oktaedrisch geformten Kri stallen vorkommen, je nach den für die Kri stallisation gewählten Bedingungen, das heisst also je nach .den verwendeten Ausgangsstof fen, deren Konzentrationen und den physi kalisch chemischen Bedingungen während ihrer Vermischung. Zur Erzielung bestimm ter Kristallgrössen und -formen müssen zwi schen den einzelnen Variablen bestimmte Gesetzmässigkeiten eingehalten werden.
Beispiel <I>1:</I> 1,6 g kristallisiertes Insulin, das 0,4 Zink enthält, werden in<B>25</B> cm' Wasser mittels 0,1n-Sa-lzsäure gelöst. Dann fügt man wäss- rige Lösungen von 0,3 cm" Trikresol, 7,6 g hatriumchlorid und so viel Natriumphosphat- puffer hinzu, dass die Endkonzentration des- s elben 1/7,
-molar wird und das ZH 6,9 beträgt.
Schliesslich werden 0,14 g in Wasser gelöstes Salmiridinsulfat unter Schütteln zugegeben, wobei zinkhaltiges Protamininsulin ausfällt. Die Lösung wird auf 1000 cm' aufgefüllt wieder geschüttelt. Nach einstündigem Stehen ist: das ausgefällte Protamininsulin kristallin geworden.
<I>Beispiel 2:</I> 3,2 g kristallisiertes Insulin mit 0,4% Zinkgehalt, 50 cm' 0,1n-Salzsäure, 3 cm' meta-Kresol, so viel Natriumphosphatpuffer, dass die Endkonzentration desselben 1/.,-molar wird und der pH-Wert 6,67 beträgt, 0,25 g Salmiridinsulfat, eventuell 50 g Glukose und Wasser werden wie in Beispiel 1 beschrieben vermischt, so dass man ein Endvolumen von 1000 cm' erhält.
Die Suspension wird bei 20 so lange aufbewahrt, bis eine Probe unter dem Mikroskop zeigt, dass die Kristallisation beendigt ist.
Beispiel <I>3:</I> 1;6 g kristallisiertes Insulin mit 0,4 Zinkgehalt, 25 cm' 0,1n-Salzsäure, 2 cm' meta-Kresol, 7,6 g Natriumchlorid, so viel Natriumphosphatpuffer und eventuell Na triumhydroxyd, dass die Endkonzentration der letzten Stoffe '/7,-molar wird und der PH-Wert <B>7,35</B> beträgt. 0,16 g Salmiridinsulfat und Wasser werden wie in Beispiel 1 vermischt, so dass das Endvolumen 1000 cm' beträgt. Nach, einigem Stehen wird die Suspension kristallin.
Beispiel .4: 1,6 g kristallisiertes Insulin mit 0,4 Zinkgehalt, 25 cm' 0,1n-Salzsäure, 0,15 g Zinkchlorid, 3 cm' meta-Kresol, 7,6 Natrium- ehlorid, so viel Natriumphosphatpuffer, dass die Endkonzentration desselben '/7,-molar wird und der pH-Wert 6,8 beträgt, 0,15 g Salmiridin- sulfat und Wasser werden wie in Beispiel 1 beschrieben vermischt,
so dass ein Endvolumen von 1000 cm' erhalten wird. Die Suspension, die in bezug auf das vorhandene Insulin etwa 5 % Zink enthält, wird beim Stehenlassen ,lber Nacht kristallin.
<I>Beispiel 5:</I> Man stellt eine Suspension aus 80 mg kri stallisiertem Insulin mit einem Zinkgehalt von 0,4%, 7,25 mg Salmiridinsulfat, 0,3 meta-Kresol, 0,76% Natriumchlorid und so viel Natriumphosphatpuffer, da-ss die Suspen siOn '1/7,-molar wird und der p1,-Wert 6.,69 be trägt, her und stellt auf 50 cm' ein.
Das Prä parat, das<B>7,570</B> mehr Protamin enthält, als dem Faktor P/I für isophane Bedingungen entsprechen würde, wird im Verlauf von<B>1.)</B> bis 20 Minuten kristallin. Beispiel <I>6:</I> Man stellt 50 cm' einer Suspension von 80 mg kristallinem Insulin mit 0,4% Zink gehalt, 0,2% para-Chlor-phenol, <B>0,76%</B> Na triumchlorid, so viel Natriumphosphatpuffer. dass die Suspension 1/,-molar wird und der pH-Wert 6,91 beträgt, und 6 mg Clupein.- sulfat her.
Nach einigem Stehen wird das Präparat kristallin. Die verwendete Protamin- menge ist<B>25%</B> niedriger als dem Faktor P/I für isophane Bedingungen entspricht.