CH255252A - Verfahren zur Herstellung eines Insulinpräparates mit verlängerter Wirkung. - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung eines     Insulinpräparates    mit verlängerter Wirkung.    Es sind bereits verschiedene     Insulinprä-          parate    mit verlängerter Wirkung bekannt.  und es wurden insbesondere auch     Protamin-          Insulin-Suspensionen    mit und ohne Zink ver  wendet. Die charakteristische Eigenschaft       solcher        Präparate    ist ihre geringe     Wasserlös-          liebkeit    beim     pfj    des Blutes.  



  Vorliegende Erfindung bezieht sich auf  ein Verfahren zur Herstellung ähnlicher Prä  parate, die     jedocb    im Gegensatz zu den bisher  bekannten in kristalliner Form erhalten wer  den. Der     li:ristall'ine    Zustand ist ein Kriterium  für die     Reinheii,    da die vollständige Kristal  lisation gut gereinigte Ausgangsmaterialien  verlangt. Überdies haben die Kristalle keine  Neigung, sich     ztLsammenzuballen    oder am  (Aas anzuhaften und bilden beim Schütteln       eine    gleichmässige Suspension. Die Kristalle       sind        ge-en    verschiedene Einwirkungen ziem  lich     bestä        ndig    und können z.

   B. ohne Scha  den von     cler        3Iutterlauge    getrennt werden,       wonach    man sie in einem Medium anderer       Zusammensetzung    suspendieren kann. In  reinem Wasser kann man sie z. B. bei 2 bis  4"     C        unverändert    monatelang aufbewahren.       Bei        ihrer    Anwendung für die Behandlung der  Zuckerkrankheit sichern die gemäss der Er  findung hergestellten     Präparate    eine gleich  mässige und     verlängerte    Wirkung. Ausserdem  werden bei dem Verfahren minimale Mengen  von alkalischen Proteinen bzw. Proteinspalt  produkten und Zink benötigt.

   Während die       handelsüblichen        Zink-Protamin-Insulin-Sus-          pensionen    in der Regel 4-5     I    Zink, berech-         net    auf das Insulin, enthalten, können nach  dem erfindungsgemässen Verfahren     kristalline     Präparate erhalten     werden,    -die z. B. 0,2'  Zink enthalten.

   Da die kristallinen Präparate  praktisch kein freies alkalisches Protein ent  halten, kann man sie mit gewöhnlichen In  sulinlösungen mischen, ohne dass letzteres in  beträchtlichen Mengen ausfällt.     Ferner    wird  das freie Insulin von den Kristallen nicht in  dem Masse     adsorbiert    wie von einem amor  phen Sediment, so dass eine Injektion einer  solchen Mischung gleich wirkt, wie wenn  man beide Lösungen getrennt an verschiede  nen Stellen des     Körpers    einspritzen würde.  



  Es ist bekannt,     Insulinpräparate    mit ver  längerter Wirkung dadurch herzustellen, dass  man in einem     wässrigen    Medium Insulin und  ein Zinksalz mit einem alkalischen Protein  oder Proteinspaltprodukt und Phenol zu  sammenbringt. Dabei wurden jedoch bisher  keine kristallinen Produkte erhalten. Das  Phenol wurde zwecks Verhinderung des Bak  terienwachstums im Präparat zugesetzt.  



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur  Herstellung eines     Insulinpräparates    mit ver  längerter 'Wirkung, bei welchem Insulin, ein  Zinksalz und ein alkalisches Protein bzw.  Proteinspaltprodukt in Gegenwart eines Phe  nols in     wässrigem    Medium miteinander um  gesetzt werden, ist nun dadurch gekenn  zeichnet,     da,ss    zwecks Erzielung eines kri  stallinen Produktes die Umsetzung bei einem  PH zwischen 6 und 8 durchgeführt     und    ein  solches Verhältnis von Protein bzw. Protein-           spaltprodukt    zu Insulin gewählt wird, dass  ungefähr     isophane    Bedingungen vorliegen.  



       Isophane        Bedingungen.    herrschen im vor  liegenden Fall dann vor, wenn folgende Be  dingungen erfüllt sind:  Wenn der gemäss obigen     Angaben    er  zeugte Niederschlag     abzentrifugiert    ist und  die klare überstehende Flüssigkeit in zwei  Teile getrennt ist, so     mu.ss,der        Zusatz    von In  sulin zum einen Teil     und        eines    alkalischen  Proteins oder Proteinspaltproduktes zum an  dern Teil in beiden Teilen die gleiche Trü  bung hervorrufen. Wenn z.

   B. der     erste    Teil  trüber     wird    als der zweite, so enthält das  Präparat zu viel alkalisches Protein oder  Proteinspaltprodukt und     es    bestehen deshalb  keine     isophanen    Bedingungen.

   Durch die Zu  sätze dürfen auch keine     Änderungen    des       pH-Wertes    eintreten und sie müssen     -eine    voll  ständige Fällung und infolgedessen maximale  Trübung garantieren (Schweiz.     1bled.        'v#rschr.     68 [1938] pp.     37-41,        insbesondere    p. 38,  Spalte 2 und     p.    39,     Spalte    1).  



  Für die Ausstellung der Ausgangslösung       verwendet    man vorzugsweise kristallines,       zinkhaltiges    Insulin. In diesem Produkt ist  das Zink chemisch an das Insulin     gebunden.     Die     Verbindung    ist jedoch in wässriger  Lösung     nieht    existenzfähig, so dass an sich  in der     Ausgangslösung    dieselben Stoffe anlie  gen, wie bei     Herstellung    derselben aus In  sulin und einem Zinksalz.     Gute    Resultate  werden aber auch erzielt, wenn man z.     B.          ZnCl=    und amorphes,     zinkfreies    Insulin ver  wendet.

   Die     Insulinkonzentration    im     Kri-          stal'lisationsmedium    kann ziemlich willkürlich  gewählt werden. Vorzugsweise verwendet man  weniger als<B>0,5%</B> Zink, berechnet auf die       Insulinmenge,    doch kann man auch     mit-bei-          spielsweise    5 % Zink arbeiten.  



  Als alkalische Proteine und Proteinspalt  produkte, die für das vorliegende Verfahren  geeignet sind, seien beispielsweise genannt       Histone    und     Protamine    sowie verschiedene  Spaltprodukte derselben. Das Verfahren       wurde    z. B. mit     Salmiridin,        Clupein,          Scombrin,        Sturin,        Thynnin,        Cyprinin,        Cy-          klöpterin,        iait    einem Spaltprodukt des Sal-         miridin    und mit     Thymushiston    durchgeführt.

    Das Verhältnis von Protein bzw. Protein  spaltprodukt zu Insulin sei im folgenden mit       P/I    bezeichnet. Bei den meisten     Protaminen     liegen     isophane    Bedingungen dann vor, wenn       P/I        ungefähr        '/1o    beträgt. Der Faktor     P/I     für     isophane    Bedingungen ist allerdings auch  etwas von dem     pH-Wert,    der Salzkonzentra  tion, der Temperatur usw. abhängig. Es ist  nicht unbedingt erforderlich, bei genau     iso-          phanen        Bedingungen    zu arbeiten. Wenn z. B.

    für ein     bestimmtes        Protein    bei bestimmten  Bedingungen     (pH,    Temperatur, Salzkonzen  tration usw.) der Faktor     P/I    für     isophane    Be  dingungen     '/",    ist, so werden bei sonst glei  chen Bedingungen auch noch z. B. bei       P/I    = etwa     '/$    oder etwa     1/,,    gute Resultate  erzielt. In ersterem Falle bilden sich die Kri  stalle sehr rasch und :sind deshalb verhältnis  mässig klein und besitzen eine gewisse Ten  denz zu Deformationen, so dass es schwierig  sein kann, die Kristallform zu bestimmen.

   In  letzterem Falle     geht    die Kristallisation lang  oamer vor sich, und die Kristalle sind dann  ausgeprägter, dick und kurz.     Wenn    die Ab  weichung vom Faktor     P/I    zu gross ist, wird  das Produkt nicht oder mindestens nicht vor  wiegend kristallin. Grosse Zinkmengen erfor  dern verhältnismässig mehr alkalisches Pro  tein oder Proteinspaltprodukte.  



  Die Anwesenheit von     Phenolen    ist eine  Bedingung für ,die     Kristallbildung.    Die Kon  zentration dieser Substanzen im     Kristallisa-          tionsmedium    kann ziemlich willkürlich ge  wählt werden. Vorzugsweise setzt man 0,1  bis 1 %,     berechnet    auf das Volumen der Lö  sung zu, unter Umständen aber auch mehr,  je nach den Ausgangsstoffen.

   Am besten eig  nen sich im allgemeinen in     meta-Stellung     substituierte     Phenole.    Unter anderem ergaben       ortho-meta-    und     para-Kresol,        meta-    und     para-          Chl'or-phenol,        meta-    und     para-Nitro-phenol     und     Resorcine    befriedigende Ergebnisse,  während z. B.     ortho-Chlor-phenol,        ortho-          Nitro-phenol    und     Natriumsalicylat    ungeeig  net sind.  



  Der     pH-Wert    der Lösung liegt erfin  dungsgemäss zwischen 6 und B. Ein höherer           pn-Wc        i-t.    würde die Beständigkeit des     Pro-          diikte        s    beeinträchtigen.

   Der     pH-Wert    kann  auf beliebige Weise eingestellt werden, je  doch vorzugsweise mittels eines Puffer  geniisches, z.     B.    mit einem     Natriumphosphat-          puffer    oder     Natriumacetatpuffer.    Der Faktor       l'/'t    für     isophane    Bedingungen nimmt mit zu  nehmendem     PH-Wert    zu, wobei     gleichzeitig     die     Kritall'isationsgeschwindigkeit    erhöht  wird.

   Bei niedrigem     pH-Wert    kann die Kri  stallisation so     langsam    vor sich gehen, dass  sie     nilvollständig    wird und man deformierte  Kristalle erhält.  



  Bei Verwendung grosser Zinkmengen ist  es     zweckmässig,    auch einen verhältnismässig  rohen     pH-Wert    innerhalb der genannten  Grenzen zu wählen.  



  Es kann erwünscht sein, bei einer Salz  konzentration zu arbeiten, die grösser ist, als  man sie durch Mischen der     Substanzen,    An  passung des     PH-ZVertes    usw. normalerweise  erhält. In einem solchen Fall setzt man der       Lö:snnng    vorzugsweise noch     Natriumchlorid     zu. In gleicher Weise kann eine hohe Puf  ferkonzentration den gewünschten Effekt be  wirken. Bereits eine geringe Erhöhung der  Salzkonzentration begünstigt die     Kristalli-          sat-ion,    die dann schneller verläuft.  



  Im allgemeinen empfiehlt es sich, bei       Zimmertemperatur    zu arbeiten, doch kann der       Kristallisationsverlauf,    die     Kristall'isations-          geschwindigkeit    usw. durch Einhalten einer  geeigneten Temperatur sehr gut etwas     be-          cinflusst:        tverden,    sei es, dass man kühlt oder  erwärmt. Eine     Temperaturerhöhung    erfordert  jedoch den Zusatz von mehr Protein oder       Proteinspaltprodukt,    um die     isophanen        Be-          ciingungen    aufrechtzuerhalten.

     Die genannten Substanzen können in  willkürlicher Reihenfolge miteinander ver  mischt werden. Es kann jedoch vorteilhaft  sein, vorerst einen Teil der Substanzen oder  auch jede für sich bei einem geeigneten       p11-Wert    zu lösen, bevor man die End  mischung herstellt. Der     pH-Wert    von 6-8  kann z. B. eingestellt werden, nachdem die  einzelnen     Ausgangsstoffe,    beispielsweise bei       verhältnismässig    saurer Reaktion vermischt    wurden. Man kann auch einzelne Lösungen       solcher        PH-Werte,    herstellen, dass sich beim  Vermischen gerade der gewünschte     pH-Wert     ergibt.

   Die Kristallisation kann im Verlauf  weniger Minuten     beinahe        beendigt    :sein, beson  ders wenn Präparate mit kleinen Kristallen  hergestellt werden. In einigen andern Fällen  jedoch kann sie mehrere Tage dauern.  



  Die Kristalle können, wenn sie einmal  gebildet sind, leicht von der Mutterlauge ab  getrennt werden. Es     ist    vorteilhaft, das Ver  fahren unter sterilen Bedingungen durchzu  führen. Unter geeigneten Bedingungen kann  man in diesem Fall die erhaltenen sterilen  Suspensionen direkt für Injektionen ver  wenden.  



  Die Form der Kristalle ist deutlich ver  schieden von derjenigen der     Insulinkristalle.     Letztere sind meist     Rhomboeder    oder Pris  men. In der Literatur sind jedoch auch     dop-          pel'spindelförmige        Kristalle    beschrieben. Die  gemäss vorliegender Erfindung erhältlichen  Kristalle zeigen am häufigsten eine ausge  sprochene     Längenentwicklung.    Senkrecht zur  längsten Achse besitzen sie einen quadrati  schen oder rechtwinkligen     Querschnitt    und  an beiden Enden eine charakteristische     py        ra-          midale    Form.

   Ausser dieser Form können alle  möglichen Zwischenformen     zwischen    langen.  dünnen,     bipyramidalen    Kristallen und kur  zen, dicken, oft     oktaedrisch    geformten Kri  stallen vorkommen, je nach den für die Kri  stallisation gewählten Bedingungen, das heisst  also je nach .den     verwendeten    Ausgangsstof  fen, deren Konzentrationen und den physi  kalisch chemischen Bedingungen während  ihrer     Vermischung.    Zur Erzielung bestimm  ter     Kristallgrössen    und -formen müssen zwi  schen den einzelnen Variablen bestimmte  Gesetzmässigkeiten eingehalten werden.

           Beispiel   <I>1:</I>    1,6 g kristallisiertes Insulin, das 0,4  Zink enthält, werden in<B>25</B> cm' Wasser mittels       0,1n-Sa-lzsäure    gelöst. Dann fügt man     wäss-          rige    Lösungen von 0,3 cm"     Trikresol,    7,6 g       hatriumchlorid    und so viel     Natriumphosphat-          puffer    hinzu, dass die Endkonzentration des-           s        elben        1/7,

  -molar        wird        und        das        ZH        6,9        beträgt.     



  Schliesslich werden 0,14 g in Wasser gelöstes       Salmiridinsulfat    unter Schütteln zugegeben,  wobei zinkhaltiges     Protamininsulin    ausfällt.  Die Lösung     wird    auf 1000 cm' aufgefüllt  wieder geschüttelt. Nach einstündigem Stehen       ist:    das ausgefällte     Protamininsulin    kristallin  geworden.  



  <I>Beispiel 2:</I>  3,2 g     kristallisiertes    Insulin mit 0,4%  Zinkgehalt, 50 cm'     0,1n-Salzsäure,    3 cm'       meta-Kresol,    so     viel        Natriumphosphatpuffer,     dass     die        Endkonzentration    desselben     1/.,-molar          wird    und der     pH-Wert    6,67 beträgt, 0,25 g       Salmiridinsulfat,    eventuell 50 g Glukose und  Wasser werden wie in Beispiel 1     beschrieben     vermischt, so dass man ein     Endvolumen    von  1000 cm' erhält.

   Die Suspension wird bei 20   so lange aufbewahrt, bis eine Probe unter  dem Mikroskop zeigt, dass die Kristallisation  beendigt ist.  



       Beispiel   <I>3:</I>  1;6 g kristallisiertes Insulin mit 0,4  Zinkgehalt, 25 cm'     0,1n-Salzsäure,    2 cm'       meta-Kresol,    7,6 g     Natriumchlorid,    so viel       Natriumphosphatpuffer    und eventuell Na  triumhydroxyd, dass die     Endkonzentration    der  letzten Stoffe     '/7,-molar    wird und der PH-Wert  <B>7,35</B> beträgt. 0,16 g     Salmiridinsulfat    und  Wasser werden wie in Beispiel 1 vermischt,  so dass das     Endvolumen    1000 cm' beträgt.       Nach,    einigem Stehen wird die Suspension  kristallin.  



       Beispiel        .4:     1,6 g kristallisiertes Insulin mit 0,4  Zinkgehalt, 25 cm'     0,1n-Salzsäure,    0,15 g  Zinkchlorid, 3 cm'     meta-Kresol,    7,6     Natrium-          ehlorid,    so viel     Natriumphosphatpuffer,    dass  die Endkonzentration desselben     '/7,-molar        wird     und der     pH-Wert    6,8     beträgt,    0,15 g     Salmiridin-          sulfat    und Wasser werden wie in Beispiel 1  beschrieben vermischt,

   so dass ein     Endvolumen     von 1000 cm' erhalten wird. Die     Suspension,     die in bezug auf das vorhandene Insulin etwa  5 % Zink enthält,     wird    beim Stehenlassen       ,lber    Nacht kristallin.

      <I>Beispiel 5:</I>  Man stellt eine Suspension aus 80 mg kri  stallisiertem     Insulin    mit einem Zinkgehalt  von 0,4%, 7,25 mg     Salmiridinsulfat,    0,3       meta-Kresol,        0,76%        Natriumchlorid    und so  viel     Natriumphosphatpuffer,        da-ss        die    Suspen  siOn     '1/7,-molar        wird    und der     p1,-Wert    6.,69 be  trägt, her und stellt auf 50 cm' ein.

   Das Prä  parat, das<B>7,570</B> mehr     Protamin    enthält, als  dem Faktor     P/I    für     isophane    Bedingungen  entsprechen würde, wird im Verlauf von<B>1.)</B>  bis 20 Minuten kristallin.         Beispiel   <I>6:</I>  Man stellt 50 cm' einer Suspension von  80 mg kristallinem Insulin mit 0,4% Zink  gehalt,     0,2%        para-Chlor-phenol,   <B>0,76%</B> Na  triumchlorid, so viel     Natriumphosphatpuffer.     dass die Suspension     1/,-molar    wird und der       pH-Wert    6,91 beträgt, und 6 mg     Clupein.-          sulfat    her.

   Nach einigem Stehen wird das  Präparat     kristallin.    Die verwendete     Protamin-          menge    ist<B>25%</B> niedriger als dem Faktor     P/I     für     isophane    Bedingungen entspricht.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung eines Insulin präparates mit verlängerter Wirkung, bei welchem Insulin, ein Zinksalz und ein al kalisches Protein bzw. Proteinspaltprodukt in Gegenwart eines Phenols in wässrigem Me dium miteinander umgesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, dass zwecks Erzielung eines kristallinen Produktes die Umsetzung bei einem pg zwischen 6 und 8 durchgeführt und ein solches. Verhältnis von Protein bzw. Pro- teinspaltprodukt zu Insulin gewählt wird, dass ungefähr isophane Bedingungen vorliegen.

   UNTERANSPRUCH: Verfahren nach Patentanspruch, gekenn zeichnet durch einen weiteren Zusatz von Salzen zwecks Förderung der Kristallbildung.