DE947334C

DE947334C - Verfahren zur Herstellung von Insulinpraeparaten mit einem Zinkgehalt von 0,5% und darunter

Info

Publication number: DE947334C
Application number: DEW9541A
Authority: DE
Inventors: Dr Dr Guenther Weitzel
Original assignee: GUENTHER WEITZEL DR DR
Current assignee: GUENTHER WEITZEL DR DR
Priority date: 1952-09-24
Filing date: 1952-09-24
Publication date: 1956-08-16

Description

Verfahren zur Herstellung von Insulinpräparaten mit einem Zinkgehalt von 0,5°/o und darunter Unter HG-freien Insudinpräparaten sind im folgenden solche zu verstehen, welche nach intravenöser oder intramuskulärer Injektion keine initiale Blutzuckersteigerung hervorrufen, sondern lediglich Blutzuckersenkung bewirken. Bei den im Handel befindlichen Insulinpräparaten tritt im Anschluß an die Injektion eine kurzdauernde, bisweilen sehr erhebliche Blutzuckersteigerung auf (5 bis 15 Minuten), ehe die erstrebte Senkung des Blutzuckers einsetzt.
Kristallisierte Zinkinsuline mit einem Zinkgehalt unter 0,5"/0 sind bereits beschrieben; z. B. ist bekannt, Insulin unter Zusatz von Zitrationen bei gleichzeitiger Zugabe von Zink auszukristallisieren, wobei ein kristallisiertes Zinkinsulin mit einem Zinkgehalt von 0,38% Zink erhalten wird. Bei diesem Verfahren wird die Zitronensäure nicht zurr Entfernung des Zinks zugegeben, sondern die Auskristallisation des mit Zink beladenen Insulins soll, indem noch Zink zugesetzt wird, unterstützt werden. Von einer Herabsetzung des Zinkgehaltes kann bei diesem Verfahren nicht die Rede sein.
Im Gegensatz zu diesen bekannten Verfahren beruht das nachstehend beschriebene Verfahren auf der neuen Erkenntnis, daß durch Herabsetzen des Zinkgehaltes der durch die übliche Fabrikation 'erhaltenen zinkreichen Insudine mit etwa i % und mehr Zink die unerwünschte initiale Blutzuckersteigerung verschwindet. Weiter hat das neue Verfahren den Vorteil, daß zur Herabsetzung des Zinkgehalter kristallisierter Insulinpräparate die Kristalle als solche nicht umkristallisiert zuc werden brauchen und daher die bei den bisherigen Verfahren- unvermeidlichen Verluste an wertvollem Präparat nunmehr vermieden werden. Hierdurch werden die Ausbeuten gegenüber den bekannten Verfahren um beispielsweise io bis 20% erhöht.
Bisher war es unbekannt, daß die anfängliche blutzuckersteigernde Wirkung mit dem Zinkgehalt zusammenhing, und aus diesem Grund war kein Präparat auf dem Markt, welches -die anfängliche blutzuckersteigernde Wirkung nicht besaß.
Es wurde nämlich gefunden, - daß in reinen amorphen und kristallinischen Insulinpräparaten ein bestimmter Anteil des vom Insulin komplex gebundenen Zinks als hyperglykämisierender Faktor wirksam ist. Wenn man z. B. Insulinpräparate mit 1 bis 2% Zink, welche den hyperglykämisierenden Anfangseffekt aufweisen, im Zinkgehalt auf o,5 % oder darunter senkt, dann zeigen sie die anfängliche Blutzuckersteigerung nicht mehr. Werden umgekehrt Insulinpräparate.mit 0,50/9 und darunter, welche den HG-Effekt vermissen lassen, im Zinkgehalt erhöht, z. B. auf i bis 2a/0, so rufen sie nach der Injektion initiale Blutzuckersteigerung hervor.
Auf Grund dieser Befunde wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem es gelingt, HG-wirksame Insulinpräparate durch Behandlung mit passenden Zinkkomplexbildnern in solche umzuwandeln, welche den HG-Effekt nicht mehr zeigen. Geeignete Komplexbildner sind Oxy-Monocarbonsäuren (z. B. Milchsäure, a-Oxybuttersäure), Oxy-di- und Oxypolycarbonsäuren (z. B. Apfelsäure, Zitronensäure), organische Phosphorsäuren (z. B. Glycerin-phosphorsäure) und Aminosäuren (z. B. Glykokoll, Alanin, Asparaginsäure). Kristallisiert man HG-wirksame Insulinpräparate aus stark verdünnten Lösungen dieser Substanzen um, so verschwindet die HG-Wirkung.
Der besondere Wert des neuen Verfahrens liegt jedoch darin, daß man damit kristallinisches Insulin unter Erhaltung seiner Kristallstruktur vom hyperglykämischen Faktor befreien kann, indem man die Insulinkristalle unter passenden Bedingungen in Lösungen der genannten Komplexbildner suspendiert. Dadurch läßt sich die Befreiung vom HG-Faktor unter sehr geringen Insulinverlusten und in sehr kurzer Zeit ausführen; eine Veränderung der Kristallstruktur des Insulins ist nicht feststellbar.
Beispiel i io mg kristallisiertes, HG-wirksames Insulin (Zn-Gehalt 1,4%) werden in einem Gemisch von 2 ccm wäßriger Asparaginsäurelösung (3,35 mg Asparaginsäure/ccm, aurf pA 5,3 eingestellt) und 2 ccm Aceton suspendiert. Die Einstellung auf PH 5,3 erfolgt zweckmäßig mit Hilfe von stark verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure. 30 Minuten gelinde schütteln, abzentrifugieren, nochmals in frischer Asparaginsäurelösung schütteln, abzentrifugieren, Kristalle mit i ccm Aceton waschen, Aceton abzentrifugieren, Kristalle im Vakuuanexsikkator trocknen. Ausbeute 9,1 mg, Zn-Gehalt jetzt 0;q.0/0, HG-Wirkung nicht mehr nachweisbar.
Beispiel 2 zoo mg kristallisiertes, HG-wirksames Insulin (Zn-Gehalt 111/9) werden in 5 ccm o,1 n wäß riger Apfelsäurelösung mit NaOH auf pg 5,4 eingestellt) im Zentrifugenglas suspendiert. Nach i2stündigem Stehenlassen abzentrifugieren, zweimaliges Wiederholen der Behandlung mit Apfelsäure. Nach Abzentrifugieren der letzten Apfelsäurefraktion waschen mit 2 ccm Aceton und abzentrifugieren. Trocknender Kristalle im Vakuumexsikkator. Ausbeute 95 mg. Zn-Gehalt 0,48%. HG-Wirkung i. v. und i. m. nicht mehr nachweisbar.
Das Verfahren beruht darauf, daß das im handelsüblichen Insulin chemisch gebundene Zink aus der Verbindung entfernt wird. Das Zink ist als fester Scherenkomplex am Insulin gebunden. Bei der beschriebenen Behandlung werden die Bindungen des Zinks mit den N H2 Gruppen aufgespalten, das Zink geht die Salzbildung mit dem Säureüberschuß ein, und die an das Zink gebundenen sauren Gruppen des Insulins gehen in freie saure Gruppen über. Die Behandlung wird zweckmäßig in solchen Behandlungsflüssigkeiten vorgenommen, die die Insulinkristalle nicht lösen. Beispielsweise in acetonhaltigen Lösungen von a-Aminosäuren (pH etwa 5 bis 6) oder in Oxy-mono- oder Polycarbonsäuren, insbesondere a-Oxy-Säuren (pg etwa 5 bis 6). Wenn man lösende Behandlungsflüssigkeiten verwendet, läßt sich das Zink schneller und vollständiger entfernen, aber die Wiedergewinnung eines kristallisierten Produktes bereitet gewisse Schwierigkeiten, und die Entfernung des Zinks auf einen Gehalt von 0,4 bis 0,5 % ist ausreichend für die Entfernung der störenden HG-Wirkung. Als zinkbindende Behandlungsmittel sind milde wirkende Stoffe zu verwenden, die nicht vom Insulin festgehalten werden und das Insulinmofekül in seiner blutzuckersenkenden Wirkung nicht schädigen. Eine Herabsetzung des Zinkgehaltes auf 0,5 0/a oder weniger erreicht man beispielsweise durch Dialysieren einer Zink-Insulin-Lösung gegen eine saure o,oi n-Apfelsäurelösung vom PH 3 bis 4, zweckmäßig unter fortlaufendem Zutropfen frischer Apfelsäurelösung in das Dialysat.
Neben den vorstehend genannten Verbindungen finden sich noch zahlreiche andere, auch aromatische, aliphatisch-aromatische, heterocyclische saure Verbindungen, Pyridincarbonsäwren usw., die Zink zu binden vermögen und daher grundsätzlich für die Durchführung des Verfahrens geeignet sind. Die vorstehend genannten Verbindungen sind jedoch zellvertraut und nicht toxisch, so daß ihre Anwendung immer unbedenklich ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung von Insutlinpräparaten mit einem Zinkgehalt von o,5 % und darunter, dadurch gekennzeichnet, daß zinkreicheres Insulin zur Vermeidung der nach parenteraler Injektion eintretenden initialen Blu.tzuckersteigerung mit zinkbindenden Reagenzien, wie Milchsäure, Apfelsäure, Asparagins-äure, behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch r, dadurch gekennzeichnet, daß kristallinische zinkhaltige Insulinpräparate in solche Lösungen zinkbindender Reagenzien eingebracht werden, in denen sie sich nicht lösen, wie wäBrig-acetonische Lösung von Asparaginsäure mit einem pH-Wert von 5 bis 6, und dabei ohne Verlust ihrer kristallinen Struktur vom hyperglykämischen Faktor befreit werden.
3. Verfahren nach Anspruch r, dadurch gekennzeichnet, daß die Herabsetzung des Zinkgehaltes durch Dialysieren einer Zink-Insulin-Lösung gegen eine saure Apfelsäurelösung, beispielsweise mit einem pl, von 3 bis 4, zweckmäßig unter fortlaufendem Zutropfen frischer Apfelsäurelösung in das Dialysat, durchgeführt wird. In Betracht gezogene Druckschriften: Schweizerische Patentschrift Nr. 255 252; deutsche Patentschrift Nr. 835 499.