DE2626626C2

DE2626626C2 - Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe

Info

Publication number: DE2626626C2
Application number: DE19762626626
Authority: DE
Inventors: Winfried Dr. 6530 Bingen Hartmeier
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Priority date: 1976-06-14
Filing date: 1976-06-14
Publication date: 1978-08-03
Also published as: DE2626626B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Invertase durch gleichzeitige Einwirkung von Cellulase, Protease und Lipase auf die Hefe freigesetzt sodann von den unlöslichen Stoffen befreit und von anderen löslichen Hefeextraktstoffen abgetrennt wird.

Es sind sowohl Verfahren für die Gewinnung von Invertase einerseits sowie von Hefeextrakt bzw. Hefeautolysat andererseits (siehe U11 m a η η, Enzyklopädie der techn. Chemie, Bd. 7, [1956], Seiten 416 und 417) bekannt. Diese bekannten Arbeitsweisen ließen sich jedoch bisher nicht zu einer befriedigenden, wirtschaftlich günstigen Methode zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe vereinigen.

Denn Invertase ist im natürlichen Zustand relativ fest an die Hefezellwand gebunden. Zur Gewinnung löslicher Invertase aus frischer Hefe wird diese daher üblicherweise einer Plasmolyse und anschließender Autolyse unterworfen. Dieser Vorgang ist relativ langwierig (Dauer z. B. 96 Stunden) und deshalb sowohl mit Invertase-Aktivitätsverlusten sowie mit einer Infektionsgefahr verbunden. Die Plasmolyse und Autolyse wird üblicherweise durch Toluol- oder Salzzugabe oder durch andere Zusatzstoffe beschleunigt. Toluol, Salz und andere Zusatzstoffe stören jedoch im Endprodukt und müssen deshalb wieder entfernt werden. Üblicherweise wird die gelöste Invertase z. B. durch Lösungsmittel oder Ammoniumsulfat ausgefällt.

Die Verwendung getrockneter (z. B. sprühgetrockneter) Ausgangshefe wäre im Hinblick auf eine bessere Lagerfähigkeit dieses Ausgangsproduktes zwar wünschenswert, es galt jedoch bisher als gesicherte Erkenntnis, daß die Invertasefreisetzung aus vorher getrockneter und wieder suspendierter Hefe schwieriger ist und die dabei erzielten Ausbeuten niedriger sind (vgl. H. Fischer und L K ο h t e s : Purification de l'invertase de levure; HeIv. Chim. Acta 34, 1223-1131. [1951]).

Zur Beschleunigung der Invertasefreisetzung sind auch schon proteolytische und celluloytische Enzyme vorgeschlagen worden. Dennoch ist die erforderliche Aufschlußzeit immer noch so lang, daß erhebliche Infektionsgefahr besteht Die Verwendung von Antiseptika ist zwar möglich, dann aber entsteht das zusätzliche Problem der späteren Entfernung dieser Stoffe aus dem Autolysat,

Aufgabe der Erfindung war es somit, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren für die Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe zu finden.
Es wurde nun gefunden, daß die Gewinnung von

ίο löslicher Invertase aus Hefe mit hoher Ausbeute aus Hefe gelingt, wenn die Hefe einem Aufschluß unter gleichzeitigem Zusatz einer mikrobiellen oder pflanzlichen Protease (ζ. B. Papaün, Bromelin, Ficin), Cellulase und Lipase ausgesetzt, dann filtriert und das Filtrat schließlich durch Ultrafiltration in Hefeextrakt und Invertase getrennt wird. Als Hefe-Substrat wird dabei vorzugsweise sprühgetrocknete Hefe verwendet, die zweckmäßig in kaltem Wasser resuspendfe-r wird.

Die Sprühtrocknung der Ausgangshefe erfolgt zweckmäßig bei Luft-Eingangstemperaturen zwischen etwa 140 und 240⁰C und bei Luft-Ausgangstemperaturen zwischen etwa 70 und 120⁰C. Es wurde nämlich festgestellt, daß bei niedrigeren Trocknungstemperaturen die Invertasefreisetzung überraschenderweise stark verzögert wird. Außerdem überleben auch eine Reihe hefeinfizierender Fremdorganismen, die beim späteren Aufschluß stören. Höhere Temperaturen als die oben angegebenen vermindern die Invertaseausbeute durch Inaktivierung des Enzyms.

jo Die sprühgetrocknete Hefe wird dann in etwa der 2-bis 5fachen Menge kalten, möglichst salzfreien Wassers bei ca. 0 bis 25°C resuspendiert. Bei höherer Wassertemperatur als 25° C sowie bei höherem Salzgehalt des Wassers ist der günstige Effekt auf die

J5 schnellere Invertasefreisetzung gemäß der Erfindung nicht mehr gegeben.

Der Hefeaufschluß, der mit der Invertasefreisetzung gekoppelt ist, erfolgt erfindungsgemäß unter Zugabe von etwa 0,2 bis 5 g Cellulase, etwa 0,2 bis 5 g Protease und etwa 0,2 bis 5 g Lipase pro kg Trockenhefe. Während 8- bis 20stündiger Aufschlußzeit muß auf ca. 40 bis 5C°C, vorzugsweise 45° C temperiert werden. Als Cellulase eignet sich vor allem Pilzcellulase, z. B. solche aus Basisdiomyceten oder aus Trichoderma viride mit

4-> einer Aktivität von beispielsweise 20 000 Cellulase-Einheiten pro Gramm. Als Protease kann Papain, z. B. solches mit 4,5 Einheiten pro Gramm (gemessen nach der Anson-Methode) eingesetzt werden. Die verwendete Lipase kann sowohl tierischen wie auch mikrobiellen Ursprungs sein; gut geeignet ist z. B. Lipase aus Aspergillusarten mit einer Aktivität von 7000 Lipaseeinhciten pro Gramm.

Die Aktivitütsbestimmung von Cellulase und Lipase erfolgte dabii nach den im folgenden angegebenen Methoden:

1. Pilzcellulase

Die Bestimmung von Pilzcellulase erfolgt durch Messung der reduzierenden Zucker, die nach Einwirken ho auf eine 1°/oige Lösung von Carboxymethylcellulose bei 37° C und pH 4,6 innerhalb von einer Stunde entstehen (photometrische Bestimmung der Färbung mit 3,5-Dinitrosalicylsäure).

Durchführung

In einen 25-ml-Meßzylinder werden 1 ml Glukoselösung (0,5 mg/ml), I ml deionisiertes Wasser und 1 ml I n-NaOH gegeben und nach Umschütteln mit 3 ml

Dinitrosalicylsäurelösungversetzt

Getrennt davon wird eine Kontrolläsung angesetzt, indem die Glukoselösung durch 1 ml Wasser ersetzt wird. Beide Meßgefäße werden für 5 Minuten in ein Bad mit kochendem Wasser gestellt und nach Abkühlen auf 25 ml aufgefüllt Nach mehrfachem Umschütteln wird dann in Meßküvetten von 1 cm Dicke im Spektralphotometer nach 10 Minuten bei 540 nm gemessen. Die Färbung ist über24 Stunden stabil.

Danach wird eine Mutterlösung hergestellt, entweder aus einem Extrakt des Pulvers oder seiner Lösung. Falls notwendig, wird abfiltriert Dann werden drei Verdünnungen hergestellt in einer Größenordnung, wie man sie für die Messung von 0,5 mg Glukose benötigt

Dann wird in zwei 25-ml-Kolben 1 ml Substrat und 1 ml Enzymlösung eingefüllt, beide Kolben werden geschüttelt und für genau eine Stunde in einen Thermostat von 37° C gestellt

In den anderen Kolben (Kontrollösung) werden t ml 1 n-NaOH und 3 ml Dinitrosalicylsäure-Reagenz gegeben und mit 5 rat pochendem Wasser übergössen. Nach Abkühlung wird auf 25 ml aufgefüllt und wiederholt umgeschüttelt Der gleiche Vorgang wird mit den anderen Enzymverdünnungen vorgenommen. Man mißt dann nach 10 Minuten in Meßküvetten von 1 cm gegen die betreffende Kontrolle bei 54G nm.

Die Ergebnisse werden in einem Koordinatensystem eingetragen, dessen Abszisse die Enzymverdünnungen und die Ordinate die optische Dichte angibt Die Punkte sind deutlich auf den Nullpunkt ausgerichtet Man zeichnet dann die Parallele zur Abszissenachse von dem Punkt der optischen Dichte, der durch 0,5 mg Glukose angegeben wird. Ausgehend von dem Schnittpunkt dieser Kurve und der Kurve der Enzymaktivität zieht man die Senkrechte von der Abszksenachse. Damit erhält man eine Verdünnung die einer Cellulase-Einheit entspricht Davon zieht man den Titer der Enzymlösung ab, den man in mg-Substrat ausdrückt

Verwendete Reagenzien

3,5-DtnitrosalicyIsäurereagenz:

Zu 300 ml einer 4,5%igen Natronlauge werden 800 ml einer l%igen Dinitrosalicylsäurelösung und 255 g Kaliumnatriumtartrat zugegeben.
In einem anderen Gefäß werden 10 g Phenol krist. 22 ml 10%ige Natronlauge gegeben und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt Zu 69 ml dieser Phenollösung gibt man dann 6,9 g Natriumbisulfit und mischt diese Lösung mit der Dinitrosalicylsäurelösung.

Das Reagenz muß in braunen, gut verschlossenen Flaschen aufbewahrt werden.
3 ml von diesem Reagenz müssen bei der Titration mit Phenolphthalein 5—6 ml der Lösung äquivalent sein.

pH 4,6-Pufferlösung:

1 m Essigsäure / Natriumacetat.

Carboxymethylcellulose:

Zu 900 ml desL Wasser werden unter schnellem Rühren 10 g CMC so zugegeben, daß Klumpenbildung vermieden wird. Es wird weitere 30 Min. gerührt und über Nacht stehengelassen. Dann werden 10 ml einer pH-4,6-Pufferlösung zugegeben und nach lOminütigem Rühren über ein Filter Nr. 2 abfiltriert.
Diese Lösung ist bei Zimmertemperatur 1 Monat lang

in einer verschlossenen Flasche haltbar.

2. Pilz-Lipase

Die Bestimmung beruht auf dem Prinzip der Hydrolyse einer Emulsion von Olivenöl mit Hilfe von Upase unter bestimmten Bedingungen (37"C, pH 7,5) und Messung der innerhalb von einer Minute freigesetzten Menge Fettsäure.

Bestimmungsgemäß entspricht I Einheit Lipase der Menge Fettsäure, die durch ein Mikromol Natronlauge in neutralisiert wird (P. Desnuelles, M.J. Constant in und J. Baldy, Bull. Soc. Chemie BioL. 37, 285 [1955]).

Durchführung

is In einem auf 37° ± 0,1⁰C gehaltenen 150-ml-Bccherglas (Thermostat) werden nacheinander 7,5 ml einer Emulsion von Olivenöl (50 ml neutralisiertes Olivenöl, 25 ml Wasser, 5OmI einer frisch bereiteten 3%igen wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol 1 bis 2 Minuten mittels Ultraturrax gerührt), 5 ml 0,1 -m Calciumchlorid-Lösung, 1 ml Rinderalbumin (2O°/oige wäßrige Lösung, die 0,5% Natriumazid als Konservierungsmittel enthält) und 76,5 ml destilliertes Wasser (vorher auf 37° C temperiert) vorgelegt und mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,6 eingestellt. Nach Erreichen der Temperaturkonstanz wird 1 ml Lipase-Lösung (ca. 5 bis 500μg/ml in 0,01-m Calciumch'orid-Lösung) zugegeben und entweder mit einem automatischen Titrierapparat titriert oder mit einem pHstat durch

jo Zusatz von 0,1 η-Natronlauge auf einem pH-Wert von 7,5 gehalten. Bei Verwendung eines automatischen Titrierapparates wird der Verbrauch an Mikromolen Natronlauge gegen die Zeit in einem Koordinatensystem eingetragen, in dessen Abszisse die Zeit in

y, Sekunden und in dessen Ordinate der Verbrauch an Mikromol Natronlauge eingetragen ist. Für eine ausreichende Bestimmung müssen 100 Mikromol Natronlauge innerhalb von 3 bis 6 Minuten verbraucht sein. Aus dem geraden Teil der Kurve wird die Anzahl Mikromole Natronlauge, die pro Minute verbraucht werden, berechnet Das Ergebnis entspricht der Aktivität der Lipase in Einheiten pro Milligramm.

Bei einem registrierenden pHstat wird in gleicher Weise aus dem Kurvenverlauf die Ativität abgelesen.

Einheit/mg =

Berechnung

ml NaOH/Min. ■ 1 n-NaOH ■ 1000
mg Protein

Verwendete Reagenzien

3°/p'ger Polyvinylalkohol:

30 g Rhodoviol 20/100 M/Rhöne-Poutenc werden in 600 ml dest Wasser bei 60° C unter starkem Rühren eingetragen. Danach wird 1 Stunde bei 80°C gerührt und anschließend abgekühlt. Dann wird die Lösung mit dest Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und filtriert. Diese Lösung muß zwischen der 24. und 72. Stunde verbraucht werden.

Albumin:

Rinderalbumin Armour, Fraktion V oder
Rinderalbumin Pentex/Fluka BVO 262.

Olivenöl:

reinst, neutralisiert (Säuregehalt max. 0,15%).
Im Anschluß an die 8- bis 20stündige Invertasefreiset-

zung wird die Aufschlußbrühe über ein entkeimendes Filter (EK-Filter) filtriert. Das Filtrat (EK-FiltraO wird

dann einer Ultrafiltration mit einem Molekulargewichtsschnitt zwischen 50 000 und 120 000 unterworfen. Die Ausgangsmenge EK-Filtrat wird dabei auf Ά bis '/20 konzentriert Dieses Retentat enthält die Invertase in hoher Reinheit, während das Ultrafiltrat wohlschmekkenden dünnflüssigen Hefeextrakt darstellt

Sowohl die flüssige invertase wie auch der flüssige Hefeextreakt können je nach Wunsch weiterverarbeitet (z. B. getrocknet) werden. Bevorzugt wird die konzentrierte flüssige Invertaselösung mit Glycerin und/oder Sorbitlösung stabilisiert und standardisiert Der flüssige Hefeextrakt wird vorzugsweise sprühgetrocknet

Beispiel

1,8 kg einer frischen Backhefe mit einer Invertaseaktivität von 5,0 μ/mg Trockensubstanz wurden in 31 entionieriertem Wasser suspendiert und bei 170⁰C Lufteingangstemperatur und 90° C Luftausgangstemperatur sprühgetrocknet Es resultierten daraus 530 g Trockenhefe. Diese sprühgetrocknete Hefe wurde in 1,51 entionisiertes Wasser von 10°C eingerührt Dieser Suspension wurden 1 g Pilzcellulase mit 20 000 Ceüulaseeinheiten pro Gramm, I g Papain mit 4,5 Anson-Einheiten pro Gramm und 1,0 g Pilzlipase mit 7000 Lipaseeinheiten pro Gramm zugegeben. Dann wurde 14 Stunden lang bei 45° C temperiert Diese Aufschlußlö sung wurde ausgewaschen, so daß insgesamt 4,95 I EK-Filtrat mit 0,468 μ/mg Invertaseaktivität resultierten. Ober ein Ultrafilter mit Molekulargewichtsschnitt bei 100 000 wurde das EK-Filtrat ultrafiltriert Es resultierten 420 g Retentat einer Invertaseaktivität von 4,60 μ/mg und 4,53 kg Ultrafiltrat, das praktisch keine Invertase, sondern nur Hefeextrakt enthielt Das Retentat wurde durch Zugabe von Glycerin mit einer Dichte von 1,23 kg/1 zu 1,00 kg stabilisierter Invertinlösung von 2,00 μ/mg Aktivität aufgefüllt Das Ultrafiltrat mit den darin enthaltenen Extraktstoffen wurde bei 200° C Lufteingangstemperatur und 100° C Luftausgangstemperatur zu 225 g pulvrigem Hefeextrakt sprühgetrocknet

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß die Invertase durch gleichzeitige Einwirkung von Cellulase, Protease und Lipase auf die Hefe freigesetzt, sodann von den unlöslichen Stoffen befreit und von anderen löslichen Hefeextraktstoffen abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sprühgetrocknete Hefe als Ausgangsmaterial eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die sprühgetrocknete Hefe in kaltem Wasser resuspendiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Papain eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Invertase von dem von unlöslichen Stoffen befreiten Hefeextrakt durch Ultrafiltration abtrennt