DE2329919C2 - Gewinnung hellfarbiger Proteasen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Fermentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen und die Verwendung dieser Proteasen.

In den letzten Jahren hat die Verwendung von Proteasen für die verschiedensten industriellen Anwendungszwecke stark zugenommen. Die Gewinnung erfolgt in bekannter Weise durch Fermentationsprozesse in Nährlösungen mittels Bakterien- oder Pilzarten und Abscheiden der gebildeten Proteasen durch Aussalzen, Eindampfen oder dgl. Obwohl die Fermentationslösungen vor dem Abtrennen der Enzyme durch Filtrieren oder Zentrifugieren sorgfältig gereinigt werden, weisen die Proteasen in der Regel eine sehr dunkle Färbung auf, die die weitere Verwendung in vielen Fällen stark beeinträchtigt. Insbesondere kann der Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern zu sichtbaren Inhomogenitäten oder Verfärbungen führen.

Die bisherigen Versuche zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Bleichen mit Sulfit oder durch Niederschlagen der färbenden Verunreinigungen im Fermentationsstadium durch Bildung unlöslicher Feststoffe in situ (DE-OS 20 39 752) haben in der Praxis nicht voll befriedigt, sei es, daß die Aufhellung für viele Zwecke nicht ausreicht, oder daß die Handhabung der Verfahren zu umständlich ist.

Gegenstand der Erfindung (vgl. Patentanspruch 1) ist ein Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Fermentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Fermentalionslösung nach Beendigung des Fermentationsprozesses 0,1-5 Prozent Thioharnstoffdioxid zusetzt und 30 Minuten bis 24 Stunden einwirken läßt. Die Patentansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Der AnsDruch 6 beinhaltet die Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen Proteasen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern.

Der Fermentationsprozeß zur Gewinnung der Pro- -, teasen wird in üblicher Weise durch Vergären von Nährlösungen mittels Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien oder Pilzarten durchgeführt Als Mikroorganismen kommen z. B. Stämme der Gattung Fusarium, Giberella, Streptomyces, Aspergillus, Psnicillium, Cytophagae, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas, Bacillus usw. in Betracht Am besten werden bestimmte Varietäten des Bacillus licheniformis, insbesondere der Stamm OR 48, hinterlegt am Laboratorium voor Microbiologie, Delft (gemäß DE-OS 20 63 988), verwandt, die ein besonderes beständiges und für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln hervorragend geeignetes proteolytisches Enzym produzieren.

Als Nährmedium verwendet man zweckmäßig eine wäßrige Lösung, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere von den Mikroorganismen benötigte Nähr- und Wuchsstoffe enthält. Als geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glucose, Fructose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff, Kasein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl bzw. -kuchen in Frage. Weiterhin können der Nährlösung anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydrogenphosphate, sowie Fermentationsbeschleuniger, wie

jo Hefeextrakte und Vitamine zugesetzt werden.

Die Fermentationstemperatur liegt normalerweise in den Grenzen zwischen 25 und 55°C, zweckmäßig zwischen etwa 30 und 40°C. Der pH-Wert des Nährbodens muß den optimalen Wachstumsanforde-

j-, rungen des betreffenden Mikroorganismus möglichst weitgehend angepaßt werden; er beträgt im Falle des Bacillus licheniformis etwa 5,0 bis 9,0, am besten 6,5 bis 8,0. Der Fermentationsprozeß benötigt etwa 20 bis 80 Stunden.

4.1 Nach Beendigung des Fermentationsprozesses wird die Fermentationslösung filtriert oder zentrifugiert, um Zellbestandteile, Nährstoffreste oder andere Verunreinigungen abzutrennen. Danach erfolgt die Abscheidung der gebildeten Proteasen durch Zusatz organischer

4-j Lösungsmittel oder durch Aussalzen, z. B. mit Kochsalz, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Kalziumchlorid. Zweckmäßigerweise wird die gereinigte Fermentationslösung vor dem Aussalzen durch Eindampfen in Vakuum bei niederen Temperaturen konzentriert.

"in Der Bleichprozeß wird durch Zusatz von Thioharnstoffdioxid zur Fermentationslösung durchgeführt. Der Zusatz kann vor oder nach dem Filtrieren bzw. Zentrifugieren der Fermentationslösung erfolgen, wobei die zuletzt genannte Arbeitsweise einen geringeren

■-,·-, Einsatz an Bleichmittel erfordert. Je nach Verfahrensweise benötigt man 0,1 bis 5%, vorzugsweise 0,3 bis 1% an Thioharnstoffdioxid, bezogen auf die Fermentationslösung. Zur Erzielung eines guten Ergebnisses muß eine ausreichende Einwirkungszeit für das Bleichmittel zur

ho Verfügung stehen, die, je nach Konzentration, Temperaur, Einsatzmenge an Bleichmittel u. dgl., 30 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis 3 Stunden beträgt. Um den Produktionsablauf nicht zu behindern, kann während der Einwirkungszeit des Bleichmittels das

tr, Abfiltrieren oder Zentrifugieren bzw. das Konzentrieren der Lösungen, wie das Ausfällen der Protease, durchgeführt werden.

Da die Anwesenheit von Sauerstoff zu einer

stärkeren Braunfärbung bzw. einem höheren Verbrauch an Bleichmittel führt ist es vorteilhaft die Fermentationslösung vor dem Zusatz des Thioharnstoffdioxids mit einem inerten Gas, z. B. Stickstoff oder Kohlendioxid zur Entfernung des Sauerstoffs durchzublasen. Hierdurch können erhebliche Mengen an Bleichmittel eingespart bzw. ein besseres Ergebnis erzielt werden.

Die weitere Aufarbeitung der Fermentationslösung sowie die Gewinnung des Enzyms erfolgt in bekannter Weise. Man erhält nach dem beschriebenen Verfahren Proteasen von hellbräunlicher bis grauweißer Farbe, die eine hohe Aktivität aufweisen. Überraschenderweise erzielt man durch den beschriebenen Bleichvorgang gleichzeitig eine gewisse Stabilisierung der Enzymaktivität.

Die gewonnenen Proteasen eignen sich für die gleichen Einsatzzwecke, für die man bisher ungereinigte Proteasen eingesetzt hat, wie z. B. Zusätze zu Tierfuttermitteln sowie für den Einsatz in eiweißlösenden Wasch- und Reinigungsmitteln. Insbesondere für die Verwendung in Wasch- oder Reinigungspulvern sind die erfindungsgemäß gewonnenen Produkte wegen ihrer hellen Farbe vorzüglich geeignet.

Für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern werden die Proteasen zweckmäßig in sogenannte Vorgemische übergeführt, die zu einem nicht staubenden und gut rieselfähigen Granulat verarbeitet werden können. Die Herstellung der Vorgemische erfolgt beispielsweise durch Einbringen der Enzyme in eine Schmelze von geeigneten nichtionogenen Tensiden, z. B. Fettalkohol- bzw. Alkylphenol-Äthylenoxid-Addukten unter Zugabe einer vorbestimmten Menge von Natriumtriphosphat oder anderen Salzen, wobei die proteolytische Aktivität wunschgemäß eingestellt werden kann. Die Vorgemische enthalten die Enzyme in einer stabilisierten und gut lagerfähigen Form. Sie können den Wasch- und Reinigungspulvern unmittelbar zugesetzt werden. Die mit den erfindungsgemäß gebleichten Proteasen hergestellten Vorgemische führen auf Grund ihrer hellen Farbe nicht zu sichtbaren Inhomogenitäten in den Reinigungsmittelpulvern.

Beispiele

1. Eine durch Fermentation mittels Bacillus licheniformis erhaltene Fermentationslösung wurde nach dem

in Filtrieren mit 0,6% Thiohamstoffdioxid versetzt. Nach einer Einwirkungszeit von 3 Stunden wurde die Protease mit Natriumsulfat ausgefällt und die Aufhellung im Vergleich zu einer ohne Bleichung gewonnenen Protease bestimmt. Hierzu wurden mit Hilfe eines

ι -, Filterfarbmeßgerätes (RFC 3 Zeiss) die Remissionskurven bestimmt, aus denen sich die in der Farbmetrik gebräuchlichen Helligkeitswerte Verrechnen ließen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Protease ungebleicht:
-" Y= 20,1

Protease gebleicht:

r=40,3, entsprechend etwa 100% Aufhellung

Bezogen auf Protease betrug der Gleichmittelverj-, brauch im vorstehenden Falle 22,5 g Thioharnstoffdioxid/kg Protease, entsprechend einem Bleichmittelverbrauch von 2,25%.

2. Zur Oberprüfung des Aktivitätsverlustes durch den Bleichvorging wurde eine Aufschlämmung von 6 g

in ungebleichter Protease in 20 ml Wasser mit 3 bzw. 5% Thiohamstoffdioxid, bezogen auf Protease, versetzt. Die Aktivitäten wurden zu Beginn des Versuches sowie nach 30, 60 und 150 Minuten bestimmt. Die Temperatur betrug 20°C. Die Aktivitätswerte sind in Protease-Ein-

j-, heiten/g(PE/g) angegeben.

Tabelle

Protease nicht gebleicht

Protease + 3% ThioharnstofTdioxid

Protease + 5% ThiohurnslofTdioxid

0 Min.

30 Min.

60 Min.

598 000 580 000 590 000 601 000
598 000
588 000

574 000
583 000
576 000

150 Mm.

586 000 PE/g 576 000 PE/g 574 000 PE/g

Die Ergebnisse zeigen, daß durch den Bleichvorgang kein nennenswerter Verlust an Protease-Aktivität eintritt.

3. Zur Bestimmung der Stabilität wurde eine entsprechend Beispiel 2 mit 5% Thiohamstoffdioxid gebleichte Protease mit einer ungebleichten Protease verglichen. Dazu wurden 1,5 mg Enzymkonzentrat in 100 ml einer 2%igen Lösung von Natrium-Polyphosphat bei 20°C und pH 8,5 gelöst. Die Aktivitäten wurden zu Beginn des Versuchs und nach 24 Stunden bestimmt. Sie sind wiederum in Proiease-Einheiten/g (PE/g) angegeben.

Tabelle

	gebleicht	0 Sid.	24 Std.	PE/g
Protease nicht		580 000	397 000
	Thioham-	(100%)	(68,5%)	PE/g
Protease + 5%		562 000	493 000
stoffdioxid	(100%)	(87,8%)

Die Meßwerte zeigen eindeutig, daß die gebleichte Protease eine höhere Stabilität aufweist, als die ungebleichte Protease.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Fermentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Fermentationslösung nach Beendigung des Fermentationsprozesses 0,1—5 Prozent Thioharnstoffdioxid zusetzt und 30 Minuten bis 24 Stunden einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den Zusatz von 0,3-1 Prozent an Thioharnstoffdioxid zur Fermentationslösung.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkungszeit des Thioharnstoffdioxids 2 — 3 Stunden beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 —3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationslösung vor dem Zusatz des Thioharnstoffdioxids mit einem inerten Gas zur Entfernung des Sauerstoffs durchbläst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen den Stamm Bacillus licheniformis OR 48, hinterlegt am Laboratorium voor Microbiologie, Delft, einsetzt.

6. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen Proteasen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern.