DE2329921C2

DE2329921C2 - Gewinnung hellfarbiger Proteasen

Info

Publication number: DE2329921C2
Application number: DE2329921A
Authority: DE
Inventors: Helmut Dipl.-Chem. Dr. 4010 Hilden Bloching
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1973-06-13
Filing date: 1973-06-13
Publication date: 1982-06-09
Also published as: DE2329921A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Formentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen und die Verwendung dieser Proteasen.

In den letzten Jahren hat die Verwendung von Proteasen für die verschiedensten industriellen Anwendungszwecke stark zugenommen. Die Gewinnung erfolgt in bekannter Weise durch Fermentationsprozesse in Nährlösungen mittels Bakterien- oder Pilzarten und Abscheiden der gebildeten Proteasen durch Aussalzen, Eindampfen oder dergleichen. Obwohl die Fermentationslösungen vor dem Abtrennen der Enzyme durch Filtrieren oder Zentrifugieren sorgfältig gereinigt werden, weisen die Proteasen in der Regel eine sehr dunkle Färbung auf, die die weitere Verwendung in vielen Fällen stark beeinträchtigt Insbesondere kann der Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern zu sichtbaren Inhomogenitäten oder Verfärbungen führen.

Die bisherigen Versuche zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Bleichen mit Sulfit oder durch Niederschlagen der färbenden Verunreinigungen im Fermentationsstadium durch Bildung unlöslicher Feststoffe in situ (DE-OS 20 39 752) haben in der Praxis nicht voll befriedigt, sei es, daß die Aufhellung für viele Zwecke nicht ausreicht, oder daß die Handhabung der Verfahren zu umständlich ist

Gegenstand der Erfindung (vgl. Anspruch 1) ist ein Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Fermentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Fermentationslösung nach Beendigung des Fermentationsprozesses 0,1 —5 Prozent Salze der Oxymethansulfinsäure zusetzt und 30 Minuten bis 24 Stunden einwirken läßt Die Ansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Der Anspruch 7 beinhaltet die Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen

ίο Proteasen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern.

Der Fermentationsprozeß zur Gewinnung der Proteasen wird in üblicher Weise durch Vergäien von Nährlösungen mittels Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien oder Pilzarten durchgeführt Als Mikroorganismen kommen z. B. Stämme der Gattung Fusarium, Giberella, Streptomyces, Aspergillus, Penicillium, Cytophagae, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas, Bacillus usw. in Betracht Am besten werden bestimmte Varietäten des Bacillus licheniformis, insbesondere der Stamm OR 48, hinterlegt am Laboratorium voor Microbiologie, Delft, (gemäß DE-OS 2063 988) verwandt, die ein besonders beständiges und für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln hervorragend geeignetes proteolytisches Enzym produzieren.

Als Nährmedium verwendet man zweckmäßig eine wäßrige Lösung, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere von den Mikroorganismen benötigte Nähr- und Wuchsstoffe enthält Als geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glucose, Fructose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff, Kasein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl bzw. -kuchen infrage.

Weiterhin können der Nährlösung anorganische Salze, wie Natrium-, Kalkium- oder Ammoniumhydrogenphosphate, sowie Fermentationsbeschleuniger, wie Hefeextrakte und Vitamine zugesetzt werden.
Die Fermentationstemperatur liegt normalerweise in den Grenzen zwischen 25 und 55° C, zweckmäßig zwischen etwa 30 und 40⁰C. Der pH-Wert des Nährbodens muß den optimalen Wachstumsanforderungen des betreffenden Mikroorganismus möglichst weitgehend angepaßt werden, er beträgt im Falle des Bacillus licheniformis etwa 5,0 bis 9,0, am besten 6,5 bis 8,0. Der Fermentationsprozeß benötigt etwa 20 bis 80 Stunden.

Nach Beendigung des Fermentationsprozesses wird die Fermentationslösung filtriert oder zentrifugiert, um

so Zellbestandteile, Nährstoffreste oder andere Verunreinigungen abzutrennen. Danach erfolgt die Abscheidung der gebildeten Proteasen durch Zusatz organischer Lösungsmittel oder durch Aussalzen, z. B. mit Kochsalz, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Kalziumchlorid.

Zweckmäßigerweise wird die gereinigte Fermentationslösung vor dem Aussalzen durch Eindampfen im Vakuum bei niederen Temperaturen konzentriert.

Der Bleichprozeß wird durch Zusatz von Salzen der Oxymethansulfinsäure, insbesondere den Alkali- oder Ammoniumsalzen zur Fermentationslösung durchgeführt Der Zusatz kann vor oder nach dem Filtrieren bzw. Zentrifugieren der Fermentationslösung erfolgen, wobei die zuletztgenannte Arbeitsweise einen geringeren Einsatz an Bleichmittel erfordert Je nach Verfahrensweise benötigt man 0,1 bis 5%, vorzugsweise 03 bis 1% an Oxymethansulfinsäure-Salzen, bezogen auf die Fermentationslösung. Zur Erzielung eines guten Ergebnisses muß eine ausreichende Einwirkungszeit für das

Bleichmittel zur Verfügung stehen, die, je nach Konzentration, Temperatur, Einsatzmenge an Bleichmittel und dergleichen, 30 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis 3 Stunden beträgt Um den Produktionsablauf nicht zu behindern, kann während der Einwirkungszeit des Bleichmittels das Abfiltrieren oder Zentrifugieren bzw. das Konzentrieren der Lösungen, wie das Ausfüllen der Protease durchgeführt werden.

Da die Anwesenheit von Sauerstoff zu einer stärkeren Braunfärbung bzw. einem höheren Verbrauch an Bleichmittel führt, ist es zweckmäßig, die Fermentationslösung vor dem Zusatz der Oxymethansulfinsäure-Salze mit einem inerten Gas, z.B. Stickstoff oder Kohlendioxid zur Entfernung des Sauerstoffs durchzublasen. Hierdurch können erhebliche Mengen an Bleichmittel eingespart bzw. ein besseres Ergebnis erzielt werden.

Die weitere Aufarbeitung der Fermentationslösung sowie die Gewinnung des Enzyms erfolgt in bekannter Weise. Man erhält nach dem beschriebenen Verfahren Proteasen von hellbräunlicher bis grauweißer Farbe, die eine hohe Aktivität aufweisen. Überraschenderweise erzielt man durch den beschriebenen Bleichvorgang gleichzeitig eine gewisse Stabilisierung der Enzymaktivität

Die gewonnenen Proteasen eignen sich für die gleichen Einsatzzwecke, für die man bisher ungereinigte Proteasen eingesetzt hat, wie z. B. Zusätze zu Tierfuttermitteln sowie für den Einsatz in eiweißlösenden Wasch- und Reinigungsmitteln. Insbesondere für die Verwendung in Wasch- oder Reinigungspulvern sind die erfindungsgemäß gewonnenen Produkte wegen ihrer hellen Farbe vorzüglich geeignet.

Für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern werden die Proteasen zweckmäßig in sogenannte Vorgemische übergeführt, die zu einem nicht stäubenden und gut rieselfähigen Granulat verarbeitet werden können. Die Herstellung der Vorgemische erfolgt beispielsweise durch Einbringen der Enzyme in eine Schmelze von geeigneten nichtionogenen Tensiden,

z. B. Fettalkohol- bzw. Alkylphenol-Äthylenoxid-Addukten unter Zugabe einer vorbestimmten Menge von Natriumtriphosphat oder anderen Salzen, wobei die proteolytische Aktivität wunschgemäß eingestellt werden kann. Die Vorgemische enthalten die Enzyme in einer stabilisierten und gut lagerfähigen Form. Sis können den Wasch- und Reinigungspulvern unmittelbar zugesetzt werden. Die mit den erfindungsgemäß gebleichten Proteasen hergestellten Vorgemische führen auf Grund ihrer hellen Farbe nicht zu sichtbaren Inhomogenitäten in den Reinigungsmittelpulvern.

Beispiele

1. Eine durch Fermentation mittels Bacillus licheniformis erhaltene Fermentationslösung wurde nach dem Filtrieren mit 0,5% Na-SaIz der Oxymethansulfinsäure versetzt Nach einer Einwirkungszeit von 4 Stunden wurde die Protease mit Natriumsulfat ausgefällt und die Aufhellung im Vergleich zu einer ohne Bleichung gewonnenen Protease bestimmt Hierzu wurden mit Hilfe eines Filterfarbmeßgerätes (RFC3Zeiss) die Remissionskurven bestimmt, aus denen sich die in der Farbmetrik gebräuchlichen Helligkeitswerte Y errechnen ließen. Es wurde folgende Ergebnisse erhalten:

Protease ungebleicht: Y = 26,3
Protease gebleicht: Y = 49,5, entsprechend etwa
88% Aufhellung

Bezogen auf Protease betrug der Bleichmittelberbrauch im vorstehenden Fall 18,75 g oxymethansulfinsaures Natrium/kg Protease, entsprechend einem Bleichmittelverbrauch von 1,87%.

2. Zur Überprüfung des Aktivitätsverlustes durch den Bleichvorgang wurde eine Aufschlämmung von 6 g ungebleichter Protease in 20 ml Wasser mit 3 bzw. 5% Na-SaIz der Oxymethansulfinsäure, bezogen auf Protease versetzt. Die Aktivitäten würden zu Beginn des Versuches sowie nach 30,60 und 150 Minuten bestimmt. Die Temperatur betrug 200° C. Die Aktivitätswerte sind in Protease-Einheiten/g (PE/g) angegeben.

Tabelle 1

0 Min.

Min.

60 Min.

150 Min.

Protease nicht gebleicht 600 000

Protease + 3% Oxymethansulfin- 590 000

säure

(Na-SaIz)

Protease + 5% Oxymethansulfin- 595 000

säure

(Na-SaIz)

000
000

591000

576 000
586 000

579 000

589 000 PE/g
578 000 PE/g

576 000 PE/g

Die Ergebnisse zeigen, daß durch den Bleichvorgang kein nennenswerter Verlust an Protease-Aktivität eintritt

3. Zur Bestimmung der Stabilität wurde eine entsprechend Beispiel 2 mit Na-SaIz der Oxymethansulfinsäure gebleichte Protease mit einer ungebleichten Protease verglichen. Dazu wurden 1,5 mg Enzymkonzentrat in 100 ml einer 2%igen Lösung von Natrium-Polyphosphat bei 20° C und pH 8,5 gelöst Die Aktivitäten wurden zu Beginn des Versuches und nach 24 Stunden bestimmt Sie sind wiederum in Protease-Einheiten/g (PE/g) angegeben.

Tabelle 2

O Stunden 24 Stunden

Protease nicht gebleicht 590 000

Protease + 5% Oxa- 584 000

methansulfinsäure (100%) (Na-SaIz)

396 000 PE/g (67,1%) 497 000 PE/g (85,8%)

Die Meßwerte zeigen eindeutig, daß die gebleichte Protease eine höhere Stabilität aufweist, als die ungebleichte Protease.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung hellfarbiger Proteasen durch Fermentation in Nährlösungen mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man de· Fennentationslösung nach Beendigung des Fermentationsprozesses 0,1—5 Prozent Salze der Oxymethansulfinsäure zusetzt und 30 Minuten bis 24 Stunden einwirken läßt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkali- oder Ammoniumsalze der Oxymethansulfinsäure verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch den Zusatz von 03— 1 Prozent an Oxymethansulfinsäure-Salzen zur Fermentationslösung.

4. Verfahren nach Anspruch 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkungszeit der Oxymethansulfinsäure-Salze 2—4 Stunden beträgt

5. Verfahren nach Anspruch 1 —4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationslösung vor dem Zusatz der Oxymethansulfinsäure-Salze mit einem inerten Gas zur Entfernung des Sauerstoffs durchbläst

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Bacillus licheniformis OR 48, hinterlegt am Laboratorium voor Microbiologie, Delft, einsetzt.

7. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen Proteasen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungspulvern.