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Verfahren zur Reinigung von aus Mikroorganismen erzeugten Enzymen
Die Lösungen und Fällungen von Enzymen, die durch Gärung von an Kohlehydraten, Proteinen
und organischen Salzen reicher Zuchtmaische unter Einwirkung von Mikroorganismen,
wie z. B. von Bakterien der Gruppe subtilis oder mesentericus, oder von Pilzen,
wie z. B. Amylomyces, Aspergillus usw., erhalten werden, haben den Nachteil, daß
sie oft durch Mikroorganismen verunreinigt sind, daß sie einen wenig angenehmen
Geruch haben und daß sie aus einem Gemisch verschiedener Enzyme bestehen.
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Aus diesen Gründen war bisher die Verwendung dieser Enzyme zu verschiedenen
Industriezwecken praktisch unmöglich.
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Es wurde nun gefunden, daß man Lösungen oder Fällungen von Enzymen
dadurch reinigen, d. h. geruchlos machen und entfärben kann, daß man sie mit solchen
Lösungsmitteln behandelt, die Fettsäuren und Salze der Fettsauren zu lösen vermögen,
wie z. B. reinem Aceton oder reinem Alkohol, wenn es sich um Fällungen handelt,
oder, falls Lösungen zu reinigen sind, mit irgendeinem Gemisch von Lösungsmitteln,
wie z. B. trockenem Chloroform und Äther.
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Nachdem durch diese Behandlung die Fettsäuren entfernt sind, genügt
es, wenn man das erhal tene Pulver der Einwirkung eines trockenen Luftstromes oder
eines inerten Gases oder auch dem Vakuum aussetzt, um geruchlose und geschmacklose
Enzyme zu bekommen.
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Die Entfettung hat dabei noch den Vorteil, daß das Ranzigwerden der
enzymatischen Produkte verhindert und dadurch ihre Haltbarkeit in hohem Grade gefördert
wird.
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Um die Mikroorganismen aus den Enzymlösungen abzuscheiden, genügt
eine Filtration durch dichten Stoff oder Papier mit Kieselgur nicht. Man muß Osmose-Apparate
anwenden, die durch irgendein Mittel, wie z. B. Dampf oder ein Antiseptikum, sterilisiert
sind und bei denen man steriles Wasser auf der einen Seite der Membran auf die Enzymlösung,
die sich auf der anderen Seite befindet, einwirken läßt. Man kann auch die Ultrafiltration
oder die Dialyse in Gegenwart von sterilem Wasser vornehmen oder, was noch besser
ist, die seit langem bekannte Filtriermethode mit Chamberland- oder Berkefeld-Filter
verwenden.
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Die praktische Durchführung der Filtration mit rohen und sogar mit
entfetteten Enzymlösungen wird aber dadurch erheblich erschwert, daß sich die Filteroberfläche
der Kerzenfilter mit gummiartigen, eiweißhaltigen Substanzen überzieht, wodurch
das En-' zym auf der Oberfläche zurückgehalten und dadurch die Ausbeute sehr schlecht
wird.
Es wurde gefunden, daß man einen körnigen Niederschlag erhält,
der leicht filtrierbar ist und die ganze Enzymsubstanz enthält, wenn man die rohe
Enzymlösung vor der Filtration reinigt, d. h. einen Teil der darin enthaltenen Kolloide
auf chemischem oder physikalischem Wege entfernt.
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Zu diesem Zweck kann man den PH-Wert der Enzymlösung durch Zugabe
einer kleinen Menge eines sauren Salzes oder einer freien organischen oder mineralischen
Säure oder eines Alkalis oder eines Salzes mit alkalischer Reaktion auf 7,4 bis
7,5 einstellen. Es bildet sich dann bei der Abkühlung auf o° eine Trübung oder ein
Niederschlag, der eine bedeutende Menge an proteolytischen und kolloiden Substanzen
mitreißt.
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Man kann auch einen Teil der Kolloide mittels Zugabe einer geringen
Menge von Schwermetalloxyden ausfällen, wie z. B. Blei oder Eisenoxyd, oder von
Aluminiumhydroxyd oder von irgendeinem Salz dieser Metalle, wie z. B. basischem
Bleiacetat, Alaun, Aluminiumsulfat, Zinksulfat, Alkali-oder Erdalkalialuminate usw.
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Bei der Ausführung dieses Verfahrens muß' man zunächst die Menge des
Salzes bestimmen, die nötig ist, um kein Enzym mit auszufällen. Es ist zu bemerken,
daß die vorherige.Entfettung der Lösungen die Fällung der Kolloide mit viel geringeren
Mengen dieser Salze ermöglicht; denn durch die Behandlung mit Lösungsmitteln werden
die Kolloide den Salzen gegenüber empfindlicher.
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Vor dem Gebrauch der Enzymlösung ist es zweckmäßig, die Wasserstoffionenkonzentration
der Enzymlösung auf die für ihre Wirkung günstigste Höhe zurückzuführen durch Zugabe
von kleinen Mengen Alkali oder Säure oder von Puffern, wie z. B. Zitraten oder Phosphaten.
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Nach dem Filtrieren des Niederschlages kann man die ganze Menge des
Enzyms mit der S- bis iofachen Menge Alkohol oder durch einen überschuß von geeigneten
Salzen, wie z. B. Ammoniumsulfat, Kochsalz oder Magnesiumsulfat, ausfällen. Mittels
dieser zweiten Fällung, die nicht unbedingt notwendig ist, entfernt man die löslichen
Salze und einen weiteren Teil der in der Lösung gebliebenen Kolloide.
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Die vorherige Reinigung der Enzymlösung verhindert, daß sich beim
Aussahen oder Ausfällen mittels Alkohole leimige, klebrige, schwer zu trocknende
Niederschläge bilden.
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Durch das Zusammenanwenden dieser Mittel erhält man handelsfähige
enzymatische Produkte, die einen außerordentlich hohen Wirkungswert haben und alle
bekannten Handelsprodukte bei weitem übertreffen. So war es möglich, mit Hilfe von
aus Mesentericusarten gewonnenen Enzymen pulverförmige Produkte zu erhalten, die
das 75 000-bis ioo ooofache ihres' Gewichtes an Stärke in z Stunde zu verflüssigen
vermögen.
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Da die Wirkung der so erhaltenen Enzympulver sehr groß ist, kann man
sie mit einem geeigneten Stoff, wie z. B. Phosphaten oder Stärkemehl, verdünnen.
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Beispiel Eine nach dem-Verfahren der Patentschriften Sao 571 und 470
74o erzeugte Enzymlösung kühlt man auf io bis i5° ab und führt sie durch eine Zentrifuge,
in welcher sich die festen Stoffe, namentlich Mikroorganismen und klebrige Stoffe,
absetzen. Man führt sie dann in eiilen zum Abklären geeigneten Apparat. Dieser Apparat
hat einen doppelten Mantel im Hinblick auf die Abkühlung und eine luftdichte Verschlußvorrichtung;
er ist mit einem Rührwerk versehen. . Man gibt zu der Lösung 3 bis 51 Äther und
rührt, um ein wirksames Gemisch zu erhalten; dann läßt man stehen, bis sich der
Äther eben abgesetzt hat. Man trennt und wiederholt das Verfahren mit derselben
Menge Äther.
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Die in dem Apparat zurückbleibende Flüssigkeit wird dann bis auf ungefähr
o° abgekühlt, und % kg Tierkohle werden hinzugefügt. Man bringt sie dann mit Hilfe
von geeigneten Puffern auf pH 7,5 und läßt sie so lange stehen, bis die Kolloide
sich abgesetzt haben. Wenn eine völlige Abscheidung der Kolloide hierdurch noch
nicht erreicht ist, gibt man zweckmäßig nach Entfernung des Niederschlages Mineralsalze
zu, z. B. 5 bis 15 g Bleiacetat oder etwa ioo g Aluminiumhydroxyd.
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Die getrübte Lösung wird dann über ein Filter oder eine Zentrifuge
zurückgeleitet, um die Flüssigkeit klar vom Niederschlag zu trennen; man verdampft
im Vakuum bei einer Temperatur, die 40° nicht übersteigt. Wenn das Volumen auf ungefähr
io 1 reduziert ist, fügt man z 1 Alkohol und eine Menge Aluminiumsulfat hinzu, die
genügt, um eine gesättigte Lösung zu erhalten. Man läßt stehen, zentrifugiert dann
von neuem, um das Sulfat abzutrennen, das alle Enzyme mit sich zieht.
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Das Produkt kann dann im Vakuum getrocknet werden, wenn es genügend
rein ist, wenn nicht, fügt man eine Menge Alkohol hinzu, die genügt, um es zu verdünnen;
dann zentrifugiert man noch einmal. Es wurde noch weiter gefunden, daß man die proteolytischen
Fermente zu entfernen oder zu schwächen vermag, ohne damit die verflüssigende und
verzuckernde Diastase zu schädigen. Es genügt, das diastatische Produkt
während
einiger Minuten auf eine Temperatur von ungefähr 6o bis 8o° zu erwärmen.
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Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Anwendung der durch
Bakterien oder andere Mikroorganismen erzeugten Enzyme in einer Reihe von Betrieben,
in welchen sie bisher unbrauchbar geblieben `waren.
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Um solche Enzyme in der Brotbereitung zu gebrauchen, ist es zuerst
notwendig, ein geschmack- und geruchloses Präparat zu erhalten. Dies geschieht durch
die Entfettung. Selbstverständlich soll dieses Präparat auch bakterienfrei sein;
zu diesem Zweck muß es zuerst von fremden Kolloiden befreit werden. Unentbehrlich
ist es aber auch, um jede schädliche Wirkung auf den Kleber des Mehls zu vermeiden,
daß die proteolytischen Fermente entfernt werden.
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Diese Entfernung kann, wie oben gesagt, vor dem Gebrauch stattfinden.
Man kann aber auch bei der Brotbereitung aus ioo kg Mehl folgendermaßen arbeiten:
Man läßt auf i oder 2 kg Stärkemehl, das 1/2 bis :21i, gereinigtes Enzym enthält,
ein Gemisch von 81 siedendem und 21 kaltem Wasser etwa io Minuten einwirken. Die
Stärke wird dann" verflüssigt und hydrolysiert und das Ganze zum übrigen beim Kneten
notwendigen Wasser gegeben.
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Die aus der Traubenzuckerfabrikation herkommenden Schlempen sind gewöhnlich
noch ziemlich reich an Stärke. Infolgedessen ist ihr Proteingehalt verhältnismäßig
niedrig, und ihr Wert wird dadurch vermindert. IDeswegen ist es vorteilhaft, diese
Schlempen möglichst vollständig von Stärke zu befreien. Die zu diesem Zwecke zu
verwendenden Enzyme brauchen nicht entfettet und gereinigt zu werden, dürfen aber
keineswegs eine proteolytische Wirkung ausüben.
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Sie werden deshalb vor dem Gebrauch einige Minuten auf 6o bis 8o°
erhitzt. Man verdünnt dann die nassen Schlempen mit 2 bis 3 Volumen Wasser und gibt
der Mischung i bis i1/2 °/o Enzym zu (gerechnet nach dem Gehalt an Stärke) ; man
läßt das Ganze 2 bis 3 Stunden bei Temperaturen von 62 bis 68° und filtriert dann
die Masse.
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Die Erwärmung der ganzen Mischung würde die proteolytischen Fermente
nicht töten; deswegen findet das Erhitzen der Enzyme vor dem Gebrauch statt.
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Für den Gebrauch zu pharmazeutischen Zwecken müssen die Enzyme unbedingt
geroch- und geschmacklos, aseptisch und sehr lange haltbar sein. Die nachdem beschriebenen
Verfahren entfetteten und filtrierten Enzyme sind zu diesem Gebrauch vollständig
geeignet. Sollte man die Enzympräparate für solche Zwecke verwenden, welche die
Schwächung der proteolytischen Wirkung verlangen, so könnte diese Schwächung, wie
gesagt, durch kurzes Erhitzen vor dem Gebrauch erreicht werden.
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Die proteolytischen Enzyme können ebensowohl wie die amylolytischen
gereinigt werden. Dadurch wird die Anwendung solcher Enzyme als Ersatz des Labs
in der Molkerei ermöglicht. Es ist bekannt, daß alle proteolytischen Enzyme auch
eine gerinnende Wirkung auf die Milch ausüben. Für diesen G°-brauch können aber
nur geschmacklose und aseptische Enzyme verwendet werden. Von einem gemäß vorliegendem
Verfahren gereinigten proteolytischen Enzym genügen 3 bis io g, um ioo l Milch zum
Gerinnen zu bringen. Die Enzymlösung wird hierbei in der gleichen Weise angewendet,
wie dies beim Lab üblich ist.
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Die Fällung der fremden Kolloide wird außerdem noch in jedem Falle,
wo es zweckmäßig ist, ein trockenes Präparat zu gebrauchen, Anwendung finden.