DE60313518T2 - Verfahren zur Herstellung eines Amylaseinhibitors

Info

Description

Claims

DE60313518T2

Publication number: DE60313518T2
Application number: DE60313518T
Authority: DE
Inventors: Ryuji Shiso-gun Murayama; Takeo Shiso-gun Kanafuji; Yasuhito Shiso-gun Muranaka; Rumiko Shiso-gun Muranaka; Kazuo Ueda-shi Sato; Akira Ueda-shi Sekigawa; Kazuhiko Iruma-gun Yamada; Yoshio Iruma-gun Suzuki; Hiroyuki Iruma-gun Ikemoto
Original assignee: Nagata Sangyo Co Ltd; Nisshin Pharma Inc
Current assignee: Nagata Sangyo Co Ltd; Nisshin Pharma Inc
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2003-01-27
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2023-01-28
Also published as: AU2003200219B2; CA2417316A1; AU2003200219A1; US6858234B2; CA2417316C; US20030186409A1; EP1331008B1; ATE361088T1; EP1331008A1; DE60313518D1

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors aus Weizenmehl oder Weizengluten, das einfach, aber ertragreich ist, so dass hohe Ausbeuten erzielt werden.
Die Anzahl von an Stoffwechselerkrankungen wie beispielsweise Diabetes erkrankten Patienten steigt aufgrund der modernen reichhaltigen und verschiedenartigen Ernährung rapide an. Die Aufnahme überschüssiger Nährstoffe führt zu einer übermäßigen Ausschüttung an Insulin, so dass indirekt ein Stoffwechsel-Ungleichgewicht entsteht; das wiederum führt zu Glukose-Unverträglichkeit (Hyperglykämie), Diabetes, Hyperlipidämie, Arteriosklerose etc. Insbesondere Diabetes-Patienten leiden an einer unzureichenden Insulinwirkung und Glukose-Unverträglichkeit, so dass ihr Blutzuckerspiegel nach den Mahlzeiten drastisch ansteigt, wodurch Schwierigkeiten wie beispielsweise Schädigungen der Blutkapillaren und Arteriosklerose heraufbeschworen werden.
Man erachtet es für die Vorbeugung und Behandlung solcher Krankheiten als wirkungsvoll, Medikamente oder Nahrungsmittel ein- bzw. aufzunehmen, die den Anstieg des Blutzuckerspiegels nach Aufnahme der lebenswichtigen Nährstoffe unterdrücken oder die die übermäßige Ausschüttung von Insulin hemmen. Deshalb wird eine Substanz, die die Hydrolyse der aufgenommenen Stärke in Glukose regulieren bzw. hemmen kann, und eine Substanz, die die Insulinausschüttung regulieren kann, benötigt.
Unter den oben ausgeführten Gesichtspunkten wurden verschiedene Untersuchungen an Amylase-Inhibitoren durchgeführt, die verhindern, dass eine Amylase Stärke zu Glukose hydrolysiert. Seitdem bekannt ist, dass Weizen einen solchen Amylase-Inhibitor enthält, beschäftigen sich Forschung und Entwicklung mit dem aus Weizen stammenden Amylase-Inhibitor.
Der aus Weizen stammende Amylase-Inhibitor enthält 0.19 Al (Al: Amylase-Inhibitor), ein aus zwei, jeweils aus 124 Aminosäureresten bestehenden Untereinheiten aufgebautes Protein mit einem Molekulargewicht von 13337, das in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande bei einer Mobilität von 0,19 zeigt (Swiss Port: ID = IAA1_WHEAT); 0.28 Al, ein aus zwei, jeweils aus 123 Aminosäureresten bestehenden Untereinheiten aufgebautes Protein mit einem Molekulargewicht von 13326, das in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande bei einer Mobilität von 0,28 zeigt ( US-Patent Nr. 5,444,046 , Swiss Port: ID = IAA2_WHEAT); und ein aus zwei, jeweils aus 124 Aminosäureresten bestehenden Untereinheiten aufgebautes Protein mit einem Molekulargewicht von 13185, das in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande bei einer Mobilität von 0,53 zeigt ( US-Patent Nr. 5,726,291 , Swiss Port: ID = IAA5_WHEAT). Es ist bekannt, dass diese Amylase-Inhibitoren wirksam den Anstieg des Blutzuckerspiegels hemmen und die Insulin-Ausschüttung regulieren. Die Mobilität bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese basiert auf der Mobilität von 1 von Bromphenolblau bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5 %, pH-Wert 9,5), wie in J. Sci. Food Agric., 20, S. 260-261 (1969) beschrieben.
JP-A-46(1971)/1833 und JP-A-61(1986)/171431 offenbaren, dass die mit Wasser, einer Säure oder einem wässrigen Alkohol aus Weizen extrahierten Amylase-Inhibitoren zur Behandlung von Diabetes und Fettleibigkeit eingesetzt werden können. Dennoch sind diese herkömmlichen, aus Weizen stammenden Amylase-Inhibitoren nicht so wirksam wie erwartet, wenn sie Menschen oral verabreicht werden; sie können nur eingeschränkt die Verdauung (Hydrolyse) von heiß gegarter Stärke, wie beispielsweise von gekochtem Reis, zu Glukose hemmen; und sie sind teuer.
Im U.S. Patent Nr. 5,332,803 wird ein Verfahren zur Herstellung von Amylase-Inhibitor beschrieben, das die folgenden Schritte umfasst: Extrahieren von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigen Alkohol, wobei man eine Extrakt-Lösung gewinnt (die Lösung kann ansonsten ein beim Gewinnungsprozess von Stärke aus Weizenmehl etc. anfallendes Stärke-Abwasser sein); Zugabe eines Polysaccharids, wie beispielsweise Natriumalginat, zur Extraktlösung, wobei sich ein unlöslicher Komplex bildet; Gewinnung des Komplexes aus der Lösung und Lösen oder Dispergieren in einem Lösungsmittel; Dissoziieren des Polysaccharids aus dem Komplex und Abtrennen davon aus der Lösung; Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Kationenaustauscherharz; sowie Gewinnung des Amylase-Inhibitors aus der über das Kationenaustauscherharz geleiteten Fraktionen. Der durch den oben beschriebenen Prozess gewonnene Amylase-Inhibitor zeigt eine sehr starke hemmende Wirkung gegenüber Amylase, jedoch kaum gegenüber Trypsin. Der Amylase-Inhibitor hat auch eine starke hemmende Wirkung gegenüber der im Pankreassaft enthaltenen Amylase, so dass er für das Regulieren der Insulinausschüttung sehr wirkungsvoll ist.
Das Verfahren gemäß JP-A-7(1995)/48268 ermöglicht die Behandlung einer Vielzahl von Materialien mit guter Durchführbarkeit bei gleichzeitiger Reduzierung von Abfällen, so dass eine Massenproduktion des angestrebten Amylase-Inhibitors möglich ist. Das Verfahren, das ebenfalls die oben beschriebene, Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung (gemäß US-Patent Nr. 5,332,803 ) verwendet, die durch Abtrennen des aus dem unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und dem Polysaccharid dissoziierten Polysaccharids aus der Flüssigkeit erhalten wird, umfasst die folgenden Schritte: Fällung von 40 bis 70 % des in der Lösung enthaltenen Proteins; Lösen des ausgefallenen Proteins in Wasser, wobei man eine weitere, den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung erhält; Zugabe von Kalzium- und Phosphor-Ionen zu der neu erhaltenen Lösung, wobei ein den Amylase-Inhibitor enthaltender Komplex insolubilisiert wird, und dessen Isolierung aus der Lösung; sowie Aufschluss des Amylase-Inhibitors aus dem insolubilisierten Komplex in Wasser, wobei man eine den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung erhält. Das gewonnene Endprodukt enthält den Amylase-Inhibitor in hoher Konzentration und hat eine stärkere Amylase-hemmende Wirkung.
Gemäß den im US-Patent Nr. 5,332,803 und JP-A-7(1995)/48268 offenbarten Verfahren enthalten die erhältlichen Amylase-Inhibitoren 0.19 Al in hohen Konzentrationen, der eine sehr starke hemmende Wirkung gegenüber der Amylase, aber kaum gegenüber Trypsin hat. Die durch diese Verfahren erhaltenen Amylase-Inhibitoren hemmen sehr wirksam die im Pankreassaft enthaltene Amylase und regulieren deshalb wirkungsvoll die Insulinausschüttung. Entsprechend können diese Amylase-Inhibitoren wirksam die Hydrolyse von heiß gegarter Stärke, wie beispielsweise von gekochtem Reis, zu Glukose unterdrücken.
Das Verfahren gemäß US-Patent Nr. 5,332,803 ist jedoch mit dem Einsatz von Kationenaustauscherharz verbunden, wodurch ein Waschen des Kationenaustauscherharzes nach der Herstellung des Amylase-Inhibitors erforderlich ist, damit es wiederverwendet werden kann. Das Verfahren gemäß JP-A-7(1995)/48268 umfasst so viele Schritte, dass es zu kompliziert ist. Daher soll ein einfacheres und effizienteres Verfahren eingeführt werden, das die schnelle Herstellung des Amylase-Inhibitors mit einer guten Produktivität ermöglicht.
Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Amylase-Inhibitor bereitzustellen, wobei das Verfahren einfach und produktiv ist, so dass der, Amylase-Inhibitor, der den die Amylase sehr wirksam hemmenden 0.19 Al in hohen Konzentrationen enthält, schnell und in hohen Ausbeuten erhalten werden kann.
Das Verfahren zur Herstellung von Amylase-Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst:

(A) einen Schritt, bei dem man eine den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung gewinnt, indem man
(A1) Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigen Alkohol extrahiert, oder
(A2) Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigen Alkohol extrahiert; die erhaltene Lösung zur Denaturierung der Kontaminanten säurebehandelt und/oder wärmebehandelt; und die denaturierten Kontaminanten aus der Lösung entfernt, und
(A3) den pH-Wert einer in (A1) oder (A2) gewonnenen, den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Lösung mit einem Polysaccharid versetzt, um in der Lösung ein Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden, und dann den pH-Wert auf 3,0 bis 4,0 einstellt, um einen unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden; den unlöslichen Komplex von der Lösung abtrennt; und das Polysaccharid vom unlöslichen Komplex dissoziiert und das Polysaccharid in einer ungelösten Form aus der Lösung entfernt, um den Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung zu gewinnen;
(B) einen Schritt, bei dem man den Amylase-Inhibitor durch Aussalzen insolubilisiert, indem man ein Salz oder Salze zu der in Schritt (A) erhaltenen Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung zugibt, wobei das Aussalzen in der Extraktlösung erfolgt, die auf einen pH-Wert von 3 bis 4 eingestellt ist, und die durch das Aussalzen erhaltene insolubilisierte Substanz gewinnt; und
(C) einen Schritt, bei dem man die im Schritt (B) gewonnene insolubilisierte Substanz direkt trocknet oder die insolubilisierte Substanz zur Herstellung einer wässrigen Lösung in Wasser auflöst und die wässrige Lösung entsalzt und trocknet, um den Amylase-Inhibitor zu gewinnen.

Im oben beschriebenen Verfahren ist das Salz in Schritt (B) bevorzugt Natriumchlorid. Bevorzugt wird das Aussalzen in Gegenwart von Kalzium-Ionen in der Extraktlösung durchgeführt.
Im oben beschriebenen Verfahren beinhaltet bevorzugt wenigstens einer der Schritte (B) oder (C) die Zugabe von Ascorbinsäure und/oder von Cystein.
Bei der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung, die zum Aussalzen in Schritt (B) eingesetzt wird, handelt es sich um ein Konzentrat der in Schritt (A) erhaltenen Lösung. Das Konzentrat hat vorzugsweise eine Protein-Konzentration von 1 bis 100 mg/cm³.
Das Verfahren zum Einengen der den erfindungsgemäßen Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung umfasst die folgenden Schritte:

(I) Einstellen des pH-Wertes einer den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung im Bereich von 4,5 bis 5,5, Zugabe eines Polysaccharid zu der Lösung, wobei sich ein Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids in der Lösung bildet, und anschließendes Einstellen des pH-Wertes im Bereich von 3,0 bis 4,0, wobei sich ein unlöslicher Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids bildet; sowie
(II) Abtrennen des unlöslichen Komplexes von der Lösung, Dissoziieren des Polysaccharids von dem unlöslichen Komplex, und Entfernen des Polysaccharids in einer insolubilisierten Form aus der Lösung, wobei man den Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung gewinnt.

Im oben beschriebenen Konzentrations-Verfahren wird das Polysaccharid bevorzugt vom unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids unter dem Einfluss von Glucanase dissoziiert; und das dissoziierte Polysaccharid wird bevorzugt in einer insolubilisierten Form durch Filtration entfernt. Die Filtration erfolgt vorzugsweise unter Zugabe einer Filtrationshilfe. Die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung wird bevorzugt während oder nach der Dissoziation des Polysaccharids auf 50°C oder mehr erwärmt.
Die vorliegende Patentanmeldung beansprucht die Priorität basierend auf den japanischen Patentanmeldungen Nr. 2002-16573 und Nr. 2002-16574 , auf die hiermit Bezug genommen wird.
Das Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßem Amylase-Inhibitor wird nachfolgend beschrieben.
Schritt (A)
In Schritt (A) wird die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung aus Weizenmehl oder Weizengluten hergestellt. Die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung wird durch einen der Schritte (A1) oder (A2) und Schritt (A3) erhalten:

(A1) den Schritt, bei dem Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigem Alkohol extrahiert wird;
(A2) den Schritt, bei dem Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigem Alkohol extrahiert wird; die gewonnene Lösung zur Denaturierung der Kontaminanten säurebehandelt und/oder wärmebehandelt wird; und die denaturierten Kontaminanten aus der Lösung entfernt werden;
(A3) den Schritt, bei dem man den pH-Wert einer in (A1) oder (A2) gewonnenen, den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung in einem Bereich von 4,5 bis 5,5 einstellt, die Lösung mit einem Polysaccharid versetzt, um in der Lösung ein Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden, und dann den pH in einem Bereich von 3,0 bis 4,0 einstellt, um einen unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden; den unlöslichen Komplex von der Lösung abtrennt; und das Polysaccharid vom unlöslichen Komplex dissoziiert und das Polysaccharid in einer ungelösten Form aus der Lösung entfernt, um den Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung zu gewinnen.

Die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) kann mittels eines unter Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung und einem wässrigen Alkohol ausgewählten Mittels durchgeführt werden.
Wird die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) mittels Wasser durchgeführt, unterliegen die Extraktionsbedingungen keinen besonderen Beschränkungen und die Extraktlösung kann aus Weizenmehl oder Weizengluten durch ein beliebiges geeignetes Verfahren erhalten werden.
Stärke oder Gluten werden beispielsweise in der Regel aus Weizenmehl folgendermaßen erhalten: Weizenmehl und Wasser werden zusammen zu einem Teig oder Backteig geknetet, den man dann reifen lässt, wobei das Gluten vollständig hydratisiert. Der Teig wird wiederholt mit Wasser gespült, wobei man Gluten und Stärkemilch (Gluten-Waschwasser) erhält; und die Stärkemilch wird einer Auftrennung wie beispielsweise einer mechanischen Trennung unterzogen, wodurch man die Stärke gewinnt. Die wie oben beschrieben verworfene Lösung enthält den Amylase-Inhibitor so, dass sie als Extraktlösung in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Das ist ausgesprochen vorteilhaft, da es sich bei der als Extraktlösung einsetzbaren Flüssigkeit um eine Abfallflüssigkeit handelt, die bei der Herstellung von Stärke und Gluten nach dem Martin- oder Batter-Verfahren anfällt.
Wird die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) mittels einer sauren wässrigen Lösung durchgeführt, so wird die saure wässrige Lösung wünschenswerter Weise durch die Zugabe von Wasser zu einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure etc. oder einer organischen Säure wie beispielsweise Essigsäure etc. zubereitet, so dass die resultierende saure wässrige Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 eingestellt ist.
Wird die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) mittels einer alkalischen wässrigen Lösung durchgeführt, so wird die alkalische wässrige Lösung wünschenswerter Weise durch die Zugabe von Ammoniak oder Natriumhydroxid oder dergleichen zu Wasser zubereitet, so dass die resultierende alkalische wässrige Lösung auf einen pH-Wert von etwa 8 bis 10 eingestellt ist.
Wird die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) mittels einem wässrigen Alkohol durchgeführt, so ist es ideal, eine alkoholische wässrige Lösung mit einer Alkohol-Konzentration von etwa 1 bis 50 % einzusetzen. Beispiele der hierbei verwendeten Alkohole umfassen Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol.
Die Extraktion in Schritt (A1) oder (A2) wird üblicherweise unter Rühren bei Temperaturen von etwa 10 bis 40°C, zum Beispiel bei Umgebungstemperatur, durchgeführt.
In Schritt (A1) werden die festen Bestandteile in der Flüssigkeit durch eine geeignete Maßnahme wie beispielsweise Trennschleudern, Filtrieren oder Stehenlassen entfernt, wodurch man die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung erhält.
In Schritt (A2) wird die Extraktlösung säurebehandelt und/oder wärmebehandelt, um die kontaminierenden Proteine zu denaturieren; und diese Proteine werden aus der Lösung entfernt, so dass man die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung erhalten kann. Die Säurebehandlung wird bevorzugt ausgeführt, indem mein die den Amylase- Inhibitor enthaltende Extraktlösung bei einem pH-Wert von 2 bis 4 stehen lässt; und die Wärmebehandlung wird bevorzugt ausgeführt, indem man die Lösung auf Temperaturen von 70 bis 90°C, besonders bevorzugt von 85 bis 90°C erwärmt. Durch diese Behandlungen können die kontaminierenden Proteine, die in der Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung vorhanden sind, denaturiert werden, damit sie in Wasser unlöslich werden, so dass die Wasser-insolubilisierten, kontaminierenden Proteine aus der Lösung durch eine geeignete Maßnahme wie beispielsweise Trennschleudern, Filtrieren oder Stehenlassen entfernt werden können. Die so erhaltene, den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung wird anschließend Schritt (A3) unterzogen.
In Schritt (A3) wird ein Polysaccharid, das in der Lage ist, zusammen mit dem Amylase-Inhibitor einen unlöslichen Komplex zu bilden, zu der Amylase-Inhibitor enthaltenden, in Schritt (A1) oder (A2) erhaltenen Extraktlösung zugegeben, wobei sich solch ein unlöslicher Komplex bildet. Der so gebildete, unlösliche Komplex wird aus der Lösung abgetrennt. In Folge wird eine Dissoziationsflüssigkeit zu dem abgetrennten, unlöslichen Komplex gegeben. Anschließend wird das Polysaccharid von dem unlöslichen Komplex dissoziiert und in einer insolubilisierten Form aus der Dissoziationsflüssigkeit entfernt. So kann der Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung erhalten werden. Die in Schritt (A3) erhaltene Extraktlösung ist konzentriert worden, so dass sie den Amylase-Inhibitor in höheren Konzentrationen enthält.
Das in Schritt (A3) einzusetzende Polysaccharid kann ein beliebiges sein, das in der Lage ist, zusammen mit dem Amylase-Inhibitor den unlöslichen Komplex zu bilden. Beispiele umfassen Polysaccharide, die in der Lage sind Kationen auszutauschen, wie beispielsweise Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, κ-Carrageenan, ν-Carrageenan und λ-Carrageenan; Pektin, Xanthan und Gellan. Unter diesen ist Natriumalginat im Hinblick auf die Ausbeute des unlöslichen Komplexes bevorzugt.
Das Polysaccharid wird üblicherweise in einer Menge von 50 bis 600 ppm zu der den Amylase-Inhibitor enthaltenden und in Schritt (A1) oder (A2) erhaltenen Extraktlösung zugegeben.
In Schritt (A3) wird das Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids durch Einstellen des pH-Wertes der Extraktlösung im Bereich von 4,5 bis 5,5, und Zugeben eines Polysaccharids zu der Lösung gebildet. Der pH-Wert der Lösung wird anschließend auf 3,0 bis 4,0 eingestellt, wobei die Bildung des unlöslichen Komplexes des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids ausgelöst wird. Der so gebildete, unlösliche Komplex ist ein solch großes Agglomerat, dass er leicht durch eine geeignete Maßnahme wie beispielsweise Filtrieren isoliert werden kann.
In Schritt (A3) kann die Bildung des unlöslichen Komplexes des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids unter Erwärmen, aber bevorzugt bei Umgebungstemperatur oder unter Kühlen stattfinden. Der gewonnene unlösliche Komplex kann durch eine geeignete Maßnahme wie beispielsweise Sedimentieren, Filtrieren, Trennschleudern etc. von der Lösung abgetrennt werden.
Das Polysaccharid wird von dem unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids in einer Dissoziationsflüssigkeit dissoziiert und anschließend in einer insolubilisierten Form aus der Flüssigkeit entfernt. So wird der Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung gewonnen.
Schritt (B)
In Schritt (B) wird der Amylase-Inhibitor durch Aussalzen insolubilisiert, indem man ein Salz oder Salze zu der in Schritt (A) erhaltenen Lösung zugibt, und die durch das Aussalzen erhaltene, insolubilisierte Substanz wird gewonnen.
Die konzentrierte Lösung wird eingesetzt, da der Amylase-Inhibitor in der Lösung eine höhere Konzentration aufweist, so dass er in hoher Ausbeute durch die Zugabe von einem Salz oder Salzen ausgesalzt werden kann, wodurch man eine höhere Ausbeute des Amylase-Inhibitor erzielt. Das Konzentrationsmaß, das in geeigneter Weise abhängig von dem Gehalt des Amylase-Inhibitors in der einzuengenden Extraktlösung eingestellt wird, wird in der Regel so gewählt, dass sich die Protein-Konzentration in der konzentrierten Lösung zwischen 1 und 100 mg/cm³ bewegt. Diese Konzentration ist im Hinblick auf die Ausbeute des Amylase-Inhibitors, die Regulierung der Kontamination der Lösung durch Verunreinigungen, die Durchführbarkeit etc. zu bevorzugen.
Enthält die Extraktlösung vom Amylase-Inhibitor verschiedene, darin als unlösliche Verunreinigungen dispergierte oder ausgefällte Proteine, werden diese Verunreinigungen vorzugsweise durch Filtrieren, Trennschleudern, Dekantieren etc. aus der Lösung entfernt, bevor die Extraktlösung dem Aussalzen in Schritt (B) unterzogen wird.
Da die konzentrierte Extraktlösung neben dem Amylase-Inhibitor häufig dispergierte Verunreinigungen wie beispielsweise Proteine enthält, erfolgt das Aussalzen idealerweise erst, nachdem diese Verunreinigungen durch Säurebehandlung oder Behandlung mit Alginsäure oder dergleichen entfernt worden sind.
Beispiele für das zum Aussalzen des Amylase-Inhibitors in Schritt (B) zu verwendende Salz umfassen Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumsulfat und Kalziumphosphat, wobei Natriumchlorid und Ammoniumsulfat bevorzugt sind. Vor allem Natriumchlorid ist besonders bevorzugt, da es den Amylase-Inhibitor zufriedenstellend aus der in Schritt (A) erhaltenen Lösung trennen und leicht im folgenden Schritt (C) entfernt werden kann. Außerdem belastet Natriumchlorid die Umwelt kaum.
Die Menge des zum Aussalzen eingesetzten Salzes kann abhängig von der Art des Salzes, der Konzentration des Amylase-Inhibitors in der Extraktlösung, davon, ob die Extraktlösung eingeengt worden ist, und dem Konzentrationsmaß eingestellt werden. Das Salz wird in der Regel in einer Menge eingesetzt, so dass sich seine Konzentration in der Lösung zwischen 1 und 20 Gew.-% bewegt, insbesondere etwa zwischen 3 und 15 Gew.-%, wobei diese Konzentration bevorzugt ist, da sie eine günstige Abtrennung des Amylase-Inhibitors zulässt und gleichzeitig andere Proteine am Aussalzen hindert.
Das Salz, wie beispielsweise Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, kann zum Aussalzen alleine oder zusammen mit einer Verbindung, die Kalzium-Ionen freisetzt (Kalziumchlorid, Kalziumbromid, Kalziumcarbonat etc.), eingesetzt werden. Das Aussalzen in Gegenwart von Kalzium-Ionen ermöglicht die Abtrennung des Amylase-Inhibitors in höheren Ausbeuten. Im Hinblick auf ein beschleunigtes Aussalzen beträgt die Konzentration der Kalzium-Ionen in der Lösung bevorzugt etwa 100 bis 10000 ppm.
Die Temperatur der Lösung während des Aussalzens in Schritt (B) liegt bevorzugt bei 50°C oder darunter, besonders bei 30°C oder darunter, da der Amylase-Inhibitor bei diesen Temperaturen problemlos ausgesalzt werden kann. Das Aussalzen bei Flüssigkeits-Temperaturen oberhalb von 50°C kann zu Denaturierung oder Desaktivierung des Amylase-Inhibitors führen.
Der pH-Wert der Lösung beim Aussalzen liegt im Hinblick auf das effiziente Aussalzen des Amylase-Inhibitors zwischen 3 und 4. Das Aussalzen bei einem pH-Wert der Flüssigkeit von weniger als 2 oder oberhalb von 8 führt zu einem geringeren Wirkungsgrad des Aussalzens, wodurch die Ausbeute des Amylase-Inhibitors verringert wird.
Die durch das Aussalzen gewonnene insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt), die den Amylase-Inhibitor enthält, wird abgetrennt und aus der Lösung gewonnen. Das Verfahren zum Abtrennen und Gewinnen des ausgesalzten Produktes unterliegt keinen besonderen Beschränkungen und es kann sich um Dekantieren, Filtrieren, Trennschleudern oder Sedimentieren handeln. Das in Schritt (B) erhaltene, ausgesalzte Produkt kann leicht von der flüssigen Phase abgetrennt werden, so dass es durch ein übliches Fest-Flüssig-Trennverfahren problemlos abgetrennt und gewonnen werden kann.
Das in Schritt (B) erhaltene, ausgesalzte Produkt wird anschließend Schritt (C) unterzogen.
Schritt (C)
Schritt (C) ist entweder (i) ein Schritt, bei dem die in Schritt (B) gewonnene, insolubilisierte Substanz direkt getrocknet wird, oder (ii) ein Schritt, bei dem die insolubilisierte Substanz zum Herstellen einer wässrigen Lösung in Wasser gelöst wird, und die Lösung zur Gewinnung des Amylase-Inhibitors entsalzt und getrocknet wird.
Im Fall von Schritt (ii) wird die den Amylase-Inhibitor enthaltende, insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt) vorzugsweise in Wasser gelöst, dessen Temperatur 10 bis 85°C, insbesondere 20 bis 40°C beträgt, da die Wassertemperatur das Auflösen des ausgesalzten Produktes in Wasser beschleunigt und keine Denaturierung des Amylase-Inhibitors bewirkt.
Das Wasser wird vorzugsweise in einer 3- bis 30-fachen Masse, bezogen auf das ausgesalzte Produkt, eingesetzt.
In Schritt (ii) kann das Salz aus der wässrigen Lösung des ausgesalzten Produktes mittels Ultrafiltration, Dialyse, Ionenaustausch etc. entfernt werden. Unter diesen ist die Ultrafiltration wegen der einfachen Wartung ihrer Geräte bevorzugt.
In Schritt (ii) kann eine Behandlung (wie beispielsweise Filtrieren) zum Entfernen von Verunreinigungen und Bakterien wahlweise vor, während oder nach dem Entfernen des Salzes aus der wässrigen Lösung des ausgesalzten Produktes durchgeführt werden. Die Verunreinigungen und Bakterien können mit Hilfe einer Mikrofiltrationsmembran, einer porösen Polymermembran, einem Keramikfilter etc. entfernt werden.
Bei der Trocknungsbehandlung in Schritt (C) zum Gewinnen des Amylase-Inhibitors kann es sich um Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, Sprühtrocknung oder Kugeltrocknung handeln. Unter diesen sind Gefriertrocknung und Vakuumtrocknung im Hinblick auf die Vermeidung der Denaturierung des Amylase-Inhibitors bevorzugt. Die den Amylase-Inhibitor enthaltende wässrige Lösung kann direkt oder nach dem Einengen getrocknet werden. Der letztere Fall ist hinsichtlich der Trocknungseffizienz und des spezifischen Schüttgewichtes des Endproduktes bevorzugt.
Wenigstens einer der Schritte (B) oder (C) umfasst vorzugsweise die Zugabe von Ascorbinsäure und/oder Cystein. Die Zugabe unterdrückt eine Verfärbung der Lösung, so dass der erhaltene Amylase-Inhibitor eine ausgezeichnete Farbe aufweisen wird, wobei er einen weißen oder ähnlichen Farbton annimmt.
Die eingesetzte Menge an Ascorbinsäure und/oder Cystein beträgt vorzugsweise 1 bis 1000 g/m³, bezogen auf die Flüssigkeitsmenge. Der Grund, warum die Ascorbinsäure und das Cystein die Färbung der Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung hemmen können, liegt vermutlich darin, dass sie die Aktivität des in der Lösung enthaltenen Enzyms, das für die Färbung der Lösung partiell verantwortlich ist, neutralisieren oder verringern können.
Durch das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung von Amylase-Inhibitor, das die Schritte (A) bis (C) umfasst, kann der Amylase-Inhibitor, der in hohen Konzentrationen den Amylase stark hemmenden 0.19 Al enthält, ziemlich leicht, schnell, in großen Mengen und mit einer guten Produktivität erhalten werden.
Als nächstes wird das Verfahren zum Konzentrieren der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung beschrieben.
Das Konzentrationsverfahren umfasst folgende Schritte:

(I) Einstellen des pH-Wertes einer den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung im Bereich von 4,5 bis 5,5, Zugabe eines Polysaccharids zu der Lösung, wobei ein Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitor und des Polysaccharids in der Lösung gebildet wird, und anschließendes Einstellen des pH-Wertes im Bereich von 3,0 bis 4,0, wobei sich ein unlöslicher Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids bildet; sowie
(II) Abtrennen des unlöslichen Komplexes aus der Lösung und Dissoziieren des Polysaccharids vom unlöslichen Komplex und Entfernen des Polysaccharids in einer insolubilisierten Form aus der Flüssigkeit, wobei der Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung gewonnen wird.

Schritt (I)
Die im Konzentrationsverfahren einzusetzende, den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung erhält man entweder durch Schritt (A1) oder durch Schritt (A2) des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Amylase-Inhibitor.
In Schritt (I) kann ein beliebiges Polysaccharid eingesetzt werden, das zusammen mit dem Amylase-Inhibitor den unlöslichen Komplex bilden kann. Beispiele umfassen Polysaccharide, die in der Lage sind Kationen auszutauschen, wie beispielsweise Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, κ-Carrageenan, ν-Carrageenan und λ-Carrageenan; Pektin, Xanthan und Gellan und dergleichen. Im Hinblick auf die Ausbeute des unlöslichen Komplexes ist Natriumalginat bevorzugt.
Das Polysaccharid wird üblicherweise in einer Menge von 50 bis 600 ppm zu der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung gegeben.
In Schritt (I) wird die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung zuerst auf den pH-Wert 4,5 bis 5,5 eingestellt, dann wird das Polysaccharid zu der Lösung gegeben, wobei sich das Assoziationsprodukt bildet, und der pH-Wert des Lösungsgemisches wird im Bereich von 3,0 bis 4,0 eingestellt.
Durch das vorangehende Einstellen des pH-Wertes der Extraktlösung im Bereich von 4,5 bis 5,5 kann das Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids mit einem hohen Wirkungsgrad gebildet werden, sobald das Polysaccharid zu der Lösung gegeben wird. Durch das anschließende Einstellen des pH-Wertes im Bereich von 3,0 bis 4,0 bildet der unlösliche Komplex ein solch großes Agglomerat, dass er durch Sedimentieren oder Trennschleudern leicht aus der Lösung gewonnen werden kann. Demzufolge kann der Amylase-Inhibitor in hohen Ausbeuten aus der Extraktlösung gewonnen werden. Die prozentuale Ausbeute des Amylase-Inhibitors aus der Extraktlösung liegt in der Regel nicht unter 80 Gew.-%.
Wird das Polysaccharid zu der Extraktlösung, deren pH-Wert unter 4,5 oder über 5,5 liegt, gegeben, kann die Assoziation des Amylase-Inhibitor und des Polysaccharids nicht vollständig erfolgen, so dass die Ausbeute des Amylase-Inhibitors geringer wird.
Der pH-Wert der Extraktlösung kann unter Verwendung einer Säure, wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure, oder einer Base, wie beispielsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, die entsprechend, abhängig vom pH-Wert der Extraktlösung gewählt werden kann, eingestellt werden.
In Schritt (I) kann sich der unlösliche Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids unter Erwärmung, aber bevorzugt bei Umgebungstemperatur oder unter Kühlen im Bereich von 1 bis 30°C bilden.
Der unlösliche Komplex bildet sich in der Regel folgendermaßen bei Temperaturen von etwa 1 bis 30°C: Zu der vorher auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,5 eingestellten Extraktlösung wird das Polysaccharid gegeben, das Lösungsgemisch wird kontinuierlich mehrere zehn Minuten bis einige Stunden gerührt, der pH-Wert wird dann auf 3,0 bis 4,0 eingestellt und das Lösungsgemisch wird kontinuierlich mehrere zehn Minuten bis einige Stunden gerührt. Der so gebildete unlösliche Komplex ist ein solch großes Agglomerat, dass er in Schritt (II) leicht durch geeignete Maßnahmen wie beispielsweise Sedimentieren, Filtrieren, Trennschleudern etc. aus der Lösung gewonnen werden kann. Gemäß Schritt (I) bildet der unlösliche Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids ein großes Agglomerat, das eine einfache Abtrennung erlaubt.
Schritt (II)
In diesem Schritt wird der in Schritt (I) erhaltene, unlösliche Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids von der Lösung abgetrennt, zu dem abgetrennten unlöslichen Komplex wird eine Dissoziationsflüssigkeit zugegeben, und das Polysaccharid wird in einer insolubilisierten Form (insolubilisiertes Polysaccharid) aus der Flüssigkeit entfernt, wobei man den Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung erhält.
In Schritt (II) kann der unlösliche Komplex durch geeignete Maßnahmen wie beispielsweise Sedimentieren, Filtrieren, Trennschleudern etc. gewonnen werden.
In Schritt (II) wird das Abtrennen des Polysaccharids aus dem unlöslichen Komplex in einer Dissoziationsflüssigkeit durchgeführt, indem man eine Dissoziationsflüssigkeit zu dem gewonnenen unlöslichen Komplex zugibt. Der Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid, die den unlöslichen Komplex gebildet haben, werden in der Dissoziationsflüssigkeit voneinander dissoziiert und werden in der Dissoziationsflüssigkeit gelöst oder aufgequollen. Bei der hierzu verwendeten Dissoziationsflüssigkeit kann es sich um Wasser, eine schwach alkalische wässrige Lösung, die Ammoniak, Ammoniumhydrogencarbonat etc. enthält, oder eine wässrige Salz-Lösung, die weder Kalzium noch Kalium enthält, handeln.
Obwohl die Dissoziation des unlöslichen Komplexes in den Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid bei Umgebungstemperatur stattfinden kann, wird die Dissoziationsflüssigkeit bevorzugt auf 30°C oder darüber erhitzt, um die Dissoziation zu beschleunigen.
Insbesondere die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung wird bevorzugt auf 50°C oder darüber, stärker bevorzugt 60°C oder darüber, insbesondere 80°C oder darüber wenigstens einmal während oder nach der Dissoziation des unlöslichen Komplexes erwärmt, da die gewonnene Flüssigkeit dann farblos oder von ähnlicher Farbe (hellgelb) anstelle des üblichen braun wird, so dass das Endprodukt des Amylase-Inhibitors in Form eines trockenen Pulvers einen weißen oder ähnlichen Farbton annimmt.
Werden Metallionen, wie beispielsweise von Kalzium oder Magnesium, zu der Lösung gegeben, in der der Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid voneinander dissoziiert werden, so wird das Polysaccharid insolubilisiert, wobei es ein festes Gel bildet, wohingegen der Amylase-Inhibitor in der Flüssigkeit gelöst bleibt. Die gewonnene Lösung wird anschließend einem geeigneten Trennverfahren unterzogen, wobei das Gel aus insolubilisiertem Polysaccharid entfernt wird. So kann die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung gewonnen werden.
Natriumalginat, κ-Carrageenan, ν-Carrageenan und λ-Carrageenan werden leicht insolubilisiert, wobei sie bei Zugabe von Metallionen wie beispielsweise von Kalzium oder Magnesium, ein festes Gel bilden. Wird zum Beispiel Kalziumchlorid zu der dissoziiertes Natriumalginat enthaltenden Lösung gegeben, so bildet sich leicht das Kalziumalginat-Gel.
Das insolubilisierte Polysaccharid kann mittels Filtrieren, Trennschleudern oder anderen Trennverfahren abgetrennt oder entfernt werden, wobei das Filtrieren in Bezug auf Ausbeute und Reinheit des Amylase-Inhibitor bevorzugt ist.
Wird das insolubilisierte Polysaccharid, das durch die Dissoziation des unlöslichen Komplexes gewonnen wird, durch Filtrieren entfernt, wird das Filtrieren durch Verstopfen aufgrund der schlechten Filtrierbarkeit des insolubilisierten Polysaccharids beeinträchtigt, so dass dieses Verfahren viel Zeit benötigt.
Deshalb kann das feste Polysaccharid (insolubilisierte Polysaccharid) unter Einwirkung von Glucanase, die zu der Lösung gegeben wird, wenn der unlösliche Komplex in den Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid dissoziiert und/oder wenn das dissoziierte Polysaccharid insolubilisiert (geliert) wird, entfernt werden. Die Zugabe von Glucanase verbessert die Filtrierbarkeit des insolubilisierten Polysaccharids, so dass das insolubilisierte Polysaccharid durch Filtrieren effizient entfernt werden kann.
Der Begriff Glucanase steht für alle Enzyme, die in der Lage sind Glukose-Polysaccharid (Glucan) zu Oligosaccharid oder Glukose zu hydrolisieren. Bei der erfindungsgemäß verwendeten Glucanase kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, zum Beispiel Cellulosin (von HANKYU KYOEI BUSSAN erhältlich).
Die Glucanase kann vor der Dissoziation des Polysaccharids aus dem unlöslichen Komplex, während der Dissoziation des unlöslichen Komplexes in den Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid oder während der Insolubilisierung (Gelatinierung) des dissoziierten Polysaccharids zu der Lösung gegeben werden. Die Glucanase wird im Hinblick auf die verbesserte Filtrierbarkeit des gewonnnen Polysaccharid-Gels (insolubilisiertes Polysaccharid) bevorzugt während der Dissoziation des unlöslichen Komplexes zugegeben.
Die Glucanase wird bevorzugt in einer Menge von wenigstens 0,1 mg, stärker bevorzugt von 1 bis 100 mg bezogen auf 1 Liter der Lösung oder Suspension, die entweder den unlöslichen Komplex oder den dissoziierten Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid enthält.
Die Filtrierbarkeit des insolubilisierten Polysaccharids kann durch die Zugabe einer Filtrationshilfe zusammen mit der Glucanase zusätzlich verbessert werden, so dass das aus dem unlöslichen Komplex dissoziierte, insolubilisierte Polysaccharid durch Filtrieren sogar noch problemloser entfernt werden kann. Beispiele der Filtrationshilfe umfassen die von der Firma Showa Chemical Industry Co., Ltd. hergestellte Radiolite-Reihe, die von der Firma Celite Corporation hergestellte Celite-Reihe, Talkum und dergleichen, die entweder jede für sich oder in Kombination verwendet werden können.
Die Filtrationshilfe wird bevorzugt in einer Menge von 1:40 oder mehr, stärker bevorzugt in einer Menge von 1:30 oder mehr, bezogen auf die Masse der abzufiltrierenden, festen Bestandteile (hauptsächlich des insolubilisierten Polysaccharids) eingesetzt.
Die Filtrationshilfe kann der Lösung vor der Dissoziation des Polysaccharids vom unlöslichen Komplex, während der Dissoziation des unlöslichen Komplexes in den Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid oder während der Insolubilisierung (Gelierung) des dissoziierten Polysaccharids zugesetzt werden. Die Filtrationshilfe wird bevorzugt während der Dissoziation des unlöslichen Komplexes zugegeben, da es die Filtrierbarkeit des insolubilisierten Polysaccharids weiter verbessert.
Das insolubilisierte Polysaccharid kann mit Hilfe einer Trennvorrichtung wie beispielsweise einer Einrichtung zur Druckfiltration oder einer Trennschleuder abgetrennt werden, wobei die Einrichtung zur Druckfiltration hinsichtlich der Mikrofiltration bevorzugt ist. Die Bauform der Einrichtung zur Druckfiltration unterliegt dabei keiner besonderen Beschränkung und kann eine herkömmliche Einrichtung zur Druckfiltration sein, wie beispielsweise eine automatische Filterpresse von YABUTA oder eine automatische Filterpresse von YAEGAKI.
Die in Schritt (II) gewonnene, Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung kann gegebenenfalls einer Sterilisation, einer Desinfizierung, einer Behandlung mit einem Kationenaustauscherharz (um einen Trypsin-Inhibitor zu entfernen) etc. unterzogen werden. Verunreinigungen und Bakterien können mittels einer Mikrofiltrationsmembrane, einer porösen Polymermembrane, einem Keramikfilter etc. entfernt werden.
Das Konzentrat des Amylase-Inhibitors wird den Schritten (B) und (C) des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Amylase-Inhibitor unterzogen, in denen das Salz dem Konzentrat zugegeben wird, wobei der Amylase-Inhibitor insolubilisiert und abgetrennt (ausgesalzt) wird, gegebenenfalls anschließend die Lösung entsalzt wird und die Lösung getrocknet wird, um den Amylase-Inhibitor als trockenes Pulver zu erhalten.
Der nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Amylase-Inhibitor kann alleine oder zusammen mit herkömmlichen Trägerstoffen oder Zusatzstoffen in Form eines flüssigen Medikamentes, eines Granulates oder einer Tablette als Mittel gegen Hyperglykämie und/oder als Mittel zur Kontrolle der Insulinausschüttung eingesetzt werden. Der Amylase-Inhibitor kann auch als Lebensmittelzusatz, insbesondere für stärkereiche, kohlenhydrathaltige Nahrungsmittel, wie beispielsweise Brot and Kekse; Tee; Suppe; Fisch- oder Gemüseflocken; sowie Aufstriche, wie beispielsweise Butter und Konfitüre verwendet werden.
Erfindungsgemäß kann der Amylase-Inhibitor, der den gegen die Amylase hoch wirksamen 0.19 Al in hohen Konzentrationen enthält, leichter, schneller und mit einer besseren Produktivität als nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden.
Der nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Amylase-Inhibitor weist eine sehr starke hemmende Wirkung gegenüber der Amylase, aber kaum gegenüber Trypsin auf. Der Amylase-Inhibitor hat eine besonders starke hemmende Wirkung gegenüber der in Pankreassaft enthaltenen Amylase, so dass die Insulinausschüttung wirkungsvoll reguliert werden kann. Daher kann der Amylase-Inhibitor für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise Hyperglykämie, Diabetes, Hyperlipidämie, Arteriosklerose und Fettleibigkeit eingesetzt werden. Darüber hinaus ist der durch das vorliegende Verfahren erhaltene Amylase-Inhibitor frei von Nebenwirkungen, wie beispielsweise Diarrhöe und Brechreiz nach der Einnahme, und ist wegen seines milden Geschmacks oral leicht einzunehmen.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung keineswegs einschränken.
In den Beispielen wurde der Gehalt an 0.19 Al auf folgende Weise gemessen.
Messen des 0.19 Al-Gehaltes
Bezüglich der Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung und des unlöslichen Komplexes des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids wurden die aus der Verdampfung von Wasser erhaltenen Feststoffe gefriergetrocknet, bis ein Wasser-Gehalt von maximal 5 Gew.-% erreicht wurde; und das gewonnene Pulver wurde als Probe eingesetzt. Das Pulver wurde ebenfalls als Endprodukt-Probe des Amylase-Inhibitors verwendet. Diese Proben wurden einzeln in einer wässrigen Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure gelöst und anschließend über einem 0,45 μm Membranfilter filtriert. Der Filterkuchen wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen unterzogen, wobei ein Peak-Bereich für 0.19 Al im Chromatogramm gemessen wurde. In der Zwischenzeit wurde eine Referenz-Probe von 0.19 Al (Reinheit: 100 %) einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter den gleichen Bedingungen unterzogen, wobei der Peak-Bereich für 0.19 Al im Chromatogramm gemessen wurde. Der 0.19 Al-Gehalt (Gew.-%) in der Probe wurde nach folgender Gleichung (1) berechnet: 0.19 Al-Gehalt in der Probe (Gew.-%) = (Sa/St) × 100 (1)worin Sa für den Peak-Bereich für 0.19 Al in der Probe und St für den Peak-Bereich für 0.19 Al in der Referenz-Probe steht.
Tabelle 1
Bedingungen für die Hochleistungsflüssigchromatographie

Probe: die Probe zu 1 Gew.-% enthaltende Lösung
Probenmenge in der Säule: 10 μl
Säule: Füllmaterial: CAPCELL PAK C18 SG120A (Partikelgröße: 5 μm, von Shiseido Co., Ltd.) Größe: 4,6 mm Durchmesser × 250 mm Temperatur: 50°C
Durchfluss: 0,5 ml/min
Nachweis: Absorption bei 280 nm
Mobile Phase (Elutionslösung) bestehend aus: Lösung A: wässrige Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure Lösung B: wässrige Lösung aus 80 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure
Elution: Hochdruck-Gradientenelution mit einem Zeit-Konzentrations-Gradienten wie unten veranschaulicht

Zeit [min]	Lösung A [%]	Lösung B [%]
0	100	0
5	62	38
25	62	38
35	57	43
40	0	100
45	0	100
46	100	0

Beispiel 1
(1) Herstellung einer Amylase-Inhibitor enthaltenden wässrigen Lösung
30 m³ Wasser wurden zu 50.000 kg Weizenmehl gegeben, und die Mischung wurde zu einem Teig geknetet. Der Teig wurde mit 400 m³ Wasser gespült, und es wurden 30.000 kg (Feuchtgewicht) Gluten und 30.000 kg (Trockengewicht) Weizenstärke gewonnen.
Die 312 m³ der gewonnenen Extraktlösung wurden durch Zugabe von Salzsäure auf den pH-Wert 3 eingestellt und anschließend 30 Minuten stehen gelassen. Der pH-Wert der Lösung wurde dann mit einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung auf 6 eingestellt, wodurch eine unlösliche Substanz ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde mittels einer De-Laval-Zentrifuge entfernt, wobei 310 m³ einer überstehenden Flüssigkeit gewonnen wurden. Gemäß der Messung nach dem oben beschriebenen Verfahren enthielt die überstehende Flüssigkeit einen Anteil an 0,19 Al von 130 g pro 1 m³.
(2) Bildung des unlöslichen Komplexes
Die 310 m³ der in (1) gewonnenen überstehenden Flüssigkeit (0,19 Al-Gehalt: 40,3 kg) wurden mit Salzsäure und einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung auf den pH-Wert 4,9 eingestellt (Temperatur der Flüssigkeit: 25°C). Dann wurde Alginsäure in einem Anteil von 300 ppm dazu gegeben und anschließend 30 Minuten gerührt. Der pH-Wert der Flüssigkeit wurde durch Zugabe von Salzsäure auf 4,0 eingestellt, und die Flüssigkeit wurde 30 Minuten lang gerührt und anschließend 2 Stunden stehen gelassen. Der Niederschlag aus einem unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und Natriumalginat wurde mittels eines Dekanters gewonnen und mittels einer De-Laval-Zentrifuge (BRPX-617, von Alfa Laval K. K.) eingeengt. Dadurch erhielt man 6 m³ eines unlöslichen Komplexes (feuchte Materie). Die Messung des 0,19 Al-Gehaltes nach dem oben beschriebenen Verfahren zeigte, dass der so gewonnene unlösliche Komplex 0,19 Al in einer Menge von 37,5 kg enthielt. Das heißt, dass 93 Gew.-% des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen 0,19 Al als unlöslicher Komplex gewonnen wurden.
(3) Dissoziation des Polysaccharids vom unlöslichen Komplex und Gewinnung der Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung

(i) 2 m³ gereinigtes Wasser mit einer Temperatur von 30°C wurden zu den 6 m³ des in (2) gewonnenen unlöslichen Komplexes gegeben, und die Mischung wurde 60 Minuten lang gerührt, wobei man 8 m³ einer Suspension herstellte. Zu der Suspension wurde Kalziumchlorid gegeben, so dass sich eine Kalzium-Konzentration von 5000 ppm einstellte, und gleichzeitig wurde eine Filtrationshilfe (Radiolite #700, von Showa Chemical Industry Co., Ltd.) in einer Menge von 60 kg zugegeben. Das Lösungsgemisch wurde 2 Stunden lang bei 30°C gerührt, und Glucanase (Cellulosin TP25, von HANKYU KYOEI BUSSAN erhältlich) wurde in einer Menge von 40 g zu der Lösung gegeben; anschließend wurde 2 Stunden lang bei 30°C gerührt.
(ii) Die in (i) erhaltene Suspension wurde einer Druckfiltration mittels eines Druckfilters (YABUTA automatische Filterpresse vom Typ 100D-70/48 von Yabuta Kikai K. K.) unterzogen. Vor der Druckfiltration wurde das Filtertuch des Druckfilters mit 100 kg Radiolite #700 und 56,8 kg Celite 505 (von Celite Corporation) bei einem Druck von 29,4 kPa (0,3 kgf/cm²) beschichtet. Die Suspension wurde unter Anlegen eines Drucks im Bereich von 29,4 bis 147,1 kPa (0,3 bis 1,5 kgf/cm²) durch das Filtertuch filtriert. Während der Druckfiltration wurde der Druck in einem Bereich von 29,4 bis 147,1 kPa (0,3 bis 1,5 kgf/cm²) aufrecht erhalten, so dass die 8 m³ der Suspension mit einem konstanten Durchsatz über 1,5 Stunden filtriert wurden. Das so aufgefangene insolubilisierte Polysaccharid wurde mit 1,5 m³ gereinigtem Wasser gewaschen. Auf diese Weise wurde das den Amylase-Inhibitor enthaltende Filtrat in einer Ausbeute von 8 m³ erhalten.

(4) Aussalzen
1000 kg Ammoniumsulfat wurden zu den 8 m³ Filtrats, das den in (3) gewonnenen Amylase-Inhibitor enthielt, gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 8 bis 10°C gerührt. In der Folge wurde ausgesalzt, wobei eine den Amylase-Inhibitor enthaltende, insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt) abgetrennt wurde (der pH-Wert der Flüssigkeit während des Aussalzens betrug 3,5). Die insolubilisierte Substanz wurde mittels eines Dekanters gewonnen und mit einer äquivalenten Menge einer wässrigen Lösung aus 10 % Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen) gewaschen. Infolge von Trennschleudern wurde eine insolubilisierte Substanz in einer Ausbeute von 250 kg (Feuchtgewicht) gewonnen. (5) Gewinnung des ausgesalzten Produktes und Entsalzen
2 m³ gereinigtes Wasser wurden zu den in (4) erhaltenen 250 kg der insolubilisierten Substanz (ausgesalztes Produkt) im feuchten Zustand gegeben, und das Gemisch wurde unter Erwärmen bei 50°C gerührt. Die insolubilisierte Substanz wurde auf diese Weise in Wasser gelöst, wobei man eine wässrige Lösung erhielt, die dann einer Druckfiltration mit einem ähnlichen kleinen Druckfilter wie in (3) unterzogen wurde. Das gewonnene Filtrat wurde nochmals filtriert, um Bakterien mit einem Keramikfilter (S-86 von NIHON ROSUIKI KOGYO CO., LTD) zu entfernen, und anschließend eingeengt und mittels einer Ultrafiltrationsmembrane (ein Produkt von DAICEN MEMBRANE SYSTEMS CO., LTD., Polysulfon-Ausführung mit einem Rückhaltevermögen von 30000 Dalton (Molekulargewicht)) entsalzt. So wurde ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Konzentrat hergestellt. (6) Herstellung des Amylase-Inhibitors als trockenes Pulver
Das in (5) erhaltene, den Amylase-Inhibitor enthaltende Konzentrat wurde 24 Stunden lang bei –20°C eingefroren. Die Temperatur wurde dann bei einem Druck von 133,3 Pa (1 Torr) schrittweise von 0°C bis 50°C erhöht. Als Folge der oben beschriebenen Gefriertrocknung wurde trockenes Pulver in einer Ausbeute von 102,9 kg erhalten.
Der 0.19 Al-Gehalt des trockenen Pulvers betrug 3,86 kg; das entspricht einer 0,19 Al-Ausbeute von 95.8 Gew.-%.
Die Durchführung der Behandlungen (4) bis (6) in Beispiel 1 dauerte 3 Tage.
Beispiel 2

(1) Eine den Amylase-Inhibitor enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (1) hergestellt.
(2) Die in (1) erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde mit Salzsäure und einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung (Temperatur der Flüssigkeit: 25°C) auf die pH-Werte 4; 4,5; 5; 5,5 bzw. 6 eingestellt. Ein unlöslicher Komplex (feuchte Materie) wurde aus jeder der überstehenden Flüssigkeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (2) gewonnen. Die 0.19 Al-Gehalte in den unlöslichen Komplexen (prozentuale 0.19 Al-Ausbeuten aus den überstehenden Flüssigkeiten) sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit

4 4,5 5 5,5 6

0.19 Al-Ausbeute [%] 87 92 98 93 81
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass der Amylase-Inhibitor in Form eines unlöslichen Komplexes in hoher Ausbeute gewonnen werden kann, indem man die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung vor der Zugabe von Polysaccharid im vorliegenden Schritt (I) (dem Schritt, in dem sich der unlösliche Komplex aus dem Amylase-Inhibitor und dem Polysaccharid bildet) auf den pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 einstellt.
Beispiel 3

(1) Ein unlöslicher Komplex aus dem Amylase-Inhibitor und dem Polysaccharid wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (1) und (2) gewonnen. 150 cm³ gereinigtes Wasser mit einer Temperatur von 25°C wurden zu den 450 cm³ des unlöslichen Komplexes gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, wobei 600 cm³ einer Suspension hergestellt wurden. Kalziumchlorid wurde zu der Suspension gegeben, so dass sich eine Kalzium-Konzentration von 5000 ppm einstellte, und gleichzeitig wurde Aktivkohle (TAKECOL von Takeda Chemical Industries, Ltd.) in einer Menge von 1 g zugegeben. Das Lösungsgemisch wurde eine 1 Stunde lang bei 30°C gerührt und in sechs gleiche Teile aufgeteilt, die 4 Minuten lang bei Flüssigkeitstemperaturen von 30, 40, 50, 60, 70 bzw. 80°C inkubiert wurden. Danach wurden die Flüssigkeitstemperaturen schnell auf 30°C gesenkt, und die gewonnenen Suspensionen wurden 5 Minuten lang einem Trennschleudern bei 3000 Upm unterzogen, um die ausgefällten Feststoffe, wie beispielsweise das aus dem unlöslichen Komplex dissoziierte, insolubilisierte Polysaccharid, zu entfernen. So wurde die den Amylase-Inhibitor enthaltende überstehende Flüssigkeit jeweils in einer Ausbeute von etwa 95 cm³ gewonnen. Um den Farbton der überstehenden Flüssigkeit zu bestimmen, wurde das Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge 380 nm und 280 nm in Bezug jeder einzelnen überstehenden Flüssigkeit mit einem Spektralphotometer (U-2010 von Hitachi, Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
(2) Die in (1) erhaltenen, den Amylase-Inhibitor entaltenden überstehenden Flüssigkeiten, wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (6) gefriergetrocknet, wobei man den Amylase-Inhibitor enthaltende trockene Pulver erhielt. Der Farbton der Amylase-Inhibitoren (der trockenen Pulver) wurde visuell und mit Bezug auf einen Standard-Farbindex (New Coloration Cards 199a von JAPAN COLOR ENTERPRISE CO., LTD. unter der Schriftleitung des Japan Color Research Institute) begutachtet. Die Ergebnisse sind zusammen mit der 0,19 Al-Ausbeute im trockenen Pulver in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3

	Flüssigkeitstemperatur [°C] bei der Abtrennung des Polysaccharids aus dem unlöslichen Komplex
	30	40	50	60	70	80
Absorptionsvermögen der überstehenden Flüssigkeit (Brix 1%) bei 380 nm	1,21	1,22	1,98	0,61	0,29	0,28
bei 280 nm	8,58	8,60	8,54	8,94	8,40	8,08
Ausbeute des Amylase-Inhibitors im trockenen Pulver	100	100	100	100	98	90
visuell festgestellter Farbton	dunkel-grau	dunkel-grau	dunkel-grau	grau	asch-grau	asch-grau
mit Bezug auf den Standard-Farbindex (Wert der Gy-Helligkeit)	6,0	6,0	6,0	7,5	8,5	9,0

Wie in Tabelle 3 gezeigt, kann die Braunfärbung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung verhindert werden, indem die Lösung für eine kurze Zeit auf 60°C oder darüber erwärmt wird. Als Folge wird die Flüssigkeit anstelle des üblichen braun farblos oder von ähnlicher Farbe sein, so dass der hieraus erhaltene Amylase-Inhibitor im trockenen Pulver von ausgezeichneter Farbe sein wird, wobei er einen weißen oder ähnlichen Farbton annehmen wird.
Beispiel 4

(1) Ein unlöslicher Komplex aus dem Amylase-Inhibitor und dem Polysaccharid wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 (1) und (2) gewonnen. Das vom unlöslichen Komplex abgetrennte Polysaccharid wurde in einer insolubilisierten Form mittels Druckfiltration auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 (3) entfernt, allerdings wurde die Glucanase in den in Tabelle 4 aufgeführten Mengen eingesetzt. Ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Filtrat wurde in einer Ausbeute von jeweils 8 m³ gewonnen. Die zur vollständigen Druckfiltration des insolubilisierten Polysaccharids jeweils benötigte Zeit ist in Tabelle 4 dargestellt.
(2) Die in (1) gewonnenen Filtrate wurden den Behandlungen (4) bis (6) aus Beispiel 1 unterzogen, wobei man die Amylase-Inhibitoren als trockenes Pulver erhielt.

Tabelle 4

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass das Filtrieren zum Entfernen des insolubilisierten Polysaccharids problemlos ausgeführt werden kann, wenn Glucanase anwesend ist. Insbesondere kann das Filtrieren des insolubilisierten Polysaccharids noch problemloser durchgeführt werden, wenn die Glucanase in einer anteiligen Menge von 0,5 bis 24 g pro 1 m³ des unlöslichen Komplexes eingesetzt wird (der Zustand des Polysaccharids vor der Dissoziation davon).
Beispiel 5

(1) Ein unlöslicher Komplex aus dem Amylase-Inhibitor und dem Polysaccharid wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 (1) und (2) gewonnen.
Das vom unlöslichen Komplex abgetrennte Polysaccharid wurde in einer insolubilisierten Form mittels Druckfiltration auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 (3) entfernt, allerdings wurde eine Filtrationshilfe (Radiolite #700) in den in Tabelle 5 aufgeführten Mengen eingesetzt. Ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Filtrat wurde in einer Ausbeute von jeweils 8 m³ gewonnen. Die zur vollständigen Druckfiltration des insolubilisierten Polysaccharids jeweils benötigte Zeit ist in Tabelle 5 dargestellt.
(2) Die in (1) gewonnenen Filtrate wurden den Behandlungen (4) bis (6) aus Beispiel 1 unterzogen, wobei man die Amylase-Inhibitoren als trockene Pulver erhielt.

Tabelle 5

	Menge der pro 1 m³des unlöslichen Komplexes eingesetzten Glucanase [g]
	1	2,5	5	10	15	20
Filtrat-Menge [m³]	8	8	8	8	8	8
für die vollständige Druckfiltration benötigte Zeit [h]	¹⁾	¹⁾	4	1,5	1,5	1,5

¹⁾ unvollständige Filtration wegen Verstopfen

Wie die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, kann das Filtrieren zum Entfernen des insolubilisierten Polysaccharids problemlos mit Hilfe einer Filtrationshilfe ausgeführt werden. Insbesondere kann das Filtrieren des insolubilisierten Polysaccharids noch problemloser durchgeführt werden, wenn die Filtrationshilfe in einer anteiligen Menge von 5 bis 20 g pro 1 m³ des unlöslichen Komplexes eingesetzt wird.
Referenz-Beispiel 1

(1) Ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Filtrat wurde in einer Ausbeute von 8 m³ in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (1)–(3) gewonnen.
(2) Die 8 m³ des in (1) gewonnenen Filtrats wurden mit Phosphorsäure neutralisiert und anschließend 30 Minuten lang auf 80°C erwärmt. Die so gebildete insolubilisierte Substanz wurde mittels des in Beispiel 1 (3) benutzten Druckfilters entfernt, wobei eine überstehende Flüssigkeit gewonnen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde einer Einengung und Entsalzung von überschüssigem Kalziumsalz mittels einer Ultrafiltrationsmembrane (von DAICEN MEMBRANE SYSTEMS CO., LTD., Polysulfon-Ausführung mit einem Rückhaltevermögen von 30.000 Dalton (Molekulargewicht)). So erhielt man ein Konzentrat in einer Ausbeute von 4 m³.
(3) Zu den 4 m³ des in (2) erhaltenen Konzentrats wurde Wasser gegeben, so dass sich ein Gesamtvolumen von 10 m³ ergab. Die verdünnte Lösung wurde mit einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und anschließend mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 m³/h über eine mit einem Kationenaustauscherharz (DIAION HPK-55 von Mitsubishi Kasei K. K.) gefüllte Säule (1,7 m Länge und 1 m Durchmesser), geleitet. Die Fraktionen, die durch den Kationenaustauscherharz eluiert wurden, ohne daran absorbiert zu werden, wurden gesammelt und mit dem in Beispiel 1 (3) verwendeten Druckfilter filtriert. Das Filtrat wurde nochmals filtriert, um Bakterien mit einem Keramikfilter (S-86 von NIHON ROSUIKI KOGYO CO., LTD) zu entfernen, und anschließend eingeengt und mittels der in (2) verwendeten Ultrafiltrationsmembrane entsalzt. Das Filtrat wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (6) gefriergetrocknet, wobei man einen Amylase-Inhibitor als trockenes Pulver in einer Ausbeute von 38,4 kg erhielt. In Referenz-Beispiel 1 benötigte man 8 Tage, um den Amylase-Inhibitor durch die Behandlungen (2) und (3) aus dem Filtrat als trockenes Pulver zu erhalten, also länger als in Beispiel 1.

Beispiel 6 (Referenz)
(1) Herstellung einer Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung (Schritt A)
Eine den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung wurde in einer Ausbeute von 310 m³ in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (1) erhalten. Die Extraktlösung hatte einen 0,19 Al-Gehalt von 130 g pro 1 m³.
(2) Aussalzen (Schritt B)
Die 310 m³ der in (1) erhaltenen Extraktlösung wurde unter Vakuum auf 77,5 m³ eingeengt (die Protein-Konzentration im Konzentrat betrug 10,8 mg/cm³) und mit Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Zu dem gewonnenen Konzentrat gab man 11600 kg Natriumchlorid (mit der Menge stellte sich eine Natriumchlorid-Konzentration von 15 Gew.-% im Konzentrat ein) und 860 kg Kalziumchlorid (mit der Menge stellte sich eine Kalziumionen-Konzentration von 4000 ppm in der Flüssigkeit ein), und es wurde 2 Stunden lang bei 4°C gerührt, um das Aussalzen zu bewirken (der pH-Wert der Flüssigkeit beim Aussalzen betrug 3,5). In der Folge zeigte sich eine den Amylase-Inhibitor enthaltende insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt). Die insolubilisierte Substanz wurde mittels einer Filterpresse gewonnen, mit einer äquivalenten Menge einer wässrigen Lösung aus 15 % Natriumchlorid (Gewicht/Volumen) gewaschen, und mit einer Filterpresse filtriert. So wurde eine insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt) in einer Ausbeute von 320 kg (Feuchtgewicht) gewonnen. Die Protein-Konzentration in der Flüssigkeit wurde mit einem DC Protein Assay Kit (von Bio-Rad Laborstories, Inc.) gemessen.
(3) Entsalzen und Gewinnung des Amylase-Inhibitors (Schritt C)
4 m³ gereinigtes Wasser wurden zu den 320 kg der in (2) erhaltenen insolubilisierten Substanz (ausgesalztes Produkt) gegeben, und beide wurden unter Erwärmen bei 40°C gerührt, wodurch sich die insolubilisierte Substanz in Wasser löste. Die gewonnene wässrige Lösung wurde mit einem Filter (YABUTA Filterpresse Typ 66-D-22) filtriert und nochmals filtriert, um Bakterien mit einem Keramikfilter (S-86 von NIHON ROSUIKI KOGYO CO., LTD) zu entfernen. Das Filtrat wurde anschließend eingeengt und mittels einer Ultrafiltrationsmembrane (von DAICEN MEMBRANE SYSTEMS CO., LTD., Polystyrol-Ausführung mit einem Rückhaltevermögen von 30.000 Dalton (Molekulargewicht)) entsalzt. So wurde ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Konzentrat hergestellt. Das Konzentrat wurde 24 Stunden lang bei –20°C eingefroren. Die Temperatur wurde anschließend bei einem Druck von 133,3 Pa (1 Torr) schrittweise von 0°C bis 50°C erhöht. Als Folge der oben beschriebenen Gefriertrocknung erhielt man ein trockenes Pulver in einer Ausbeute von 192 kg. Der 0,19 Al-Gehalt des trockenen Pulvers betrug 40,3 kg; das entspricht einer 0,19 Al-Ausbeute von 100 %.
Beispiel 7 (Referenz)
Amylase-Inhibitoren in Form trockener Pulver wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 hergestellt, allerdings wurde das Konzentrat (eingeengte überstehende Flüssigkeit) vor der Zugabe von Natriumchlorid auf den pH-Wert 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 bzw. 4,5 eingestellt. Um die 0,19 Al-Ausbeute zu bestimmen, wurden die 0,19 Al-Gehalte in den trockenen Pulvern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6

pH-Wert des Konzentrats

2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

0,19 Al-Ausbeute [%] 72 92 100 91 85
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, dass der Amylase-Inhibitor (0,19 Al) in hoher Ausbeute gewonnen werden kann, indem man die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung vor der Zugabe von Natriumchlorid auf den pH-Wert 3 bis 4, insbesondere auf den pH-Wert 3,5 einstellt.
Beispiel 8 (Referenz)

(1) Amylase-Inhibitoren in Form trockener Pulver wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 hergestellt, allerdings wurde die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung, die mit Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt worden war, auf die in Tabelle 7 dargestellten Werte eingeengt und das Aussalzen erfolgte mit den in Tabelle 7 dargestellten variierten Konzentrationen von Natriumchlorid und von Kalzium-Ionen in der Lösung. Die Protein-Konzentrationen in den überstehenden Flüssigkeiten oder in Konzentraten davon vor dem Aussalzen sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die Protein-Konzentrationen in der Flüssigkeit wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 bestimmt.
(2) Um die 0.19 Al-Ausbeute zu bestimmen, wurden die 0.19 Al-Gehalte in den trockenen Pulvern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

Exp. Nr.	Al-haltige Lösung	Protein-Konzentration ¹⁾	NaCl-Konzentration [Gew.-%]	Ca-Ionen-Konzentration [ppm]	0.19 Al-Ausbeute [%]
Exp. Nr.		Protein-Konzentration ¹⁾	NaCl-Konzentration [Gew.-%]	Ca-Ionen-Konzentration [ppm]	0.19 Al-Ausbeute [%]
1	unkonzentriert	2,7	15	-	6,4
2	unkonzentriert	2,7	25	-	67,9
3	unkonzentriert	2,7	15	4000	17,2
4	unkonzentriert	2,7	25	4000	87,1
5	unkonzentriert	2,7	15	6000	19,8
6	unkonzentriert	2,7	25	6000	90,3
7	konzentriert ²⁾	5,4	15	-	70,5
8	konzentriert ²⁾	5,4	25	-	90,8
9	konzentriert ²⁾	5,4	15	4000	82,3
10	konzentriert ²⁾	5,4	25	4000	97,7
11	konzentriert ²⁾	5,4	15	6000	95,1
12	konzentriert ²⁾	5,4	25	6000	99,4
13	konzentriert ³⁾	10,8	15	-	98,0
14	konzentriert ³⁾	10,8	25	-	100
15	konzentriert ³⁾	10,8	15	4000	100
16	konzentriert ³⁾	10,8	25	4000	100
17	konzentriert ³⁾	10,8	15	6000	100
18	konzentriert ³⁾	10,8	25	6000	100

¹⁾ Einheit: mg/cm³
²⁾ 1/2-Volumen-Konzentrat der Lösung (den Amylase-Inhibitor enthaltende überstehende Flüssigkeit) aus Experiment Nr. 1
³⁾ 1/4-Volumen-Konzentrat der Lösung (den Amylase-Inhibitor enthaltende überstehende Flüssigkeit) aus Experiment Nr. 1

Beispiel 9 (Referenz)
(1) Herstellung einer Amylase-Inhibitor enthaltenden wässrigen Lösung (Schritt A)
30 m³ Wasser wurden zu 50.000 kg Weizenmehl gegeben und die Mischung wurde zu einem Teig geknetet. Der Teig wurde mit 400 m³ Wasser gespült, und es wurden 30.000 kg (Feuchtgewicht) Gluten und 30.000 kg (Trockengewicht) Weizenstärke gewonnen. Die Protein-Konzentration aus den 312 m³ der gewonnenen Extraktlösung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gemessen, für die man einen Wert von 4,2 mg/cm³ bestimmte. Die Extraktlösung enthielt einen 0.19 Al-Anteil von 129,2 g per 1 m³.
(2) Aussalzen (Schritt B) sowie Entsalzen und Gewinnung des Amylase-Inhibitors (Schritt C)
Aus den 312 m³ der in (1) erhaltenen Extraktlösung wurde ein Amylase-Inhibitor als trockenes Pulver in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 hergestellt, allerdings wurde die den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung, die mit Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt worden war, auf die in Tabelle 8 dargestellten Werte eingeengt und das Aussalzen erfolgte mit den in Tabelle 8 dargestellten variierten Konzentrationen von Natriumchlorid und von Kalzium-Ionen in der Lösung. Die Protein-Konzentrationen in den Extraktlösungen oder in Konzentraten davon vor dem Aussalzen wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 wiedergegeben.

(3) Um die 0.19 Al-Aus beute zu bestimmen, wurden die 0.19 Al-Gehalte in den trockenen Pulvern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8

Exp. Nr.	Al-haltige Lösung	Protein-Konzentration ¹⁾	NaCl-Konzentration [Gew.-%]	Ca-Ionen-Konzentration [ppm]	0.19 Al-Ausbeute [%]
1	unkonzentriert	4,2	15	-	2,7
2	unkonzentriert	4,2	25	-	55,0
3	unkonzentriert	4,2	15	4000	14,8
4	unkonzentriert	4,2	25	4000	80,2
5	unkonzentriert	4,2	15	6000	17,5
6	unkonzentriert	4,2	25	6000	88,2
7	konzentriert ²⁾	8,4	15	-	66,1
8	konzentriert ²⁾	8,4	25	-	87,4
9	konzentriert ²⁾	8,4	15	4000	78,3
10	konzentriert ²⁾	8,4	25	4000	95,5
11	konzentriert ²⁾	8,4	15	6000	86,6
12	konzentriert ²⁾	8,4	25	6000	97,2
13	konzentriert ³⁾	16,8	15	-	97,9
14	konzentriert ³⁾	16,8	25	-	100
15	konzentriert ³⁾	16,8	15	4000	100
16	konzentriert ³⁾	16,8	25	4000	100
17	konzentriert ³⁾	16,8	15	6000	100
18	konzentriert ³⁾	16,8	25	6000	100

Beispiel 10 (Referenz)
Ein Amylase-Inhibitor als trockenes Pulver wurde in einer Ausbeute von 202 kg in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 erhalten, allerdings wurden zum Aussalzen anstelle der 11.600 kg Natriumchlorid 12.000 kg Ammoniumsulfat verwendet. Der 0,19 Al-Gehalt des Amylase-Inhibitors in Form von trockenem Pulver wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gemessen, und es wurde eine 0.19 Al-Ausbeute von 100 % bestimmt.
Beispiel 11

(1) 310 m³ einer den Amylase-Inhibitor enthaltenden, überstehenden Flüssigkeit wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 (1) erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf 77,5 m³ eingeengt, indem man den Wasser-Gehalt unter Vakuum abdestillierte (die Protein-Konzentration im Konzentrat betrug 10,8 mg/cm³), und der pH-Wert mit Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Das gewonnene Konzentrat war braun.
(2) 11.600 kg Natriumchlorid (mit der Menge stellte sich eine Natriumchlorid-Konzentration von 15 Gew.-% im Konzentrat ein) und 860 kg Kalziumchlorid (mit der Menge stellte sich eine Kalziumionen-Konzentration in der Flüssigkeit von 4000 ppm ein) sowie darüber hinaus Ascorbinsäure in den in Tabelle 9 aufgeführten Mengen wurden zu den 77,5 m³ des in (1) erhaltenen Konzentrats gegeben. Es wurde 2 Stunden lang bei 4°C gerührt, um das Aussalzen zu bewirken. In der Folge zeigte sich jeweils eine den Amylase-Inhibitor enthaltende insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt). Die insolubilisierten Substanzen wurden jeweils mit einem Dekanter gewonnen, mit einer äquivalenten Menge einer wässrigen Lösung aus 10 % Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen) gewaschen, und mittels Dekanters ein ausgesalztes Produkt im feuchten Zustand gewonnen.
(3) Die in (2) erhaltenen ausgesalzten Produkte wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 (3) eingeengt, entsalzt und getrocknet, wobei man trockene Pulver erhielt. Um die 0.19 Al-Ausbeute zu bestimmen, wurden die 0.19 Al-Gehalte in den trockenen Pulvern gemessen, die in allen Fällen unabhängig von der Menge Ascorbinsäure bei etwa 100 % lag. Die wie oben beschrieben erhaltenen trockenen Pulver wurden hinsichtlich ihres Farbtones visuell begutachtet, und deren Glanz wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 (2) ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9

	Menge der pro 1 m³ Konzentrat eingesetzten Ascorbinsäure [g]
	0	10	50	100	300	1000
visuell festgestellter Farbton	dunkel-grau	_grau	asch-grau	asch-grau	asch-grau	asch-grau
mit Bezug auf den Standard-Farbindex (Wert der Gy-Helligkeit)	6,0	7,5	8,5	9,0	9,0	9,0

Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass die Färbung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung durch die Zugabe von Ascorbinsäure verhindert werden kann. Folglich wird der daraus als trockenes Pulver gewonnene Amylase-Inhibitor eine ausgezeichnete Farbe aufweisen, wobei er einen weißen oder ähnlichen Farbton annehmen wird.
Beispiel 12 (Referenz)

Die Amylase-Inhibitoren in Form trockener Pulver wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 (1)–(3) erhalten, allerdings wurde anstelle von Ascorbinsäure Cystein eingesetzt. Um die 0.19 Al-Ausbeute zu bestimmen, wurden die 0.19 Al-Gehalte in den trockenen Pulvern gemessen, die in allen Fällen unabhängig von der Menge Cystein bei etwa 100 % lag. Die wie oben beschrieben erhaltenen trockenen Pulver wurden hinsichtlich ihres Farbtones visuell begutachtet, und deren Glanz wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10

	Menge des pro 1 m³ Konzentrat eingesetzten Cystein [g]
	0	15	45	145	450	1450
visuell festgestellter Farbton	dunkel-grau	dunkel-grau	grau	grau	asch-grau	asch-grau
mit Bezug auf den Standard-Farbindex (Wert der Gy-Helligkeit)	6,0	6,0	7,0	7,5	8,5	9,0

Die Ergebnisse in Tabelle 10 zeigen, dass die Färbung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung durch die Zugabe von Cystein verhindert werden kann. Folglich wird der daraus als trockenes Pulver gewonnene Amylase-Inhibitor eine ausgezeichnete Farbe aufweisen, wobei er einen weißen oder ähnlichen Farbton annehmen wird.
Beispiel 13 (Referenz)

(1) 310 m³ einer den Amylase-Inhibitor enthaltenden überstehenden Flüssigkeit wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 (1) erhalten. Die überstehende Flüssigkeit enthielt einen 0.19 Al-Anteil von 130 g pro 1 m³.
(2) Die 310 m³ der in (1) erhaltenen überstehenden Flüssigkeit (0.19 Al-Gehalt: 40,3 kg) wurde in der gleichen Weise wie Beispiel 1 (2) und (3) behandelt, allerdings wurde die überstehende Flüssigkeit mit Alginsäure in einem Verhältnis von 300 ppm versetzt, bevor die Flüssigkeit mit Salzsäure und wässriger Natriumhydroxid-Lösung auf den pH-Wert 4,9 (Flüssigkeitstemperatur: 25°C) eingestellt wurde. So wurde ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Filtrat in einer Ausbeute von 8 m³ erhalten.
(3) 500 kg Natriumchlorid wurden zu den 8 m³ des in (2) erhaltenen Filtrats gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 8 bis 10°C gerührt. In der Folge erfolgte das Aussalzen, wobei eine den Amylase-Inhibitor enthaltende insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt) abgetrennt wurde (der pH-Wert der Flüssigkeit beim Aussalzen betrug 3,5). Die insolubilisierte Substanz wurde mittels eines Dekanters gewonnen, mit der äquivalenten Menge einer wässrigen Lösung aus 10% Natriumchlorid (Gewicht/Volumen) gewaschen, und eine insolubilisierte Substanz in einer Ausbeute von 250 kg (Feuchtgewicht) mittels eines Dekanters gewonnen.
(4) 2 m³ gereinigtes Wasser wurden zu den 250 kg der in (3) erhaltenen insolubilisierten Substanz gegeben, und das Gemisch wurde unter Erwärmen bei 50°C gerührt. Die insolubilisierte Substanz wurde so in Wasser gelöst, wobei man eine wässrige Lösung erhielt, die anschließend einer Druckfiltration mit einem kleinen Druckfilter (YABUTA automatische Filterpresse von Yabuta Kikai K. K.) unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 (5) unterzogen wurde. Das Filtrat wurde zum Entfernen von Bakterien mit einem Keramikfilter (S-86 von NIHON ROSUIKI KOGYO CO., LTD) nochmals filtriert und anschließend eingeengt und mittels einer Ultrafiltrationsmembrane (von DAICEN MEMBRANE SYSTEMS CO., LTD., Polysulfon-Ausführung mit einem Rückhaltevermögen von 30.000 Dalton (Molekulargewicht)) entsalzt. So wurde ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Konzentrat hergestellt.
(5) Das in (4) erhaltene, den Amylase-Inhibitor enthaltende Konzentrat wurde 24 Stunden lang bei –20°C eingefroren. Die Temperatur wurde anschließend bei einem Druck von 133,3 Pa (1 Torr) schrittweise von 0°C bis 50°C erhöht. Infolge der oben beschriebenen Gefriertrocknung erhielt man ein trockenes Pulver in einer Ausbeute von 109,7 kg. Der 0.19 Al-Gehalt des trockenen Pulvers betrug 39,5 kg, das bedeutet eine 0,19 Al–Ausbeute von 98 Gew.-%. Die Behandlungen (3) bis (5) in diesem Beispiel dauerten 3 Tage.
(6) Wurde das oben beschriebene, den Amylase-Inhibitor enthaltende Filtrat dem wie in (3) gesondert entsalzt und der pH-Wert dabei auf entweder 3 oder 4 variiert, so betrug die 0.19 Al-Ausbeute im Endprodukt 87 % im Falle von einem pH-Wert 3 und 89 % im Falle von einem pH-Wert 4.

Die obigen Ergebnisse zeigten, dass das Aussalzen vorzugsweise zur Erzielung extrem hoher 0.19 Al-Ausbeuten durchgeführt wird, sofern das den Amylase-Inhibitor enthaltende Filtrat auf den pH-Wert 3,5 eingestellt wurde.
Beispiel 14
Amylase-Inhibitoren (in Form trockener Pulver) wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 hergestellt, allerdings wurde das Aussalzen durch Zugabe von Natriumchlorid in den in Tabelle 11 gezeigten Mengen ausgeführt. Die jeweiligen 0.19 Al-Ausbeuten sind in Tabelle 11 aufgeführt. Tabelle 11

Menge des pro 1 m³ des IA-haltigen Konzentrat eingesetzten Natriumchlorids

10 30 50 100 200

0,19 Al-Ausbeute [%] 37 80 98 100 100
Beispiel 15
Ein Amylase-Inhibitor wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 hergestellt, allerdings wurde das Aussalzen mit 1000 kg Ammoniumsulfat anstelle der 500 kg Natriumchlorid durchgeführt. Die 0.19 Al-Ausbeute betrug 95,8 %.
Beispiel 16

(1) Ein den Amylase-Inhibitor enthaltendes Filtrats wurde in einer Ausbeute von 8 m³ in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 (1) und (2) gewonnen. Das Filtrat war braun.
Gemäß den Messungen mit einem Spektralphotometer (U-2010 von Hitachi, Ltd.) wies das Filtrat ein Absorptionsvermögen von 1,28 bzw. 14,98 bei einer Wellenlänge von 380 nm bzw.
280 nm auf.
(2) 1000 kg Ammoniumsulfat und Ascorbinsäure in den in Tabelle 12 gezeigten Mengen wurden zu den 8 m³ des in (1) erhaltenen Filtrats gegeben. Es wurde 2 Stunden lang bei 8 bis 10°C gerührt. In der Folge erfolgte das Aussalzen, wobei jeweils eine den Amylase-Inhibitor enthaltende insolubilisierte Substanz (ausgesalztes Produkt) abgetrennt wurde. Die insolubilisierten Substanzen wurden jeweils mittels eines Dekanters gewonnen, mit der äquivalenten Menge einer wässrigen Lösung aus 10 % Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen) gewaschen, anschließend wurde jeweils eine insolubilisierte Substanz in einer Ausbeute von 250 kg mittels eines Dekanters gewonnen.
(3) Zu den jeweils 250 kg der in (3) erhaltenen insolubilisierten Substanzen (ausgesalzte Produkte) wurden 2 m³ gereinigtes Wasser gegeben, und die insolubilisierten Substanzen wurden darin gelöst, wobei man jeweils eine wässrige Lösung erhielt. Die so hergestellten Lösungen wurden anschließend wie in Beispiel 13 (4) eingeengt und entsalzt, wobei den Amylase-Inhibitor enthaltende Konzentrate hergestellt wurden. Die gewonnenen Konzentrate wurden hinsichtlich ihres Farbtones visuell begutachtet, und das Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge von 380 nm und 280 nm wurde mit dem in (1) verwendeten Spektralphotometer bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt.
(4) Die in (3) erhaltenen, den Amylase-Inhibitor enthaltenden Konzentrate wurden wie in Beispiel 13 (5) gefriergetrocknet, wobei man jeweils einen Amylase-Inhibitor als trockenes Pulver erhielt. Der Farbton der trockenen Pulver wurde visuell begutachtet, und deren Glanz in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 ausgewertet; die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Die 0.19 Al-Ausbeute lag jeweils im Bereich von 94 bis 96 %.

Tabelle 12

	Menge der pro 1 m³ Konzentrat eingesetzten Ascorbinsäure [g]
	0	10	50	100	300	1000
visuell festgestellter Farbton des Konzentrats	dunkel-braun	ocker	gelb	gelb	hell-gelb	hell-gelb
Absorption bei 380 nm	42,2	13,1	5,3	4,0	3,4	1,9
bei 280 nm	28,1	22,5	19,6	18,5	17,7	17,2
visuell festgestellter Farbton des Amylase-Inhibitors	dunkel-grau	grau	asch-grau	asch-grau	asch-grau	asch-grau
mit Bezug auf den Standard-Farbindex (Wert der Gy-Helligkeit)	6,0	7,5	8,5	9,0	9,0	9,0

Die Ergebnisse in Tabelle 12 zigen, dass die Zugabe von Ascorbinsäure die Verfärbung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung hemmen kann. Eine besonders effektive Hemmung der Verfärbung wird insbesondere durch Zugabe von Ascorbinsäure zur Lösung in einem Anteil von 1 bis 1000 g pro 1 m³ erreicht.
Beispiel 17

(1) Die Amylase-Inhibitor enthaltenden Konzentrate wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 16 (1) und (2) hergestellt, allerdings wurde Cystein anstelle von Ascorbinsäure eingesetzt. Die Konzentrate wurden hinsichtlich ihres Farbtones visuell begutachtet, und das Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge von 380 nm und 280 nm wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 16 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt.
(2) Die in (1) erhaltenen Konzentrate wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 (5) gefriergetrocknet, wobei man Amylase-Inhibitoren in Form trockener Pulver erhielt. Der Farbton der trockenen Pulver wurde visuell begutachtet und deren Glanz in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 ausgewertet; die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt.

Tabelle 13

	Menge des pro 1 m³ Konzentrat eingesetzten Cystein [g]
	0	15	45	145	450	1450
visuell festgestellter Farbton des Konzentrats	dunkel-braun	dunkel-braun	braun	ocker	gelb	hell-gelb
Absorption bei 380 nm	42,2	32,8	18,2	11,5	4,6	2,1
bei 280 nm	28,1	24,3	23,6	22,2	18,8	17,1
visuell festgestellter Farbton des Amylase-Inhibitors	dunkel-grau	dunkel-grau	grau	grau	asch-grau	asch-grau
mit Bezug auf den Standard-Farbindex (Wert der Gy-Helligkeit)	6,0	6,0	7,0	7,5	8,5	9,0

Die Ergebnisse in Tabelle 13 zeigen, dass die Zugabe von Cystein die Verfärbung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung hemmen kann. Eine besonders effektive Hemmung der Verfärbung wird insbesondere durch Zugabe von Cystein zur Lösung in einem Anteil von 15 bis 10.000 g pro 1 m³ erreicht.

Menge der pro 1 m³ des unlöslichen Komplexes eingesetzten Glucanase [g]

Filtrat-Menge [m³]

für die vollständige Druckfiltration benötigte Zeit [h]

Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors, umfassend: (A) einen Schritt, bei dem man eine den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung gewinnt, indem man (A1) Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem wässrigen Alkohol extrahiert, oder (A2) Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer sauren wässrigen Lösung, einer alkalischen wässrigen Lösung oder einem alkalischen Alkohol extrahiert; die erhaltene Lösung zur Denaturierung der Kontaminanten säurebehandelt und/oder wärmebehandelt; und die denaturierten Kontaminanten aus der Lösung entfernt, und (A3) den pH einer in (A1) oder (A2) gewonnenen, den Amylase-Inhibitor enthaltenden Extraktlösung auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Lösung mit einem Polysaccharid versetzt, um in der Lösung ein Assoziationsprodukt des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden, und dann den pH auf 3,0 bis 4,0 einstellt, um einen unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids zu bilden; den unlöslichen Komplex von der Lösung abtrennt; und das Polysaccharid vom unlöslichen Komplex dissoziiert und das Polysaccharid in einer ungelösten Form von der Lösung entfernt, um den Amylase-Inhibitor in Form einer Lösung zu gewinnen; (B) einen Schritt, bei dem man den Amylase-Inhibitor durch Aussalzen insolubilisiert, indem man ein Salz oder Salze zu der in Schritt (A) erhaltenen Amylase-Inhibitor-enthaltenden Lösung zugibt, wobei das Aussalzen in der Extraktlösung erfolgt, die auf einen pH von 3 bis 4 eingestellt ist, und die durch das Aussalzen erhaltene insolubilisierte Substanz gewinnt; und (C) einen Schritt, bei dem man die im Schritt (B) gewonnene insolubilisierte Substanz direkt trocknet oder die insolubilisierte Substanz zur Herstellung einer wässrigen Lösung in Wasser auflöst und die wässrige Lösung entsalzt und trocknet, um den Amylase-Inhibitor zu gewinnen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Salz im Schritt (B) um Natriumchlorid handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Aussalzen im Schritt (B) in Gegenwart von Calciumionen in der Extraktlösung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die in Schritt (A) erhaltene, den Amylase-Inhibitor enthaltende Extraktlösung eine Proteinkonzentration von 1 bis 100 mg/cm³ aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei wenigstens einer der Schritte (B) und (C) die Zugabe von Ascorbinsäure und/oder Cystein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man das Polysaccharid vom unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors und des Polysaccharids unter dem Einfluss von Glucanase dissoziiert und das dissoziierte Polysaccharid in einer insolubilisierten Form durch Filtration entfernt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Filtration unter Zugabe einer Filtrationshilfe erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei man die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung während oder nach der Dissoziation des Polysaccharids auf 50°C oder mehr erwärmt.