DE69707607T2 - Enzymbehandeltes Hesperidin, Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung von enzymbehandeltem Hesperidin - Google Patents

Enzymbehandeltes Hesperidin, Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung von enzymbehandeltem Hesperidin

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Description

    Hinterrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft enzymbehandeltes Hesperidin mit einer besseren Wasserlöslichkeit sowie seine Herstellung und Verwendungen.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik.
  • Hesperidin ist der Name einer Verbindung, bei der, wie in Formel [I] zu sehen ist, Rutinose oder L-Rhamnosyl-(alpha- 6)-Glucose über eine beta-Verbindung mit der Hydroxylgruppe an der Position 7 in Hesperetin oder 5,7,3'-Trihydroxy-4'- methoxyflavanon gebunden ist. [Hesperidin]
  • Hesperidin, das im unreifen Pericarp von Zitrusfrüchten enthalten ist, wird bei Arzneimitteln und Kosmetika als Quelle von Vitamin P eingesetzt, das eine Vielzahl von physiologischen Wirkungen zeigt, wie die Verstärkung der Blutkapillargefäße, die Vorbeugung bzw. Verhinderung von Blutungen und die Regulation des Blutdrucks. Hesperidin ist in wäßrigen alkalischen Lösungen löslich aber in Wasser und Säuren im wesentlichen unlöslich. Bei Raumtemperatur werden in fünfzig Liter Wasser nur etwa 1 g Hesperidin (etwa 0,002 v/v %) gelöst. Selbst wenn Hesperidin in kleinen Mengen enthalten ist, z.B. im Sirup von Dosenprodukten, kann der Sirup trüb werden, was den Handelswert schmälert.
  • Es wurden eine Vielzahl von Verfahren vorgeschlagen, die eine Trübung von Sirupen aufgrund der Gegenwart von Hesperidin verhindern können.
  • Zum Beispiel ist in dem japanischen Patent Kokai Nr. 7.593/91 ein Verfahren zur Herstellung von enzymbehandeltem Hesperidin mit erhöhter Wasserlöslichkeit offenbart, bei dem ein Saccharid-übertragendes Enzym, insbesondere ein Enzym, das eine alpha-Glucosyltransferase-Aktivität besitzt, in Gegenwart eines Stärketeilhydrolysats als alpha- Glucosylsaccharid-Verbindung auf Hesperidin wirkt, um alpha-Glucosylhesperidin zu binden, daß durch die Formel [II] dargestellt ist. [Alpha-glucosylhesperidin]
  • Alpha-Glucosylhesperidin ist, wie in Formel [II] zu sehen ist, entweder eine Einzelverbindung, bei der n (1-20) Einheiten Glucose (G) in Reihe über eine 1,4-Bindung mit der Glucose an der Position 4 in Hesperidin, wie es in Formel [I] dargestellt ist, gebunden ist, oder eine Mischung von alpha-Glucosylhesperidinen sein, wobei jedes hinsichtlich der Anzahl der Glucoseeinheiten unterschiedlich ist.
  • Bei der vorstehend erwähnten Enzymreaktion werden 40 bis 80 % des Hesperidins in dem flüssigen Material während der Enzymbehandlung zu alpha-Glucosylhesperidin umgesetzt, während 20 bis 60% des Hesperidins intakt bleibt. Obwohl intaktes Hesperidin eine relativ hohe Löslichkeit in wäßriger Lösung zeigt, wenn alpha-Glucosylhesperidin mit vorhanden ist, ergibt sich innerhalb einer kurzen Zeitdauer ein höheres Verhältnis von intaktem Hesperidin zu alpha- Glucosylhesperidin aus der Insolubilisierung und eine Ausfällung von Hesperidin.
  • Bei einem anderen Verfahren, das die Ausfällung von intaktem Hesperidin verhindern kann, werden Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose, zu Lösungen mit Hesperidin gegeben, um ihre Viskosität zu erhöhen. Ein derartiges Verfahren ist jedoch im allgemeinen nicht akzeptabel, weil die Zugabe von Bindemitteln das Interesse der Verbraucher reduzieren kann und die Verwendung von Bindemitteln ist bei zu exportierenden Produkten verboten.
  • Es gibt ein weiteres Verfahren, das die Ausfällung von intaktem Hesperidin verzögern kann, bei dem intaktes Hesperidin ausgefällt und dann durch Abtrennung unter Verwendung von z.B. Filtration entfernt wird, so daß das Verhältnis von intaktem Hesperidin zu alpha-Glucosylhesperidin verringert wird.
  • Dieses Verfahren ist jedoch nicht völlig befriedigend, weil intaktes Hesperidin nach einer Verzögerung über eine verlängerte Zeitperiode immer noch eine Ausfällung verursacht.
  • Es gibt noch ein weiteres Verfahren, bei dem Anteile von alpha-Glucosylhesperidin aus einer wäßrigen Lösung isoliert werden, die sowohl alpha-Glucosylhesperidin als auch intaktes Hesperidin enthält, mittels z.B. chromatographischer Trennung vor der Verwendung. Dieses Verfahren ist jedoch vom wirtschaftlichen Standpunkt aus nicht akzeptabel, da es zu erhöhten Kosten führen kann.
  • Um diese Probleme zu lösen, haben die Erfinder ausführliche und intensive Untersuchungen durchgeführt, die zu dem Ergebnis führten, daß wenn alpha-Glucosylhesperidin und intaktes Hesperidin in Lösung einer alpha-L-Rhamnosidase (E.C.3.2.1.40) ausgesetzt werden, das alpha-Glucosylhesperidin keiner Veränderung unterliegt und im wesentlichen intakt bleibt, während das Hesperidin zu Rhamnose und Monoglucosylhesperetin hydrolisiert wird, das durch die Formel [III] dargestellt ist. Dies ergibt auch ein enzymbehandeltes Hesperidin mit einer viel besseren Wasserlöslichkeit und verursacht keine Trübung, sogar wenn es über eine verlängerte Zeitperiode stehengelassen wird. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Ergebnissen.
  • In diesem Zusammenhang wird bei dem Verfahren, bei dem zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit von Hesperidin alpha-L- Rhamnosidase darauf wirken gelassen wird, um Hesperidin zu beta-Monoglucosylhesperetin umzusetzen, im industriellen Maßstab durchgeführt, um die Trübung im Sirup von Dosenmandarinen zu verhindern.
  • In der Literatur wird jedoch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht offenbart, bei dem Hesperidinase als das Enzym, das alpha-L-Rhamnosidase-Aktivität besitzt, auf eine Lösung wirken gelassen wird, die sowohl alpha-Glucosylhesperidin als auch intaktes Hesperidin enthält, so daß die Rhamnosekomponente in dem alpha-Glucosylhesperidin intakt bleibt, während die in dem Hesperidin spezifisch hydrolysiert wird, um Hesperidin in beta-Monoglucosyl-hesperetin umzuwandeln und somit die Wasserlöslichkeit der Lösung zu erhöhen.
  • Im japanischen Patent Kokai Nr. 80.177/96 ist ein Verfahren zur Verhinderung der Ausfällung von Hesperidinkristallen offenbart, bei dem ein solubilisiertes Hesperidin einer Lösung mit Hesperidin zugesetzt wird. In diesem japanischen Patent Kokai wird behauptet, daß das solubilisierte Hesperidin eine Verbindung ist, bei der 1 bis 10 oder mehr Glucosekomponenten über alpha-1,4-Bindungen an die Position 4 der Glucosekomponente in Hesperidin nacheinander gebunden sind und daß das solubilisierte Hesperidin hergestellt werden kann, indem Hesperidin in der Gegenwart von Cyclodextrin einem Saccharid-übertragenden Enzym ausgesetzt wird, das zum Beispiel CGTase oder 1,4-alpha-D-Glucan-; 1,4-alpha- D-(1,4-Glucano)-Transferase (E.C.2.4.1.19) sein kann, das aus Kulturen des Stamms A2-55a der Gattung Bazillus gewonnen wird.
  • In diesem japanischen Patent Kokai wird jedoch nur die technische Idee offenbart, daß solubilisiertes Hesperidin intaktem Hesperidin zugemischt wird, um die Ausfällung von Hesperidinkristallen in Hesperidin enthaltenden Produkten zu verhindern. Zudem ergibt das Verfahren eine Mischung von alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin, wobei intaktes Hesperidin intakt bleibt. Somit haben durch das Verfahren hergestellte Dosenprodukte den Nachteil, daß ihre Sirupe schrittweise trübe werden. Zur Behebung dieses Problems werden in den Ausführungsformen des japanischen Patents Kokai Anteile von alpha-Monoglucosyl- und alpha-Diglucosylhesperidinen vor der Verwendung isoliert, aber es bestehen technische Schwierigkeiten in der Durchführung bei geringen Kosten.
    • Aufgabe der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diese Probleme aus dem Stand der Technik zu lösen. Die Hauptaufgaben der vorliegenden Erfindung sind es, ein enzymbehandeltes Hesperidin bereitzustellen, das aus einer Mischung von alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin durch ein einfaches Verfahren erhältlich sind, das bezüglich der Wasserlöslichkeit überlegen ist und weder eine Ausfällung von Kristallen noch eine Trübung verursacht, sogar wenn es für eine längere Zeitperiode gelagert wird, sowie seine Herstellung und Verwendungen bereitzustellen.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein enzymbehandeltes Hesperidin bereitzustellen, das insbesondere zur Verhinderung einer Trübung bei Dosenmandarinen nützlich ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein enzymbehandeltes Hesperidin bereitzustellen, das insbesondere als Mittel zur Verhinderung des Verblassens von natürlichen Farbstoffen nützlich ist.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es alpha-Glucosylhesperidin zusammen mit Hesperidin und beta-Monoglucosylhesperetin enthält, insbesondere 0,1 Gewichtsteile oder weniger Hesperidin und 0,1 bis 0,5 Gewichtsteile beta- Monoglucosylhesperetin auf der Basis von einem Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
  • Das Verfahren zur Herstellung von enzymbehandeltem Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß alpha-L-Rhamnosidase auf eine Lösung wirken gelassen wird, die sowohl alpha-Glucosylhesperidin als auch Hesperidin enthält, wodurch das Hesperidin zu beta- Monoglucosylhesperetin umgesetzt oder umgewandelt wird.
  • Bei gemäß der vorliegenden Erfindung zu behandelnden Lösungen, die alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin enthalten, ist es vorzuziehen, solche zu verwenden, die durch Wirkung eines Saccharid-übertragenden Enzyms auf eine Lösung erhalten werden, die Hesperidin zusammen mit einer alpha- Glucosylsaccharidverbindung enthält.
  • Bei der vorliegenden Erfindung ist es vorzuziehen, Hesperidinase als Enzym zu verwenden, das eine alpha-L-Rhamnosidase-Aktivität besitzt.
  • Vorzugsweise enthalten die somit erhaltenen enzymbehandelten Hesperidine alpha-Glucosylhesperidin zusammen mit Hesperidin und beta-Monoglucosylhesperetin, insbesondere 0,1 Gewichtsteile oder weniger Hesperidin und 0,1 bis 0,5 Gewichtsteile beta-Monoglucosylhesperetin auf der Basis von einem Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
  • Darüber hinaus wird ein Enzym mit alpha-L-Rhamnosidase- Aktivität, insbesondere Hesperidinase, auf eine Lösung wirken gelassen, die alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin enthält, um das Hesperidin zu beta-Monoglucosylhesperetin umzusetzen. Das alpha-Glucosylhesperidin kann zu alpha- Monoglucosyl- und alpha-Diglucosylhesperidin umgewandelt werden, indem es Glucoamylase (E.C.3.2.1.3) oder beta- Amylase (E.C.3.2.1.2) gleichzeitig oder nacheinander mit dem vorliegenden Enzym ausgesetzt wird.
  • Durch die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auf einfache Weise ein enzymbehandeltes Hesperidin in der Form einer Zusammensetzung erhalten, die alpha- Glucosylhesperidin und beta-Monoglucosylhesperetin enthält, das sehr überlegen hinsichtlich der Wasserlöslichkeit ist und keine Trübung oder Ausfällung von Kristallen verursacht.
  • Weiterhin kann man ein enzymbehandeltes Hesperidin erhalten, das sowohl einen erhöhten alpha-Glucosyl-hesperidingehalt als auch einen wirtschaftlichen Wert besitzt, indem das alpha-Glucosylhesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung in Lösung auf eine Säule mit vorab aktiviertem Adsorptionsharz, wie HP-20 und XAD-7, aufgegeben wird, um eine Adsorption von Glycosidfraktionen zu bewirken, mit Wasser gewaschen und mit wäßrigem Alkohol eluiert wird.
  • Das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung ist dazu in der Lage, eine Trübung bei Dosenmandarinen zu verhindern, wenn es darin vorliegt. Das enzymbehandelte Hesperidin ist auch dazu in der Lage, eine Trübung bei Zitrusgetränken zu verhindern, wenn es darin vorliegt. Darüber hinaus ist das enzymbehandelte Hesperidin dazu in der Lage, das Verblassen von natürlichen Farbstoffen zu verhindern, wenn diese in Kombination verwendet werden. Darüber hinaus wird das Verblassen von natürlichen Farbstoffen viel wirksamer verhindert, indem ein derartiger Farbstoff zusammen mit dem enzymbehandelten Hesperidin und enzymbehandeltem Rutin und/oder L-Ascorbinsäure verwendet wird.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Das enzymbehandelte Hesperidin und seine Herstellung und Verwendungen werden nachstehend im einzelnen beschrieben.
  • Das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung enthält alpha-Glucosylhesperidin zusammen mit Hesperidin und beta-Monoglucosylhesperetin, insbesondere 0,1 Gewichtsteile oder weniger Hesperidin und 0,1 bis 0,5 Gewichtsteile beta-Monoglucosylhesperetin auf der Basis von 1 Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
  • Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung eines derartigen enzymbehandelten Hesperidins eine Lösung, die sowohl alpha-Glucosylhesperidin als auch Hesperidin, die durch die Formeln [I] bzw. [II] dargestellt sind, einem Enzym ausgesetzt wird, das eine alpha-L- Rhamnosidase-Aktivität besitzt, insbesondere Hesperidinase, um das Hesperidin in der Lösung zu beta-Monoglucosylhesperetin umzusetzen oder umzuwandeln, das durch die Formel [III] dargestellt ist.
    • Lösung, die alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin enthält
  • Bei einer derartigen enzymatischen Behandlung ist jede beliebige Lösung verwendbar, ungeachtet ihrer Zusammensetzung und Konzentration, solange sie sowohl alpha-Glucosylhesperidin als auch Hesperidin enthält. Die Konzentration für alpha-Glucosylhesperidin in der zu behandelnden Lösung beträgt 0,1 bis 30 Gewichts-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gewichts-%, und die für Hesperidin beträgt 0,02 bis 15 Gewichts-%, vorzugsweise 0,2 bis 5 Gewichts-%, wobei 1 bis 200, vorzugsweise 1 bis 25 Gewichtsteile Hesperidin auf der Basis von 100 Gewichtsteilen alpha-Glucosylhesperidin enthalten sind.
    • Beispiele für derartige Lösungen sind folgende:
  • (1) Eine Lösung, die alpha-Glucosylhesperidin und intaktes Hesperidin enthält, wie in dem japanischen Patent Kokai Nr. 7.593/91 beschrieben ist, die durch Zugabe eines Saccharidübertragenden Enzyms als Enzym, das eine alpha- Glucosyltransferase-Aktivität besitzt, zu Hesperidin in der Gegenwart eines Stärketeilhydrolysats als alpha-Glucosylsaccharidverbindung erhalten wird,
  • und
  • (2) eine Lösung mit einem verminderten Verhältnis von Hesperidin zu alpha-Glucosylhesperidin, die durch Ausfällung von Hesperidin in dem vorstehend erhaltenen Produkt und Abtrennen und Entfernen des Hesperidins mittels Filtration erhalten wird.
    • Enzym, das alpha-L-Rhamnosidase-Aktivität besitzt
  • Bei der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige Enzym verwendet werden, sofern es eine alpha-L-Rhamnosidase- Aktivität besitzt. Beispiele für derartige Enzyme schließen Naringinase und vorzugsweise Hesperidinase ein, die beide handelsüblich von Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan erhältlich sind.
  • Derartige Enzyme werden vorzugsweise in einer Menge von 0,05 bis 50 Gewichtsteilen, besonders vorzugsweise 1,5 bis 15 Gewichtsteilen auf der Basis von 100 Gewichtsteilen Hesperidin in einer Lösung verwendet, die alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin enthält.
  • Um zu ermöglichen, daß das Enzym in einer derartigen Lösung auf Hesperidin wirkt, wird die Lösung allgemein bei pH 3 bis 7, vorzugsweise bei pH 3 bis 4 und bei 40 bis 70ºC, vorzugsweise 50 bis 60ºC für 0,5 bis 48 Stunden, vorzugsweise 6 bis 24 Stunden inkubiert.
  • Wenn eine alpha-Glucosylhesperidin und Hesperidin enthaltende Lösung unter diesen Bedingungen enzymatisch behandelt wird, ändert sich der Gehalt von alpha-Glucosylhesperidin in der Lösung vor und nach der Behandlung nicht, weil alpha-Glucosylhesperidin im wesentlichen unempfindlich gegenüber alpha-L-Rhamnosidase ist.
  • Das somit erhaltene enzymbehandelte Hesperidin enthält Hesperidin in einer Menge von 0,1 Gewichtsteilen oder weniger, vorzugsweise 0,02 Gewichtsteilen oder weniger, besonders vorzugsweise 0 bis 0,01 Gewichtsteilen, zusammen mit beta- Monoglucosylhesperetin in einer Menge von 0,1 bis 0,5 Gewichtsteilen, vorzugsweise 0,15 bis 0,4 Gewichtsteilen, besonders vorzugsweise 0,15 bis 0,3 Gewichtsteilen auf der Basis von 1 Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
  • Derartiges enzymbehandeltes Hesperidin ist hinsichtlich der Wasserlöslichkeit überlegen: Zum Beispiel bildet es kaum Flocken aufgrund der Ausfällung von Hesperidin, sogar wenn es als eine wäßrige Lösung mit 30 Gewichts-% hergestellt wird, und dann bei Raumtemperatur (25ºC) über vier Wochen stehengelassen wird, während es makroskopisch beobachtet wird.
  • Das somit erhaltene alpha-Glucosylhesperidin in dem enzymbehandelten Hesperidin zeigt somit eine Vielfalt von Wirkungen, die bei Vitamin P vorhanden sind, wenn es in den Körper aufgenommen wird, weil es auf Enzyme in dem Körper anspricht, die Hesperidin freisetzen. In diesem Fall führt eine Kombination mit Vitamin C zu einem Synergismus bei Vitamin-P-Aktivitäten, einschließlich der Erhöhung des Widerstands der Blutkapillargefäße. Darüber hinaus ist das enzymbehandelte Hesperidin für eine Verwendung zur Verhinderung des Verblassens von natürlichen Farbstoffen geeignet.
  • In diesem Fall wird das enzymbehandelte Hesperidin in einer Menge von 0,001 bis 0,2 Gewichts-%, vorzugsweise 0,005 bis 0,1 Gewichts-%, besonders vorzugsweise 0,01 bis 0,05 Gewichts-% auf Basis des Gewichts der Produkte verwendet, die mit den natürlichen Farbstoffen gefärbt sind.
  • Im einzelnen wurde die Verwendung von Hesperidin bei der Verhinderung des Verblassens von Farbstoffen, insbesondere natürlichen Farbstoffen, die UV-empfindlich sind, um ein Verblassen zu bewirken, mehrfach versucht, weil Hesperidin ein charakteristisches Absorptionsspektrum im Ultraviolettbereich aber keine ausgeprägten Absorptionen im sichtbaren Bereich besitzt, was Hesperidin fast farblos macht. Diese Versuche haben sich jedoch als erfolglos herausgestellt, weil Hesperidin die gewünschten Wirkungen aufgrund seiner sehr geringen Löslichkeit in Wasser nicht ausüben kann. Übliche bzw. bekannte enzymbehandelte Hesperidine, die zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit modifiziert wurden, waren nicht akzeptabel, weil eine Ausfällung und Ablagerung von intaktem Hesperidin die Interessen des Verbrauchers stört.
  • Im Gegensatz dazu ist das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung des Verblassens von natürlichen Farbstoffen breit anwendbar, weil es schnell in Wasser löslich ist und keine Ausfällung verursacht. Insbesondere ist es wirkungsvoll mit Farbstoffen der Carotinoid- und Flavonoid-Reihe einsetzbar, wie Paprika, beta-Carotin, Astaxanthin, Pampelmusen-Pericarp (Schalenextrakt) und Saflorgelb, sowie mit anderen Farbstoffen einschließlich Betanin, Kurkuma, Gardeniagelb und Ang-Khak.
  • In diesem Fall führt eine Kombination mit enzymbehandeltem Rutin und/oder entweder L-Ascorbinsäure oder Natrium-L- Ascorbat zu einem Synergismus bei der Verhinderung des Verblassens.
  • Verwendet man das enzymbehandelte Hesperidin zur Verhinderung der Trübung bei Dosenmandarinen, wird die Menge von enzymbehandeltem Hesperidin auf 0,1 bis 10 Gewichtsteile, vorzugsweise 0,1 bis 2 Gewichtsteile, besonders vorzugsweise 0,4 bis 1 Gewichtsteile auf der Basis von 1 Gewichtsteil intaktem Hesperdin eingestellt, das in den Mandarinen und dem Sirup in den Dosenmandarinen vorliegt.
  • Darüber hinaus ist das vorliegende enzymbehandelte Hesperidin zur Verhinderung der Trübung bei Zitrusgetränken, zum Beispiel aus Mandarinen (Citrus unshiu), Valencia-Orangen und Pampelmusen, die üblicherweise Hesperidin enthalten, einsetzbar. Bei dieser Verwendung wird die Menge von enzymbehandeltem Hesperidin auf 0,1 bis 10 Gewichtsteile, vorzugsweise 0,1 bis 2 Gewichtsteile, besonders vorzugsweise 0,4 bis 1 Gewichtsteile auf der Basis von 1 Gewichtsteil intaktem Hesperidin, das in Lösungen vorhanden ist, eingestellt.
  • Weiterhin ist das vorliegende enzymbehandelte Hesperidin als ein UV-Absorptionsmittel zur Verwendung in Kosmetika einsetzbar, weil es eine charakteristische Absorption im Ultraviolett-Bereich besitzt, aber eine sehr blasse Farbe zeigt.
    • Wirkung der Erfindung
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann man auf leichte Weise und bei niedrigen Kosten ein enzymbehandeltes Hesperidin erhalten, das eine sehr verbesserte Wasserlöslichkeit besitzt, indem alpha-L-Rhamnosidase, insbesondere Hesperidinase als Enzym, das alpha-Rhamnosidase-Aktivität besitzt, auf eine Lösung wirken gelassen wird, die alpha- Glucosylhesperidin und Hesperidin enthält.
  • Das somit erhaltene enzymbehandelte Hesperidin verursacht keine Ausfällung von Hesperidin, wenn es für eine längere Zeitdauer stehengelassen wird, weil es kaum Hesperidin enthält oder, wenn es vorhanden ist, der Gehalt sehr gering ist, insbesondere 0,1 Gewichtsteile oder weniger gegenüber 1 Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
  • Das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung verhindert wirksam das Verblassen von natürlichen Farbstoffen.
  • Das vorliegende enzymbehandelte Hesperidin verhindert wirksam eine Trübung bei Dosenmandarinen und Zitrusgetränken, wenn es darin enthalten ist.
  • Wenn es in den Körper aufgenommen wird, ist das alpha- Glucosylhesperidin als dominierender Bestandteil in dem enzymbehandelten Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber Enzymen empfindlich, um Hesperidin freizusetzen, das eine Vielfalt von Aktivitäten ausübt, die bei Vitamin P vorhanden sind, weil alpha-Glucosylhesperidin keinem anderen Enzym als alpha-L-Rhamnosidase ausgesetzt war.
  • Das enzymbehandelte Hesperidin gemäß der vorliegenden Erfindung ist im großen Umfang bei üblichen Lebensmittelprodukten, einschließlich Getränken und gesundheitsfördernden Lebensmitteln sowie in physiologisch funktionellen Lebensmitteln einsetzbar, wobei ein oder mehrere Inhaltsstoffe mit physiologischen Aktivitäten enthalten sind, um die Gesundheit des Menschen aufrechtzuerhalten und zu fördern.
  • Darüber hinaus macht die charakteristische Absorption im Ultraviolettbereich das vorliegende enzymbehandelte Hesperidin als UV-Absorptionsmittel nutzbar.
    • Beispiel
  • Die vorliegende Erfindung wird im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die den Bereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen.
    • Beispiel 1
  • Fünfzig Gramm Hesperidin wurden in 0,25 N Natriumhydroxid bei Raumtemperatur (25ºC) gelöst und 150 g Dextrin (DE8) wurde zugegeben und in der resultierenden Lösung aufgelöst.
  • Die Lösung wurde auf pH 9,0 durch Zugabe von 4 N Schwefelsäure eingestellt, Cyklodextrin-Glucoanotransferase, die aus der Spezies Bacillus stearothermophilus gewonnen war, vertrieben von Hayashibara, Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, in einer Menge von 15 Einheiten/g Dextrin- Feststoff zugegeben, auf pH 7,0 durch tropfenweise Zugabe von 4 N Schwefelsäure eingestellt, während auf 60ºC erwärmt wurde, auf 68ºC erhitzt und für 40 Stunden reagieren gelassen.
  • Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch für 30 Minuten auf 95ºC erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren und dann filtriert, um eine Lösung von enzymbehandeltem Hesperidin (nachstehend als "Lösung A" bezeichnet) zu erhalten.
  • Eine HPLC-Analyse von Lösung A unter den nachstehenden Bedingungen zeigte, daß 72 Gewichts-% Hesperidin in der Ausgangslösung zu alpha-Glucosylhesperidin umgesetzt war, während die verbleibenden 28 Gewichts-% intakt blieben.
    • Analytische Bedingungen der HPLC
  • Die verwendete Säule war C18, Elutionsmittel: Mischung aus Methanol/Wasser/Essigsäure (Volumenverhältnis 30 : 65 : 5), Detektion 280 nm, Temperatur: 40ºC, Flußrate: 0,5 ml/Minute.
  • (Das Absorptionsspektrum im Ultraviolettbereich wurde bei 200 bis 400 nm unter Verwendung eines PDA-Detektors bestimmt.)
  • Lösung A wurde auf pH 4,0 mit 4 N Schwefelsäure eingestellt, es wurde 2,0 g "HESPERIDINASE #2" zugegeben, ein Hesperidinaseprodukt, das eine alpha-L-Rhamnosidaseaktivität besitzt, vertrieben von Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan, und für 6 Stunden bei 60ºC reagieren gelassen.
  • Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch für 30 Minuten auf 95ºC erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren, und dann filtriert, um eine Lösung von enzymbehandeltem Hesperidin (nachstehend als "Lösung B" bezeichnet) zu erhalten.
  • Eine HPLC-Analyse von Lösung B unter den vorstehenden Bedingungen zeigte, daß das alpha-Glucosylhesperidin in Lösung B keiner wesentlichen Veränderung unterlag und intakt blieb, während ein Hauptteil (99 Gewichts-% oder mehr) des intakten Hesperidins in Lösung A zu beta-Monoglucosylhesperetin umgewandelt war.
    • Identifikation von Hesperidin, beta-Monoglucosylhesperetin, alnha-Monoglucosylhesperetin und alpha-Glucosyl-hesperidin.
  • Hesperidin, beta-Monoglucosylhesperetin, alpha-Monoglucosylhesperetin und alpha-Glucosylhesperidin wurden auf folgende Weise identifiziert.
    • 1. Hesperidin
  • Die Identifikation wurde unter Verwendung einer authentischen Probe von Hesperidin durchgeführt, die von Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan hergestellt war.
    • 2. Beta-Monoglucosylhesperetin
  • Die authentische Probe von Hesperidin wurde zuerst einer alpha-L-Rhamnosidase ausgesetzt und dann mit Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC") unter den vorstehenden Bedingungen analysiert. Danach wurde eine Einzelpeakfraktion (RT (Retentionszeit) = 12, 13) gesammelt, die einem Hesperidin-Peak (RT = 10,90) folgte, hydrolysiert und eine Glucosebstimmung durchgeführt. Darüber hinaus wurde bestätigt, daß das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Fraktion in guter Übereinstimmung mit dem von Hesperidin stand, so daß die Einzelpeakfraktion als die von beta-Monoglucosylhesperetin oder Hesperitin-7-glucosid identifiziert wurde.
    • 3. Alpha-Monoglucosylhesperetin und alpha-Glucosylhesperidin
  • Das Reaktionsgemisch aus der authentischen Probe von Hesperidin wurde mit HPLC unter den vorstehenden Bedingungen analysiert. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von jeder Peakfraktion wurde auf Übereinstimmung mit dem von Hesperidin überprüft. Darüber hinaus wurde das Reaktionsgemisch einer Glucoamylase ausgesetzt und dann mit HPLC unter den vorstehenden Bedingungen analysiert. Als Ergebnis ergab jede Peakfraktion einen Einfachpeak (RT = 10,34), der vor dem von Hesperidin (RT = 10,90) auftrat.
  • Nach dem Sammeln der Fraktion (RT = 10,34) wurde bestätigt, daß sie Glucose und Hesperidin ergab, wenn sie einer alpha- Glucosidase (E.C.3.2.1.20) ausgesetzt wurde. Somit wurde der Peak (RT = 10,34) als alpha-Monoglucosylhesperidin identifiziert, während dieser Peak und eine Gruppe von Peaks mit einer geringeren RT als alpha-Glucosylhesperidin.
    • Gewichtsmessung von Hesperidin, beta-Monoglucosylhesperetin, alpha-Monoglucosylhesperidin und alpha- Glucosylhesperidin
  • Hesperidin, beta-Monoglucosylhesperetin, alpha-Monoglucosylhesperidin und alpha-Glucosylhesperidin wurden in der folgenden Weise einer Gewichtsbestimmung unterzogen.
    • 1. Hesperidin
  • Proben wurden mit HPLC analysiert und unter Verwendung einer authentischen Probe von Hesperidin einer Gewichtsbestimmung unterzogen, die von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan hergestellt war.
    • 2. Beta-Monoglucosylhesperidin
  • Proben wurden mit HPL analysiert und einer Gewichtsbestimmung unterzogen, indem ihr Molekulargewicht unter Verwendung der authentischen Probe von Hesperidin geschätzt wurde.
    • 3. Alpha-Monoglucosylhesperetin
  • Proben wurden mit HPLC analysiert und einer Gewichtsbestimmung unterzogen, indem ihr Molekulargewicht unter Verwendung der authentischen Probe von Hesperidin geschätzt wurde.
    • 4. Alpha-Glucosylhesperidinfraktion
  • Ein Gramm der Fraktion wurde in 50 ml Wasser gelöst, bei SV1 zu 100 ml XAD-7 gegeben, das in konzentriertem wäßrigen Ethanol aktiviert und ausreichend mit Wasser gewaschen wurde, wonach eine Elution mit 200 ml 50% wäßrigen Ethanol bewirkt wurde. Das Eluat wurde von Ethanol befreit, konzentriert, getrocknet und einer Gewichtsbestimmung unterzogen. Wenn Hesperidin und/oder beta-Monoglucosylhesperetin in dem Eluat bei der HPLC-Analyse detektiert wurden, wurden die Gewichte, die gemäß der vorstehenden Punkte 1 und 2 bestimmt wurden, von den für das Eluat bestimmten Gewichten substrahiert.
    • Beispiel 2
  • Lösung A als alpha-Glucosylhesperidinlösung, die separat hergestellt wurde, wurde sowohl mit 0,5 ml "GLUCZYME NL4.2", einem Glucoamylaseprodukt (4.200 Einheiten/ml), vertrieben von Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Japan, als auch mit 2,0 g "HESPERIDINASE #2", einem Hesperidinaseprodukt, vertreiben von Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan, gemischt, auf pH 4,0 mit 4 N Schwefelsäure eingestellt und für 48 Stunden bei 55ºC reagieren gelassen.
  • Nach dem Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch für 30 Minuten auf 90ºC erwärmt, um die Enzyme zu desaktivieren, und dann filtriert, um eine Lösung von enzymbehandeltem Hesperidin (nachstehend als "Lösung C" bezeichnet) zu erhalten.
  • Eine HPLC-Analyse von Lösung C unter den Bedingungen von Beispiel 1 zeigte, daß in Lösung C ein Hauptteil von alpha- Glucosylhesperidin zu alpha-Monoglucosylhesperetin umgewandelt war, während ein Hauptteil (99% oder mehr) von intaktem Hesperidin zu beta-Monoglucosyl-hesperetin umgewandelt war.
  • Danach wurde die Lösung C auf eine Säule mit 1,5 L "XAD-7" aufgegeben, einem porösen Adsorptionsharz mittels einer mittleren Polarität, das in konzentriertem wäßrigen Ethanol aktiviert war, wonach die Säule mit Wasser (zweifaches Harzvolumen) gewaschen war, gefolgt von einer Desorption der absorbierten Bestandteile unter Verwendung von 3 L 50% (v/v) wäßrigem Ethanol.
  • Das Eluat wurde vom Ethanol befreit und lyophilisiert, um 44,8 g eines enzymbehandelten Hesperidins (nachstehend als "Feststoff D" bezeichnet) zu ergeben.
    • Beispiel 3
  • Lösung A als Lösung von enzymbehandeltem Hesperidin (Lösung A), die separat hergestellt wurde, wurde mit 0,5 ml "GLUCZYME NL4.2" gemischt, auf pH 5,0 mit 4 N Schwefelsäure eingestellt und für 24 Stunden bei 55ºC reagieren gelassen. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch für 30 Minuten auf 90ºC erwärmt, um das Enzym zu desaktivieren, und dann filtriert, um eine Lösung von enzymbehandeltem Hesperidin (nachstehend als "Lösung E" bezeichnet) zu erhalten.
  • Eine HPLC-Analyse von Lösung E unter den Bedingungen von Beispiel 1 zeigte, daß in Lösung E ein Hauptteil von alpha- Glucosylhesperidin zu alpha-Monoglucosylhesperidin umgewandelt war, während intaktes Hesperidin in Lösung E keiner wesentlichen Änderung unterlag.
  • Danach wurde wie bei Beispiel 2 Lösung E auf eine Säule mit 1,5 L "XAD-7", einem porösen Absorptionsharz mit einer mittleren Polarität, aufgegeben, die in konzentriertem wäßrigen Ethanol aktiviert war, wonach die Säule mit Wasser (zweifaches Harzvolumen) gewaschen war, gefolgt von einer Desorption der adsorbierten Komponenten unter Verwendung von 3 L 60% (v/v) wäßrigem Ethanol.
  • Das Eluat wurde von Ethanol befreit und dann lyophilisiert, um 48,0 g eines enzymbehandelten Hesperidins (nachstehend als "Feststoff F" bezeichnet) zu ergeben.
    • Ausflockungstest
  • Lösungen A und B als Lösungen von enzymbehandeltem Hesperidin wurden getrennt mit Wasser gemischt, um jeweilige Feststoffgehalte von 30 Gewichts-% zu ergeben, während Feststoffe D und F getrennt in reinem Wasser gelöst wurden, um jeweilige Feststoffgehalte von 15 Gewichts-% zu ergeben, wonach jede Lösung durch Erhitzen sterilisiert wurde, in 200-ml-Aliquoten in sterilen Glasflaschen verteilt wurde und dann für 4 Wochen stehengelassen wurde, während auf eine Beziehung zwischen der Anzahl von Lagerungstagen und der Menge von Flocken, die sich während der Lagerung gebildet hatten, zu prüfen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 (Ergebnisse der Beobachtung der Ausflockung)
  • Die Auswertungskriterien waren wie folgt: Das Symbol "-" wurde vergeben, wenn sich keine Flocken gebildet hatten, "+", wenn sich Spurenmengen von Flocken gebildet hatten, "++", wenn sich eine kleine Menge von Flocken gebildet hatte, "+++" wenn sich eine große Menge von Flocken gebildet hatte, und "++++" wenn sich eine sehr große Menge von Flocken gebildet hatte.
  • Die Gewichtsverhältnisse von Komponenten in den enzymbehandelten Hesperidinproben waren wie in Tabelle 2 dargestellt ist. Tabelle 2 (Gewichtsverhältnisse der Komponenten von enzymbehandelten Hesperidinen)
    • Beispiel 4
  • 1,5 Gramm Zitronensäure (als Zitronensäure-Monohydrat) 0,13 g Natriumcitrat (als Trinatriumcitrat-Dihydrat) und 200 g granulierte Saccharose wurden in Wasser gelöst, um eine Gesamtmenge von 1.000 g zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde mit Hesperidin gemischt, das in alkalischem Wasser, insbesondere in 0,2 N wäßrigem Natriumhydroxid, zu 2,0 Gewichtsprozent gelöst war, und mit 1 N Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt war, so daß sich eine Testlösung mit einem Hesperidingehalt von 0,05 Gewichts-% ergab.
  • Aliquoten mit 200 Gramm der Testlösung wurden 200 mg von Feststoff D in Beispiel 2 zugegeben, die auf 10 Gewichts-% gelöst waren, um "Testlauf 1" mit 0,01 Gewichts-% enzymbehandeltem Hesperidin bereitzustellen.
  • Genauso wie vorstehend wurden "Testlauf 2" und "Testlauf 3" mit 0,02 Gewichtsprozent bzw. 0,04 Gewichtsprozent enzymbehandeltem Hesperidin bereitgestellt.
  • Darüber hinaus wurde ein Lauf ohne enzymbehandeltem Hesperidin als Kontrolle bereitgestellt, wie in Tabelle 3 dargestellt ist.
  • Testläufe 1 bis 3 und die Kontrolle wurden bei Raumtemperatur während einer Woche stehengelassen, wobei makroskopisch auf Trübung geprüft wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 (Visuelle Untersuchung der Trübung)
  • *: eine große Niederschlagsmenge trat auf.
  • Die Bewertung erfolgte gemäß der folgenden Kriterien:
  • Die Bewertuntgskriterien waren wie folgt: Das Symbol "-" wurde vergeben, wenn keine Trübung auftrat, "±" wenn eine Spurentrübung auftrat, "+" wenn eine geringe Trübung auftrat, und "++" wenn eine große oder deutliche Trübung auftrat.
    • Beispiel 5
  • Feststoff D in Beispiel 2 als enzymbehandeltes Hesperidin wurde 0,05 Gewichts-% Gardeniagelb in Zitronensäurepuffer (pH 3,3) zugegeben, um einen Gehalt von 0,02 oder 0,04 Gewichts-% für enzymbehandeltes Hesperidin zu ergeben, wonach, wie in Tabelle 4 dargestellt ist, entweder "alpha G Rutin PS", ein enzymbehandeltes Rutin, das aus 77,5 Gewichts-% alpha-Monoglucosylrut in, 14,5 Gewichts-% Isoquercitrin, 5,2 Gewichts-% Sacchariden und 2,8 Gewichts-% Wasser bestand, vertrieben von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan oder L-Ascorbinsäure oder beides wurden gleichzeitig zugegeben, in geschlossenen Flaschen durch Hitze sterilisiert und dann der verbleibende Gehalt (%) von Gardeniagelb an abwechselnden Tagen bei einer Wellenlänge von 442 nm unter Verwendung einer Spektrometrie bestimmt, während mit einer Fluoreszenzlampe (7000 Lux) bestrahlt wurde.
  • Die Testbedingungen und Ergebnisse sind in Tabellen 4 bzw. 5 dargestellt.
  • Als Kontrolle wurde ein zusätzlicher Lauf ohne Zusätze bereitgestellt, wie in Tabellen 4 und 5 dargestellt ist.
  • Darüber hinaus wurden "Testlauf 10" und "Testlauf 11" mit enzymbehandeltem Rutin bzw. L-Ascorbinsäure bereitgestellt, wie in Tabellen 4 und 5 dargestellt ist. Tabelle 4-1 (Testbedingung/Einheit: Gew.-%) Tabelle 4-2 (Testbedingung/Einheit: Gew.-%)
  • Anmerkung: Test Nr. 9: Leerwert (Kontrollplot). Tabelle 5-1 (Ergebnis/Wert zeigt Überlebensrate in % von Gardeniagelb-Farbstoff an) Tabelle 5-2 Ergebnis/Wert zeigt Überlebensrate in % von Gardeniagelb-Farbstoff an)
  • Anmerkung: Test Nr. 9: Leerwert (Kontrollplot).
  • Jeder Testlauf zeigte allgemein einen verbesserten übrigen Gehalt (%) für Gardeniagelb im Vergleich zu dem in der Kontrolle. Ein Vergleich von Testlauf 5 mit Testlauf 1, wobei enzymbehandeltes Hesperidin in verschiedenen Mengen verwendet wurde, aber weder enzymbehandeltes Rutin noch L- Ascorbinsäure zugegeben war, bestätigte, daß der verbleibende Gehalt um 12% verbessert war, wie an dem vierten Tag bestimmt wurde, wenn die Zugabe von enzymbehandelten Hesperidin zu der Lösung von 0,02 auf 0,04 Gewichtsprozent erhöht wurde.
  • Eine synergistische Wirkung wurde bestätigt, wenn enzymbehandeltes Hespirdin zusammen mit enzymbehandeltem Rutin und/oder L-Ascorbinsäure verwendet wurde.
    • Beispiel 5
  • Dreihundert Gramm eines Mandarinensafts (Citrus unshiu), 95 g granulierte Saccharose, 0,12 g Zitronensäure in der Form von Zitronensäuremonohydrat und 1,0 ml Aromastoff wurden in Wasser gemischt, um 1.000 g Zitrusgetränk (Getränk auf Basis von Fruchtsaft) zu erhalten. Aliquote des Getränks von 100 ml wurden mit Lösung A aus Beispiel 1 in einer Menge von 4 mg (0,004 Gewichts-%), 8 mg (0,008 Gewichts-%) oder 12 mg (0,012 Gewichts-%) auf Basis des trockenen Feststoffs versetzt, so daß jeweils die Testläufe 1 bis 3 erhalten wurden. Testläufe 4 bis 5 wurden ebenso wie vorstehend bereitgestellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Lösung A Lösung B aus Beispiel 1 in einer Menge von 4 mg (0,004 Gewichts-%), 8 mg (0,008 Gewichts-%) oder 12 mg (0,012 Gewichts-%) verwendet wurde. Darüber hinaus wurde ein Lauf ohne enzymbehandeltes Hesperidin als Kontrolle bereitgestellt. Jeder Lauf wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, während makroskopisch auf Trübung geprüft wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Ergebnisse der visuellen Untersuchung
    • Trübung:
  • -: Klar,
  • ±: Leicht trüb,
  • +: Trüb auf geringem Niveau,
  • ++: Trüb auf geringen aber erhöhtem Niveau, und
  • +++: Stark trüb (Ausfällung in großem Umfang).

Claims (10)

1. Enzymbehandeltes Hesperidin, das alpha-Glucosylhesperidin, Hesperidin und beta-Monoglucosylhesperetin aufweist, wobei der Hesperidingehalt 0,1 Gewichtsteile oder weniger und der beta-Monoglucosylhesperetin-Gehalt 0,1 bis 0,5 Gewichtsteile beträgt auf der Basis von 1 Gewichtsteil alpha- Glucosylhesperidin.
2. Enzymbehandeltes Hesperidin nach Anspruch 1, das 0,15 bis 0,4 Gewichtsteile beta-Monoglocusylhesperetin enthält auf der Basis von 1 Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
3. Verfahren zur Herstellung von enzymbehandeltem Hesperidin nach Anspruch 1, das das Behandeln einer Lösung, die alpha-Glucosylhesperidin und intaktes Hesperidin enthält, mit alpha-L-Rhamnosidase umfaßt, um das intakte Hesperidin zu beta-Monoglucosylhesperetin umzusetzen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lösung durch Behandeln einer Lösung, die Hesperidin und eine alpha- Glucosylsaccharid-Verbindung enthält, mit einem Saccharid übertragendem Enzym erhältlich ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die alpha-L- Rhamnosidase Hesperidinase ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das enzymbehandelte Hesperidin 0,1 Gewichtsteile oder weniger Hesperidin und 0,1 bis 0,5 Gewichtsteile beta-Monoglucosylhesperetin enthält auf der Basis von 1 Gewichtsteil alpha-Glucosylhesperidin.
7. Verfahren zur Verhinderung bzw. Vorbeugung einer Trübung bei Dosen-Mandarinen, daß das Zufügen einer wirksamen Menge von dem enzymbehandelten Hesperidin nach Anspruch 1 zu den Dosenmandarinen umfaßt.
8. Verfahren zur Verhinderung bzw. Vorbeugung einer Trübung bei Zitrusgetränken, daß das Zufügen einer wirksamen Menge von dem enzymbehandelten Hesperidin nach Anspruch 1 zu dem Zitrusgetränk umfaßt.
9. Verfahren zur Verhinderung bzw. Vorbeugung eines Verblassens von natürlichen Färbemitteln bzw. Farbstoffen, das das Zusammenbestehenlassen des enzymbehandelten Hesperidins nach Anspruch 1 mit natürlichen Färbemitteln bzw. Farbstoffen umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das enzymbehandelte Hesperidin zusammen mit enzymbehandeltem Rutin und/oder L- Ascorbinsäure verwendet wird.
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