DE60019506T2

DE60019506T2 - Laminaria Algenextrakt, Verfahren zur Herstellung und diese enthaltende kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60019506T2
Application number: DE60019506T
Authority: DE
Inventors: Nicole Mekideche
Original assignee: SECMA BIOTECHNOLOGIES MARINES
Current assignee: BiotechMarine SAS
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: ES2241561T3; EP1074262A1; JP4632494B2; EP1074262B1; FR2797187A1; DE60019506D1; JP2001048776A; FR2797187B1; ATE293452T1

Description

Die Erfindung betrifft einen an Betainen angereicherten Algenextrakt, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Wirkstoff in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Die Hersteller von kosmetischen Produkten sind ständig bemüht, Zusammensetzungen vorzuschlagen, die den Schutz der Haut, hauptsächlich gegen Angriffe durch das umgebende Medium, die insbesondere auf Schadstoffe zurückzuführen sind, gegen Temperaturschwankungen, gegen Feuchtigkeitsschwankungen und, unter ganz speziellen Umständen, gegen einen längeren Kontakt mit Meerwasser und gegen die Einwirkung der Sonne gewährleisten.
Es wurden bereits verschiedene Wirkstoffe untersucht, vorzugsweise aus natürlichen pflanzlichen oder tierischen Quellen. In der Natur sind nämlich mehrere Moleküle zu finden, die an der Verteidigung der Zellen gegen verschiedene Stresszustände beteiligt sind. Unter diesen sind die Betaine bekannt für ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und insbesondere beim Schutz des intrazellulären Mediums gegen osmotischen Druck (vgl. insbesondere Petronini et al., "Biochem. J." 282, 1992, 69 – 73, und Sutherland et al., "J. Bacteriol." 168, 1986, 805 – 814).
Diese Moleküle sind zu finden sowohl im Tierreich als auch im Pflanzenreich oder in Bakterien und im Plankton.
Sie sind sehr häufig in Algen, die osmotischen Druckschwankungen ausgesetzt sind, insbesondere in Algen, die abwechselnd dem Kontakt mit Wellen und der Emersion (einer Schleifwirkung) ausgesetzt sind.
Die Anmelderin hat daher das häufige Auftreten von Braunalgen aus der Familie der Pheophyceae an den Küsten der Bretagne dazu ausgenutzt, darin po tentiell interessante Moleküle, insbesondere für die kosmetische Industrie interessante Moleküle, zu suchen.
Sie hat sich insbesondere der Herstellung von Extrakten der Alge aus der Familie der Laminaria ochroleuca und der Anreicherung der genannten Extrakte an Substanzen aus der Familie der Betaine durch ein leicht in industriellem Maßstab durchzuführendes Verfahren gewidmet.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst:

a) das Ernten von frischen Algen,
b) das Waschen der Algen,
c) das Zerkleinern und Feinstmahlen derselben,
d) das Eliminieren von Zellbruchstücken durch Zentrifugieren,
e) das Fraktionieren durch Ausfällung mittels Säure, vorzugsweise HCl, und die Adsorption an Aktivkohle und
f) das kontrollierte Filtrieren durch Zudosierung des Glycinbetains bei der HPLC-Chromatographie (Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie), das beendet wird, wenn das Filtrat eine Glycinbetain-Konzentration von 12,5 % erreicht hat. Bei der genannten Filtration handelt es sich vorzugsweise um eine Tangential-Filtration mit einem Fraktionier- bzw. Ausschluss-Schwellenwert von 1 000 D.

Der dabei erhaltene Extrakt, der in Bezug auf seinen Gehalt an Glycinbetain standardisiert ist, der mindestens 10 % beträgt, wird nachstehend als Laminain bezeichnet wegen der Quelle für das Ausgangsmaterial, die Laminarien.
Außer den bekannten Eigenschaften der Betaine als Osmoseschutzmittel (Osmoprotektor) hat die Anmelderin einen Antiradikal-Effekt und einen Stimulator-Effekt auf die Neosynthese von Bestandteilen der Zellmembranen und der extrazellulären Matrix (Proteoglycane und Glycosaminoglycane) nachgewiesen und sie hat diese nicht erwarteten Eigenschaften dazu genutzt, die Verwendung eines Algenextrakts gemäß der Erfindung als Wirkstoff insbesondere in Zusammensetzungen für die Verwendung in der Kosmetik vorzuschlagen.
Die Gesamtheit der Eigenschaften des Algenextrakts, die von der Anmelderin nachgewiesen worden sind und die aus den nachfolgenden Beispielen hervorgehen, erlauben nämlich die Verwendung dieses Extrakts insbesondere zur Verbesserung des Zustandes der Haut und ihrer Beständigkeit (Resistenz) gegenüber verschiedenen Stress-Zuständen, welche die Freisetzung von freien Radikalen hervorrufen und/oder die Regeneration der Haut verlangsamen und dadurch die Alterung beschleunigen.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung des weiter oben beschriebenen Algenextrakts in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere als Osmoprotektor-Wirkstoff, Antiradikal-Wirkstoff und als Wirkstoff gegen eine Alterung der Haut.
Dieser Wirkstoff kann in jede kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung vom Creme-, Gel-, Emulsions- und Milch-Typ eingearbeitet werden.
Die Erfindung betrifft somit auch die genannten kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die 1 bis 40 % des weiter oben beschriebenen Algenextrakts enthalten.
Der gleiche Wirkstoff kann auch aus anderen Pflanzen durch ein Extraktionsverfahren hergestellt werden, das ähnlich ist dem hier beschriebenen Verfahren. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung des genannten Wirkstoffes, der aus einer beliebigen Pflanze, die ihn enthält, extrahiert worden ist, als Antiradikal-Wirkstoff und/oder als Wirkstoff zur Behandlung der Alterung der Haut.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
Beispiel 1: Extraktionsverfahren
Algen aus der Familie Laminaria ochroleuca werden zwischen Mai und September an den Nordküsten der Bretagne geerntet.
Die geernteten Algen werden in einem Behälter in Meerwasser transportiert. Sie werden ab ihrer Ankunft an der Produktionsstelle behandelt.
Die Algen werden zweimal mit entmineralisiertem Wasser, dann mit Wasser gewaschen, dem eine sterilisierende Lösung zugesetzt worden ist.
Sie werden in einer Lamellen(Messer)-Mühle vom Urschell^®-Typ zerkleinert und zu Teilchen mit einer Größe zwischen 100 und 200 μm weiter zerkleinert.
Das Mahlgut wird in mit 50 % Glycol versetztem entmineralisiertem Wasser suspendiert in einer Menge von 430 g Mahlgut in 1 l Lösung.
Mit Hilfe eines Lamellen(Messer)-Homogenisators vom Ultra Turax^®-Typ wird bei Umgebungstemperatur 3 h lang eine Feinstmahlung durchgeführt, die dazu bestimmt ist, den Zelleninhalt freizusetzen.
Das Mahlgut wird 45 min lang bei 16 000 g zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu eliminieren. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und unter Vakuum auf ein Drittel des Anfangsvolumens eingeengt.
Anschließend wird es auf das 20-fache mit destilliertem Wasser verdünnt, dann wird 35 %ige HCl zugegeben, um seinen pH-Wert auf 1,0 zu bringen, es werden 4 % Aktivkohle zugegeben und es wird 30 min lang mit einem Magnetrührer gerührt.
Die Zugabe der Säure erlaubt die Ausfällung von zahlreichen unerwünschten Substanzen (insbesondere von Proteinen) und die zugegebene Aktivkohle adsorbiert verschiedene organische Substanzen (vom Phenol-Typ...).
Die überstehende Flüssigkeit wird anschließend an Betainen angereichert durch eine Tangential-Filtration mit einem Fraktionier(Ausschluss)-Schwellenwert von 1 000 D. Das klare Filtrat wird abgetrennt und durch HPLC-Chromatographie mit einem UV-Detektor nach der Methode von Zamarreno ("J. Agricultural and Food Chemistry", 45,3; 774 – 776) analysiert.
Als Standard verwendet man gereinigtes Glycinbetain (von der Firma Sigma), gelöst in destilliertem Wasser in einer Menge von 0,2 Gew.-%, 0,4 Gew.-%, 0,8 Gew.-% und 2 Gew.-%, verdünnt auf das 20-fache, um eine Eichkurve zu erstellen.
Die Algenextrakt-Probe wird durch Vergleich der Fläche des Chromatographie-Peaks mit der Standardkurve bestimmt.
Das Anreicherungsverfahren wird beendet, wenn die Glycinbetain-Konzentration 12,5 % ± 2,5 % erreicht hat. Der so erhaltene Extrakt wird in den nachfolgenden Beispielen als "Laminain" bezeichnet.
Beispiel 2: Nachweis eines Antiradikal-Effekts
Der Nachweis eines Antiradikal-Effekts des Laminains wurde erhalten durch Bestimmung des Malondialdehyds in Fibroblasten von menschlicher Haut, die unter Anwendung einer Haut-Biopsie kultiviert wurden. Die Tests wurden durchgeführt mit Kulturen zwischen der zweiten und der vierten Passage.
Bestimmung des Malondialdehyds (MDA): Lipoperoxydations-Index
Die Fibroblasten wurden auf Tüpfelplatten (24 Vertiefungen) in einer Menge von 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 1 ml Kulturmedium RPMI 1640, ergänzt durch 10 fötales Kalbsserum, 10 mM L-Glutamin und 80 μg/ml Gentamycin, verteilt. Anschließend wurden sie 24 h lang in einen Trockenschrank mit CO₂-Atmosphäre gestellt.
Das Laminain wurde in verschiedenen Konzentrationen (rein, 1/2, 1/5 und 1/10) auf Tüpfelplatten in einer Menge von 3 Vertiefungen pro Dosis verteilt. Parallel dazu wurden verschiedene Kontrollen durchgeführt:

– 3 Vertiefungen erhielten nur das Lösungsmittel;
– 3 Vertiefungen erhielten SOD (Superoxiddismustase) und Catalase (negatives Vergleichsmaterial);
– 3 Vertiefungen erhielten den Xanthin-Hypoxanthin-Komplex (Wirksamkeitskontrolle für die Schutz-Enzyme (SOD + Catalase);
– 12 Vertiefungen erhielten die 4 Laminain-Verdünnungen zusätzlich zu dem Xanthin-Hypoxanthin-Komplex;
– 12 Vertiefungen erhielten die 4 Laminain-Verdünnungen.

Extraktion des Malondialdehyds
Nach dem Trypsinieren und Zentrifugieren der Zellen wurden die Zentrifugen-Zellrückstände wieder suspendiert in:

– 250 μl 50 mM Tris-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl;
– 20 mM EDTA;
– 25 μl 7 %igem SDS;
– 300 μl HCl (0,1 N);
– 38 μl 1 %ige Phosphorwolframsäure in Wasser;
– 300 μl 0,67 %ige Thiobarbitursäure in Wasser.

Nach 1-stündiger Inkubation im Dunkeln bei 50 °C und dem Abkühlen im Eiswasser wurden 300 μl n-Butanol jedem Reagensglas zugesetzt. Diese Reagensgläser wurden bei 0 °C 10 min lang bei 10 000 g zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde für die Bestimmung des MDA abgetrennt.
Bestimmung des Malondialdehyds
Der MDA wurde bestimmt durch Messung der Fluoreszenz nach der Abtrennung des MDA-TBA-Komplexes mittels HPLC:

– Bischoff-Pumpe, Modell 2.200
– automatischer Alcott-Injektor, Modell Autosampler
– Ultrasep-Kolonne C18 (30 cm × 0,18 cm) mit einer Porosität von 6 μm
– Fluoreszenzdetektor Jasco 821-F1

Der Nachweis der Fluoreszenz wurde durchgeführt mit einer Erregungswellenlänge von 515 nm und einer Emissionswellenlänge von 553 nm. Das verwendete Eluierungsmittel bestand aus Methanol/V1lasser (Volumenverhältnis 40 : 60), dessen pH-Wert mit 1 M KOH auf 8,3 eingestellt wurde.
Die quantitative Bestimmung wurde durchgeführt im Vergleich zu Standards, die wie die Proben behandelt worden waren (0,125 μM; 0,25 μM; 0,5 μM; 1 μM) mit Hilfe eines ICS-Rechenprogramms (Peak 3) (Instrumentierung, Consommable Service)).
Bestimmung der Proteine
Die Bestimmung der Proteine wurde durchgeführt nach der BRADFORD-Methode. Die Zunahme der Extinktion bei 595 nm ist proportional zur Konzentration der mit Hilfe eines UNICAM 8625 Spektrofotometers bestimmten Proteine.
Ergebnisse Bestimmung des Malondialdehyds (MDA) in dem Zellhomogenat
1. physiologische Lipoperoxidation
Man stellt eine signifikante Schutzwirkung gegen physiologische Lipoperoxidation in Gegenwart von Laminain fest, vor allem bei den Verdünnungen 1/5 und 1/10.
2. künstlich hervorgerufene Lipoperoxidation
Für diese Bestimmung wurden nur die 1/5- und 1/10-Verdünnungen verwendet wegen der nicht signifikanten Verminderung des physiologischen MDA mit dem reinen Laminain und dem im Verhältnis 1/2 verdünnten Laminain.
Man stellt eine beträchtliche Schutzwirkung durch das Laminain gegen eine durch das Xanthin/Hypoxanthin-System durch Bildung von freien Radikalen künstlich hervorgerufene Lipoperoxidation bei den 1/5- und 1/10-Verdünnungen fest, die mindestens gleich derjenigen ist, die durch die bekannten Schutzenzyme SOD-Catalase erzielt wird.
Unter den angewendeten experimentellen Bedingungen weist das Laminain somit eine signifikante Antiradikal-Aktivität gegenüber Human-Fibroblasten in einer Kultur nach 24-stündigem Kontakt damit auf.
Beispiel 3 – Nachweis einer Stimulierung der Synthese von Proteoglycanen und Glycosaminoglycanen durch kultivierte Fibroblasten
Fibroblasten, die nach einer Biopsie aus Human-Haut kultiviert und durch 2 bis 4 Passagen vervielfältigt worden waren, wurden auf 25 cm² großen Platten in einer Menge von 10⁵/ml in 10 ml Kulturmedium RPMI 1640, ergänzt durch 10 fötales Kalsserum, 10 mM L-Glutamin und 80 μg/ml Gentamycin, verteilt. Anschließend wurden sie 24 h lang in einem Trockenschrank mit CO₂-Atmosphäre aufbewahrt.
Das Laminain wird in verschiedenen Konzentrationen (Verdünnung 1/2, 1/5 und 1 /10) auf die Platten in einer Menge von drei Platten pro Dosis verteilt. Parallel dazu erhielten drei Platten nur Wasser und dienten als Vergleichsmaterial.
Zur Untersuchung der Fähigkeit der Zellen, die vorher mit Laminain behandelt worden waren, zur Aufnahme (Einarbeitung) des radioaktiven Vorläufers wurde das Impulsverfahren angewendet. Der radioaktive Vorläufer ([3H]-Glucosamin) wird 18 h vor der Abtrennung der Zellen den Kulturen zugesetzt. Die Dauer des Kontakts der Zellen mit dem Produkt betrug 24 h bei 37 °C.
Nach dem Eliminieren des Mediums durch Absaugen wurden die Zellen zweimal mit dem Medium ohne Serum gewaschen, um die nicht aufgenommene (eingearbeitete) Radioaktivität zu eliminieren, dann wurden sie von dem Träger durch Abkratzen der Oberfläche der Kultur abgelöst. Die Zellen wurden erneut mit dem Medium gewaschen, dann 5 min lang bei 600 g zentrifugiert. Mit diesem Zellrückstand führt man durch:

– die Bestimmung der Proteoglycane durch FPLC (schnelle Protein-Flüssigchromatographie)
– die Neosynthese der gesamten Glycosaminoglycane (GAGs)
– die Bestimmung der gesamten Proteine
– die Charakterisierung der Glycosaminoglycane durch selektive Digerierung.

1. Extraktion
Membran-Proteoglycane
Eine erste Fraktion des Zentrifugenrückstands wird in 1 M NaCl, das Desoxyribonuclease (50 U/ml) und Protease-Inhibitoren enthält, wieder suspendiert. Das Homogenat wird anschließend 2 h lang bei 4 °C inkubiert. Eine 30-minütige Zentrifugierung bei 12 000 g erlaubt die Gewinnung des ersten Homogenats, das die Perimembran-Proteoglycane enthält. Der Zentrifugenrückstand dient dazu, die Proteoglycane aus den beiden anderen Behältern (C1) zu extrahierten.
Transmembran-Proteoglycane
Der in der ersten Extraktionsstufe erhaltene Rückstand C1 wird in 0,1 %igem Natriumazid, das 4 % Natriumdesoxycholat enthält, durch Ultraschallbehandlung bei 75 mv 20 s lang wieder suspendiert und dann 2 h lang bei 4 °C inkubiert. Ein 30-minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g erlaubt die Gewinnung der zweiten überstehenden Flüssigkeit, welche die Transmembran-Proteoglycane enthält. Der Zentrifugenrückstand dient dazu, die Proteoglycane des Matrix-Anteils (C₂) zu extrahieren.
Matrix-Proteoglycane
Der Zentrifugenrückstand C₂ wurde dreimal mit 0,1 %igem Natriumazid gewaschen, dann unter Rühren in einem 50 mM Natriumacetat-Puffer, der 4 M Guanidin-HCl und 0,1% Triton X-100 sowie Proteasen-Inhibitoren enthielt, wieder suspendiert.
Ein 30-minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g erlaubte die Gewinnung der dritten überstehenden Flüssigkeit, welche die Matrix-Proteoglycane enthielt.
2. Reinigung durch FPLC
Vor der Reinigung durch FPLC wurde jede der drei überstehenden Flüssigkeiten eine Nacht lang bei 4 °C in 3 Volumenteilen absolutem Ethanol präzipitiert, dann 30 min lang bei 12 000 g zentrifugiert. Die erhaltenen Rückstände wurden in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer von pH 7,4 wieder suspendiert.
Für die drei Proben wurde das gleiche Analysenprotokoll durchgeführt.
Es wurde die Anionenaustauschchromatographie angewendet. Sie ist nämlich begünstigt durch die große Dichte von negativen Ladungen, die bei den Proteoglycanen vorliegt aufgrund ihrer Glycosaminoglycan-Ketten.
Jeder Rückstand wurde in 250 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer von pH 7,4 wieder suspendiert. Das Gel Sepharose^® CL-6B-DEAE (von der Firma Pharmacia) wurde in eine Kolonne K 10/40 (von der Firma Pharmacia) eingefüllt. Dieses Anionenaustauschergel weist eine große Auflösung auf und ergibt eine gute Ausbeute. Es wurden jeweils 100 μl jeder Probe injiziert, nach der Elution folgte der Nachweis mit einem Spektrofluorometer bei einer Wellenlänge von 280 nm.
Der Peak, der die Proteoglycane enthält, wird mit 1 M NaCl eluiert.
3. Bestimmung (Dosierung)
Die Bestimmung der Radioaktivität erfolgt am Ende der HPLC unter Verwendung eines Packard-Counters (Flo-one).
4. Identifizierung durch selektiven Abbau
Zur Bestimmung der Art der in den Fraktionen vorhandenen GAGs wurden verschiedene Abbaureaktionen durchgeführt.
Digerierung durch Chondroitinase AC
Die Chondroitinase AC depolymerisiert die Glucuronsäuren, wobei auf diese Weise das Chondrotinsulfat abgebaut wird.
Ein aliquoter Anteil des Lyophilisat der GAGs wurde zusammen mit Chondroitinase AC (0,2 U/ml) in einem Tris-HCl-Puffer, pH 8, 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Einführen bei –20 °C abgestoppt.
Digerierung durch Chondroitinase ABC
Die Chondroitinase ABC depolymerisiert die Glucuron- und Iduronsäuren, wo bei auf diese Weise das Chondroitinsulfat und das Dermatansulfat abgebaut werden.
Ein zweiter aliquoter Anteil des Lyophilisats der GAGs wurde zusammen mit der Chondroitinase ABC (0,5 U/ml) in den gleichen Tris-HCl-Puffer, pH 8, 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde bei –20 °C abgestoppt.
Digerierung mit Salpetersäure
Die Salpetersäurelösung wurde hergestellt durch Mischen von Natriumnitrat (0,148 M) mit Essigsäure (3,6 M).
Die Salpetersäure öffnet (zerschneidet) die Glucosid-Bindungen der Glucosamin-Bindungen, die eine Aminosulfonat-Gruppe in der 2-Position aufweisen; sie ist tatsächlich spezifisch für Heparin und für Heparansulfat.
Die Reaktion wird 80 min lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt; sie wird abgestoppt durch Zugabe von 1 M Ammoniumsulfonat. Das Hydrolysat wird zur Trockne eingedampft, dann in 50 mM Tris-HCl aufgenommen zur Durchführung der Analyse.
Trennung der GAGs auf dem Gel CL.6B (der Firma Pharmacia)
Dieses Gel ist geeignet zur Untersuchung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht. Es wird mit einem 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, äquilibriert, dann in eine Kolonne K 10/40 (der Firma Pharmacia) eingefüllt. Das Eluieren wird mit dem gleichen Puffer durchgeführt, der 0,35 M NaCl enthält. Es werden 1 ml-Fraktionen gewonnen, die nach der Zugabe von 5 ml Szintillationsflüssigkeit ausgezählt werden.
Ergebnisse der Bestimmung der Radioaktivität: Effekt auf die Neosynthese der Proteoglycane
– Perimembran-Proteoglycane
– Membran-Proteoglycane
– Matrix-Proteoglycane
Man stellt somit eine signifikante Stimulation der Neosynthese von Proteoglycanen in Gegenwart des Laminains fest.
Ergebnisse der Charakterisierung der durch Neosynthese hergestellten Glycosaminoglycane
– Neosynthese von Dermatan und Heparansulfat (DS und HS).
– Neosynthese von Dermatan und Chondroitinsulfat (DS und CS)
– Neosynthese von Heparansulfat (HS)
Daraus ergibt sich, dass das im Vwrhältnis 1/5 und 1/10 verdünnte Laminain eine signifikante Aktivität auf die Neosynthese der Matrix-Bestandteile der kultivierten Human-Fibroblasten aufweist.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen nämlich eine signifikante Stimulierung der Neosynthese der Membran-Proteoglycane (67 %), der Perimembran-Proteoglycane (etwa 34 %) und der Matrix-Proteoglycane (25 % bei einer Verdünnung im Verhältnis 1/5).
Parallel dazu zeigen die Bestimmungen der Paare DS/HS, DS/CS und HS eine Stimulierung der Bildung von Heparansulfat (30 % bei einer Verdünnung im Verhältnis 1/10), das vor allem im Bereich der Zellmembran vorhanden ist. Die Anwesenheit der PGs im zellulären Bereich hat einen bedeutenden Einfluss auf den Stoffwechsel sowohl der Zellen als auch der extrazellulären Matrix. Diese PGs können aufgrund ihrer Lokalisierung verschiedene Typen von Wechselwirkungen zwischen Zelle und Ligand, Zelle und Zelle, Zelle und Matrix hervorrufen.
Beispiel 4 – Nachweis einer Stimulierung der Collagensynthese durch kultivierte Fibroblasten
Die Fibroblasten werden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 kultiviert.
Vorinkubation der Zellen
Ziel der Vorinkubation ist es, die Zellen in der G1-Phase oder G0-Phase des Zellzyklus zu synchronisieren durch Verlangsamung ihrer Aktivität durch Verminderung der Serumfaktoren. Nachdem das Stadium der Konfluenz erreicht worden ist, wird das Medium eliminiert und durch das Medium RPMI ersetzt, dem 0,5 % SVF zugesetzt worden sind. Die Vorinkubation läuft 24 h lang ab.
Inkubation der Zellen
Nachdem die Vorinkubation beendet ist, wird das Medium eliminiert und die Zellenschicht wird mit dem Medium RPMI ohne SVF gespült, um jede Spur von Serumbestandteilen zu eliminieren. Die Inkubationen werden mit einem Kulturmedium durchgeführt, dem entweder Vitamin C in einer Konzentration von 0,28 mmol/l oder das Laminain bei unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt worden ist.
Die verwendete Vitamin C-Konzentration ist optimal für die Aktivierung von Hydroxylierungsenzymen sowie für die Sekretion von Collagen. Außerdem gibt man β-Aminopropionitril in einer Konzentration von 0,2 mmol/l zu, um die Ablagerung des neu gebildeten Collagens in Form von Fibrillen in dem Kulturmedium zu verhindern, indem man das Lysyloxidase-Enzym hemmt (inhibiert).
Am Ende der Inkubation (nach 24 h) wird das Kulturmedium abgetrennt und die Zellenschicht wird gespült.
Bestimmung von Hydroxyprolin durch HPLC
– Prinzip des Verfahrens
Die Aminosäuren werden derivatisiert durch Ophtaldehydsäure (OPA), wobei man auf diese Weise ihre Interferenz eliminiert. Danach werden das Hydroxyprolin und das Prolin durch NBD-Cl derivatisiert durch Kuppeln der Aminogruppen an NBD-Cl. Das NBD-Hyp wird abgetrennt und durch HPLC in inverser Phase identifiziert. Zur Durchführung der Abtrennung der Aminosäure-Derivate wird zunächst eine Kupplung eines Hydroxyprolin enthaltenden Standards an NBD-Cl durchgeführt.
– Materialien
Das Hydroxyprolin wird bestimmt durch Messung der Fluoreszenz nach der Abtrennung des Hydroxyprolins durch HPLC in inverser Phase:

– Bischoff-Pumpe, Modell 2.200 automatischer Alcott-Injektor, Modell 788 Autosampler
– Kolonne Ultrasep C18 (30 cm × 0,18 cm) mit einer Porosität von 6 μm
– Fluoreszenz-Detektor, Jasco 821-FI
– chromatographische Bedingungen: die mobile Phase besteht aus einer Mischung von Acetonitril und 0,1 mol/l Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2 (Mischungsverhältnis 9 : 91 Volumenteile/Volumenteile), die Durchflussmenge wird auf 1 ml/min eingestellt, das Eluieren wird im statischen Modus durchgeführt und der Zyklus beträgt 10 min. Die mobile Phase wird vorher filtriert und dann vor der Verwendung entgast.

– Herstellung der Reagentien

NBD-Cl = 25 mmol wird in Methanol gelöst
OPA = 150 mmol/l in Methanol
Puffer = 0,4 mmol/l, der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt wässrige Hydroxyprolin-Lösung (50 mg/l), dann verdünnt zur Herstellung von Konzentrationen in dem Bereich von 0,5 bis 40 mg/l.

– Eichungsbereich
10 μl Eichlösung mit unterschiedlichen Konzentrationen werden mit 10 μl Puffer (pH 9) gemischt. Nach der Zugabe von 5 μl OPA und nach dem Rühren lässt man die Reagensgläser 5 min lang bei Umgebungstemperatur stehen, dann gibt man 10 μl der NBD-Cl-Lösung zu. Das Derivat entsteht bei 60 °C innerhalb von 3 min in Abwesenheit von Licht. Die Reagensgläser werden anschließend in Eis gestellt. Die erhaltene Färbung ist orangefarben und mindestens 3 h lang in Abwesenheit von Licht stabil. 50 μl dieser Mischung werden anschließend injiziert. Die Eichkurve ist linear.
Die Proben des Kulturmediums werden auf die gleiche Weise behandelt und der Versuch wird dreimal wiederholt.
• Ergebnisse
Die Abtrennung und Identifizierung von Hydroxyprolin werden durchgeführt durch HPLC in inverser Phase. Die Fluoreszenz-Peaks nach der Integration erlauben die Berechnung der Hydroxyprolin-Konzentration in dem Kulturmedium.
Man stellt fest, dass das im Verhältnis 1/5 und 1/10 verdünnte Laminain auf Human-Fibroblasten im Konfluenz-Zustand eine erhöhte Neosynthese von Collagen induziert, die viel stärker ist als diejenige, die durch Vitamin C induziert wird (43 %), das in einer optimalen Konzentration für die Collagen-Synthese und für die Aktivierung der Hydroxylierungsenzyme verwendet wird.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines an Betainen angereicherten Algenextrakts durch Eliminierung von Zellbruchstücken, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: a) das Ernten von Algen aus der Familie der Pheophyceae, b) das Waschen der Algen, c) das Zerkleinern und Feinstmahlen derselben, d) das Eliminieren von Zellbruchstücken durch Zentrifugieren, e) das Fraktionieren durch Ausfällung mittels Säure und durch Adsorption an Aktivkohle und f) das kontrollierte Filtrieren durch Zudosierung des Glycinbetains bei der HPLC-Chromatographie.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem es sich bei den Algen um solche aus der Familie Laminaria ochroleuca handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die Säure HCl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Filtration eine Tangential-Filtration mit einem Fraktionier-Schwellenwert von 1000 D ist.
Algenextrakt, der an Betainen angereichert ist, wie er nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist.
Algenextrakt nach Anspruch 5, der mindestens 10 % Glycinbetain enthält.
Algenextrakt nach einem der Ansprüche 5 und 6 für die therapeutische Verwendung.
Verwendung des Algenextrakts nach einem der Ansprüche 5 und 6 als Wirkstoff in Zusammensetzungen für die kosmetische Verwendung wegen minde stens einer der folgenden Wirkungen: Osmoschutzwirkung, Antiradikal-Wirkung und Wirkung gegen Hautalterung.
Kosmetische Zusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung vom Creme-, Gel-, Emulsions- und Milch-Typ, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1 bis 40 % Algenextrakt nach einem der Ansprüche 5 und 6 enthält.