ES2441469B2

ES2441469B2 - Extracto antioxidante a partir de macroalgas pardas y procedimiento de obtención

Info

Publication number: ES2441469B2
Application number: ES201330523A
Authority: ES
Inventors: Jorge Sineiro Torres; Marivel S�NCHEZ GUERRERO; Mar�a Jos� N��EZ GARC�A
Original assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Current assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2014-07-04
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: ES2441469A1; KR20150140382A; EP2997963A4; CN105377232A; JP2016522171A; EP2997963A1; WO2014167162A1; US20160074317A1

Abstract

Se presenta un procedimiento de obtención de extractos antioxidantes a partir de macroalgas empleando extracción acuosa en continuo y asistida por ultrasonidos. El proceso se puede realizar sobre alga fresca o sobre alga seca, tras una resuspensi�n en agua. Se prepara una suspensión de alga en agua con una concentración de sólidos entre un 10 y un 30%. La mezcla se alimenta a un sistema de ruptura ultrasónica. El extracto es filtrado y liofilizado, obteniéndose concentraciones de polifenoles totales de 62.4 mg eq. de floroglucinol/ g de liofilizado con Bifurcaria bifurcata y 44 mg eq. de floroglucinol/ g de liofilizado con Ascophyllum nodosum. El extracto se puede emplear como ingrediente en formulaciones cosm�ticas y alimentarias.

Description

Extracto antioxidante a partir de macroalgas pardas y procedimiento de obtención

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la extracción de compuestos a partir de macroalgas. Más concretamente la invención se refiere a la extracción de antioxidantes a partir de macroalgas pardas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los antioxidantes son metabolitos secundarios presentes en las macroalgas, plantas, y particularmente en las frutas. Son compuestos que inhiben o previenen la oxidación de un sustrato. En la industria alimentaria, farmacéutica y cosm�tica se emplean principalmente compuestos sintéticos antioxidantes como hidroxitolueno butilado (BHT), galato de propilo o butirohidroxianisol (BHA). Los antioxidantes naturales como los provenientes de extractos de uva, de romero, de cacao etc., est�n siendo mejor acogidos debido a su baja toxicidad y alta actividad antioxidante. Una gran familia de compuestos antioxidantes son los florotaninos presentes en macroalgas que muestran buena actividad antioxidante

Varios protocolos de extracción de florotaninos han sido propuestos, entre ellos se pueden citar particiones secuenciales líquido-líquido, utilizando principalmente solventes orgánicos como metanol, hexano, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo y butanol, además de purificaciones en columnas cromatogr�ficas, tales como Antioxidant Effects of Phlorotannins Isolated fromIshige okamurae in Free Radical Mediated Oxidative Systems, Yanping, Z., Zhong-Ji Q., Yong L., Moon-Moo K.,Sang-Hoon, L. & Se-Kwon K, J. Agric. Food Chem., 56, 7001-7009, 2008; Phenolic Compounds in the Brown Seaweed Ascophyllum nodosum: Distribution and Radical-scavenging Activities, Audibert, L., Fauchon,M., Blanc,N., Hauchard, D. & Ar Galla, E, Phytochemical analysi, 21, 399-405, 2010; Chemical components and its antioxidant properties in vitro: an edible marine brown alga Ecklonia cava, Li, Y., Qian, Z.J., Ryu, B., Lee, S.H., Kim, M.M. and Kim, S.K., Bioorg Med Chem 17, 19631973, 2009; Distribution and radical scavenging activity of phenols in Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae), Breton, F., C�rantola, S. & Ar Gall E., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 399, 167–172, 2011. Sin embargo estos procesos generan residuos no permitidos en alimentación y cosm�tica, tales como metanol o compuestos organohalogenados. Además, si se requiere una polaridad inferior a la del agua, las mezclas hidroalcoh�licas son una opción a los disolventes derivados del petróleo.

La utilización de acetona al 70% y acetato de etilo como disolventes fue reportada en Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of Sargassum ringgoldianum, Nakai, M., Kageyama, N., Nakahara, K. & Miki, W., Marine Biotechnology, 8, 409-414, 2006). Una primera fase de eliminación de material lip�dico con hexano y posterior extracción de florotaninos con acetona-agua al 70% fue utilizada en High-performance liquid chromatographic analysis of phlorotannins from the brown alga Fucus vesiculosus, Koivikko, R., Loponen, J., Pihlaja, K. and Jormalainen, V., Phytochem. Anal. 18, pp. 326-332, 2007. Se ha utilizado etanol puro y al 60% para la extracción de florotaninos en especies como Ascophyllum nodosum y Fucus vesiculosus, seguido de partición líquido-líquido con éter de petróleo o diclorometano (Evaluation of quantitative methods for the determination of polyphenols in algal extracts, Parys, R.,Rosenbaum, A., Kehraus, S., Reher, G., Glombitza, K-W and K�nig, G.M. . J. Nat. Prod., , 1865-1870, 2007.

DESCRIPCI�N DE LA INVENCIÓN

Los extractos obtenidos a partir del tratamiento de macroalgas pardas, como pueden ser Bifurcaria bifurcata y Ascophyllum nodosum, pueden emplearse para consumo alimentario, cosm�stico y/o farmacéutico por su contenido en fucoidanos y florotaninos. El alto contenido en fucoidanos provoca que estos extractos posean una capacidad humectante en la piel, mientras que el poder antioxidante viene dado por la presencia de florotaninos.

La obtención de un producto natural que no posea un fuerte aroma característico es deseable para su empleo como ingrediente cosmético para no interferir con otros deseados, lo cual se favorece con extracción acuosa y evitando usar disolventes orgánicos. Es otra característica deseable del proceso de extracción de extractos que los disolventes empleados sean baratos, renovables, de baja o nula toxicidad y que su manejo no sea peligroso. Los extractos crudos o fracciones aisladas presentan frecuentemente mayor actividad antioxidante que antioxidantes sintéticos como BHA (butirohidroxianisol) o BHT (butirohidroxitolueno).

El procedimiento objeto de la presente invención permite emplear agua para obtener un producto estable, fácil de manejar y adicionar a diferentes productos y libre de trazas de disolventes.

El método de extracción del antioxidante a partir de una macroalga parda comprende:

a) Si se emplea macroalga fresca, esta se somete a un lavado con agua corriente que elimina arenas y epifitas, y posteriormente se seca con papel absorbente. En el caso de que se emplee alga seca este proceso de limpieza con agua no es necesario.

b) A continuación se mezcla el alga seca o fresca con agua a una relación líquido/sólido (L/S) entre 3 y 5 g/g.

c) A continuación se sometela mezcla anterior a un proceso de triturado, preferiblemente en un molino de aspas, hasta reducir el tamaño de partícula entre 0.5 y 2 mm para macroalga seca y entre 0.5 y 3 mm para macroalga fresca.

d)Mezclar la macroalga triturada con un disolvente líquido que comprende etanol puro o mezclas etanol:agua en relación 1:1 v/v, en una relación Líquido/Sólido (L/S) de entre 5 y 15 (g/g) cuando se parte de macroalga fresca y de entre 50 y 150 (g/g) cuando se parte de macroalga secae) Someter la mezcla a un proceso de disrupci�n celular aplicando ultrasonidos en continuo.

f) El residuo sólido algal obtenido en la etapa anterior se separa por sedimentación y posterior centrifugaci�n o filtración.

g) Se elimina el etanol o el 50% del agua, en el caso de que sólo se hubiera empleado agua, a vacío sin superar la temperatura de 40 �C.

h) El extracto concentrado se liofiliza para obtener un extracto sólido.

El producto se almacena refrigerado a menos de 5 �C y se protege de la luz para evitar su alteración.

En otro aspecto, la invención se refiere a un extracto antioxidante estable obtenido a partir del procesado de macroalgas pardas, más concretamente de macroalgas algas de las especies Bifurcaria bifurcata, Ascophyllum nodosum, Saccorhiza polyschides y Sargassum muticum

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las modalidades detalladas en las figuras se ilustran a modo de ejemplo y no a modo de limitación:

La Figura 1 muestra el esquema para disrupci�n celular asistida por ultrasonido en un sistema de alimentación macroalgal en continuo.

La Figura 2 muestra la detección de florotaninos mediante HPLC en columna de fase reversa C18.

La Figura 3 muestra el perfil ultravioleta del extracto de Bifurcaria bifurcata, con un perfil característico de florotaninos y semejante al de floroglucinol.

EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN.

En una realización particular la invención se dirige a un extracto acuoso antioxidante obtenido a partir de macroalgas pardas caracterizado por a) un contenido de carbohidratos entre 33 y 156 mg de glucosa/g de liofilizado; b) un contenido en fucoidanos, expresados como sulfatos totales tras la digestión de la muestra, entre 44 y 118 mg de sulfatos/g de liofilizado; c) un contenido de florotaninos, expresados como floroglucinol, entre 12 y 62.4 mg equivalentes de floroglucinol/g de liofilizado; y d) un contenido en alginatos, entre 10 y 55 mg equivalentes de ácido glucur�nico/g de liofilizado.

En otro aspecto, la invención se dirige a una composición cosm�tica y/o alimentaria que comprende el extracto antioxidante objeto de la presente invención.

Se cita a modo de ejemplo y sin limitar el alcance de la protección un ejemplo de la aplicación del método de extracción de antioxidantes a partir de Bifucaria Bifurcata. La extracción se realiza en continuo y en condiciones de temperatura inferior a 40 �C para evitar reducción en el poder antioxidante o cantidad de los compuestos extraídos.

En la Figura 1 se muestra el esquema para disrupci�n celular asistida por ultrasonido en un sistema de alimentación macroalgal en continuo compuesto por una unidad de generación de ultrasonidos que incluye un sonotrodo (105) dispuesto en una celda de flujo continuo (104), que es alimentado mediante una bomba perist�ltica principal (102) y otra de recirculaci�n (103).

En una realización particular de la invención el proceso de extracción del compuesto acuoso antioxidante comprende las siguientes etapas:

a) Se lavaron 120 g de macroalga fresca con agua potable y posteriormente con agua destilada.

b) Se añadieron 300 mL de agua

c) Se pretriturar la macroalga, accionando una batidora de aspas durante 10 min obteniendo un tamaño de partícula inferior a 3 mm.

d) Se a�adi� agua a la preparación obtenida en el paso anterior hasta obtener una relación L/S de 10 y se introdujo en un tanque de alimentación (100) que se mezcla mediante un agitador (101). Se seleccion� una de las condiciones de extracción descritas en la Tabla 1, que resume un diseño experimental factorial 22 con 4 puntos centrales.

e) Las condiciones extracción ultrasónica en continuo consideraron los parámetros de potencia (como amplitud o porcentaje de la potencia nominal aplicada) y relaciones de recirculaci�n del caudal de entrada del caldo de alga a la celda de flujo continuo (celda de sonicado o ultrasónica) (104) en la que un sonotrodo (105) aplica ultrasonidos en continuo a la mezcla con una densidad de potencia en el rango entre 3 y 13 W/cm3. La Tabla 1 resume la combinación de tratamientos ejecutados para el diseño experimental. El montaje de extracción requiere de un sistema de extracción asistido con ultrasonido como el que se muestra en la Figura 1.

f) Se dej� sedimentar el residuo sólido sedimentable y se separ� del sobrenadante por decantación.

g) El siguiente paso consistió en centrifugar y separar nuevamente el sobrenadante. Este tiene un volumen de 1200 mL, el cual se redujo hasta 500 mL por evaporación a vacío a 30�C o a temperatura ambiente,

h) h) Se obtuvo un extracto liofilizado (106), que en esta realización particular comprende un volumen total de 1400 mL en el que y finalmente para obtener un extracto sólido y seco.

Amplitud: Ratio de recirculaci�n Potencia W/cm3 Tiempo de residencia en celda (s)

1
1: 13 9.2

1: -1 13 6.9

-1: 1 7.2 9.2

-1
-1: 7.2 6.9

0
0: 10.1 8.28

0
0: 10.1 8.28

0
0: 10.1 8.28

0
0: 10.1 8.28

Tabla 1.- Diseño experimental 22 y 4 puntos centrales. Códigos de ajuste de amplitud -1, 0 y 1corresponden a 5 amplitudes de 50%, 70% y 90%. Códigos de relación de recirculaci�n -1, 0 y +1 corresponden a 1, 1.5 y 2, siendo el caudal de recirculaci�n constante de 300 mL/min

El rendimiento de extracción en base húmeda a partir de macroalga fresca se encuentra dentro de un intervalo de 2.9 - 6.6 % (p/p); mientras que el rendimiento de extracción para alga seca se encuentra dentro del intervalo 10 27.7 y 57.3 % (p/p); los rendimientos para cada una de las especies de algas analizadas se recogen en la Tabla

2.

El máximo de absorbancia de este extracto liofilizado y posteriormente redisuelto en agua, frente a un blanco de agua se localiza entre 250 nm y 280 nm, tal y como se recoge en la Figura 3.

15 Contenido de polifenoles totales:

Se entiende por polifenoles toda una famila de compuestos presentes en los vegetales, que contiene o se derivan del grupo fenol: derivados del ácido benzoico, derivados de ácido cin�mico, flavonoides, etc.

Para determinar el contenido de polifenoles del extracto obtenido se emple� una ligera modificación del método propuesto en Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. Singleton &

20 Rossi,Singleton, V. L.; Rossi, J. J. Am. J. Enol. Vitic., 16, 144–158, 1965. As�, se usaron 500 μL de muestra disuelta en agua, a la cual se le añadieron 2,5 mL de reativo Folin-Ciocalteu y 2,0 mL de Na2CO3. La absorbancia se leyó a 765 nm, después de incubar las muestras durante 15 min a 45�C.

Especie: Rendimiento (%, p/p)b.s Rendimiento (%, p/p)b.h.

Ascophyllum nodosum: 38,0 6,6

Bifurcaria bifurcata: 27,7 4,8

Saccorhiza polyschides: 42,0 4,9

Sargassum muticum: 57,3 2,9

Tabla 2.- Rendimientos de extractos acuosos en base seca y húmeda. b.s: considerando secado de 24 h � 45�C

El ensayo de inhibición del radical DPPH propuesto en “Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”, Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C . LWT Food Sci Technol 28:5–30 18 (1995), se utilizó para 5 determinar la capacidad donante de protones por parte del extracto. El método se aplicó con una leve modificación tal y como se describe, en donde a 980 μL de una solución metan�lica del radical (6,9 �10-5 mol/L) se añadieron 20 μL de una solución acuosa del extracto. La disminución de la absorbancia se registr� a 515 nm después de 16 minutos. El porcentaje de inhibición del radical DPPH se calcul� frente al registro de un blanco. Intervalos de concentración entre 5 y 40 mg/mL de extractos de Ascophyllum nodosum y Bifurcaria bifurcata se

10 evaluaron para determinar la EC50, cuyos resultados fueron 23.73 � 3.83 mg extracto /mL y 17.68� 2.2 mg extracto/mL, respectivamente. Estos mismos valores expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) corresponden a 1.08� 0.16 y 1.04 � 0.13 mg EAG/mL, respectivamente.

Especie: Azúcares totales Sulfatos ácido ur�nico Polifenoles totales Oligoelementos

Na: K Mg P Ca S

mg/g extracto

Ascophyllum nodosum: 115 50 47 44 70 46 9 2 6 18

Bifurcaria bifurcata: 156 118 55 62.4 20 71 3 1 4 36

Saccorhiza polyschides: 33 44 10 3 48 180 6 4 3 12

Sargassum muticum: 122 70 40 12 44 87 23 4 5 19

Tabla 3. Caracterización de extractos liofilizados a partir de cuatro variedades de algas pardas.

15 Contenido en polisac�ridos:

Se entiende por polisac�ridos los pol�meros formados a partir de azúcares, principalmente hexosas y/o pentosas, que funcionan como componente estructural y de reserva energética en los vegetales.

Se determin� el contenido en polisac�ridos mediante el método fenol-sulfúrico, propuesto en Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Dubois, M.; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; 20 Smith, F. Anal. Chem. , 28, 350–356, 1956. Se obtuvo un contenido promedio de carbohidratos de 156.7 mg de

glucosa/g de liofilizado del extracto obtenido a partir de la macroalga Bifurcaria bifurcata, siendo un 29% superior al obtenido a partir de Ascophyllum nodosum en similares condiciones.

Se entiende por fucoidanos una familia de polisac�ridos característicos de las algas, que son formados por polimerizaci�n de derivados de la fucosa, un azúcar sulfatado.

El contenido promedio en fucoidanos fue determinado mediante el procedimiento descrito en Determination of inorganic sulphate in studies on the enzimic and non- enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters, Dodgson, Dodgson, K. S. . Biochem. J., 78, pp. 312-317, 1961, y es expresado como sulfatos totales tras la digestión de la muestra. El valor promedio en los extractos de Bifurcaria bifurcata es de 118 mg de sulfatos/g de liofilizado, un 134% superior a un extracto de Ascophyllum nodosum obtenido en similares condiciones. Los niveles de azufre determinados mediante técnicas de ICP-OES (media de 36.3 mg S/g liofilizado) fueron el doble de los obtenidos para Ascophyllum nodosum (media de 18.14 mg/g).

Los principales polisac�ridos en las algas son los denominados alginatos, formado por polimerizaci�n principalmente del ácido glucur�nico.

El contenido en alginatos fue estimado a partir del contenido en ácidos ur�nicos según el método propuesto en New method for quantitative determination of uronic acids, Blumenkrantz et al., Blumenkrantz, N. y Asboe-Hansen, G. Anal. Biochem, 54, pp. 484-489, 1973. El extracto de Bifurcaria bifurcata mostr� un contenido medio de alginatos, expresado como ácidos ur�nicos y empleando ácido glucur�nico como estándar, de 55.1 mg/g de liofilizado, siendo un 15% superior a un extracto de Ascophyllum nodosum obtenido en las mismas condiciones.

Determinaci�n espectrofotom�rica de polifenoles totales.

Se emple� el método Folin-Ciocalteau de determinación de polifenoles totales, empleando floroglucinol como estándar. El contenido promedio de polifenoles totales, principlamente florotaninos, en el extracto de Bifurcaria bifurcata, fue de 62.4 mg equivalentes de floroglucinol/g de liofilizado, un 7.3 % superior al obtenido de Ascophyllum nodosum.

Detecci�n cromatogr�fica de florotaninos:

Por florotaninos se entienden pol�meros generados por polimerizaci�n de floroglucinol (1,3,5 trihidroxibenceno), en paralelismo con la denominación de taninos, formados por polimerizaci�n de catequina/epicatequina y derivados. Los taninos son componentes de la pared celular de las plantas y los florotaninos lo son en las macroalgas.

Se realizó la extracción de florotaninos a partir del extracto liofilizado, de acuerdo con la metodología propuesta en High-performance liquid chromatographic analysis of phlorotannins from the brown alga Fucus vesiculosus Phytochem, Koivikko et al., 2007, Koivikko, R., Loponen, J., Pihlaja, K. and Jormalainen, V. ,Anal. 18, pp. 326332,2007, en donde se eliminaron las etapas de lavados con hexano.

Se pesaron 95 mg del extracto de Bifurcaria bifurcata. y se solubilizaron en 25 mL de agua, posteriormente, los florotaninos se extrajeron 4 veces con 10 mL de una mezcla de acetona/agua: 7/3. La muestra se centrifug� para separar el sobrenadante. Las porciones de sobrenadante se unieron y se elimin� la acetona con corriente de N2. El residuo se resuspendi� en agua y posteriormente se liofilizó. El liofilizado se disolvió en 1 mL de agua destilada y qued� listo para inyectar al equipo de cromatograf�a líquida de alta eficacia. El método de separación cromatogr�fica fue el propuesto en Toxicity and antioxidant activity in vitro and in vivo of two Fucus vesiculosus extracts, ,Zaragoza, M.C., López, D., S�iz, M. P., Poquet M., Pérez J., Puig-Parellada, P., Mármol, F., Simonetti, P., Gardana, C., Lerat, Y., Burtin, P., Inisan, C., Rousseau, I., Besnard, M., and Mitjavila, M.T. . J. Agric. Food Chem, 56, pp. 7773-7780, 2008.

En la Figura 2, se observan los picos mayoritarios (5-6, 11 y 18) cuya señal se detecta a los 25-26, 30 y 37 min, respectivamente. La máxima absorbancia de la mezcla de florotaninos se observa a los 273 nm, como se muestra en la Figura 3. El perfil del espectro UV-Visible coincide con el de un estándar de la molécula de floroglucinol.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un extracto antioxidante acuoso y su derivado liofilizado obtenido a partir de macroalgas pardas caracterizado por:

a) un contenido de carbohidratos entre 33 y 156 mg de glucosa/g de extracto una vez liofilizado; b) un contenido en fucoidanos, expresados como sulfatos totales tras la digestión de la muestra, entre 44 y 118 mg de sulfatos/g una vez liofilizado; c) un contenido de florotaninos, expresados como floroglucinol, entre 12 y 62.4 mg equivalentes de 10 floroglucinol/g una vez liofilizado; y d) un contenido en alginatos, entre 10 y 55 mg equivalentes de ácido glucur�nico/g una vez liofilizado.
2. El extracto según la reivindicación 1 caracterizado por un máximo de absorbancia en la región ultravioleta entre 260-280 nm.

15 3. El extracto según la reivindicación 1 caracterizado por una capacidad de inhibición del radical DPPH con un valor de EC50 de 17.7 a 23.7 mg de extracto/mL.
4. El extracto según las reivindicaciones 1 a 3 donde la macroalga parda es Bifurcaria bifurcata, Ascophyllum nodosum, Saccorhiza polyschides y Sargassum muticum.
5. Un procedimiento para obtener un extracto antioxidante, caracterizado según las reivindicaciones 1 a 4, a 20 partir de la macroalgas pardas frescas o secas que comprende:

a) lavar con agua las macroalgas, en el caso de que se empleeen macroalgas frescas;

b) mezclar la macroalga con agua con una relación líquido/sólido (L/S) entre 3 y 5 g/g;

c) triturar la mezcla obteniendo una macroalga triturada con un tamaño de partícula inferior a 3 mm.

d) mezclar la macroalga triturada con un disolvente líquido que comprende etanol puro o mezclas

25 etanol:agua en relación 1:1 v/v, en una relación Líquido/Sólido (L/S) de entre 5 y 15 (g/g) cuando se parte de macroalga fresca y de entre 50 y 150 (g/g) cuando se parte de macroalga seca; e) someter la mezcla a un proceso de disrupci�n celular aplicando ultrasonidos en continuo con una densidad de potencia en el rango entre 3 y 13 W/cm3; f) separar el residuo sólido algal obtenido en la etapa anterior mediante sedimentación y posterior 30 centrifugaci�n o filtración; g) eliminar el etanol o el 50% del agua a vacío a una temperatura inferior a 40�C obteniendo un extracto concentrado; y h) liofilizar el extracto concentrado obteniendo un extracto liofilizado.
6. El procedimiento según la reivindicación 5 en el que el tamaño de las partículas trituradas est� entre 0.5 y 2 35 mm para macroalga seca y entre 0.5 y 3 mm para macroalga fresca.
7. El uso del extracto antioxidante caracterizado según las reivindicaciones 1 a 4 como ingrediente en formulaciones cosm�ticas y alimentarias.

Figura 1 Figura 2

Figura 3

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.� solicitud: 201330523

ESPA�A

Fecha de presentación de la solicitud: 12.04.2013

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categor�a

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

US 2008280994 A1 (ZHANG, JUNZENG et al.) 13.11.2008, página 1, [0008],[0011]-[0014]; página 2, [0060],[0063]; página 3, [0078]-[0080]; página 4, [0082],[0086],[0091]-[0094]; página 5, [0112]-[0115]; página 7, [0131]; página 10, [0165],[0175]; reivindicaciones 13,17-19,27-30,55. 1-7

A

CN 101250232 A (GUOYING QUIAN ) 27.08.2008, (resumen) [en línea] [recuperado el 05.11.2013] Recuperado de EPO EPODOC Database. 4-7

A

ES 2054485 T3 (SOCIETE D’ENGRAIS COMPOSES MINERAUX ET AMENDEMENTS (S.E.C.M.A.)) 01.08.1994, página 2, líneas 12-28,40-48; página 3, ejemplos 2,7; página 4, ejemplos 10-12; página 9, líneas 26-32; página 10, líneas 40-51; reivindicaciones 2,3,5. 1,4,5,7

A

BALAJI RAGHVENDRAN H. R., SATHIVEL, A. DEVAKI, T. Antioxidant effect of Sargassum polycystum (Phaeophyceae) against acetaminophen induced changes in hepatic mitochondrial enzymes during toxic hepatitis. Chemosphere, 2005. Vol. 61, páginas 276-281. Vol. 61, páginas 276-281. ISSN 0045 6535. Doi: 10.1016/j.chemosphere.2005.01.049. 1-3,5

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NAKAI, M. et al. Phlorotannins as radical scavengers from the extract of Sargassum ringgoldianum. Marine Biotechnology, 2006. Vol. 8, páginas 409-414. Doi: 10.1007/s10126-005-6168-9. 1-3,7

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LI, YONG-XIN et al. Phlorotannins as bioactive agents from brown algae. Process Biochemistry, 2011. Vol. 46, n� 12, páginas 2219-2224. ISSN 1359 5113. Doi: 10.1016/j.procbio.2011.09.015. 1,3,5,7

A

CN 101993501 A (UNI ZHE JIANG SCI & TECH ) 30.03.2011, (resumen) [en línea] [recuperado el 05.11.2013] Recuperado de EPO EPODOC Database. 4-7

Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones n�:

Fecha de realización del informe 06.11.2013

Examinador A. Sukhwani Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

CLASIFICACI�N OBJETO DE LA SOLICITUD A61K8/96 (2006.01)

A23L1/30 (2006.01) A61K36/03 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61K, A23L

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, X-FULL, NPL, CAPLUS, KOSMET, FSTA, AGRICOLA, CABA, SCISEARCH, INTERNET

OPINI�N ESCRITA

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 06.11.2013

Declaraci�n

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1 -7 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1 -7 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones:

La presente invención tiene por objeto un extracto antioxidante liofilizado obtenido de macroalgas pardas que comprende (reivindicación 1):

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carbohidratos (entre 33 y 15 mg de glucosa/g de liofilizado), fucoidanos (expresados como sulfato, entre 44 y 118 mg), florotaninos (expresados como floroglucinol, entre 12 y 62,4) y alginatos (entre 10 y 55 mg).

El extracto tiene un máximo de absorbancia en la región ultravioleta entre 260-280 nm (reiv. 2) y una capacidad de inhibición del radical DPPH de 17,7 a 23, 7 mg de extracto/ml (reiv. 3). La macroalga parda es Bifurcaria bifurcata, Ascophyllum nodosum, Saccorhiza polyschides y Sargassum muticum (reiv. 4).

Tambi�n es objeto de protección el procedimiento para obtener un extracto antioxidante liofilizado reivindicado a partir de macroalgas pardas frescas o secas que comprende (reivindicación 5) las etapas de:

a) lavar las macroalgas frescas, b) mezclar con agua en la relación líquido/sólido entre 3 y 5 g/g, c) triturar hasta un tamaño inferior a 3 mm, d) mezclar la macroalga triturada con un disolvente líquido que comprende etanol puro o mezclas con etanol: agua, e) someter la mezcla a disrupci�n celular aplicando ultrasonidos en continuo, f) separar el residuo sólido del alga mediante sedimentación y posterior centrifugaci�n o filtración; g) eliminar el etanol o el agua a vacío a menos de 40oC obteniendo un extracto concentrado, y h) liofilizar.

El tamaño de partículas est� entre 0,5 y 2 para macroalga seca y entre 0,5 y 3 mm para macroalga fresca (reiv. 6).

Por último, es objeto de protección el uso del extracto antioxidante como ingrediente de formulaciones cosm�ticas y alimentarias (reiv. 7).

OPINI�N ESCRITA

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

US 2008280994 A1 (ZHANG, JUNZENG et al.) 13.11.2008

D02

CN 101250232 A (GUOYING QUIAN ) 27.08.2008

D03

ES 2054485 T3 (SOCIETE D’ENGRAIS COMPOSES MINERAUX ET AMENDEMENTS (S.E.C.M.A.)) 01.08.1994

D04

BALAJI RAGHVENDRAN H. R., SATHIVEL, A. DEVAKI, T. Antioxidant effect of Sargassum polycystum (Phaeophyceae) against acetaminophen induced changes in hepatic mitochondrial enzymes during toxic hepatitis. Chemosphere, 2005. Vol. 61, páginas 276-281. 2005

D05

NAKAI, M. et al. Phlorotannins as radical scavengers from the extract of Sargassum ringgoldianum. Marine Biotechnology, 2006. Vol. 8, pág.409-414 2006

D06

LI, YONG-XIN et al. Phlorotannins as bioactive agents from brown algae. Process Biochemistry, 2011. Vol. 46, n� 12, páginas 2219-2224 2011

D07

CN 101993501 A (UNI ZHE JIANG SCI & TECH ) 30.03.2011
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

NOVEDAD

Los documentos citados D01 a D07 se refieren a algas pardas, a extractos antioxidantes obtenidos de ellos, a métodos de extracción y a usos del extracto. As�,

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D01 divulga composiciones del alga parda Ascophyllum como Ascophyllum nodosum (página 2, [0060], [0063]) y su riqueza en alginatos (página 1, [0008]) y comprenden extractos acuosos de este alga (página 1, [0011]-[0014]) rico en polifenoles del tipo de floroglucinol y florotaninos (página 2, [0063]; página 3, [0078]-[0080]) y la extracción preferida es con 50% de etanol: agua y, tras eliminar el solvente orgánico, se liofiliza (página 4, [0082], [0086], [0091]-[0094]) aunque puede haber una ultrafiltraci�n no est� previsto un proceso de disrupci�n celular por ultrasonidos.

Las composiciones se pueden utilizar en productos alimenticios por su capacidad de antioxidante (página 5, [0112][0115]; página 7, [0131]; página 10, [0165], [0175]; reivindicaciones 13, 17-19, 27-30, 55). Sin embargo, no est�n divulgadas las cantidades de carbohidratos, fucoidanos, florotaninos y alginatos reivindicados, por lo que no anticipa la invención.

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D02 se refiere a un método de extracción de polisac�ridos activos de Sargassum fusiform que combina la extracción con agua y la técnica de ultrasonido, pero no utiliza la extracción con etanol y tampoco divulga las cantidades del extracto reivindicado (resumen).

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D03 divulga la utilización de algas para la preparación de composiciones farmacéuticas, cosm�ticas y alimentarias entre ellas las algas pardas de los géneros Ascophyllum y Sargassum como Ascophyllum nodosum y Sargassum muticum (página 2, líneas 12-28, 40-42). La preparación de extractos se puede hacer con extracción acuosa y extracción con disolvente polar, secado a vacío, concentración, ultrafiltraci�n (página 2, líneas 44-48; página 3, Ejemplos 2, 7) e incluso mezcla hidroalcoh�lica agua: etanol (página 4, Ejemplos 10-12; página 9, líneas 26-32; página 10, líneas 40-51; reivindicaciones 2, 3, 5) pero no divulga las cantidades del extracto ni otras etapas del procedimiento.

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D04 se refiere al efecto antioxidante del extracto de Sargassum polycystum, alga que se extrae con etanol, se filtra y se seca al vacío (página 277, primera columna). El extracto contiene fucoidanos y alginatos (página 279, segunda columna, último párrafo).

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D05 divulga los florotaninos de Sargassum ringgoldianum y un extracto de 50% de etanol y absorbancia en la región UV de 280 (página 412, Tabla 2) si bien no divulga las otras etapas e inicia la extracción con acetona (página 411, segunda columna) por lo que no anticipa el extracto ni el procedimiento.

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D06 se refiere a florotaninos como agentes bioactivos de las algas pardas y su uso potencial como ingredientes funcionales en productos alimenticios, farmacéuticos y cosmoc�uticos y en particular, menciona los extractos etan�licos de especies de Ecklonia y de Undaria (página 2222, párrafo 3.2.3.).

OPINI�N ESCRITA

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D07 se refiere a un método para preparar fucoidanos que comprende añadir agua a algas pardas, tratar con molinos coloidales y hacer una extracción con microondas o con ultrasonidos. Posteriormente hay previsto extracción con etanol a 50%, a 90% para obtener un polvo de fucoidanos (resumen) pero no divulga el mismo orden de etapas ni las cantidades del extracto y de los otros componentes como los florotaninos y alginatos.

Por ello, a la vista de los documentos D01 a D07, se puede concluir que las reivindicaciones 1-7 son nuevas de acuerdo con el Artículo 6 LP 11/86.

ACTIVIDAD INVENTIVA

El extracto antioxidante liofilizado y su procedimiento de obtención no resultan evidentes para el experto en la técnica puesto que los documentos citados D01 a D07 no divulgan todos los componentes, carbohidratos, fucoidanos, florotaninos y alginatos en las cantidades previstas tal como lo hace la solicitud en estudio.

Aunque en el procedimiento de obtención del extracto de alga parda si est� previsto la utilización de etanol: agua (D01, D03, D04, D05) y la utilización de ultrasonidos (D02, D07), no resulta obvio combinar ambos métodos, siguiendo el mismo orden que las etapas reivindicadas, ni las relaciones, tamaño, potencia empleados en el procedimiento.

Por ello, a la vista de los documentos D01 a D07, se puede concluir que las reivindicaciones 1-7 tienen actividad inventiva según el Artículo 8 LP 11/86