Extracto de un alga Laminaria como agente terapéutico
La presente invención se refiere al campo de la aplicación en medicina de productos naturales marinos. Concretamente, se refiere a varios usos terapéuticos relacionados de un extracto de un alga marrón específica.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El desarrollo del cáncer se comprende como un proceso que precisa de la acumulación de la acción de eventos múltiples. Esto ocurre incluyendo distintas etapas; inicio, promoción y progresión, donde las especies re^activas de oxígeno juegan un papel importante.
Durante la primera etapa de un tumor la célula sufre una alteración de su crecimiento como resultado de la mutación de uno de los genes que controla el proceso de crecimiento. El agente que induce esta primera etapa se denomina iniciador, y éste puede ser físico (p. ej. radiación), biológico (p. ej. virus) o químico. Entre los iniciadores químicos existen oxidantes exógenos, especies reactivas de oxígeno ("oxigen reactive species", ORS en lo que sigue), tales como H2O2, O3, 1O2 , HCIO, OH- (radical hidroxilo), O2 " (radical superóxido) y ROO- (radical peroxilo), y especies reactivas de nitrógeno ("nitrogen reactive species", NRS en lo que sigue), tales como NO- (ó:xido nítrico). Estos iniciadores o carcinógenos pueden producir oncogenes activos debido a una mutación de proto-oncogenes, añadiendo una modificación en el control del crecimiento y en la diferenciación celular.
El estrés oxidativo está implicado en varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Agentes ambientales como la luz ultravioleta, la radiación ionizable, carcinógenos químicos y el humo del tabaco pueden inducir estrés o idativo. Pero muchas células tienen un sistema defensivo antioxidante constituido por diferentes enzimas (p. ej. superóxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa, etc.) y/o por antioxidantes de bajo peso molecular (vitami na C, vitamina E, glutation, tioredoxina, etc.).
El estrés oxidativo ocurre cuando la producción de ORS excede la ca pacidad de su eliminación por los mecanismos antioxidativos del organismo, y consecuentemente daña macromoléculas cruciales como el ADN, las
proteínas y los lípidos. Así, por ejemplo, las especies que provienen de la reducción de moléculas de oxígeno generalmente reaccionan con bases del esqueleto de ADN (residuos de desoxirribosa) produciendo una rotura de la cadena. El daño endógeno del ADN es genotóxico e induce mutaciones en oncogenes y en genes supresores de tumores. Las alteraciones inducidas en lípidos y proteínas son de tipo oxidativo, generando intermedios que reaccionan con el ADN para crear aducios. Hay otros hallazgos que muestran la implicación de ORS en carcinogénesis, tales como la implicación de la peroxidación de lípidos en el carcinoma renal inducido por nitriltriacetato férrico.
Es interesante remarcar la acción de los agentes que modulan las concentraciones extra e intracelulares de grupos tiol, grupos esenciales para la activación de numerosas enzimas. Tales agentes han sido empleados para reducir los efectos secundarios asociados con la quimioterapia del cáncer y están siendo actualmente investigados como una nueva estrategia de prevención. Uno de los agentes más extensamente estudiados es la N-acetilcisteína (NAC), cuyo efecto protector contra la carcinogénesis proviene básicamente de sus propiedades antígeno-tóxicas y antioxidativas. Las propiedades antiangiogénicas de la NAC son también conocidas.
Así pues, es ampliamente reconocido que la terapia del cáncer se beneficiaría con la introducción de nuevos agentes terapéuticos con propiedades antioxidativas y/o antiangiogénicas.
Las algas son una rica fuente natural de variedad de productos, incluyendo fármacos. Algunas algas del género Laminaria han sido descritas como alimento, lo que significa que no son tóxicas para el hombre a las dosis empleadas. También han sido descritas como fuente natural para la obtención de compuestos terapéuticos tales como agentes immunoestimulantes (cfr. JP 2002209552-A2), compuestos anti-inflamatorios (cfr. US 6.337.315-B1), o mezclas de polisacáridos inductoras de apoptosis (cfr. US 6.207.652-B1).
Ha sido descrita la actividad antitumoral de una extensa variedad de algas marinas, algunas de ellas del género Laminaria (cfr. H. Noda et al., Hvdrobiologia 1990, vol. 204-205, pp. 577-84; B.S. Reddy et al., Mutation
Research 1984. vol. 127, pp. 113-18: Y. Suzuki et al.. Chemotherapy 1980, vol. 28, pp. 165-70; J. Yubin et al., Zhongguo Haivano Yaowu 1994, vol. 13, pp. 20-4), pero nunca en relación con extractos de la especie Laminaria cloustoni. Algunas algas marinas han sido descritas como fuentes naturales con actividad antioxidante y quelante del hierro, pero nunca en relación con Laminaria cloustoni sp.
Las hojas de la especie Laminaria cloustoni son conocidas desde hace tiempo en la producción de sustancias adhesivas (cfr. US 1.099.382) y como fuente de varios materiales no terapéuticos (p. ej. manitol, laminarina, ácido algínico, fucoidina o yodo, cfr. GB 727.013). Producen ácido acético cuando se permite la fermentación. Más recientemente, se ha descrito la utilidad de extractos alcohólicos de este alga para la preparación de soluciones biocatalíticas (cfr. US 6.284.012 B1 ).
El alga Laminaria cloustoni, descubierta por Edmonston en 1845, es un alga de agua dulce, clasificada como alga marrón, comúnmente conocida en inglés como "kelp". Es una gran alga marina (de uno a tres metros de longitud) perteneciente al orden de las Laminariales (que incluye alrededor de treinta géneros), clase Phaeophyceae, phylum Heterokontophyta. Crece en los mares más fríos, sobre rocas, en las costas de los océanos Pacífico y Atlántico, en el océano Ártico y en las Islas Británicas.
El alga Laminaria cloustoni no es flexible, sino rígida y erecta, de tallo cilindrico. Es de color marrón claro. Bajo el tallo se divide en raíces como ramas, que expanden y unen el alga a la base submarina de las rocas. La fronda es plana, coriácea, de color verde oliva, y dividida en divisiones como dedos. Sólo se usa la parte cilindrica del tallo.
Comercialmente, el alga Laminaria cloustoni consiste en porciones cilindricas y secas del tallo, algo irregulares, profundamente onduladas, de gran resistencia y elasticidad, y que se rompen por una fractura suave. Es de color marrón, siendo la porción interna más pálida que la externa. Cuando se forman bastones cónicos y cilindricos está lista para su uso. Contiene abundante mucílago, del cual Shimideberg (1885) aisló la laminarina y el ácido laminárico, una sustancia con la propiedad de hincharse en agua en un grado inusual.
Entre las algas que pertenecen al género Laminaria existen grandes diferencias, no sólo por la morfología, sino también por su actividad biológica y terapéutica. De hecho, es imposible predecir las propiedades biológicas/terapéuticas de una especie por analogía con las de otra especie.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni obtenible por el método que comprende los siguientes pasos: (a) someter una porción del alga seca y molida a un tratamiento con agua caliente simultáneamente acompañado por un tratamiento con ultrasonidos; (b) separar el residuo sólido mediante filtración; y (c) evaporar el filtrado hasta obtener el extracto con la concentración deseada. En una realización particular de la invención, el tratamiento con ultrasonidos se realiza durante más de 12 horas y el paso (c) de evaporación se realiza hasta sequedad.
Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica con actividad antitumoral que comprende el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. Otros aspectos de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas con actividad antioxidante y con actividad antiangiogénica que comprenden el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. Como antioxidante podrá ser utilizado en muchos campos como son los de los suplementos nutricionales, la cosmética y los conservantes industriales.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, para la preparación de un medicamento con actividad antioxidante, antiangiogénica y para el tratamiento de tumores. En otras palabras, la invención se refiere a métodos de tratamiento de pacientes que sufren enfermedades o desórdenes que se sabe pueden ser tratadas con agentes antioxidantes, antiangiogénicos y/o antitumorales.
El extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriomente puede usarse como un medicamento por sí mismo o en combinación con otros
agentes terapéuticos. El extracto puede usarse en forma de solución de diferentes concentraciones, o como sólido obtenido por evaporación hasta sequedad (opcionalmente disuelto o mezclado con otros excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables). Como será obvio para los expertos en la materia, se pueden usar diferentes vías conocidas para administrar este agente terapéutico (oral, parenteral, etc.), dependiendo del tratamiento y otras circunstancias.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes modos de realización se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Determinación de los sólidos totales de extractos acuosos de Laminaria cloustoni
La muestra de alga seca fue dividida mediante métodos mecánicos y tratada con agua, previamente a la extracción. La muestra se homogeneizó en un tubo agitador hasta la destrucción total. A continuación fue centrifugada a 3000 rpm durante quince minutos. Se recuperó el sobrenadante y el precipitado se descartó. Se determinaron los sólidos totales en el sobrenadante según un método estándar (Organización Mundial de la Salud, 1998, "Quality control methods for medicinal plant materials", Geneva, Switzerland, 33), resultando en 19,8 + 0,3 mg/ml (diez muestras, con una variación inferior al 10%).
Proceso de preparación del extracto acuoso de Laminaria cloustoni para ensayos biológicos
Se trituró una muestra de Laminaria cloustoni seca (1 g) en un mortero. El polvo seco obtenido se suspendió en agua destilada y la mezcla fue tratada
durante 24 horas en un baño de ultrasonidos a 100 °C. Se separó el residuo sólido mediante filtración y se evaporó el filtrado por microdestilación hasta sequedad. El residuo seco resultante era un sólido amorfo blanco amarillento, que se utilizó en las pruebas biológicas.
Test de la Desoxirribosa: actividad secuestradora de radicales hidroxilo y actividad guelante de hierro del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Para evaluar la actividad secuestradora de radicales hidroxilo y la actividad quelante de hierro del extracto de Laminaria cloustoni se siguieron métodos conocidos (cfr. O.l. Aruoma, "Desoxyribose assay for hydroxyl radicáis" Methods in Enzvmology 1994, vol. 23, pp. 57-66; J.A. Buege and S.D. Aust, Methods in Enzvmology 1978, vol. 52, pp. 302-310). Se encontró una correlación linear entre el secuestro de radicales OH y la concentración de sólidos en el extracto acuoso (pendiente 0,34, ordenada en el origen 0,60, r = 0,99, n = 3), a partir de la cual se calculó el valor de IC50 = 5,86 mg/ml. Se encontró una correlación linear entre la actividad quelante de hierro y la concentración de sólidos en el extracto acuoso (pendiente 42,05, ordenada en el origen 47,94, r = 0,94, n = 3), de la que se calculó el valor de IC50 = 0,11 mg/ml.
Actividad inhibidora del extracto acuoso de Laminaria cloustoni contra el daño en el DNA inducido por el complejo Fe(ll)- bleomicina
Se siguió el método descrito (cfr. O.l. Aruoma et al., "Antioxidant and pro- oxidant properties of active rosemary constituents: Carnosol and camosie acid", Xenobiotica 1992, vol. 22, pp. 257-268). Se encontró que el extracto acuoso de Laminaria cloustoni producía un fuerte efecto inhibidor, atribuido, al menos parcialmente, a su actividad quelante sobre el hierro. Se observó una fuerte inhibición en tres concentraciones distintas: 0,33, 0,66 y 1 ,32 mg/ml.
Actividad antineoplásica del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Se investigó el efecto de extractos acuosos de Laminaria cloustoni sobre la línea celular SK-Mel-28 de melanoma humano. La línea se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) [Rockville, MD, USA], se mantuvo
en medio Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) comprado a Gibco- BRL [Eggenstein, Germany] suplementado con un 10% de suero fetal de ternero ("Foetal Calf Serum", FCS) [Invitrogen, Carlsbad, CA, USA] inactivado por calor, 2% de glutamina [Gibco-BRL] y 0,1 % de antibióticos (10000 U/mL penicilina, 100 μg/ml estreptomicina) [Gibco-BRL]. La determinación de la IC50 se realizó tal como se describe (cfr. Torres et al., J. Agrie. Food Chem. 2002, vol. 50; pp. 7548-55).
La TABLA 1 muestra el efecto de las diferentes concentraciones del extracto de alga contra 1200 células de SK-Mel-28 en DMEM, 10% FCS. Se determinaron tres valores de densidad óptica (DO) por cada concentración (C) de extracto de alga (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, y 2000 μg/ml). Se calcularon las medias de DO y sus desviaciones estándar (DS). La comparación del control de DO (100%) con las respectivas DO permitieron calcular el porcentaje de viabilidad. Se estimó el valor de IC50 = 91 μg/mL. Se encontró una correlación entre el porcentaje de inhibición de la proliferación y el logaritmo de C (pendiente = 37,71; ordenada en el origen = - 23,89, r = 0.91. p<0,01). TABLA 1 : Efecto de la concentración de extracto de alga contra las células de melanoma humano
Actividad antiangiogénica del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Se analizó el efecto de extractos acuosos de Laminaria cloustoni sobre un modelo de angiogénesis inducido por Adyuvante Completo de Freund ("Complete Adjuvant of Freund", CAF). Se siguió un modelo descrito (cfr. S. Kobayashi et al., Biol. Pharm. Bull. 1998 vol. 21 , pp. 346-349). Se inyectaron subcutáneamente tres mL de aire en la espalda de ratones machos anestesiados (raza llamada OF-1 , con un peso de 20 + 2 g) para producir una bolsa ovalada regular de aire. Dentro de la bolsa de aire se administraron 0,5 mL de CAF con 0,1 % de aceite de crotón. Como control positivo, se administró dexametasona vía intraperitoneal 2 horas antes de la inyección de CAF, una vez al día, durante cinco días. El extracto acuoso de Laminaria cloustoni se inyectó siguiendo el mismo esquema y la misma vía de administración. Los ratones fueron sacrificados al sexto día, bajo anestesia, y el fluido de exudado de granuloma fue recogido y centrifugado a 3500 rpm. Se determinaron varios ensayos: la actividad superóxido dismutasa (SOD) [kit facilitado por Randox Laboratories]; actividad catalasa (cfr. Boehringer Mannheim. Enzymes for routine 1st edition 1987, pp. 15-16); H2O2, [kit Bioxytech H202-560, Oxis International Inc.Portland, OR, USA]; malondialdehido (MDA) y 4-hidroxialquenales [kit LPO-586 of Calabiochem., La Jolla, CA].
La TABLA 2 muestra el efecto del extracto acuoso de Laminaria cloustoni sobre los mediadores del estrés oxidativo en el modelo experimental de angiogénesis. Grupos experimentales: control (-), grupo tratado con solución salina; control (+), grupo tratado con 5 mg/kg de dexametasona; extracto de alga, grupo tratado con 10 mg/kg de extracto acuoso de Laminaria cloustoni. Los grupos con al menos una letra en común no presentaron diferencias significativas (p>0,05). Los extractos acuosos de Laminaria cloustoni reducieron el estrés oxidativo respecto al control (-) e incluso en comparación con la dexametasona. Se detectó una disminución de las actividades súperoxido dismutasa y catalasa con respecto al control (-), lo que explica la disminución en la producción de MDA + 4-hidroxialquenales, reconocidos como mediadores de carcinogénesis.
TABLA 2: Efectos del extracto acuoso Laminaria cloustoni en un modelo experimental de angiogénesis.
Comportamiento del extracto acuoso de Laminaria cloustoni en un modelo in vivo de carcinoma renal
Se evaluó el efecto del extracto acuoso de Laminaria cloustoni utilizando un sistema vivo. Se seleccionó un modelo de carcinoma renal que presentaba la peculiaridad de ser inducido por complejos que contienen hierro. Como el extracto acuoso de Laminaria cloustoni presentaba actividad quelante de hierro, este modelo de carcinoma renal, inducido por Fe-NTA, era de especial interés para investigar los efectos de los principios activos presentes en el extracto acuoso del alga. El carcinoma fue inducido tal como describe (cfr. Jia-Li, et al., Cáncer Research 1987, vol. 47, pp. 1867-1869). El agente inductor, una solución de Fe-NTA, se preparó diariamente. La solución de Fe(NO3)3.9H2O fue mezclada en un agitador magnético en un exceso de 4 veces molar de sal disódica de ácido nitriltriacético (NTA) y el pH fue ajustado a 7,4 con bicarbonato sódico. La dosis de Fe-NTA era 2 mg/Fe/kg peso corporal/día. La administración fue vía intraperitoneal, seis días por semana, durante doce semanas. La dosis de NTA era equivalente a la porción de NTA contenida en el complejo Fe-NTA. La TABLA 3 muestra el comportamiento d el peso corporal, catorce días después de iniciar el tratamiento. Símbolos usados: (-) = sin signos observados; NTA = nitriltriacetato; Fe-NTA = nitriltriacetato férrico (inductor del carcinoma). La TABLA 4 muestra los resultados de una evaluación cualitativa observada durante un ensayo de catorce días. Símbolos usados: (-) = sin signos observados; NTA = nitriltriacetato; Fe-NTA = nitriltriacetato férrico (inductor del carcinoma). En resumen, el extracto acuoso de Laminaria cloustoni dio resultados positivos sobre el carcinoma renal
inducido por Fe-NTA, en los primeros catorce días, determinando el aumento de peso corporal y otras evaluaciones cualitativas.
TABLA 3. Comportamiento del peso corporal en un modelo in vivo de carcinoma renal
TABLA 4: Evaluación cualitativa observada en un modelo in vivo de carcinoma renal