WO2005099738A1 - Extracto de un alga laminaria como agente terapéutico - Google Patents

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WO2005099738A1
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extract
laminaria
aqueous extract
laminaria cloustoni
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Ana María CARMONA CORNET
María Dolores PUJOL DILMÉ
Marta Cascante Serratosa
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Universidad De Barcelona
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    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/03—Phaeophycota or phaeophyta (brown algae), e.g. Fucus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants

Definitions

  • Laminaria algae extract as a therapeutic agent
  • the present invention relates to the field of application in medicine of marine natural products. Specifically, it refers to several related therapeutic uses of an extract of a specific brown algae.
  • the development of cancer is understood as a process that requires the accumulation of the action of multiple events. This occurs including different stages; initiation, promotion and progression, where re-active oxygen species play an important role.
  • the agent that induces this first stage is called the initiator, and this can be physical (eg radiation), biological (eg virus) or chemical.
  • the chemical initiators are exogenous oxidants, reactive oxygen species ("oxygen reactive species", ORS in the following), such as H 2 O 2 , O 3 , 1 O 2 , HCIO, OH- (hydroxyl radical), O 2 " (superoxide radical) and ROO- (peroxyl radical), and nitrogen reactive species (NRS in the following), such as NO- (or: nitric oxide).
  • Oxidative stress is involved in several diseases, including cancer.
  • Environmental agents such as ultraviolet light, ionizable radiation, chemical carcinogens and tobacco smoke can induce stress or idativo.
  • Many cells have a defensive antioxidant system consisting of different enzymes (eg, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, etc.) and / or low molecular weight antioxidants (vitamin C, vitamin E, glutathione, thioredoxin, etc. .).
  • Oxidative stress occurs when the production of ORS exceeds the capacity of its elimination by the body's antioxidant mechanisms, and consequently damages crucial macromolecules such as DNA, proteins and lipids.
  • the species that come from the reduction of oxygen molecules generally react with bases of the DNA skeleton (deoxyribose residues) causing a chain break.
  • Endogenous DNA damage is genotoxic and induces mutations in oncogenes and in tumor suppressor genes.
  • the alterations induced in lipids and proteins are oxidative, generating intermediates that react with DNA to create adducts.
  • ORS There are other findings that show the involvement of ORS in carcinogenesis, such as the implication of lipid peroxidation in renal carcinoma induced by ferric nitriltriacetate.
  • NAC N-acetylcysteine
  • cancer therapy would benefit from the introduction of new therapeutic agents with antioxidant and / or antiangiogenic properties.
  • Algae are a rich natural source of a variety of products, including drugs. Some algae of the genus Laminaria have been described as food, which means that they are not toxic to man at the doses used. They have also been described as a natural source for obtaining therapeutic compounds such as immunostimulating agents (cfr. JP 2002209552-A2), anti-inflammatory compounds (cfr. US 6,337,315-B1), or mixtures of apoptosis inducing polysaccharides (cfr US 6,207,652-B1).
  • immunostimulating agents cfr. JP 2002209552-A2
  • anti-inflammatory compounds cfr. US 6,337,315-B1
  • mixtures of apoptosis inducing polysaccharides cfr US 6,207,652-B1.
  • the leaves of the Laminaria cloustoni species have long been known in the production of adhesive substances (cf. US 1,099,382) and as a source of various non-therapeutic materials (eg mannitol, laminarin, alginic acid, fucoidin or iodine, cfr. GB 727.013). They produce acetic acid when fermentation is allowed. More recently, the usefulness of alcoholic extracts of this algae for the preparation of biocatalytic solutions has been described (cf. US 6,284,012 B1).
  • the Laminaria cloustoni seaweed discovered by Edmonston in 1845, is a freshwater seaweed, classified as brown algae, commonly known in English as "kelp". It is a large seaweed (one to three meters long) belonging to the order of Laminarial (which includes about thirty genera), class Phaeophyceae, phylum Heterochyphyta. It grows in the coldest seas, on rocks, on the shores of the Pacific and Atlantic oceans, in the Arctic Ocean and in the British Isles.
  • Laminaria cloustoni seaweed is not flexible, but rigid and erect, with a cylindrical stem. It is light brown. Under the stem is divided into roots as branches, which expand and attach the algae to the underwater base of the rocks. The frond is flat, leathery, olive green, and divided into divisions like fingers. Only the cylindrical part of the stem is used.
  • the Laminaria cloustoni seaweed consists of cylindrical and dry portions of the stem, somewhat irregular, deeply undulating, of great strength and elasticity, and which are broken by a soft fracture. It is brown, the inner portion being paler than the outer. When conical and cylindrical poles are formed, it is ready for use. It contains abundant mucilage, from which Shimideberg (1885) isolated laminarin and laminaric acid, a substance with the property of swelling in water to an unusual degree.
  • Shimideberg (1885) isolated laminarin and laminaric acid a substance with the property of swelling in water to an unusual degree.
  • the algae that belong to the genus Laminaria there are great differences, not only for morphology, but also for their biological and therapeutic activity. In fact, it is impossible to predict the biological / therapeutic properties of one species by analogy with those of another species.
  • the present invention relates to an aqueous extract of the Laminaria cloustoni seaweed obtainable by the method comprising the following steps: (a) subjecting a portion of the dried and ground algae to a hot water treatment simultaneously accompanied by an ultrasound treatment; (b) separating the solid residue by filtration; and (c) evaporate the filtrate until the extract is obtained with the desired concentration.
  • the ultrasonic treatment is carried out for more than 12 hours and the evaporation step (c) is carried out to dryness.
  • One aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition with antitumor activity comprising the aqueous extract of the Laminaria cloustoni algae defined above, together with pharmaceutically acceptable excipients.
  • Other aspects of the invention relate to pharmaceutical compositions with antioxidant activity and antiangiogenic activity comprising the aqueous extract of the Laminaria cloustoni algae defined above, together with pharmaceutically acceptable excipients.
  • an antioxidant it can be used in many fields such as nutritional supplements, cosmetics and industrial preservatives.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the aqueous extract of the Laminaria cloustoni algae defined above, for the preparation of a medicament with antioxidant, antiangiogenic activity and for the treatment of tumors.
  • the invention relates to methods of treating patients suffering from diseases or disorders that are known to be treated with antioxidant, antiangiogenic and / or antitumor agents.
  • the aqueous extract of the Laminaria cloustoni seaweed defined above can be used as a medicine by itself or in combination with others therapeutic agents
  • the extract can be used as a solution of different concentrations, or as a solid obtained by evaporation to dryness (optionally dissolved or mixed with other pharmaceutically acceptable excipients or carriers).
  • different known routes can be used to administer this therapeutic agent (oral, parenteral, etc.), depending on the treatment and other circumstances.
  • the dried seaweed sample was divided by mechanical methods and treated with water, prior to extraction.
  • the sample was homogenized in a shaker tube until complete destruction. It was then centrifuged at 3000 rpm for fifteen minutes. The supernatant was recovered and the precipitate was discarded. Total solids in the supernatant were determined according to a standard method (World Health Organization, 1998, "Quality control methods for medicinal plant materials", Geneva, Switzerland, 33), resulting in 19.8 + 0.3 mg / ml (ten samples, with a variation of less than 10%).
  • Deoxyribose test hydroxyl radical sequestration activity and iron glue activity of Laminaria cloustoni aqueous extract
  • aqueous extracts of Laminaria cloustoni on the SK-Mel-28 human melanoma cell line was investigated.
  • the line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) [Rockville, MD, USA], remained in Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) medium purchased from Gibco-BRL [Eggenstein, Germany] supplemented with 10% fetal calf serum ("Foetal Calf Serum", FCS) [Invitrogen, Carlsbad, CA, USA] heat-inactivated , 2% glutamine [Gibco-BRL] and 0.1% antibiotics (10,000 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin) [Gibco-BRL].
  • the determination of IC 50 was performed as described (cf. Torres et al., J. Agrie. Food Chem. 2002, vol. 50; pp. 7548-55).
  • TABLE 1 shows the effect of the different concentrations of the algae extract against 1200 SK-Mel-28 cells in DMEM, 10% FCS.
  • Three values of optical density (OD) were determined for each concentration (C) of algae extract (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, and 2000 ⁇ g / ml). The OD means and their standard deviations (SD) were calculated. The comparison of the DO control (100%) with the respective DO allowed to calculate the percentage of viability.
  • TABLE 1 Effect of algae extract concentration on human melanoma cells
  • dexamethasone was administered intraperitoneally 2 hours before CAF injection, once a day, for five days.
  • the aqueous extract of Laminaria cloustoni was injected following the same scheme and the same route of administration.
  • the mice were sacrificed on the sixth day, under anesthesia, and the granuloma exudate fluid was collected and centrifuged at 3500 rpm.
  • SOD superoxide dismutase activity
  • catalase activity .. cf. Boehringer Mannheim Enzymes for routine 1st edition 1987, pp .
  • H 2 O 2 [Bioxytech H 2 0 2 -560 kit, Oxis International Inc.Portland, OR, USA]; malondialdehyde (MDA) and 4-hydroxyalkenals [kit LPO-586 of Calabiochem., La Jolla, CA].
  • TABLE 2 shows the effect of the aqueous extract of Laminaria cloustoni on oxidative stress mediators in the experimental model of angiogenesis.
  • Experimental groups control (-), group treated with saline solution; control (+), group treated with 5 mg / kg dexamethasone; seaweed extract, group treated with 10 mg / kg of aqueous extract of Laminaria cloustoni.
  • the groups with at least one letter in common did not show significant differences (p> 0.05).
  • Aqueous extracts of Laminaria cloustoni reduced oxidative stress with respect to control (-) and even compared to dexamethasone.
  • the effect of the aqueous extract of Laminaria cloustoni was evaluated using a live system.
  • a renal carcinoma model was selected that presented the peculiarity of being induced by iron-containing complexes. Since the aqueous extract of Laminaria cloustoni had iron chelating activity, this model of renal carcinoma, induced by Fe-NTA, was of special interest to investigate the effects of the active substances present in the aqueous extract of the algae.
  • Carcinoma was induced as described (cf. Jia-Li, et al., Cancer Research 1987, vol. 47, pp. 1867-1869). The inducing agent, a solution of Fe-NTA, was prepared daily.
  • the Fe (NO 3 ) 3 .9H 2 O solution was mixed on a magnetic stirrer in a 4-molar excess of nitriltriacetic acid (NTA) disodium salt and the pH was adjusted to 7.4 with sodium bicarbonate.
  • the dose of Fe-NTA was 2 mg / Fe / kg body weight / day. Administration was intraperitoneally, six days a week, for twelve weeks. The dose of NTA was equivalent to the portion of NTA contained in the Fe-NTA complex.

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Abstract

La presente invención se refiere a varios usos terapéuticos relacionados de un extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni. El extracto es obtenible por el método que comprende los siguientes pasos: (a) someter una porción del alga seca y molida a un tratamiento con agua caliente simultáneamente acompañado por un tratamiento con ultrasonidos; (b) separar el residuo sólido mediante filtración; y (c) evaporar el filtrado hasta obtener el extracto con la concentración deseada. En particular, el tratamiento con ultrasonidos se realiza durante más de 12 horas y el paso (c) de evaporación se realiza hasta sequedad. En varios tests in vitro e in vivo, el extracto acuoso de la citada alga ha mostrado actividades antioxidante, antiangiogénica y antitumoral. Los ensayos biológicos se han realizado con el sólido obtenido después de la evaporación del extracto hasta sequedad.

Description

Extracto de un alga Laminaria como agente terapéutico
La presente invención se refiere al campo de la aplicación en medicina de productos naturales marinos. Concretamente, se refiere a varios usos terapéuticos relacionados de un extracto de un alga marrón específica.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El desarrollo del cáncer se comprende como un proceso que precisa de la acumulación de la acción de eventos múltiples. Esto ocurre incluyendo distintas etapas; inicio, promoción y progresión, donde las especies re^activas de oxígeno juegan un papel importante.
Durante la primera etapa de un tumor la célula sufre una alteración de su crecimiento como resultado de la mutación de uno de los genes que controla el proceso de crecimiento. El agente que induce esta primera etapa se denomina iniciador, y éste puede ser físico (p. ej. radiación), biológico (p. ej. virus) o químico. Entre los iniciadores químicos existen oxidantes exógenos, especies reactivas de oxígeno ("oxigen reactive species", ORS en lo que sigue), tales como H2O2, O3, 1O2 , HCIO, OH- (radical hidroxilo), O2 " (radical superóxido) y ROO- (radical peroxilo), y especies reactivas de nitrógeno ("nitrogen reactive species", NRS en lo que sigue), tales como NO- (ó:xido nítrico). Estos iniciadores o carcinógenos pueden producir oncogenes activos debido a una mutación de proto-oncogenes, añadiendo una modificación en el control del crecimiento y en la diferenciación celular.
El estrés oxidativo está implicado en varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Agentes ambientales como la luz ultravioleta, la radiación ionizable, carcinógenos químicos y el humo del tabaco pueden inducir estrés o idativo. Pero muchas células tienen un sistema defensivo antioxidante constituido por diferentes enzimas (p. ej. superóxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa, etc.) y/o por antioxidantes de bajo peso molecular (vitami na C, vitamina E, glutation, tioredoxina, etc.).
El estrés oxidativo ocurre cuando la producción de ORS excede la ca pacidad de su eliminación por los mecanismos antioxidativos del organismo, y consecuentemente daña macromoléculas cruciales como el ADN, las proteínas y los lípidos. Así, por ejemplo, las especies que provienen de la reducción de moléculas de oxígeno generalmente reaccionan con bases del esqueleto de ADN (residuos de desoxirribosa) produciendo una rotura de la cadena. El daño endógeno del ADN es genotóxico e induce mutaciones en oncogenes y en genes supresores de tumores. Las alteraciones inducidas en lípidos y proteínas son de tipo oxidativo, generando intermedios que reaccionan con el ADN para crear aducios. Hay otros hallazgos que muestran la implicación de ORS en carcinogénesis, tales como la implicación de la peroxidación de lípidos en el carcinoma renal inducido por nitriltriacetato férrico.
Es interesante remarcar la acción de los agentes que modulan las concentraciones extra e intracelulares de grupos tiol, grupos esenciales para la activación de numerosas enzimas. Tales agentes han sido empleados para reducir los efectos secundarios asociados con la quimioterapia del cáncer y están siendo actualmente investigados como una nueva estrategia de prevención. Uno de los agentes más extensamente estudiados es la N-acetilcisteína (NAC), cuyo efecto protector contra la carcinogénesis proviene básicamente de sus propiedades antígeno-tóxicas y antioxidativas. Las propiedades antiangiogénicas de la NAC son también conocidas.
Así pues, es ampliamente reconocido que la terapia del cáncer se beneficiaría con la introducción de nuevos agentes terapéuticos con propiedades antioxidativas y/o antiangiogénicas.
Las algas son una rica fuente natural de variedad de productos, incluyendo fármacos. Algunas algas del género Laminaria han sido descritas como alimento, lo que significa que no son tóxicas para el hombre a las dosis empleadas. También han sido descritas como fuente natural para la obtención de compuestos terapéuticos tales como agentes immunoestimulantes (cfr. JP 2002209552-A2), compuestos anti-inflamatorios (cfr. US 6.337.315-B1), o mezclas de polisacáridos inductoras de apoptosis (cfr. US 6.207.652-B1).
Ha sido descrita la actividad antitumoral de una extensa variedad de algas marinas, algunas de ellas del género Laminaria (cfr. H. Noda et al., Hvdrobiologia 1990, vol. 204-205, pp. 577-84; B.S. Reddy et al., Mutation Research 1984. vol. 127, pp. 113-18: Y. Suzuki et al.. Chemotherapy 1980, vol. 28, pp. 165-70; J. Yubin et al., Zhongguo Haivano Yaowu 1994, vol. 13, pp. 20-4), pero nunca en relación con extractos de la especie Laminaria cloustoni. Algunas algas marinas han sido descritas como fuentes naturales con actividad antioxidante y quelante del hierro, pero nunca en relación con Laminaria cloustoni sp.
Las hojas de la especie Laminaria cloustoni son conocidas desde hace tiempo en la producción de sustancias adhesivas (cfr. US 1.099.382) y como fuente de varios materiales no terapéuticos (p. ej. manitol, laminarina, ácido algínico, fucoidina o yodo, cfr. GB 727.013). Producen ácido acético cuando se permite la fermentación. Más recientemente, se ha descrito la utilidad de extractos alcohólicos de este alga para la preparación de soluciones biocatalíticas (cfr. US 6.284.012 B1 ).
El alga Laminaria cloustoni, descubierta por Edmonston en 1845, es un alga de agua dulce, clasificada como alga marrón, comúnmente conocida en inglés como "kelp". Es una gran alga marina (de uno a tres metros de longitud) perteneciente al orden de las Laminariales (que incluye alrededor de treinta géneros), clase Phaeophyceae, phylum Heterokontophyta. Crece en los mares más fríos, sobre rocas, en las costas de los océanos Pacífico y Atlántico, en el océano Ártico y en las Islas Británicas.
El alga Laminaria cloustoni no es flexible, sino rígida y erecta, de tallo cilindrico. Es de color marrón claro. Bajo el tallo se divide en raíces como ramas, que expanden y unen el alga a la base submarina de las rocas. La fronda es plana, coriácea, de color verde oliva, y dividida en divisiones como dedos. Sólo se usa la parte cilindrica del tallo.
Comercialmente, el alga Laminaria cloustoni consiste en porciones cilindricas y secas del tallo, algo irregulares, profundamente onduladas, de gran resistencia y elasticidad, y que se rompen por una fractura suave. Es de color marrón, siendo la porción interna más pálida que la externa. Cuando se forman bastones cónicos y cilindricos está lista para su uso. Contiene abundante mucílago, del cual Shimideberg (1885) aisló la laminarina y el ácido laminárico, una sustancia con la propiedad de hincharse en agua en un grado inusual. Entre las algas que pertenecen al género Laminaria existen grandes diferencias, no sólo por la morfología, sino también por su actividad biológica y terapéutica. De hecho, es imposible predecir las propiedades biológicas/terapéuticas de una especie por analogía con las de otra especie.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni obtenible por el método que comprende los siguientes pasos: (a) someter una porción del alga seca y molida a un tratamiento con agua caliente simultáneamente acompañado por un tratamiento con ultrasonidos; (b) separar el residuo sólido mediante filtración; y (c) evaporar el filtrado hasta obtener el extracto con la concentración deseada. En una realización particular de la invención, el tratamiento con ultrasonidos se realiza durante más de 12 horas y el paso (c) de evaporación se realiza hasta sequedad.
Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica con actividad antitumoral que comprende el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. Otros aspectos de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas con actividad antioxidante y con actividad antiangiogénica que comprenden el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. Como antioxidante podrá ser utilizado en muchos campos como son los de los suplementos nutricionales, la cosmética y los conservantes industriales.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriormente, para la preparación de un medicamento con actividad antioxidante, antiangiogénica y para el tratamiento de tumores. En otras palabras, la invención se refiere a métodos de tratamiento de pacientes que sufren enfermedades o desórdenes que se sabe pueden ser tratadas con agentes antioxidantes, antiangiogénicos y/o antitumorales.
El extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido anteriomente puede usarse como un medicamento por sí mismo o en combinación con otros agentes terapéuticos. El extracto puede usarse en forma de solución de diferentes concentraciones, o como sólido obtenido por evaporación hasta sequedad (opcionalmente disuelto o mezclado con otros excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables). Como será obvio para los expertos en la materia, se pueden usar diferentes vías conocidas para administrar este agente terapéutico (oral, parenteral, etc.), dependiendo del tratamiento y otras circunstancias.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes modos de realización se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Determinación de los sólidos totales de extractos acuosos de Laminaria cloustoni
La muestra de alga seca fue dividida mediante métodos mecánicos y tratada con agua, previamente a la extracción. La muestra se homogeneizó en un tubo agitador hasta la destrucción total. A continuación fue centrifugada a 3000 rpm durante quince minutos. Se recuperó el sobrenadante y el precipitado se descartó. Se determinaron los sólidos totales en el sobrenadante según un método estándar (Organización Mundial de la Salud, 1998, "Quality control methods for medicinal plant materials", Geneva, Switzerland, 33), resultando en 19,8 + 0,3 mg/ml (diez muestras, con una variación inferior al 10%).
Proceso de preparación del extracto acuoso de Laminaria cloustoni para ensayos biológicos
Se trituró una muestra de Laminaria cloustoni seca (1 g) en un mortero. El polvo seco obtenido se suspendió en agua destilada y la mezcla fue tratada durante 24 horas en un baño de ultrasonidos a 100 °C. Se separó el residuo sólido mediante filtración y se evaporó el filtrado por microdestilación hasta sequedad. El residuo seco resultante era un sólido amorfo blanco amarillento, que se utilizó en las pruebas biológicas.
Test de la Desoxirribosa: actividad secuestradora de radicales hidroxilo y actividad guelante de hierro del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Para evaluar la actividad secuestradora de radicales hidroxilo y la actividad quelante de hierro del extracto de Laminaria cloustoni se siguieron métodos conocidos (cfr. O.l. Aruoma, "Desoxyribose assay for hydroxyl radicáis" Methods in Enzvmology 1994, vol. 23, pp. 57-66; J.A. Buege and S.D. Aust, Methods in Enzvmology 1978, vol. 52, pp. 302-310). Se encontró una correlación linear entre el secuestro de radicales OH y la concentración de sólidos en el extracto acuoso (pendiente 0,34, ordenada en el origen 0,60, r = 0,99, n = 3), a partir de la cual se calculó el valor de IC50 = 5,86 mg/ml. Se encontró una correlación linear entre la actividad quelante de hierro y la concentración de sólidos en el extracto acuoso (pendiente 42,05, ordenada en el origen 47,94, r = 0,94, n = 3), de la que se calculó el valor de IC50 = 0,11 mg/ml.
Actividad inhibidora del extracto acuoso de Laminaria cloustoni contra el daño en el DNA inducido por el complejo Fe(ll)- bleomicina
Se siguió el método descrito (cfr. O.l. Aruoma et al., "Antioxidant and pro- oxidant properties of active rosemary constituents: Carnosol and camosie acid", Xenobiotica 1992, vol. 22, pp. 257-268). Se encontró que el extracto acuoso de Laminaria cloustoni producía un fuerte efecto inhibidor, atribuido, al menos parcialmente, a su actividad quelante sobre el hierro. Se observó una fuerte inhibición en tres concentraciones distintas: 0,33, 0,66 y 1 ,32 mg/ml.
Actividad antineoplásica del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Se investigó el efecto de extractos acuosos de Laminaria cloustoni sobre la línea celular SK-Mel-28 de melanoma humano. La línea se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) [Rockville, MD, USA], se mantuvo en medio Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) comprado a Gibco- BRL [Eggenstein, Germany] suplementado con un 10% de suero fetal de ternero ("Foetal Calf Serum", FCS) [Invitrogen, Carlsbad, CA, USA] inactivado por calor, 2% de glutamina [Gibco-BRL] y 0,1 % de antibióticos (10000 U/mL penicilina, 100 μg/ml estreptomicina) [Gibco-BRL]. La determinación de la IC50 se realizó tal como se describe (cfr. Torres et al., J. Agrie. Food Chem. 2002, vol. 50; pp. 7548-55).
La TABLA 1 muestra el efecto de las diferentes concentraciones del extracto de alga contra 1200 células de SK-Mel-28 en DMEM, 10% FCS. Se determinaron tres valores de densidad óptica (DO) por cada concentración (C) de extracto de alga (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, y 2000 μg/ml). Se calcularon las medias de DO y sus desviaciones estándar (DS). La comparación del control de DO (100%) con las respectivas DO permitieron calcular el porcentaje de viabilidad. Se estimó el valor de IC50 = 91 μg/mL. Se encontró una correlación entre el porcentaje de inhibición de la proliferación y el logaritmo de C (pendiente = 37,71; ordenada en el origen = - 23,89, r = 0.91. p<0,01). TABLA 1 : Efecto de la concentración de extracto de alga contra las células de melanoma humano
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Actividad antiangiogénica del extracto acuoso de Laminaria cloustoni
Se analizó el efecto de extractos acuosos de Laminaria cloustoni sobre un modelo de angiogénesis inducido por Adyuvante Completo de Freund ("Complete Adjuvant of Freund", CAF). Se siguió un modelo descrito (cfr. S. Kobayashi et al., Biol. Pharm. Bull. 1998 vol. 21 , pp. 346-349). Se inyectaron subcutáneamente tres mL de aire en la espalda de ratones machos anestesiados (raza llamada OF-1 , con un peso de 20 + 2 g) para producir una bolsa ovalada regular de aire. Dentro de la bolsa de aire se administraron 0,5 mL de CAF con 0,1 % de aceite de crotón. Como control positivo, se administró dexametasona vía intraperitoneal 2 horas antes de la inyección de CAF, una vez al día, durante cinco días. El extracto acuoso de Laminaria cloustoni se inyectó siguiendo el mismo esquema y la misma vía de administración. Los ratones fueron sacrificados al sexto día, bajo anestesia, y el fluido de exudado de granuloma fue recogido y centrifugado a 3500 rpm. Se determinaron varios ensayos: la actividad superóxido dismutasa (SOD) [kit facilitado por Randox Laboratories]; actividad catalasa (cfr. Boehringer Mannheim. Enzymes for routine 1st edition 1987, pp. 15-16); H2O2, [kit Bioxytech H202-560, Oxis International Inc.Portland, OR, USA]; malondialdehido (MDA) y 4-hidroxialquenales [kit LPO-586 of Calabiochem., La Jolla, CA].
La TABLA 2 muestra el efecto del extracto acuoso de Laminaria cloustoni sobre los mediadores del estrés oxidativo en el modelo experimental de angiogénesis. Grupos experimentales: control (-), grupo tratado con solución salina; control (+), grupo tratado con 5 mg/kg de dexametasona; extracto de alga, grupo tratado con 10 mg/kg de extracto acuoso de Laminaria cloustoni. Los grupos con al menos una letra en común no presentaron diferencias significativas (p>0,05). Los extractos acuosos de Laminaria cloustoni reducieron el estrés oxidativo respecto al control (-) e incluso en comparación con la dexametasona. Se detectó una disminución de las actividades súperoxido dismutasa y catalasa con respecto al control (-), lo que explica la disminución en la producción de MDA + 4-hidroxialquenales, reconocidos como mediadores de carcinogénesis. TABLA 2: Efectos del extracto acuoso Laminaria cloustoni en un modelo experimental de angiogénesis.
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Comportamiento del extracto acuoso de Laminaria cloustoni en un modelo in vivo de carcinoma renal
Se evaluó el efecto del extracto acuoso de Laminaria cloustoni utilizando un sistema vivo. Se seleccionó un modelo de carcinoma renal que presentaba la peculiaridad de ser inducido por complejos que contienen hierro. Como el extracto acuoso de Laminaria cloustoni presentaba actividad quelante de hierro, este modelo de carcinoma renal, inducido por Fe-NTA, era de especial interés para investigar los efectos de los principios activos presentes en el extracto acuoso del alga. El carcinoma fue inducido tal como describe (cfr. Jia-Li, et al., Cáncer Research 1987, vol. 47, pp. 1867-1869). El agente inductor, una solución de Fe-NTA, se preparó diariamente. La solución de Fe(NO3)3.9H2O fue mezclada en un agitador magnético en un exceso de 4 veces molar de sal disódica de ácido nitriltriacético (NTA) y el pH fue ajustado a 7,4 con bicarbonato sódico. La dosis de Fe-NTA era 2 mg/Fe/kg peso corporal/día. La administración fue vía intraperitoneal, seis días por semana, durante doce semanas. La dosis de NTA era equivalente a la porción de NTA contenida en el complejo Fe-NTA. La TABLA 3 muestra el comportamiento d el peso corporal, catorce días después de iniciar el tratamiento. Símbolos usados: (-) = sin signos observados; NTA = nitriltriacetato; Fe-NTA = nitriltriacetato férrico (inductor del carcinoma). La TABLA 4 muestra los resultados de una evaluación cualitativa observada durante un ensayo de catorce días. Símbolos usados: (-) = sin signos observados; NTA = nitriltriacetato; Fe-NTA = nitriltriacetato férrico (inductor del carcinoma). En resumen, el extracto acuoso de Laminaria cloustoni dio resultados positivos sobre el carcinoma renal inducido por Fe-NTA, en los primeros catorce días, determinando el aumento de peso corporal y otras evaluaciones cualitativas.
TABLA 3. Comportamiento del peso corporal en un modelo in vivo de carcinoma renal
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TABLA 4: Evaluación cualitativa observada en un modelo in vivo de carcinoma renal
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni obtenible por el método que comprende los siguientes pasos:
(a) someter una porción del alga seca y molida a un tratamiento con agua caliente simultáneamente acompañado por un tratamiento con ultrasonidos;
(b) separar el residuo sólido mediante filtración; y
(c) evaporar el filtrado hasta obtener el extracto con la concentración deseada.
2. Extracto según la reivindicación 1 , donde el tratamiento con ultrasonidos se realiza durante más de 12 horas y el paso (c) de evaporación se realiza hasta sequedad.
3. Composición farmacéutica con actividad antitumoral que comprendes el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
4. Composición farmacéutica con actividad antioxidante que comprende el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
5. Composición farmacéutica con actividad antiangiogénica que comprende el extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
6. Uso del extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento pa ra el tratamiento de tumores.
7. Uso del extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento co n actividad antioxidante.
8. Uso del extracto acuoso del alga Laminaria cloustoni definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento co n actividad antiangiogénica.
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